CN102337251A - 一种hk97噬菌体病毒样颗粒的嵌合体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种HK97噬菌体病毒样颗粒的嵌合体，以及该嵌合体在生物免疫靶向治疗中的作用。通过在HK97噬菌体病毒样颗粒的GP5基因的C端添加表达AFHYESQ短肽的碱基序列，将该GP5基因和编码HK97噬菌体病毒样颗粒头端的蛋白GP4基因***到pETDuet-1质粒上，构建了HK97噬菌体病毒样颗粒的嵌合体表达质粒，将表达质粒诱导表达后的前体进行纯化、酸化诱导成成熟的HK97噬菌体病毒样颗粒嵌合体。并将HK97噬菌体病毒样颗粒的嵌合体作为生物靶向治疗载体，制备成疫苗，发挥生物免疫靶向治疗作用。

Description

一种HK97噬菌体病毒样颗粒的嵌合体及其用途
发明领域
本发明属于分子生物学基因工程领域，具体涉及一种HK97噬菌体病毒样颗粒蛋白的嵌合体的构建及其纯化，以及在生物免疫靶向治疗中的作用。 
发明背景 
针对慢性疾病的治疗性疫苗是目前疫苗研究的热点之一，这些疾病包括：慢性病毒感染、过敏性疾病、肿瘤、糖尿病、高血压和阿尔茨海默病等。与普通预防性疫苗不同的是：治疗性疫苗针对的是自身抗原或外来免疫耐受抗原，因此，治疗性疫苗要发挥治疗作用必须首先打破免疫耐受，产生针对特定抗原的自身抗体或自身反应T细胞。由于治疗性疫苗所针对的靶抗原一般是短肽，抗原性较弱，必须与合适的载体结合后，在免疫佐剂的帮助下才能发挥作用，因此，选择合适的载体及佐剂往往是治疗性疫苗成功的关键。 
目前常用的载体如KLH、破伤风类毒素等，效力一般不强，必须使用佐剂，而常用的佐剂如弗氏佐剂虽然效能较强，但不能应用于人体，铝制佐剂虽然可应用于人体，但免疫效能很弱，而且也存在如脑动脉硬化、铝盐局部堆积等不良反应。因此，理想的治疗性疫苗载体，应该在与靶抗原结合后，在不应用免疫佐剂的情况下，就能有效打破机体的免疫耐受，产生高滴度抗体，发挥治疗作用。 
病毒样颗粒就是这样一类理想的疫苗载体。病毒样颗粒(VLP)是由病毒衣壳蛋白装配成的不含病毒核酸的空壳结构，具有病毒的外形和免疫原性，可诱导机体产生以体液免疫为主的反应，从而产生针对与之结合的抗体，由于不具有病毒的核酸成分，因此避免了病毒复制增殖的风险。病毒样颗粒由大量重复结构的衣壳蛋白单体聚合而成，进入体内后可以与特异性B细胞表面的B细胞受体结合并激活B细胞，同时，VLP还可提供外源性T细胞表位而激活辅助性T细胞，从而突破自身免疫耐受。另外每个衣壳蛋白单体一般具有碱性多肽域，如赖氨酸的-NH2，这些碱性多肽域朝向颗粒的外表面，短肽等小分子只要带有合适的氨基酸基团，如-SH，通过异双功能交联剂就能结合并展示于VLPs表面，刺激机体产生抗体。 
目前国内外已制备出多种噬菌体病毒样颗粒，如Qβ噬菌体病毒样颗粒、人***瘤病毒样颗粒(HPV)、MS2病毒样颗粒等。瑞士Cytos公司将Qβ噬菌体病毒样颗粒为载体研制了一系列治疗性疫苗，包括阿尔茨海默病AD疫苗(CAD106)、尼古丁疫苗(NIC002)、过敏性哮喘疫苗(CYT003-QbG10)等，其中其研制的针对血管紧张素II的降压疫苗 (CYT006-AngQb)，已完成IIa期临床实验，针对过敏性鼻结膜炎研制的疫苗(CYT003-QbG10)已完成IIb期临床实验。而比利时葛兰素史克公司(GSK)研制的已经上市的子***疫苗Cervarix(TM)的主要疫苗成分就是HPV-16和HPV-18。这些病毒样颗粒显示了强大的免疫原性和人使用之后的安全性。迄今为止，HK97噬菌体病毒样颗粒的研究虽有文献报道，但是对其嵌合体的研究少见，且作为生物免疫靶向治疗载体的用途未见报道。 
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种HK97噬菌体病毒样颗粒的嵌合体。 
本发明的第二个目的是HK97噬菌体病毒样颗粒的嵌合体在生物免疫靶向治疗中的作用。 
本发明通过以下技术方案实现： 
HK97噬菌体病毒样颗粒蛋白嵌合体HII-HK97-P的制备： 
(1)将编码HK97噬菌体病毒样颗粒头端的蛋白GP4基因***pETDuet-1质粒(购自Novagen公司)的多克隆位点上； 
(2)在编码HK97噬菌体病毒样颗粒头端的蛋白GP5基因的C端添加表达AFHYESQ短肽的碱基序列，将该GP5基因***pETDuet-1质粒的多克隆位点上，构建嵌合体表达质粒pETDuet-HK97-P； 
(3)将质粒pETDuet-HK97-P转化至BL21(DE3)感受态细菌，IPTG诱导表达病毒样颗粒嵌合体前体P II-HK97-P； 
(4)6％PEG80004℃沉降病毒样颗粒嵌合体前体PII-HK97-P； 
(5)强阴离子交换层析纯化所述病毒样颗粒嵌合体前体PII-HK97-P； 
(6)酸化诱导所述病毒样颗粒嵌合体前体PII-HK97-P成熟膨胀为成熟病毒样颗粒嵌合体HII-HK97-P； 
(7)凝胶层析纯化成熟病毒样颗粒嵌合体HII-HK97-P。 
本发明保藏培养物命名为Escherichia coli BL21(DE3)/pETDuet-HK97-P，于2011年6月21日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2011206。 
本发明的优点： 
1、HK97噬菌体病毒样颗粒GP5蛋白羧基末端可以添加融合1-12个氨基酸而不影响病毒样颗粒的自我组装，从而以嵌合体形式将短肽表位直接展示在病毒样颗粒表面。 
2、本发明制备的HK97噬菌体病毒样颗粒蛋白嵌合体HII-HK97-P可以用于生物免疫靶向治疗中。 
附图说明
序列表SEQ ID NO：1是本发明构建HK97噬菌体病毒样颗粒嵌合体所用的GP4基因的核苷酸序列。 
序列表SEQ ID NO：2是本发明构建HK97噬菌体病毒样颗粒嵌合体所用的GP5基因的核苷酸序列。 
序列表SEQ ID NO：3是本发明构建HK97噬菌体病毒样颗粒嵌合体所用的GP4基因编码的氨基酸序列。 
序列表SEQ ID NO：4是本发明构建HK97噬菌体病毒样颗粒嵌合体所用的GP5基因编码的氨基酸序列。 
图1：琼脂糖凝胶电泳鉴定嵌合体表达质粒pETDuet-HK97-P。 
图2：HII-HK97-P病毒样颗粒的成熟和纯化过程。取酸化诱导后的样品(0min)、中和后样品(5min，10min，30min，60min，2hrs)进行SDS-PAGE电泳鉴定和纯度分析，随着中和时间的延长，五聚体和六聚体所占比例越来越大。 
图3：HK97-P病毒样颗粒嵌合体前体PII-HK97-P和成熟体HII-HK97-P电镜图。左图为PII-HK97-P电镜图，右图为HII-HK97-P电镜，后者在形态结构上相比前体具有更薄的外壳，直径由54nm扩大至约66nm。 
图4：HII-HK97-P疫苗免疫正常SD雄性大鼠后抗P1短肽抗体滴度。第7、21、35、45天免疫大鼠的抗P1短肽抗体滴度的测定(血清均以1∶1000稀释)。 
具体实施方式
以下实施案例在于进一步说明本发明，但不限制其范围。 
实施案例1 嵌合体表达质粒pETDuet-HK97-P的构建 
用引物5’-CCATGGCTGAAATCGTAAAAACGCTGT-3’；5’-CCGGAATTCTTATTTACCTAAGTTAGAAGGG-3’，通过PCR扩增得到编码HK97噬菌体病毒样颗粒头端的蛋白GP4基因，大小为678bp。用引物5’-CCATATGTCTGAACTCGCTCTCATTC-3’；5’-CTCGAGTCAACGAGATTCGTAGTGG-3’，通过PCR扩增得到编码HK97噬菌体病毒样颗粒头端的蛋白GP5基因，大小为1158bp。 
将上述得到的GP5基因片段和GP4基因片段***pETDuet-1质粒(购自Novagen公司)的两个多克隆位点，构建嵌合体表达质粒pETDuet-HK97-P，酶切鉴定其分子量大小(图1)。 
实施案例2 HII-HK97-P病毒样颗粒的成熟及其纯化 
(1)将质粒pETDuet-HK97-P转化至BL21(DE3)感受态细菌，挑取单个菌落于20ml液体培养基中37℃扩增16小时，取该菌液1ml加入1L液体培养基中，37℃扩增数小时至培养 基的OD600nm约为0.6，加入IPTG(20ul，0.2g/m1)诱导表达病毒样颗粒嵌合体前体PII-HK97-P。 
(2)4小时后裂解细菌离心取上清于6％PEG80004℃沉降病毒样颗粒嵌合体前体PII-HK97-P过夜，PII-HK97-P经UnoQ强阴离子交换层析(20mM Tris-HCl，1M NaCl)纯化。 
(3)阴离子交换纯化后对PII-HK97-P进行诱导成熟：将30mg/ml PII-HK97-P病毒样颗粒嵌合体前体1.5ml稀释于150ml酸化缓冲液(pH3.8，250mM KCl，50mM Citrate)中1小时，随后加入1/6体积的中和缓冲液(pH8.3，1M Tris-HCl)至总体系的pH在7.0以上，室温放置2小时或者更长时间。SDS-PAGE电泳鉴定病毒样颗粒嵌合体前体、中间体和成熟体(见实施案例3，图2)。 
(4)酸化诱导成熟的病毒样颗粒嵌合体HII-HK97-P经凝胶过滤层析纯化以达到更高的纯度。 
实施案例3 HII-HK97-P病毒样颗粒的鉴定 
取HK97-P病毒样颗粒嵌合体前体、中间体和成熟体各20ug进行6％SDS-PAGE电泳(图2)，并取HK97-P病毒样颗粒嵌合体前体PII-HK97-P和成熟体HII-HK97-P进行透射电镜(镍网，4％醋酸双氧铀负染)下的形态和大小观测(图3)。电镜观测发现，HK97-P病毒样颗粒嵌合体前体PII-HK97-P是自行组装的棱形病毒样颗粒结构，直径大约54nm，而成熟体HII-HK97-P在形态结构上相比前体具有更薄的外壳，直径稍微扩大，约为66nm。 
实施案例4 HII-HK97-P嵌合体疫苗免疫大鼠后抗P短肽抗体的产生 
清洁级SD大鼠10只随机分为两组，每组5只，饲养于清洁级动物房，采用12h/12h光照及非限制性普通饮食。取HII-HK97-P疫苗免疫大鼠：采用背部皮下3-4点注射疫苗的方案，400ul/只，疫苗剂量约300ug/只，于初次免疫后间隔两周加强2次。 
0.3％戊二醛交联剂耦联牛血清白蛋白(BSA)与短肽P，以此耦联物(10ug/孔)包被96孔ELISA板。于7、21、35、45天取大鼠鼠尾静脉血使用ELISA进行抗P短肽抗体滴度的测定(血清均以1∶1000稀释)(图4)。 
Figure IDA0000070815170000011
Figure IDA0000070815170000021
Figure IDA0000070815170000041
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Figure IDA0000070815170000061

Claims (6)

1.一种HK97噬菌体病毒样颗粒的嵌合体，其特征在于：该病毒样颗粒的嵌合体是由构建的嵌合体表达质粒pETDuet-HK97-P经过诱导表达、纯化和酸化成熟而得到的。
2.如权利要求1所述的HK97噬菌体病毒样颗粒的嵌合体，其中所述嵌合体表达质粒pETDuet-HK97-P中含有HK97噬菌体病毒样颗粒头端的蛋白GP4基因。
3.如权利要求1所述的HK97噬菌体病毒样颗粒的嵌合体，其中所述嵌合体表达质粒pETDuet-HK97-P中含有HK97噬菌体病毒样颗粒头端的蛋白GP5基因，该GP5基因的C端添加了表达AFHYESQ短肽的碱基序列。
4.如权利要求3所述的HK97噬菌体病毒样颗粒的嵌合体，其中所述AFHYESQ短肽的碱基序列是5’-GCGTTCCACTACGAATCTCGT-3’。
5.如权利要求1所述的HK97噬菌体病毒样颗粒的嵌合体，其作为生物靶向治疗载体的用途。
6.如权利要求1所述的HK97噬菌体病毒样颗粒的嵌合体，其中所述嵌合体表达质粒pETDuet-HK97-P保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2011206，保藏命名为：Escherichia coli BL21(DE3)/pETDuet-HK97-P。
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