CN102333536B - β-抑制蛋白效应器和组合物以及其应用方法 - Google Patents
β-抑制蛋白效应器和组合物以及其应用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请描述了起β-抑制蛋白效应器作用的化合物家族。这样的化合物可以在慢性和急性心血管疾病的治疗中提供显著的治疗益处。
Description
相关申请
本申请要求于2008年12月29日提交的美国临时专利申请号61/141,126的优先权,该申请的全部内容通过引用合并于本文。
技术领域
本申请涉及起β-抑制蛋白(β-arrestin)效应器作用的化合物家族。这样的化合物可以在心血管疾病诸如急性心力衰竭或急性高血压危象的治疗中提供显著的治疗益处。
背景技术
已经基于信号传导范式(paradigm)开发了靶向GPCR的药物,在所述信号传导范式中激动剂(例如,血管紧张素II)对受体的刺激导致异源三聚体“G蛋白”的激活,然后“G蛋白”的激活导致第二信使/下游信号传导(例如,经由二酰甘油,肌醇-三磷酸,钙,等等...)和生理功能的改变(例如,血压和体液稳态)。存在对用于治疗与血压和体液稳态相关的病理学的靶向GPCR的其他药物的需求。
前面对相关领域的描述不以任何方式意在承认本文所述的任一篇文件,包括未决的美国专利申请是本发明的现有技术。此外,本文对与所述产品、方法和/或设备相关的任何缺点的描述不意在限制本发明。实际上,本发明的各个方面可以包括所述产品、方法和/或设备的某些特征,而不具有它们的所述缺点。
发明内容
根据一些实施方案,本发明提供了具有下列结构的新型β-抑制蛋白效应器:
Xx-Yy-Val-Ww-Zz-Aa-Bb-Cc,
在上面的结构中,变量Aa、Bb、Cc、Ww、Xx、Yy和Zz可以选自后面在详述中所述的化学或生物结构部分的各种基团。还提供了β-抑制蛋白效应器衍生物和模拟物。还提供了制备本发明的化合物的方法。
根据一些实施方案,本发明提供了具有下列结构的新型β-抑制蛋白效应器:
Xx-Arg-Val-Ww-Zz-His-Pro-Cc;
或其药学可接受的盐、溶剂化物或水合物。在上面的结构中,变量Cc、Ww、Xx和Zz可以选自后面在详述中所述的化学或生物结构部分的各种基团。还提供了β-抑制蛋白效应器衍生物和模拟物。还提供了制备本发明的化合物的方法。
根据一些实施方案,本发明的化合物包括下式:
Sar-Arg-Val-Ww-Zz-His-Pro-Cc
或其药学可接受的盐、溶剂化物或水合物。在上面的结构中,变量Cc、Ww和Zz可以选自后面在详述中所述的化学或生物结构部分的各种基团。还提供了β-抑制蛋白效应器衍生物和模拟物。还提供了制备本发明的化合物的方法。
根据一些实施方案,本发明的化合物包括下式:
Sar-Arg-Val-Ww-OMTh-His-Pro-Cc,
其药学可接受的盐、溶剂化物或水合物。在上面的结构中,变量Cc和Ww可以选自后面在详述中所述的化学或生物结构部分的各种基团。还提供了β-抑制蛋白效应器衍生物和模拟物。还提供了制备本发明的化合物的方法。
根据一些实施方案,本发明的组合物包含选自由下列各项组成的组的肽或模拟肽:
a)包括下列序列的肽或模拟肽:
Xx-Yy-Val-Ww-Zz-Aa-Bb-Cc,
其中Xx选自由无氨基酸、肌氨酸、N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸、N,N-二甲基甘氨酸、L-天冬氨酸、D-天冬氨酸、L-谷氨酸、D-谷氨酸、N-甲基-L-天冬氨酸、N-甲基-L-谷氨酸、吡咯烷-1-基乙酸和吗啉-4-基乙酸组成的组;
Yy选自由L-精氨酸和L-赖氨酸组成的组;
Ww选自由L-异亮氨酸、甘氨酸、L-酪氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸、3-羟基-L-酪氨酸、2,6-二甲基-L-酪氨酸、3-氟-L-酪氨酸、4-氟苯基-L-丙氨酸(aniline)、2,6-二氟-L-酪氨酸、3-硝基-L-酪氨酸、3,5-二硝基-L-酪氨酸、3,5-二溴-L-酪氨酸、3-氯-L-酪氨酸、O-烯丙基-L-酪氨酸和3,5-二碘-L-酪氨酸组成的组;
Zz选自由L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、O-甲基-L-苏氨酸、D-丙氨酸和L-正缬氨酸组成的组;
Aa选自由L-组氨酸、L-组氨酸-酰胺和L-赖氨酸组成的组;
Bb选自由L-脯氨酸、L-脯氨酸-酰胺、D-脯氨酸和D-脯氨酸-酰胺组成的组;和
Cc选自由无氨基酸、L-异亮氨酸、L-异亮氨酸-酰胺、甘氨酸、甘氨酸-酰胺、L-丙氨酸、L-丙氨酸-酰胺、D-丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-正缬氨酸组成的组;
条件是当Xx是L-天冬氨酸时,Cc不是L-苯丙氨酸;当Xx是肌氨酸时,Cc不是L-异亮氨酸;当Ww是甘氨酸时,Cc不是甘氨酸;当Xx是肌氨酸,和Zz是L-缬氨酸时,Cc不是L-丙氨酸;并且当Xx是肌氨酸,Ww是L-酪氨酸,且Zz是L-异亮氨酸时,Cc不是L-丙氨酸;
b)肽或模拟肽,其中当所述肽或模拟肽的序列的成员在(a)中所述的序列中出现时,所述成员保持其相对位置,其中在(a)中所述的一个或多个氨基酸或氨基酸类似物之间***1-3个氨基酸或氨基酸类似物的间隔区,并且其中所述肽或模拟肽的总长度为6-25个氨基酸和/或氨基酸类似物;和
c)与(a)中所述的肽或模拟肽至少70%相同的肽或模拟肽。
根据其他实施方案,本发明的组合物包含选自由下列各项组成的组的肽或模拟肽;
a)包括下列序列的肽或模拟肽:
Xx-Arg-Val-Ww-Zz-His-Pro-Cc,
其中Xx选自由肌氨酸、N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸、N,N-二甲基甘氨酸、L-天冬氨酸、D-天冬氨酸、L-谷氨酸、D-谷氨酸、N-甲基-L-天冬氨酸、N-甲基-L-谷氨酸、吡咯烷-1-基乙酸和吗啉-4-基乙酸组成的组;
Ww选自由L-异亮氨酸、甘氨酸、L-酪氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸、3-羟基-L-酪氨酸、2,6-二甲基-L-酪氨酸、3-氟-L-酪氨酸、4-氟苯基-L-丙氨酸(aniline)、2,6-二氟-L-酪氨酸、3-硝基-L-酪氨酸、3,5-二硝基-L-酪氨酸、3,5-二溴-L-酪氨酸、3-氯-L-酪氨酸、O-烯丙基-L-酪氨酸和3,5-二碘-L-酪氨酸组成的组;
Zz选自由L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、O-甲基-L-苏氨酸、D-丙氨酸和L-正缬氨酸组成的组;和
Cc选自由L-异亮氨酸、L-异亮氨酸-酰胺、甘氨酸、甘氨酸-酰胺、L-丙氨酸、L-丙氨酸-酰胺、D-丙氨酸、D-苯丙氨酸和L-正缬氨酸组成的组;
条件是当Xx是L-天冬氨酸时,Cc不是L-苯丙氨酸;当Xx是肌氨酸时,Cc不是L-异亮氨酸;当Ww是甘氨酸时,Cc不是甘氨酸;当Xx是肌氨酸,且Zz是L-缬氨酸时,Cc不是L-丙氨酸;并且当Xx是肌氨酸,Ww是L-酪氨酸,且Zz是L-异亮氨酸时,Cc不是L-丙氨酸;
b)肽或模拟肽,其中当所述肽或模拟肽的序列的成员在(a)中所述的序列中出现时,所述成员保持其相对位置,其中在(a)中所述的一个或多个氨基酸或氨基酸类似物之间***1-3个氨基酸或氨基酸类似物的间隔区,并且其中所述肽或模拟肽的总长度为8-25个氨基酸和/或氨基酸类似物;和
c)与(a)中所述的肽或模拟肽至少70%相同的肽或模拟肽。
根据其他实施方案,本发明的组合物包含选自由下列各项组成的组的肽或模拟肽:
a)包括下列序列的肽或模拟肽:
Sar-Arg-Val-Ww-Zz-His-Pro-Cc,
其中Ww选自由L-酪氨酸、3-羟基-L-酪氨酸、3-氟-L-酪氨酸、2,6-二氟-L-酪氨酸、3-硝基-L-酪氨酸、3,5-二硝基-L-酪氨酸和3-氯-L-酪氨酸组成的组;
Zz选自由L-异亮氨酸、L-赖氨酸和O-甲基-L-苏氨酸组成的组;和
Cc选自由D-丙氨酸和L-丙氨酸组成的组,
条件是当Xx是肌氨酸,Ww是L-酪氨酸,且Zz是L-异亮氨酸时,Cc不是L-丙氨酸;
b)肽或模拟肽,其中当所述肽或模拟肽的序列的成员在(a)中所述的序列中出现时,所述成员保持其相对位置,其中在(a)中所述的一个或多个氨基酸或氨基酸类似物之间***1-3个氨基酸或氨基酸类似物的间隔区,并且其中所述肽或模拟肽的总长度为8-25个氨基酸和/或氨基酸类似物;和
c)与(a)中所述的肽或模拟肽至少70%相同的肽或模拟肽。
在更具体的实施方案中,Ww选自由L-酪氨酸和3-羟基-L-酪氨酸组成的组;并且Zz选自由L-异亮氨酸和L-赖氨酸组成的组。任选地,所述肽或模拟肽包括SEQ ID NO:23、27或67的序列。
根据其他实施方案,本发明的组合物包含选自由下列各项组成的组的肽或模拟肽:
a)包括下列序列的肽或模拟肽:
Sar-Arg-Val-Ww-OMTh-His-Pro-Cc,
其中Ww选自由L-酪氨酸、3-羟基-L-酪氨酸;3-氟-L-酪氨酸和3-氯-L-酪氨酸组成的组;和
Cc选自由D-丙氨酸和L-丙氨酸组成的组;
b)肽或模拟肽,其中当所述肽或模拟肽的序列的成员在(a)中所述的序列中出现时,所述成员保持其相对位置,其中在(a)中所述的一个或多个氨基酸或氨基酸类似物之间***1-3个氨基酸或氨基酸类似物的间隔区,并且其中所述肽或模拟肽的总长度为8-25个氨基酸和/或氨基酸类似物;和
c)与(a)中所述的肽或模拟肽至少70%相同的肽或模拟肽。
在更具体的实施方案中,Ww选自由3-羟基-L-酪氨酸;3-氟-L-酪氨酸和3-氯-L-酪氨酸组成的组;并且Cc是L-丙氨酸。任选地,所述肽或模拟肽包括SEQID NO:77、78或79的序列。
根据其他实施方案,本发明的组合物包含选自由下列各项组成的组的肽或模拟肽:
a)包括下列序列的肽或模拟肽:
Sar-Arg-Val-Ww-Tyr-His-Pro-NH2,
其中Ww选自由L-酪氨酸、3-羟基-L-酪氨酸、3-氟-L-酪氨酸、2,6-二氟-L-酪氨酸、3-硝基-L-酪氨酸、3,5-二硝基-L-酪氨酸和3-氯-L-酪氨酸组成的组;
b)肽或模拟肽,其中当所述肽或模拟肽的序列的成员在(a)中所述的序列中出现时,所述成员保持其相对位置,其中在(a)中所述的一个或多个氨基酸或氨基酸类似物之间***1-3个氨基酸或氨基酸类似物的间隔区,并且其中所述肽或模拟肽的总长度为7-25个氨基酸和/或氨基酸类似物;和
c)与(a)中所述的肽或模拟肽至少70%相同的肽或模拟肽。
任选地,所述肽或模拟肽包括SEQ ID NO:26的序列。
根据其他实施方案,本发明的组合物包含选自由下列各项组成的组的肽或模拟肽:
a)包括下列序列的肽或模拟肽:
NMAla-Arg-Val-Ww-Zz-His-Pro-Cc,
其中Ww选自由L-酪氨酸、3-羟基-L-酪氨酸、3-氟-L-酪氨酸、2,6-二氟-L-酪氨酸、3-硝基-L-酪氨酸、3,5-二硝基-L-酪氨酸和3-氯-L-酪氨酸组成的组;
Zz选自由L-异亮氨酸、L-赖氨酸和O-甲基-L-苏氨酸组成的组;
和Cc选自由D-丙氨酸和L-丙氨酸组成的组;
b)肽或模拟肽,其中当所述肽或模拟肽的序列的成员在(a)中所述的序列中出现时,所述成员保持其相对位置,其中在(a)中所述的一个或多个氨基酸或氨基酸类似物之间***1-3个氨基酸或氨基酸类似物的间隔区,并且其中所述肽或模拟肽的总长度为8-25个氨基酸和/或氨基酸类似物;和
c)与(a)中所述的肽或模拟肽至少70%相同的肽或模拟肽。
在更具体的实施方案中,Ww是L-酪氨酸,Zz是L-异亮氨酸,和/或Cc是L-丙氨酸。任选地,所述肽或模拟肽包括SEQ ID NO:34的序列。
任选地,上述本发明的组合物中的任一个是环状的、二聚化的和/或三聚化的。
根据其他实施方案,本发明的组合物包含血管紧张素2-1型受体(AT1R)β-抑制蛋白偏爱性配体。在具体实施方案中,所述配体具有的用于将β-抑制蛋白-2募集至血管紧张素2-1型受体的半数最大有效浓度低于用于IP1蓄积的半数最大有效浓度。在更具体的实施方案中,所述配体的用于将β-抑制蛋白-2募集至血管紧张素2-1型受体的半数最大有效浓度比用于所述配体的IP1蓄积的半数最大有效浓度低10倍。在更具体的实施方案中,所述配体是所述配体是包含选自由下列各项组成的组的肽或模拟肽的组合物:
a)包括下列序列的肽或模拟肽:
Xx-Yy-Val-Ww-Zz-Aa-Bb-Cc,
其中Xx选自由无氨基酸、肌氨酸、N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸、N,N-二甲基甘氨酸、L-天冬氨酸、D-天冬氨酸、L-谷氨酸、D-谷氨酸、N-甲基-L-天冬氨酸、N-甲基-L-谷氨酸、吡咯烷-1-基乙酸和吗啉-4-基乙酸组成的组;
Yy选自由L-精氨酸和L-赖氨酸组成的组;
Ww选自由L-异亮氨酸、甘氨酸、L-酪氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸、3-羟基-L-酪氨酸、2,6-二甲基-L-酪氨酸、3-氟-L-酪氨酸、4-氟苯基-L-丙氨酸(aniline)、2,6-二氟-L-酪氨酸、3-硝基-L-酪氨酸、3,5-二硝基-L-酪氨酸、3,5-二溴-L-酪氨酸、3-氯-L-酪氨酸、O-烯丙基-L-酪氨酸和3,5-二碘-L-酪氨酸组成的组;
Zz选自由L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、O-甲基-L-苏氨酸、D-丙氨酸和L-正缬氨酸组成的组;
Aa选自由L-组氨酸、L-组氨酸-酰胺和L-赖氨酸组成的组;
Bb选自由L-脯氨酸、L-脯氨酸-酰胺、D-脯氨酸和D-脯氨酸-酰胺组成的组;和
Cc选自由无氨基酸、L-异亮氨酸、L-异亮氨酸-酰胺、甘氨酸、甘氨酸-酰胺、L-丙氨酸、L-丙氨酸-酰胺、D-丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-正缬氨酸组成的组;
条件是当Xx是L-天冬氨酸时,Cc不是L-苯丙氨酸;当Xx是肌氨酸时,Cc不是L-异亮氨酸;当Ww是甘氨酸时,Cc不是甘氨酸;当Xx是肌氨酸,且Zz是L-缬氨酸时,Cc不是L-丙氨酸;并且当Xx是肌氨酸,Ww是L-酪氨酸,且Zz是L-异亮氨酸时,Cc不是L-丙氨酸;
b)肽或模拟肽,其中当所述肽或模拟肽的序列的成员在(a)中所述的序列中出现时,所述成员保持其相对位置,其中在(a)中所述的一个或多个氨基酸或氨基酸类似物之间***1-3个氨基酸或氨基酸类似物的间隔区,并且其中所述肽或模拟肽的总长度为6-25个氨基酸和/或氨基酸类似物;和
c)与(a)中所述的肽或模拟肽至少70%相同的肽或模拟肽。
在更具体的实施方案中,所述配体是包含选自由下列各项组成的组的肽或模拟肽的组合物:
a)包括下列序列的肽或模拟肽:
Xx-Arg-Val-Ww-Zz-His-Pro-Cc,
其中Xx选自由肌氨酸、N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸、N,N-二甲基甘氨酸、L-天冬氨酸、D-天冬氨酸、L-谷氨酸、D-谷氨酸、N-甲基-L-天冬氨酸、N-甲基-L-谷氨酸、吡咯烷-1-基乙酸和吗啉-4-基乙酸组成的组;
Ww选自由L-异亮氨酸、甘氨酸、L-酪氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸、3-羟基-L-酪氨酸、2,6-二甲基-L-酪氨酸、3-氟-L-酪氨酸、4-氟苯基-L-丙氨酸(aniline)、2,6-二氟-L-酪氨酸、3-硝基-L-酪氨酸、3,5-二硝基-L-酪氨酸、3,5-二溴-L-酪氨酸、3-氯-L-酪氨酸、O-烯丙基-L-酪氨酸和3,5-二碘-L-酪氨酸组成的组;
Zz选自由L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、O-甲基-L-苏氨酸、D-丙氨酸和L-正缬氨酸组成的组;和
Cc选自由L-异亮氨酸、L-异亮氨酸-酰胺、甘氨酸、甘氨酸-酰胺、L-丙氨酸、L-丙氨酸-酰胺、D-丙氨酸、D-苯丙氨酸和L-正缬氨酸组成的组;
条件是当Xx是L-天冬氨酸时,Cc不是L-苯丙氨酸;当Xx是肌氨酸时,Cc不是L-异亮氨酸;当Ww是甘氨酸时,Cc不是甘氨酸;当Xx是肌氨酸,且Zz是L-缬氨酸时,Cc不是L-丙氨酸;并且当Xx是肌氨酸,Ww是L-酪氨酸,且Zz是L-异亮氨酸时,Cc不是L-丙氨酸;
b)肽或模拟肽,其中当所述肽或模拟肽的序列的成员在(a)中所述的序列中出现时,所述成员保持其相对位置,其中在(a)中所述的一个或多个氨基酸或氨基酸类似物之间***1-3个氨基酸或氨基酸类似物的间隔区,并且其中所述肽或模拟肽的总长度为8-25个氨基酸和/或氨基酸类似物;和
c)与(a)中所述的肽或模拟肽至少70%相同的肽或模拟肽。
根据其他实施方案,本发明提供了一种药物组合物,所述药物组合物包含一种或多种上述的肽或模拟肽和药学可接受的载体。在具体实施方案中,所述药学可接受的载体是纯净无菌水、磷酸盐缓冲盐水溶液或葡萄糖水溶液。
根据其他实施方案,本发明提供了一种治疗心血管病症的方法,所述方法包括:向需要所述方法的受试者施用治疗有效量的一种或多种上述组合物。在具体实施方案中,所述心血管病症选自由下列各项组成的组:慢性高血压、高血压危象、急性充血性心力衰竭、心绞痛、急性心肌梗死、左心室衰竭、脑血管功能不全、颅内出血、心力衰竭、急性失代偿性心力衰竭、原发性高血压、手术后高血压(post-operative hypertension)、高血压性心脏病、高血压性肾病、肾血管性高血压、恶性高血压、肾移植后患者稳定(post-renal transplant patientstabilization)、扩张型心肌病、心肌炎、心脏移植后患者稳定(post-cardiactransplant patient stabilization)、与支架置入后管理相关的病症、神经源性高血压、先兆子痫、腹主动脉瘤和具有血液动力学组分(hemodynamic component)的任何心血管病症。在更具体的实施方案中,所述心血管病症是急性心血管病症。在其他具体的实施方案中,所述急性心血管病症是急性高血压危象、妊娠毒血症、急性心肌梗死、急性充血性心力衰竭、急性缺血性心脏病、肺动脉高压、手术后高血压、偏头痛、视网膜病变和手术后心脏/瓣膜手术(post-operativecardiac/valve surgery)。
根据其他实施方案,本发明还提供了一种治疗与AT1R相关的病毒感染性疾病的方法,所述方法包括:向需要所述方法的受试者施用治疗有效量的一种或多种上述组合物。在具体实施方案中,所述一种或多种组合物通过静脉内注射施用。
根据其他实施方案,本发明还提供了一种治疗心血管病症的方法,所述方法包括向需要所述方法的受试者施用治疗有效量的一种或多种肽或模拟肽,所述一种或多种肽或模拟肽包括下列的序列:
Sar-Arg-Val-Ww-Zz-His-Pro-Cc,
其中Ww选自由L-异亮氨酸、甘氨酸和L-酪氨酸组成的组;
Zz选自由L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-谷氨酸盐组成的组;和
Cc选自由L-异亮氨酸、甘氨酸和L-丙氨酸组成的组。
在具体实施方案中,所述一种或多种肽或模拟肽选自由SEQ ID NOs:3、5、7、9、11、14和16组成的组。在更具体的实施方案中,所述心血管病症选自由下列各项组成的组:慢性高血压、高血压危象、急性充血性心力衰竭、心绞痛、急性心肌梗死、左心室衰竭、脑血管功能不全、颅内出血、心力衰竭、急性失代偿性心力衰竭、原发性高血压、手术后高血压、高血压性心脏病、高血压性肾病、肾血管性高血压、恶性高血压、肾移植后患者稳定、扩张型心肌病、心肌炎、心脏移植后患者稳定、与支架置入后管理相关的病症、神经源性高血压、先兆子痫、腹主动脉瘤和具有血液动力学组分的任何心血管病症。在其他具体实施方案中,所述心血管病症是急性心血管病症。在其他具体实施方案中,所述急性心血管病症是急性高血压危象、妊娠毒血症、急性心肌梗死、急性充血性心力衰竭、急性缺血性心脏病、肺动脉高压、手术后高血压、偏头痛、视网膜病变和手术后心脏/瓣膜手术。
根据其他实施方案中,本发明还提供了一种治疗与AT1R相关的病毒感染性疾病的方法,所述方法包括:向需要所述方法的受试者施用治疗有效量的一种或多种肽或模拟肽,所述一种或多种肽或模拟肽包括下列序列:
Sar-Arg-Val-Ww-Zz-His-Pro-Cc,
其中Ww选自由L-异亮氨酸、甘氨酸和L-酪氨酸组成的组;
Zz选自由L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-谷氨酸盐组成的组;和
Cc选自由L-异亮氨酸、甘氨酸和L-丙氨酸组成的组。
在具体实施方案中,所述一种或多种肽或模拟肽选自由SEQ ID NOs:3、5、7、9、11、14和16组成的组。根据其他实施方案,本发明还提供了一种激动β-抑制蛋白的方法,所述方法包括:向需要所述方法的受试者施用有效量的一种或多种上述组合物。
根据一些实施方案,本发明延伸至包含本发明的化合物和药学可接受载体的药物组合物。当然,本发明的化合物可以以任何形式使用,诸如下面进一步描述的固体或溶液(例如,水溶液)。例如,所述化合物可以以冻干形式单独地或与合适的添加剂一起获得和使用。
还提供了治疗心血管病症的方法。这样的方法将包括向需要该方法的受试者施用治疗有效量的本发明的一种或多种化合物。
具体实施方式
在描述本发明的蛋白、核苷酸序列、肽等和方法之前,要理解本发明不限于所述的特殊的方法学、实验方案、细胞系、载体和试剂,因为这些可以发生变化。还要理解的是本文使用的术语是仅是为了描述特殊的实施方案的目的,不意在限制本发明的范围,本发明的范围仅由附带的权利要求限定。
本申请描述了一个化合物家族,具有独特特性的β-抑制蛋白效应器。本发明的化合物充当经由AT1血管紧张素受体的β-抑制蛋白/GRK-介导的信号转导的激动剂。因此,这些化合物刺激信号传导途径,这些信号传导途径在心血管疾病诸如急性心力衰竭或急性高血压危象的治疗中提供显著的治疗益处。
根据一些实施方案,本发明的化合物包括下式:
Xx-Yy-Val-Ww-Zz-Aa-Bb-Cc,
其中Xx是无氨基酸、肌氨酸、N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸、N,N-二甲基甘氨酸、L-天冬氨酸、D-天冬氨酸、L-谷氨酸、D-谷氨酸、N-甲基-L-天冬氨酸、N-甲基-L-谷氨酸、吡咯烷-1-基乙酸、或吗啉-4-基乙酸;Yy是L-精氨酸、或L-赖氨酸;Ww为L-异亮氨酸、甘氨酸、L-酪氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸、3-羟基-L-酪氨酸、2,6-二甲基-L-酪氨酸、3-氟-L-酪氨酸、4-氟苯基-L-丙氨酸(aniline)、2,6-二氟-L-酪氨酸、3-硝基-L-酪氨酸、3,5-二硝基-L-酪氨酸、3,5-二溴-L-酪氨酸、3-氯-L-酪氨酸、O-烯丙基-L-酪氨酸、或3,5-二碘-L-酪氨酸;Zz是L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、O-甲基-L-苏氨酸、D-丙氨酸、或L-正缬氨酸;Aa是L-组氨酸、L-组氨酸-酰胺、或L-赖氨酸;Bb是L-脯氨酸、L-脯氨酸-酰胺、D-脯氨酸、D-脯氨酸-酰胺且Cc是无氨基酸、L-异亮氨酸、L-异亮氨酸-酰胺、甘氨酸、甘氨酸-酰胺、L-丙氨酸、L-丙氨酸-酰胺、D-丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-正缬氨酸;
条件是当Xx是L-天冬氨酸时,Cc不是L-苯丙氨酸;
条件是当Xx是肌氨酸时,Cc不是L-异亮氨酸;
条件是当Ww是甘氨酸,Cc不是甘氨酸;
条件是当Xx是肌氨酸,和Zz是L-缬氨酸时,Cc不是L-丙氨酸;
条件是当Xx是肌氨酸,Ww是L-酪氨酸,和Zz是L-异亮氨酸时,Cc不是L-丙氨酸;
根据一些实施方案,本发明的化合物包括下式:
Xx-Arg-Val-Ww-Zz-His-Pro-Cc,
其中Xx是肌氨酸、N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-D-丙氨酸、N,N-二甲基甘氨酸、L-天冬氨酸、D-天冬氨酸、L-谷氨酸、D-谷氨酸、N-甲基-L-天冬氨酸、N-甲基-L-谷氨酸、吡咯烷-1-基乙酸、或吗啉-4-基乙酸;Ww是L-异亮氨酸、甘氨酸、L-酪氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸、3-羟基-L-酪氨酸、2,6-二甲基-L-酪氨酸、3-氟-L-酪氨酸、4-氟苯基-L-丙氨酸(aniline)、2,6-二氟-L-酪氨酸、3-硝基-L-酪氨酸、3,5-二硝基-L-酪氨酸、3,5-二溴-L-酪氨酸、3-氯-L-酪氨酸、O-烯丙基-L-酪氨酸、或3,5-二碘-L-酪氨酸;Zz是L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、O-甲基-L-苏氨酸、D-丙氨酸、或L-正缬氨酸;和Cc是L-异亮氨酸、L-异亮氨酸-酰胺、甘氨酸、甘氨酸-酰胺、L-丙氨酸、L-丙氨酸-酰胺、D-丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-正缬氨酸,
条件是当Xx是L-天冬氨酸时,Cc不是L-苯丙氨酸;
条件是当Xx是肌氨酸时,Cc不是L-异亮氨酸;
条件是当Ww是甘氨酸时,Cc不是甘氨酸;
条件是当Xx是肌氨酸时,和Zz是L-缬氨酸时,Cc不是L-丙氨酸;
条件是当Xx是肌氨酸,Ww是L-酪氨酸,和Zz是L-异亮氨酸时,Cc不是L-丙氨酸;
根据一些实施方案,本发明的化合物包括下式:
Sar-Arg-Val-Ww-Zz-His-Pro-Cc,
其中Ww是L-酪氨酸、3-羟基-L-酪氨酸、3-氟-L-酪氨酸、2,6-二氟-L-酪氨酸、3-硝基-L-酪氨酸、3,5-二硝基-L-酪氨酸、3-氯-L-酪氨酸;Zz是L-缬氨酸或L-异亮氨酸;和Cc是D-丙氨酸。
根据一些实施方案,本发明的化合物包括下式:
Sar-Arg-Val-Ww-OMTh-His-Pro-Cc,
其中Ww是L-酪氨酸、3-氟-L-酪氨酸、3-氯-L-酪氨酸;和Cc是D-丙氨酸或L-丙氨酸。
本发明中使用的一些缩写的定义在下面给出:
上面各式的化合物的环状形式、环状截短形式、环状截短的二聚体形式和环状截短的三聚体形式可以使用任何已知的方法制备。截短被定义为如表1所示从X1和/或X2残基去除氨基酸的类似物。根据一些实施方案,上面各式的化合物的环状形式可以通过将游离氨基和游离羧基桥连来制备。根据一些实施方案,环状化合物的形成可以常规地通过本领域中已知的手段用脱水剂处理来进行,如果需要具有合适的保护。根据一些实施方案,开链(线性形式)至环状形式反应可能涉及脯氨酸的反式至顺式异构化。根据一些实施方案,开环(线性形式)至环状形式反应可能涉及分子内-环化。
本发明的化合物的实例包括,但不限于,下面表1中列举的化合物。
表1.
氨基酸或其类似物的定义,请参照缩写表。
测定GPCR活性
优选实施方案的化合物是经由AT1血管紧张素受体的β-抑制蛋白/GRK-介导的信号转导的激动剂。所述化合物实现G蛋白-介导的信号传导的能力可以使用本领域中已知用来检测G蛋白-介导的信号传导或GPCR活性,或不存在所述信号传导/活性的任何测定来测量。“GPCR活性”是指GPCR转导信号的能力。此类活性可以例如,在异种细胞中通过将GPCR(或嵌合GPCR)偶联至G-蛋白和下游效应器诸如PLC或腺苷酸环化酶,并测量细胞内钙的增加来测量(参见,例如,Offermans & Simon,J.Biol.Chem.270:1517515180(1995))。受体活性可以使用荧光Ca2+-指示剂染料和荧光成像通过记录配体诱导的[Ca2+]i变化来有效地测量。本文中使用的“天然配体-诱导的活性”是指通过GPCR的天然配体对GPCR的激活。可以使用任何数量的终点测量GPCR活性来评估活性。例如,GPCR的活性可以使用诸如钙动员(calcium mobilization)的测定,例如水母荧光素发光测定(Aequorin luminescence assay)来评估。
通常,用于测试调节GPCR-介导的信号转导的化合物的测定包括测定间接或直接受GPCR影响的任何参数,例如,功能、物理或化学效应。其包括在体外、体内和离体条件下的配体结合、离子流变化、膜电位、电流、转录、G-蛋白结合、基因扩增、癌细胞中的表达、GPCR磷酸化或去磷酸化、信号转导、受体-配体相互作用、第二信使浓度(例如,cAMP、cGMP、IP3、DAG或细胞内Ca2+),并且还包括其他生理效应诸如神经递质或激素释放的增加或减少;或特殊化合物例如甘油三酯的合成的增加。这样的参数可以通过本领域熟练技术人员已知的任何手段来测量,例如,光谱特性(例如,荧光、吸光度、折射率)、流体动力学(例如,形状)、色谱、或溶解度性质、膜片钳、电压敏感的染料、全细胞电流、放射性同位素外流、可诱导的标志物、GPCR的转录激活的变化;配体结合测定;电压、膜电位和电导率变化;离子流测定;细胞内第二信使诸如cAMP和三磷酸肌醇(IP3)的变化;细胞内钙水平的变化;神经递质释放等。
当G蛋白受体有活性时,其结合G蛋白(例如,Gq、Gs、Gi、Go)并刺激GTP与G蛋白的结合。然后G蛋白起GTP酶的作用并缓慢地将GTP水解为GDP,由此在正常条件下受体失活。G蛋白-介导的信号传导或GPCR活性可以使用测定***测量,所述测定***能够检测和/或测量GTP结合和/或GTP至GDP的水解。
Gs刺激酶腺苷酸环化酶。另一方面,Gi(和Go)抑制此酶。腺苷酸环化酶催化ATP至cAMP的转化。因此,与Gs蛋白偶联的构成性激活的GPCR与cAMP的细胞水平增加相关。另一方面,与Gi(和Go)蛋白偶联的激活的GPCR与cAMP的细胞水平降低相关。因此,检测cAMP的测定可以用来确定是否候选化合物例如是该受体的反相激动剂(即,这样的化合物将降低cAMP的水平)。可以利用本领域中已知的多种测量cAMP的方法;最优选的方法依靠在基于ELISA的格式中使用抗cAMP抗体。可以利用的另一种类型的测定是全细胞第二信使报告分子***测量。基因上的启动子驱动特定基因编码的蛋白的表达。环状AMP通过如下过程来驱动基因表达:促进cAMP-反应性DNA结合蛋白或转录因子(CREB)的结合,然后cAMP-反应性DNA结合蛋白或转录因子(CREB)在称为cAMP反应元件的特定位点处结合启动子并驱动基因的表达。可以构建报告分子***,其具有包含报告基因(例如,β-半乳糖苷酶或萤光素酶)前的多个cAMP反应元件的启动子。因此,构成性激活的Gs-连接的受体导致cAMP的积聚,然后cAMP激活基因并表达报告蛋白。报告蛋白诸如β-半乳糖苷酶或萤光素酶然后可以使用标准的生化测定来检测。
Gq和Go与酶磷脂酶C的激活相关,磷脂酶C的激活依次地水解磷脂PIP2,释放两个细胞内信使:二酰甘油(DAG)和肌醇1,4,5-三磷酸(IP3)。IP3的积累增加与Gq-和Go-相关受体的激活相关。检测IP3积累的测定可以用来确定是否候选化合物是,例如Gq-或Go-相关受体(即,这样的化合物将降低IP3水平)的反相激动剂。使用AP1受体测定也可以检测Gq-依赖性受体,因为Gq-依赖性磷脂酶C导致包含AP1元件的基因激活。
包括用潜在激活剂、抑制剂或调节剂处理的GPCR的样品或测定与不使用所述抑制剂、激活剂、或调节剂的对照样品相比较以检验抑制的程度。对照样品(未用抑制剂处理)被指定为100%的相对GPCR活性值。当相对于对照的GPCR活性值为约80%,优选50%,更优选25%时实现了对GPCR的抑制。当相对于对照(未用激活剂处理)的GPCR活性值为110%,更优选150%,更优选200-500%(即,相对于对照的2倍-5倍高),更优选1000-3000%以上时实现了对GPCR的激活。
所述化合物对GPCR多肽的功能的作用可以通过检验上述任一种参数来测量。影响GPCR活性的任何合适的生理学变化可以用来评估一种化合物对GPCR和天然配体-介导的GPCR活性的影响。当使用完整细胞或动物确定功能性结果时,也可以测量多种效应诸如递质释放、激素释放、已知和未表征的遗传标志物两者的转录变化(例如,northern印迹)、细胞代谢变化诸如细胞生长或pH变化,和细胞内第二信使Ca2+、IP3或cAMP的变化。
对于GPCR信号转导和测定信号转导的方法的综述,参见,例如,Methodsin Enzymology,vols.237和238(1994)和volume 96(1983);Bourne等,Nature10:349:11727(1991);Bourne等,Nature 348:12532(1990);Pitcher等,Annu.Rev.Biochem.67:65392(1998)。
如上所述使用GPCR多肽(重组的或天然存在的)测试GPCR活性的调节剂。所述蛋白可以被分离,在细胞中表达,在来源于细胞的膜中表达,在组织中或在动物中表达。例如,脂肪细胞、免疫***的细胞、转化细胞、或膜可以用来检测上述的GPCR多肽。使用本文所述的一种体外或体内测定测试调节作用。信号转导也可以在体外使用嵌合分子利用溶解态或固态反应来检验,所述嵌合分子诸如与异源信号转导结构域共价连接的受体的细胞外结构域,或与受体的跨膜或胞浆结构域共价连接的异源细胞外结构域。此外,目的蛋白的配体-结合结构域可以在体外在溶解态或固态反应中用来测定配体结合。
与GPCR、结构域或嵌合蛋白的配体结合可以以多种格式被检测。结合可以在溶液、在附着于固相的双层膜、在脂质单层、或在囊泡中进行。典型地,在本发明的测定中,天然配体与其受体的结合在候选调节剂的存在下测量。备选地,候选调节剂的结合可以在天然配体的存在下测量。经常使用竞争性测定,该测定测量化合物竞争天然配体与受体的结合的能力。可通过测量例如,光谱特征(例如,荧光、吸光度、折射率)的变化、流体动力学(例如,形状)变化、或色谱或溶解度性质的变化来测试结合。
受体-G-蛋白相互作用也可以用来测定调节剂。例如,在缺少GTP时,激活剂诸如天然配体的结合将导致G蛋白(所有三个亚基)与受体形成紧密的复合物。此复合物可以以如上所述的多种方式检测。这样的测定可以修改成搜寻抑制剂。例如,配体可以在缺少GTP的条件下加入至受体和G蛋白以形成紧密复合物。通过看到受体-G蛋白复合物的解离可以鉴定抑制剂或拮抗剂。在GTP的存在下,G蛋白的α亚基从其他两个G蛋白亚基的释放作为激活的判定标准。
激活或抑制的G-蛋白又将改变下游效应器诸如蛋白、酶和通道的性质。经典的实例是在视觉***中转导素(transducin)对cGMP磷酸二酯酶的激活,刺激性G-蛋白对腺苷酸环化酶的激活,Gq和其他同源G蛋白对磷脂酶C的激活,和Gi和其他G蛋白对不同通道的调节。也可以检验下游结果诸如磷脂酶C导致的二酰甘油和IP3的生成,和依次地,例如由IP3(下面进一步讨论)导致的钙动员。因此,可以评价调节剂刺激或抑制配体-介导的下游效应的能力。可以评估候选调节剂抑制钙动员的能力,所述钙动员由烟酸或激活该受体的相关化合物诱导。
在其他实施例中,化合物抑制GPCR活性的能力可以使用下游测定来确定,所述下游测定诸如测量脂肪细胞中的脂解作用,游离脂肪酸从脂肪组织的释放,和脂蛋白脂肪酶活性。这可以例如,使用竞争测定来完成,在所述竞争测定中不同量的化合物与GPCR一起孵育。
因此调节剂也可以使用涉及β-抑制蛋白募集的测定来鉴定。β-抑制蛋白起调节性蛋白的作用,其在未激活的细胞中广泛地分布在胞质中。与合适的GPCR的配体结合与β-抑制蛋白从胞质至细胞表面的再分布有关,在细胞表面处其与GPCR缔合。因此,受体激活和候选调节剂对配体-诱导的受体激活的作用可以通过监测β-抑制蛋白募集至细胞表面来评估。这经常通过将标记的β-抑制蛋白融合蛋白(例如,β-抑制蛋白-绿色荧光蛋白(GFP))转染至细胞中并使用共聚焦显微镜监测其分布来进行(参见,例如,Groarke等。J.Biol.Chem.274(33):2326369(1999))。
受体内化测定也可以用来评估受体功能。在配体结合时,G-蛋白偶联受体-配体复合物从质膜通过披网格蛋白小泡(clathrin-coated vesicle)胞吞过程被内化;受体上的内化基序结合衔接蛋白复合物(adaptor protein complexes)并介导激活受体募集至披网格蛋白小窝(clathrin-coated pits)和小泡。因为仅激活的受体被内化,因此有可能通过测定被内化受体的量来监测配体-受体接合。在一种测定格式中,细胞用放射性标记的受体瞬时转染,并孵育合适的时间段以允许配体结合和受体内化。此后,通过用酸溶液洗涤去除表面结合的放射性,将细胞溶解,并将内化的放射性量计算为配体结合的百分比。参见,例如,Vrecl等,Mol.Endocrinol.12:181829(1988)和Conway等,J.Cell Physiol.189(3):34155(2001)。另外,受体内化方法已经允许实时光学测量活细胞中GPCR与其他细胞成分的相互作用(参见,例如,Barak等,Mol.Pharmacol.51(2)17784(1997))。可以通过比较对照细胞和与候选化合物接触的细胞中的受体内化水平来鉴定调节剂。
可以用来评价活细胞中GPCR-蛋白相互作用的另一种技术涉及生物发光共振能量转移(BRET)。关于BRET的详细讨论可以参见Kroeger等,J.Biol.Chem.,276(16):1273643(2001)。
受体-刺激的鸟苷5′-O-(γ-硫代)-三磷酸盐([35S]GTPγS)与G-蛋白的结合也可以用作用于评价GPCR的调节剂的测定。[35S]GTPγS是放射性标记的GTP类似物,其对所有类型的G-蛋白均具有高亲和性,其可以以高比放射性使用,并且尽管处于未结合形式时不稳定,但当与G-蛋白结合时不发生水解。因此,有可能利用例如,液体闪烁计数器通过将刺激的与未刺激的[35S]GTPγS结合相比较来定量评估配体结合的受体。受体-配体相互作用的抑制剂将导致[35S]GTPγS结合减少。对[35S]GTPγS结合测定的描述见Traynor和Nahorski,Mol.Pharmacol.47(4):84854(1995)以及Bohn等,Nature 408:72023(2000)。
也可以测定调节剂影响配体-诱导的离子流的能力。可以通过测定表达GPCR的细胞或膜的极化(例如,电位)的变化来评估离子流。一种测定细胞极化变化的手段是通过使用电压钳和膜片钳技术测量电流变化(从而测量极化的变化),例如,采用″细胞贴附(cell-attached)″模式,″膜内面向外(inside-out)″模式和“全细胞”模式(参见,例如,Ackerman等,New Engl.J.Med.336:15751595(1997))。使用标准方法便利地测定全细胞电流(参见,例如,Hamil等,PFlugers.Archiv.391:85(1981)。其他已知的测定包括:放射性标记离子流测和使用电压敏感染料的荧光测定(参见,例如,Vestergarrd-Bogind等,J.Membrane Biol.88:6775(1988);Gonzales & Tsien,Chem.Biol.4:269277(1997);Daniel等,J.Pharmacol.Meth.25:185193(1991);Holevinsky等,J.Membrane Biology 137:5970(1994))。通常,待测化合物以1pM-100mM的范围存在。
优选的用于G-蛋白偶联受体的测定包括用离子或电压敏感染料负载以报告受体活性的细胞。用于测定此类受体的活性的测定也可以使用已知的用于本文公开的其他G-蛋白偶联受体和天然配体的激动剂和拮抗剂作为阴性或阳性对照以评估测试化合物的活性。在鉴定调节性化合物(例如,激动剂,拮抗剂)的测定中,分别使用离子敏感或膜电压荧光指示剂监测胞质中的离子水平或膜电压的变化。在可以采用的离子敏感指示剂和电压探针中是Molecular Probes(分子探针)1997目录中公开的那些。对于G-蛋白偶联受体,在选择的测定中可以使用杂性G-蛋白(promiscuous G-proteins)诸如Gα15和Gα16(Wilkie等,Proc.Natl Acad.Sci.USA 88:1004910053(1991))。这样的杂性G-蛋白允许将大范围的受体偶联至异源细胞中的信号转导途径。
如上所述,配体结合导致的受体激活典型地启动随后的细胞内事件,例如,第二信使诸如IP3的增加,从而释放细胞内钙离子储库。一些G-蛋白偶联受体的激活通过磷脂酶C-介导的磷脂酰肌醇的水解刺激三磷酸肌醇(IP3)的形成(Berridge & Irvine,Nature 312:31521(1984))。IP3接下来刺激细胞内钙离子储库的释放。因此,细胞质钙离子水平的变化,或第二信使水平诸如IP3的变化可以用来评估G-蛋白偶联受体功能。表达这样的G-蛋白偶联受体的细胞可以显示增加的细胞质钙水平,其是细胞内储库和经由离子通道激活两者贡献的结果,尽管没有必要在不含钙的缓冲液(任选地补充螯合剂诸如EGTA)中进行所述测定从而辨别来自内储库的钙释放导致的荧光反应,但在这种情况下可能是合乎需要的。
其他测定可以涉及测定受体的活性,当被配体结合激活时,受体的活性通过激活或抑制下游效应器诸如腺苷酸环化酶导致细胞内环核苷酸例如,cAMP或cGMP水平的变化。在一个实施方案中,细胞内cAMP或cGMP的变化可以使用免疫测定来测量。Offermanns & Simon,J.Biol.Chem.270:1517515180(1995)中所述的方法可以用来测定cAMP的水平。还可以使用Felley-Bosco等,Am.J.Resp.Cell and Mol.Biol.11:159164(1994)中所述的方法来测定cGMP的水平。此外,用于测量cAMP和/或cGMP的测定试剂盒记载在美国专利号4,115,538中,该专利通过引用合并入本文。
在另一个实施方案中,可以根据美国专利号5,436,128分析磷脂酰肌醇(PI)水解,该专利通过引用合并入本文。简言之,该测定涉及用3H-肌醇标记细胞48小时以上。标记的细胞用化合物处理1小时。溶解处理的细胞,并在氯仿-甲醇-水中萃取,之后通过离子交换色谱分离磷酸肌醇并通过闪烁计数定量。通过计算存在激动剂时的每分钟计数(cpm)与存在缓冲液对照时的cpm的比率来确定刺激倍数。同样,通过计算存在拮抗剂时的cpm与存在缓冲液对照(可以包含或不包含激动剂)时的cpm的比率来确定抑制倍数。
在另一个实施方案中,可以测量转录水平以评估测试化合物对配体诱导的信号转导的作用。在天然配体的存在下包含目的蛋白的宿主细胞与测试化合物接触足以引起任何相互作用的时间,然后测量基因表达的水平。引起这样的相互作用的时间量可以通过经验来确定,诸如通过操作一定的时程并测量作为时间的函数的转录水平。可以通过使用本领域熟练技术人员已知适合的任何方法来测量转录量。例如,可以使用northern印迹检测目的蛋白的mRNA表达或可以使用免疫测定鉴定它们的多肽产物。备选地,可以如美国专利号5,436,128中所述使用基于转录的采用报告基因的测定,该专利通过引用合并入本文。报告基因可以是,例如,氯霉素乙酰转移酶,萤火虫萤光素酶,细菌萤光素酶,β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。此外,目的蛋白可以经由与第二报告子诸如绿色荧光蛋白连接而用作间接报告子(参见,例如,Mistili & Spector,NatureBiotechnology 15:961964(1997))。
然后将转录量与在同一细胞中在缺少测试化合物的条件下的转录量相比较,或其可以与缺少该目的蛋白的基本上相同的细胞中的转录量相比较。基本上相同的细胞可以来源于相同的细胞,从该细胞制备重组细胞,但该细胞没有通过引入异源DNA而被修饰。转录量的任何差异指示测试化合物已经以某种方式改变了目的蛋白的活性。
用GPCR拮抗剂处理的样品与不含测试化合物的包含天然配体的对照样品比较以检验调节的程度。对照样品(未用激活剂或抑制剂处理)被指定为100的相对GPCR活性值。当相对于对照的GPCR活性值为约90%,任选地50%,或任选地25%时实现了对GPCR的抑制。当相对于对照的GPCR活性值为110%,任选地150%,200-500%,或1000-2000%时实现了对GPCR的激活。
测定β-抑制蛋白/GRK-介导的信号转导
本发明的化合物激活经由AT1血管紧张素受体的β-抑制蛋白/GRK-介导的信号转导的能力可以使用本领域中已知用来检测经由AT1血管紧张素受体的β-抑制蛋白/GRK-介导的信号转导,或检测缺少所述信号转导的任何测定来测量。通常,激活的GPCR变成激酶的底物,激酶磷酸化受体的C-末端尾部(也可能磷酸化其他位点)。因此,拮抗剂将抑制32P从γ-标记的GTP转移至受体,这可以用闪烁计数器来测定。C-末端尾部的磷酸化将促进抑制蛋白样蛋白的结合,并将干扰G-蛋白的结合。激酶/抑制蛋白途径在许多GPCR受体的脱敏中具有关键的作用。
由GPCR介导的β-抑制蛋白功能的邻近事件是在配体结合和由GRK引起的受体磷酸化后募集至受体。因此,β-抑制蛋白募集的测量被用来确定配体对β-抑制蛋白功能的功效。
肽、衍生物和模拟物
在整个说明书和权利要求书中使用的术语“肽基(peptidyl)”和“肽类的(peptidic)”意在包括根据本实施方案的肽的活性衍生物、变体和/或模拟物。肽类化合物是根据本实施方案的肽的结构上类似的生物活性等价物。“结构上类似的生物活性等价物”是指具有充分类似于已鉴定的生物活性肽的结构从而产生基本上相当的疗效的结构的肽基化合物。例如,来源于肽的氨基酸序列的肽类化合物,或具有肽的氨基酸序列主链的肽类化合物被认为是该肽的结构上类似的生物活性等价物。
术语“变体”是指其中与蛋白或肽的氨基酸序列相比存在一个或多个氨基酸置换、缺失和/或***的蛋白或多肽,并且其包括蛋白或肽的天然存在的等位基因变体或选择性剪接变体(alternative splice variant)。术语“变体”包括用一个或多个相似的或同源的氨基酸或不相似的氨基酸置换肽序列中的一个或多个氨基酸。优选的变体包括在一个或多个氨基酸位置处的丙氨酸置换。其他优选的置换包括保守置换,其对蛋白的总净电荷、极性或疏水性有很少的影响或没有影响。保守置换在下表中给出。根据一些实施方案,CK多肽与优选实施方案的氨基酸或氨基酸类似物序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、88%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
保守氨基酸置换
下表给出了氨基酸置换的另一张图表:
原始残基 | 置换 |
Ala | Gly;Ser |
Arg | Lys |
Asn | Gln;His |
Asp | Glu |
Cys | Ser |
Gln | Asn |
Glu | Asp |
Gly | Ala;Pro |
His | Asn;Gln |
Ile | Leu;Val |
Leu | Ile;Val |
Lys | Arg;Gln;Glu |
Met | Leu;Tyr;Ile |
Phe | Met;Leu;Tyr |
Ser | Thr |
Thr | Ser |
Trp | Tyr |
Tyr | Trp;Phe |
Val | Ile;Leu |
其他变体可以由较少的保守氨基酸置换组成,诸如选择对下列作用较显著不同的残基:(a)保持置换区域中的多肽主链的结构,例如,保持为片层或螺旋构象,(b)保持靶位点处分子的电荷或疏水性,或(c)保持侧链的体积。通常期望对功能有较显著作用的置换是其中(a)甘氨酸和/或脯氨酸被另一氨基酸置换或缺失或***;(b)亲水性残基,例如,丝氨酰基或苏氨酰基置换(或被置换为)疏水性残基,例如,亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基;(c)半胱氨酸残基置换(或被置换为)任何其他残基;(d)具有带正电荷的侧链的残基,例如,赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基置换(或被置换为)带有负电荷的残基,例如,谷氨酰基或天冬氨酰基;或(e)带有巨大侧链的残基,例如,苯丙氨酸,置换(或被置换为)不具有这样的侧链的残基,例如,甘氨酸。其他变体包括涉及用来产生一个或多个新的糖基化和/或磷酸化位点的那些,或涉及用来使一个或多个现有的糖基化和/或磷酸化位点缺失的那些。变体包括糖基化位点、蛋白水解切割位点和/或半胱氨酸残基处的至少一个氨基酸置换。变体还包括具有在连接肽上的蛋白或肽氨基酸序列之前或之后的额外的氨基酸残基的蛋白和肽。术语“变体”还包涵具有本发明的蛋白/肽的氨基酸序列的多肽,其在氨基酸序列的3′或5′端或两端的侧面具有至少一个和至多达25(例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20)个额外的氨基酸。
术语“变体”还指通过普遍用来比较两个多肽的氨基酸位置相似性的标准方法确定与本发明的蛋白的氨基酸序列至少60-99%相同(例如,60、65、70、75、80、85、90、95、98、99,或100%,包括60%和99%)的蛋白。两个蛋白之间的相似性或同一性程度可以容易地通过已知方法计算。优选的确定同一性的方法被设计给出被测序列之间的最大匹配。确定同一性和相似性的方法编撰至公共可获得的计算机程序中。变体当与比较蛋白或肽比较时典型地具有一个或多个(例如,2、3、4、5个,等)氨基酸置换、缺失和/或***,视情况而定。
本发明的化合物包括具有本文所述的通式之一的化合物,除其衍生物和/或模拟物以外。
术语“衍生物”是指已经被化学修饰的化学修饰的蛋白或多肽,所述化学修饰通过天然过程诸如加工和其他翻译后修饰,以及通过化学修饰技术,例如,通过添加一个或多个聚乙二醇分子、糖、磷酸盐和/或其他此类分子(其中所述一个或多个分子与野生型蛋白不是天然连接的)进行。衍生物包括盐类。这样的化学修饰广泛地记载在基本教科书和更详尽的专著,以及在大量的研究文献中,并且它们是本领域熟练技术人员所熟知的。要理解的是相同类型的修饰可以在指定蛋白或多肽中的数个位点处以相同或不同的程度存在。此外,指定蛋白或多肽可以包含许多类型的修饰。修饰可以在蛋白或多肽中的任何位置存在,包括肽主链,氨基酸侧链,和氨基或羧基末端。修饰包括,例如,乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素结构部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸盐的形成、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧基化、羟基化和ADP-核糖基化、硒化、硫酸化、转运-RNA介导的向蛋白添加氨基酸诸如精氨酰化和泛素化。参见,例如,Proteins-Structure And Molecular Properties(蛋白-结构和分子性质),第二版,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New York(1993)以及Wold,F.,“Posttranslational Protein Modifications:Perspectives andProspects(翻译后蛋白修饰:展望和前景),”1-12页,于Posttranslational CovalentModification Of Proteins(蛋白的翻译后共价修饰),B.C.Johnson,编辑,Academic Press,New York(1983);Seifter等,Meth.Enzymol.182:626-646(1990)和Rattan等,“Protein Synthesis:Posttranslational Modifications and Aging(蛋白合成:翻译后修饰和衰老),”Ann.N.Y. Acad.Sci.663:48-62(1992)。术语“衍生物”包括导致蛋白或多肽变成支链的或带有支链或不带有支链的环状的化学修饰。环状的、支链的和带支链的环状的蛋白或多肽可以由翻译后天然过程产生,并且也可以完全通过合成方法制备。
根据一些实施方案,本发明的化合物可以任选地包括这样的化合物,其中N-末端被衍生为-NRR1基团;为-NRC(O)R基团;衍生为-NRC(O)OR基团;衍生为-NRS(O)2R基团;衍生为-NHC(O)NHR基团,其中R和R1是氢或低级烷基,条件是R和R1不均是氢;衍生为琥珀酰亚胺基;衍生为苄氧羰基-NH-(CBZ-CH-)基团;或衍生为在苯环上具有1-3个取代基的苄氧羰基-NE-基团,所述取代基选自由低级烷基、低级烷氧基、氯和溴组成的组。
根据一些实施方案,本发明的化合物可以任选地包括这样的化合物,其中C末端被衍生为-C(O)R2,其中R2选自由低级烷氧基和-NR3R4组成的组,其中R3和R4独立地选自由氢和低级烷基组成的组。
术语“模拟肽”或“模拟物”是指模拟肽或蛋白的生物活性但在化学性质上不再是肽类(即,它们不再包含任何肽键(即,氨基酸之间的酰胺键))的生物活性化合物。在此,术语模拟肽以较宽泛的含义使用,其包括在性质上不再完全是肽类的的分子,包括假-肽(pseudo-peptide)、半-肽(semi-peptide)和类肽(peptoid)。此较宽泛含义的模拟肽(其中部分肽被缺少肽键的结构替换)的实例在下面描述。无论完全或部分非-肽,根据实施方案的模拟肽提供反应性化学结构部分的空间排列,所述空间排列与该模拟肽所模拟的肽中的活性基团的三维排列非常类似。作为此类似的活性位点几何位置的结果,该模拟肽对生物***的作用类似于该肽的生物活性。
包含在本发明的组合物中的肽和模拟肽的长度为6-25,6-20、6-15、6-10、6-9、6-8、7-25、7-20、7-15、7-12、7-10、7-9、7-8、8-25、8-20、8-15、8-12、8-10、8-9、9-25、9-20、9-18、9-15、9-14、9-12、10-25、10-20、10-15、10-14、10-12、12-25或12-20个氨基酸或氨基酸类似物。
实施方案的模拟肽优选在三维形状和生物活性两方面均基本上类似于本文所述的肽。根据一些实施方案,本发明的模拟肽在本发明的化合物的一端或两端处均具有保护基团,和/或其一个或多个肽键被非肽键替换。这样的修饰可以使该化合物与该化合物本身相比不太易受蛋白水解裂解。例如,一个或多个肽键可以被可选类型的共价键(例如,碳-碳键或酰基键)替换。模拟肽也可以加入氨基末端或羧基末端保护基团诸如叔丁氧羰基、乙酰基、烷基、琥珀酰基、甲氧琥珀酰基、环庚基、己二酰基、壬二酰基(azelayl)、丹磺酰基、苄氧羰基、芴甲氧羰基、甲氧壬二酰基(methoxyazelayl)、甲氧己二酰基、甲氧环庚基和2,4,-二硝基苯基,从而使得模拟物不太易于被蛋白水解。非肽键和羧基-或氨基末端保护基团可以单独使用或组合使用从而使模拟物与相应的肽/化合物相比不太易于被蛋白水解。另外,可以实施D-氨基酸对正常L-立体异构体的置换,例如,以增加分子的半衰期。
因此,根据一些实施方案,本发明的化合物可以任选地包括假肽键(pseudopeptide bond),其中一个或多个肽基[-C(O)NR-]键(肽键)已经被替换肽键(-CO-NH-)的非肽基键诸如-CH2-NH-、-CH2-S-、-CH2-SO-、-CH2-SO2-、-NH-CO-、或-CH=CH-替换。根据一些实施方案,本发明的化合物可以任选地包括假肽键,其中一个或多个肽基[-C(O)NR-]键(肽键)已经被非肽基键诸如-CH2-氨基甲酸酯键[-CH2-OC(O)NR-];磷酸酯键;-CH2-磺酰胺[-CH2-S(O)2NR-]键;脲[-NHC(O)NH-]键;-CH2-仲胺键;或烷基化肽基键[-C(O)NR6-其中R6是低级烷基]替换。优选的模拟物中的0个本发明的-C(O)NH-键至所有-C(O)NH-键被假肽替换。
本领域中已知的从结构上修饰肽以产生模拟肽的方法的实例包括将主链手性中心倒置产生D-氨基酸残基结构,所述D-氨基酸残基结构,尤其是在N-末端处,可以导致对蛋白水解降解的稳定性增强,而不会不利地影响活性。一个实例在文章“Tritriated D-ala1-Peptide T Binding”,Smith C.S.等,DrugDevelopment Res.,15,pp.371-379(1988)中给出。第二种方法为稳定性而改变环状结构,诸如N至C链间酰亚胺和内酰胺(Ede等,于Smith和Rivier(编辑)“Peptides:Chemistry and Biology(肽:化学和生物学)”,Escom,Leiden(1991),268-270页)。此方法的一个实例是构象限制的胸腺五肽样化合物,诸如美国专利号4,457,489(1985),Goldstein,G.等中公开的那些,该专利的全部公开内容通过引用合并入本文。第三种方法是用假肽键替换肽中的肽键,从而赋予耐蛋白水解性。包含假肽键诸如-CH2-NH-、-CH2-S-、-CH2-SO-、-CH2-SO2-、-NH-CO-或-CH=CH-的肽的合成使用有机化学的标准方法通过溶液方法或与固相合成组合的综合方法进行。因此,例如,-CH2-NH-键的引入通过根据FEHRENTZ和CASTRO(Synthesis(合成),676-678,1983)所述的技术在溶液中制备醛Fmoc-NH-CHR-CHO,并根据SASAKI和COY(Peptides(肽),8,119-121,1988)所述的技术在固相上,或在溶液中,将其与正在生长的肽链缩合来实现。
药物组合物/制剂
用于本发明中的药物组合物可以通过标准技术使用一种或多种生理学可接受的载体或赋形剂来配制。在本发明的优选实施方案中,制剂可以包含缓冲液和/或防腐剂。化合物和它们的生理学可接受的盐和溶剂化物可以配制在包含一种或多种药学可接受的载体的赋形剂中用于通过任何合适的途径给药,包括经吸入、局部、经鼻、经口、胃肠外(例如,静脉内、腹膜内、膀胱内或鞘内)或直肠,赋形剂的比例通过肽的溶解度和化学性质、选择的给药途径和标准生物学实践来确定。
根据一些实施方案,提供药物组合物,其包含有效量的一种或多种本发明的化合物以及例如,药学可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、辅剂和/或其他载体。这样的组合物包含各种缓冲液内容物(例如,TRIS或其他胺,碳酸盐,磷酸盐,氨基酸,例如,盐酸甘氨酰胺(尤其在生理学pH范围内)、N-甘氨酰甘氨酸、磷酸钠或磷酸钾(二碱式、三碱式)等,或TRIS-HCl或乙酸盐)、pH和离子强度的稀释液;添加剂诸如洗涤剂和增溶剂(例如,表面活性剂诸如Pluronics、Tween 20、Tween 80(聚山梨醇酯80)、Cremophor,多元醇诸如聚乙二醇、丙二醇等)、抗氧化剂(例如,抗坏血酸、焦亚硫酸钠(sodium metabisulfite))、防腐剂(例如,Thimersol、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯等)和填充物质(例如,糖类诸如蔗糖、乳糖,甘露醇,聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮或葡聚糖,等);和/或将材料结合至聚合化合物诸如聚乳酸、聚乙醇酸等的粉粒制剂中或结合至脂质体中。也可以使用透明质酸。这样的组合物可以用来影响本发明的化合物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。参见,例如,Remington′sPharmaceutical Sciences(雷明顿制药科学),第18版(1990,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.18042)1435-1712页,该书通过引用合并入本文中。例如,该组合物可以以液体形式制备,或可以采取干粉形式,诸如冻干形式。施用这样的组合物的具体方法在下面描述。
在本发明的制剂中包含缓冲液的情况下,缓冲液选自由下列各项组成的组:乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和三(羟甲基)-氨基甲烷(aminomethan),或它们的混合物。这些具体的缓冲液中的每一种构成本发明的备选实施方案。在本发明的优选实施方案中,缓冲液是甘氨酰甘氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠或它们的混合物。
在本发明的制剂中包含药学可接受的防腐剂的情况下,防腐剂选自由下列各项组成的组:苯酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯乙醇、苯甲醇、氯代丁醇和thiomerosal,或它们的混合物。这些具体的防腐剂中的每一种构成本发明的备选实施方案。在本发明的优选实施方案中,防腐剂是苯酚或间甲酚。
在本发明的进一步的实施方案中,防腐剂以约0.1mg/ml-约50mg/ml的浓度,更优选约0.1mg/ml-约25mg/ml的浓度和最优选约0.1mg/ml-约10mg/ml的浓度存在。
防腐剂在药物组合物中的应用是熟练技术人员所熟知的。为了方便起见,参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy(制药科学和实践),第19版,1995。
在本发明的进一步的实施方案中,制剂还可以包含螯合剂,其中所述螯合剂可以选自乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸和天冬氨酸的盐,和它们的混合物。这些具体的螯合剂中的每一种构成本发明的备选实施方案。
在本发明的进一步的实施方案中,螯合剂以0.1mg/ml-5mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步的实施方案中,螯合剂以0.1mg/ml-2mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步的实施方案中,螯合剂以2mg/ml-5mg/ml的浓度存在。
螯合剂在药物组合物中的应用是熟练技术人员所熟知的。为了方便起见,参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy(制药科学和实践),第19版,1995。
在本发明的进一步的实施方案中,制剂还可以包含稳定剂,所述稳定剂选自由下列各项组成的组:高分子量聚合物或低分子量聚合物,其中所述稳定剂包括,但不限于,聚乙二醇(例如,PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、不同的盐(例如,氯化钠)、L-甘氨酸、L-组氨酸、咪唑、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸和它们的混合物。这些具体的稳定剂中的每一种构成本发明的备选实施方案。在本发明的优选实施方案中,稳定剂选自由L-组氨酸、咪唑和精氨酸组成的组。
在本发明的进一步的实施方案中,高分子量聚合物以0.1mg/ml-50mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步的实施方案中,高分子量聚合物以0.1mg/ml-5mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步的实施方案中,高分子量聚合物以5mg/ml-10mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步的实施方案中,高分子量聚合物以10mg/ml-20mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步的实施方案中,高分子量聚合物以20mg/ml-30mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步的实施方案中,高分子量聚合物以30mg/ml-50mg/ml的浓度存在。
在本发明的进一步的实施方案中,低分子量聚合物以0.1mg/ml-50mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步的实施方案中,低分子量聚合物以0.1mg/ml-5mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步的实施方案中,低分子量聚合物以5mg/ml-10mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步的实施方案中,低分子量聚合物以10mg/ml-20mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步的实施方案中,低分子量聚合物以20mg/ml-30mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步的实施方案中,低分子量聚合物以30mg/ml-50mg/ml的浓度存在。
稳定剂在药物组合物中的应用是熟练技术人员所熟知的。为了方便起见,参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy(制药科学和实践),第19版,1995。
在本发明的进一步的实施方案中,本发明的制剂还可以包含表面活性剂,其中表面活性剂可以选自洗涤剂、乙氧基化蓖麻油、聚乙二醇化甘油酯、乙酰化单甘酯、失水山梨醇脂肪酸酯、泊洛沙姆(poloxamers)诸如188和407、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯衍生物诸如烷基化和烷氧基化衍生物(吐温类,如吐温-20、吐温-80)、单甘酯或其乙氧基化衍生物、甘油二酯或其聚氧乙烯衍生物、甘油、胆酸或其衍生物、卵磷脂、醇类和磷脂、甘油磷酸酯类(卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰丝氨酸)、甘油糖脂(半乳糖吡喃糖苷)、鞘氨醇磷脂(鞘磷脂)和鞘糖脂(神经酰胺、神经节苷脂)、DSS(多库酯钠、多库酯钙、多库酯钾、SDS(十二烷基硫酸钠或月桂基硫酸钠)、二棕榈酰磷脂酸、辛酸钠、胆汁酸和其盐以及甘氨酸或牛磺酸缀合物、熊去氧胆酸、胆酸钠、脱氧胆酸钠、磺胆酸钠、甘氨胆酸钠、N-十六烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙烷;阴离子(烷基-芳基-磺酸盐)单价表面活性剂,棕榈酰溶血磷脂酰-L-丝氨酸,溶血磷脂(例如,乙醇胺、胆碱、丝氨酸或苏氨酸的1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酯),溶血磷脂酰和磷脂酰单键的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧基(烷基醚)衍生物,例如,溶血磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱的月桂酰基和肉豆蔻酰基衍生物,和极性首基(即胆碱、乙醇胺、磷脂酸、丝氨酸、苏氨酸、甘油、肌醇)的修饰,和带正电荷的DODAC、DOTMA、DCP、BISHOP,溶血磷脂酰丝氨酸和溶血磷脂酰苏氨酸;两性离子表面活性剂(例如N-烷基-N,N-二甲基铵基-1-丙磺酸酯、3-胆酰胺基-1-丙基二甲基铵基-1-丙磺酸酯、十二烷基磷酸胆碱、肉豆蔻酰基溶血磷脂酰胆碱、鸡蛋溶血卵磷脂);阳离子表面活性剂(季铵碱)(例如,十六烷基-三甲基溴化铵、西吡氯铵);非离子表面活性剂,聚氧化乙烯/聚氧化丙烯嵌段共聚物(Pluronics/Tetronics,Triton X-100,十二烷基β-D-吡喃葡萄糖苷)或聚合表面活性剂(吐温40、吐温80、Brij-35),夫西地酸衍生物-(例如,牛磺二氢褐霉素钠等),长链脂肪酸及其C6-C12盐(例如,油酸和辛酸),酰基肉毒碱和衍生物,赖氨酸、精氨酸或组氨酸的Nα-酰化衍生物,赖氨酸或精氨酸的侧链酰化衍生物,包含赖氨酸、精氨酸或组氨酸和一个中性或酸性氨基酸的任意组合的二肽的Nα-酰化衍生物,包含一个中性氨基酸和两个带电荷的氨基酸的任意组合的三肽的Nα-酰化衍生物,或所述表面活性剂可以选自由咪唑啉衍生物,或其混合物组成的组。这些具体的表面活性剂中的每一种构成本发明的备选实施方案。
表面活性剂在药物组合物中的应用是熟练技术人员所熟知的。为了方便起见,参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy(制药科学和实践),第19版,1995。
药学可接受的甜味剂优选地包含至少一种强甜味剂(intense sweetener)诸如糖精、糖精钠或糖精钙、阿斯巴甜、醋磺内酯钾、环拉酸钠、阿力甜、二氢查耳酮甜味剂、应乐果甜蛋白(monellin)、蛇菊苷或三氯蔗糖(4,1′,6′-三氯-4,1′,6′-三脱氧半乳蔗糖),优选糖精、糖精钠或糖精钙,和任选地散装甜味剂(bulksweetener)诸如山梨醇、甘露醇、果糖、蔗糖、麦芽糖、异麦芽酮糖醇(isomalt)、葡萄糖、氢化葡萄糖浆、木糖醇、焦糖或蜂蜜。
强甜味剂适宜地以低浓度使用。例如,在糖精钠的情况下,浓度范围可以基于最终制剂的总体积为0.04%-0.1%(w/v),且在低剂量制剂中优选为约0.06%,在高剂量制剂中为约0.08%。散装甜味剂可以以较大的量有效地使用,其范围为约10%-约35%,优选约10%-15%(w/v)。
本发明的制剂可以通常常规技术制备,例如,如Remington′s PharmaceuticalSciences(雷明顿制药科学),1985中所述,或见Remington:The Science andPractice of Pharmacy(制药科学和实践),第19版,1995,其中制药工业的这些常规技术涉及根据需要溶解和混合各种成分从而得到所需的终产物。
短语“药学可接受的”或“治疗可接受的”是指生理学可耐受的分子实体和组合物,它们优选当施用于人时一般不产生***反应或类似的不良反应,诸如嘈杂、头晕等。优选,如本文所使用的术语“药学可接受的”是指被联邦政府或州政府的管理机构所批准或列举在美国药典中或其他普遍公认的药典中(例如,Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿制药科学),Mack PublishingCo.(A.R.Gennaro edit.1985))用于动物,和更特别地用于人。
本发明的化合物的给药可以使用本领域中已知的任何方法进行。例如,给药可以是经皮的、胃肠外的、静脉内的、动脉内的、皮下的、肌内的、颅内的、眶内的、眼部的、心室内的、囊内的、脊柱内的、脑池内的、腹膜内的、脑室内的、鞘内的、鼻内的、气溶胶、通过栓剂,或口服给药。优选地,本发明的药物组合物可以用于注射给药,或口服给药、肺部给药、鼻部给药、经皮给药、眼部给药。
对于口服给药,肽或其治疗可接受的盐可以配制在单位剂型中诸如胶囊或片剂。片剂或胶囊可以通过常规手段使用药学可接受的赋形剂制备,所述赋形剂包括结合剂,例如,预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、或羟丙基甲基纤维素;填料,例如,乳糖、微晶纤维素,或磷酸氢钙;润滑剂,例如,硬脂酸镁、滑石,或二氧化硅;崩解剂,例如,马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠;或湿润剂,例如,十二烷基硫酸盐。片剂可以通过本领域中熟知的方法包被。用于口服给药的液体制剂可以采取例如,溶液、糖浆或悬液的形式,或者它们作为干燥产物存在,用于在使用前与水或其他合适的媒介物一起配制。这种液体制剂可以通常常规手段使用药学可接受的添加剂制备,例如,助悬剂,例如,山梨醇糖浆、纤维素衍生物,或氢化食用脂;乳化剂,例如,卵磷脂或***胶;非水媒介物,例如,杏仁油、油酯(oily ester)、乙醇、或分馏的植物油;和防腐剂,例如,对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸。制剂也可以根据需要包含缓冲盐、调味剂、着色剂和/或甜味剂。如果需要,用于口服给药的制剂可以适当地配制成获得活性化合物的可控释放。
对于局部给药,肽可以配制在药学可接受的媒介物中,所述媒介物包含0.1-10%,优选0.5-5%(多种)活性化合物。这样的制剂可以为乳膏、洗剂、舌下片剂、气溶胶和/或乳剂的形式,并且可以包含在基质或储库型透皮或口腔贴片中,如本领域中常规用于此目的的那样。
对于胃肠外给药,本发明的化合物以具有药学可接受的媒介物或载体的组合物通过静脉内、皮下或肌内注射给药。所述化合物可以配制用于通过注射胃肠外给药,例如,通过推注或连续输注。用于注射的制剂可以以单位剂型存在,例如,在添加有防腐剂的安瓿或多剂量容器中。该组合物可以采取诸如在油性或水性媒介物中的悬液、溶液或乳液的形式,并且可以包含配方剂,例如,混悬剂、稳定剂和/或分散剂。备选地,活性成分可以为粉末形式,用于在使用前与合适的媒介物,例如,无菌无热原水一起配制。
对于通过注射给药,优选使用处于无菌水性媒介物中的溶液中的(多种)化合物,所述溶液也可以包含其他溶质诸如缓冲剂或防腐剂以及足量的药学可接受的盐或葡萄糖从而使溶液变得等渗。在一些实施方案中,本发明的药物组合物可以与药学可接受的载体一起配制以提供用于注射给药的无菌溶液或悬液。特别地,注射液可以以常规形式,作为液体溶液或悬液,适合于在注射前为液体的溶液或悬液的固体形式或作为乳液制备。合适的赋形剂是例如,水、盐水、右旋糖、甘露醇、乳糖、卵磷脂、白蛋白、谷氨酸钠、盐酸半胱氨酸等。另外,如果需要,可注射的药物组合物可以包含小量的无毒辅助物质,诸如湿润剂、pH缓冲剂等。如果需要,可以使用吸收增强制剂(例如,脂质体)。合适的药用载体记述在E.W.Martin的“Remington′s pharmaceutical Sciences(雷明顿制药科学)”中。
对于通过吸入给药,化合物可以适宜地以气溶胶喷雾制剂的形式利用合适的抛射剂,例如,二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳,或其他合适的气体,从加压包装或喷雾器中递送。在加压气溶胶的情况下,剂量单位可以通过设置阀门来确定,从而递送经计量的用量。用于吸入器或吹入器中的例如明胶的胶囊和药筒可以配制为含有化合物和合适的粉末基质(例如,乳糖或淀粉)的粉末混合物。对于鼻内给药,本发明的化合物可以例如,作为液体喷雾剂,作为粉末或以滴剂的形式使用。
化合物也可以配制在直肠组合物中,例如,栓剂或保留灌肠,例如,包含常规的栓剂基质,例如,可可脂或其他甘油酯。
此外,化合物可以配制为储库(depot)制剂。这样的长效制剂可以通过植入给药(例如,通过皮下或肌内)或通过肌内注射给药。因此,例如,化合物可以用合适的聚合或疏水材料(例如作为可接受的油中的乳液)或离子交换树脂配制,或作为略溶衍生物,例如,作为略溶盐配制。
如果需要,组合物可以存在于包装或分配装置中,所述包装或分配装置可以包含一个或多个包含活性成分的单位剂型。该包装可以例如,包括金属或塑料箔,例如,罩板包装(blister pack)。该包装或分配装置可以随附给药说明书。
剂量
本发明的化合物可以以治疗有效剂量施用于患者以预防、治疗或控制全部或部分由本发明的GPCR-配体相互作用介导的疾病和病症。包含一种或多种本发明的化合物的药物组合物可以以足以在患者中引起有效保护或治疗反应的量施用于所述患者。足以实现此目的的量被定义为“治疗有效剂量”。剂量将通过采用的具体化合物的功效和受试者的状况,以及体重和待治疗的区域的表面积来确定。剂量的大小也通过在特定受试者中伴随特定化合物或载体的给药发生的任何不良反应的存在、性质和程度来决定。
此类化合物的毒性和治疗功效可以通过标准制药方法在细胞培养或实验动物中确定,例如,通过确定LD50(使50%的群体致死的剂量)和ED50(在50%群体中治疗有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数,并且可以表示为LD50/ED50的比。优选显示治疗指数大的化合物。尽管可以使用显示毒副作用的化合物,但应该小心地设计将所述化合物靶向至受影响组织的部位的递送***,从而尽量减小对正常细胞的潜在损害,并且因此减少副作用。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用来将用于人类的剂量范围公式化。此类化合物的剂量优选在包括ED50的循环浓度的范围内,具有很少毒性或没有毒性。剂量可以在此范围内根据采用的剂型和给药途径而发生变化。对于本发明的方法中使用的任何化合物,治疗有效剂量可以初步地从细胞培养测定中估算。可以在动物模型中将剂量公式化从而达到包括在细胞培养中测定的IC50(达到症状的半数最大抑制的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。这样的信息可以用来更准确地确定人类中的可用剂量。血浆水平可以例如,通过高效液相色谱(HPLC)来测量。通常,调节剂的剂量当量为对于典型受试者为约1ng/kg-10mg/kg。
本发明的化合物和/或其药学可接受的盐的给药的量和频次将款率诸如患者的年龄、状况和尺寸以及被治疗的症状的严重度根据主治医生的判断来调整。普通技术的医生或兽医可以容易地确定和开出预防、对抗或阻止病症的进展所需的药物的有效量。通常,期望有效量将为0.001mg/kg-10mg/kg体重,和特别地为0.01mg/kg-1mg/kg体重。更具体地,期望有效量将为通过静脉给药连续输注0.01微克/kg体重/min-100微克/kg体重/min 12小时至14天的周期。在一整天内以合适的间隔将所需的剂量作为两次、三次、四次或更多次小剂量(sub-doses)施用可能是适宜的。所述小剂量可以配制为单位剂型,例如,包含0.01-500mg,和特别地0.1mg-200mg活性成分/单位剂量。
优选地,药物制剂为单位剂型。在此形式中,制剂被细分成合适大小的单位剂量,所述单位剂量包含合适量的活性成分,例如,有效量以实现所需的目的。单位剂量制剂中活性化合物的量可以根据具体的应用发生变化或从0.01mg调整至约1000mg,优选从约0.01mg调整至约750mg,更优选从约0.01mg调整至约500mg,和最优选从约0.01mg至约250mg。采用的实际剂量可以根据患者的需求和被治疗的病症的严重度而发生变化。对于特定情况确定适宜的用药方案在本领域技术人员的能力范围内。为方便起见,总剂量根据需要可以在一天内分成多个部分并施用。
医疗应用
本发明的组合物可用于治疗对血压的降低有利地反应的任何心血管病症。这些病症包括慢性高血压、高血压危象(急性高血压急症)、急性充血性心力衰竭、心绞痛、急性心肌梗死、左心室衰竭、脑血管功能不全和颅内出血。静脉内注射是治疗急性心血管病症的优选方法。这样的方法将包括向需要所述方法的受试者施用治疗有效量的一种或多种本发明的化合物。急性心血管病症的实例包括,但不限于,高血压危象、妊娠毒血症和急性充血性心力衰竭。
联合治疗
本发明还提供了治疗任何心血管或心肾病症的方法,所述方法通过施用一种或多种如上所述的本发明的组合物结合其他用于治疗心血管和/或心肾病症的药物。这些其他药物包括利尿药诸如呋塞米;血管扩张剂诸如***、硝普钠、脑利钠肽(BNP),或它们的类似物;inotrope诸如多巴酚丁胺;血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂诸如卡托普利和依那普利;β阻滞剂诸如卡维地洛和***;血管紧张素受体阻断剂(ARBs)诸如缬沙坦和坎地沙坦;和/或醛固酮拮抗剂诸如螺内酯。
在本发明的联合治疗中,一种或多种本发明的组合物将与一种或多种用于治疗心血管和/或心肾病症的药物共同施用以增加治疗心血管和/或心肾病症的功效并且减少与高剂量的这些治疗药物相关的副作用。
上述本发明的联合治疗具有协同的和相加的疗效。协同作用定义为两种或多种药剂的相互作用使得它们的综合效应大于它们各自效应的总和。例如,如果药物A在单独治疗疾病时的效应为25%,且药物B在单独治疗疾病时的效应为25%,但当这两种药物联合时,治疗该疾病的效应为75%,则A和B的效应是协同的。
相加性(additivity)定义为两种或多种药剂的相互作用使得它们的综合效应与它们各自的效应的总和相同。例如,如果药物A在单独治疗疾病时的效应为25%,且药物B在单独治疗疾病时的效应为25%,但当这两种药物联合时,在治疗该疾病时的效应为50%,则A和B的效应是相加的。
药物治疗方案的改进可以描述为两种或多种药剂的相互作用使得它们的综合效应减少了在共同治疗中使用的任一种药剂或两种药剂的不良事件(AE)的发生率。这种不良反应发生率的减少可以是例如,共同治疗中使用的任一种药剂或两种药剂以较低剂量施用的结果。例如,如果药物A单独的效应为25%并且在标示剂量下的不良事件发生率为45%;药物B单独的效应为25%且在标示剂量下的不良事件发生率为30%,但当这两种药物以低于每种药物的标示剂量的剂量联合使用时,如果总效应为35%(改进,但非协同的或相加的),且不良事件发生率为20%,则存在药物治疗方案的改进。
定义
除非另外定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述领域的普通技术人员所普遍理解的相同含义。尽管与本文所述的那些相似或等效的方法和材料可以用于实施或测试本发明,但下面描述合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献的全部内容通过引用合并。在有冲突的情况下,将适用本说明书,包括定义。另外,材料、方法和实施例仅是说明性的,不意在是限制性的。从下面的详述和权利要求中,本发明的其他特征和优点将是显而易见的。
为了促进对本文所述的实施方案的理解的目的,将参照优选的实施方案,并且将使用特定的语言描述所述优选实施方案。本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的,不意在限制本发明的范围。如在本公开中始终使用的那样,单数形式“一(a,an)”和“该(the)”包括复数指代物,除非上下文明确地指示相反的含义。因此,例如,提及“一种组合物”时包括多种所述组合物,以及单一的组合物,并且提及“一种治疗剂”时是指一种或多种治疗剂和/或药剂和本领域熟练技术人员已知的其等效形式,等等。因此,例如,提及“一个宿主细胞”时包括多个所述宿主细胞,并且提及“一种抗体”时是指一种或多种抗体和本领域熟练技术人员已知的其等效形式,等等。
实施例
下列的实施例说明但非限制本发明的方法和组合物。对在治疗中通常遇到的和对于本领域熟练技术人员显而易见的多种条件和参数的其他合适的修改和适应性改动包括在所述实施方案的精神和范围内。
实施例1:化合物的合成
本文所述的肽和中间体通过肽合成的固相方法制备(参见R.Merrifield J.Am.Chem.Soc.1964,85,2149;M.Bodansky,“Principles of Peptide Synthesis(肽合成的原理).”Springer-Verlag,1984.)。采用的肽合成和纯化步骤使用市售自动化肽合成仪和市售的树脂和受保护的氨基酸,其是本领域中充分描述的标准方法,包括,但不限于,氨基酸偶联步骤,洗涤步骤,脱保护步骤,树脂裂解步骤,和离子交换以及HPLC纯化方法。更具体地,肽从其C-末端合成,该合成通过向与不溶性载体树脂连接的酸敏感接头上逐步添加Fmoc-保护的氨基酸(预先活化或原位活化),和用哌啶脱保护Fmoc基团。合成后,结合树脂的肽被侧链脱保护并且用三氟乙酸和阳离子清除剂将其从树脂脱离。肽通过水萃取或通过从有机溶剂诸如醚或叔丁基甲醚中沉淀,然后通过离心和倾析和/或通过HPLC和冻干来纯化。
实施例:B-抑制蛋白募集测定
由GPCR介导的β-抑制蛋白功能中的邻近事件是在配体结合和由GRK引起的受体磷酸化后募集至受体。因此,测量β-抑制蛋白募集用来确定配体对β-抑制蛋白功能的功效。
B-抑制蛋白-2募集至人和大鼠血管紧张素2-1型受体(分别为人AT1R和大鼠AT1aR)使用PathHunterTM β-抑制蛋白测定(DiscoveRx Corporation,FremontCA)进行测量。细胞、质粒和检测试剂购自DiscoveRx,并且根据生产厂商的说明书进行测定。人AT1R和大鼠AT1aR克隆至pCMV-ProLink载体中,通过测序验证,并转染至PathHunterβ-抑制蛋白HEK293细胞中。稳定转染的克隆细胞系用潮霉素和G418选择。这些克隆细胞系用于所有实验。
对于测定,在96孔微量培养板中每孔以90μL的体积接种25,000个细胞,并使其在37℃在5%CO2中生长过夜。本发明的肽溶解在去离子水中至1mM的浓度。然后将肽在测定缓冲液(含有20mM HEPES的Hank’s平衡盐溶液)中进一步稀释,从而将肽加入至细胞达到10μM-1pM范围的终浓度。然后细胞在37℃在5%CO2中孵育60分钟,然后向每孔添加50μL PathHunter检测试剂。然后微量培养板在室温下孵育60分钟,然后使用购自BMG Labtech的NOVOstar微量板读数仪测量发光。B-抑制蛋白-2募集至受体测量为以任意单位表示的相对发光强度。结果显示在下面的表2中。
实施例3:IP1积累测定
还进行了对G蛋白偶联功效的第二种测量。通过Gα-q激活磷脂酶C产生IP3。IP3降解为IP1,通过用氯化锂阻断降解可以迫使其在细胞中积累。因此我们测量了IP1的积累以确定配体对G蛋白激活的功效。
用购自Cisbio的IP-One Tb试剂盒和根据生产厂商的说明书使用测量由人和大鼠血管紧张素2-1型受体(分别为人AT1R和大鼠AT1aR)产生的IP1积累。表达人AT1TR或大鼠AT1aR的稳定转染的克隆细胞系用于所有实验。
对于测定,在384孔小容量微量培养板中每孔以20μL的体积接种4,000个细胞,并使其在37℃在5%CO2中生长过夜。然后用包含50mM氯化锂的由Cisbio供应的刺激缓冲液更换细胞生长培养基。肽TRV-120,001至TRV-120,035溶解在去离子水中至1mM的浓度。对于激动剂检测,肽然后进一步在刺激缓冲液中稀释,从而将肽加入至细胞达到10uM-1pM范围的终浓度。对于拮抗剂检测,肽然后进一步在刺激缓冲液中稀释,从而将肽加入至细胞达到10uM-1pM范围的终浓度,然后添加10nM AngII。添加肽后,细胞在37℃在5%CO2中孵育30分钟,然后根据生产厂商的说明书添加检测试剂溶解细胞。微量培养板孵育60-90分钟,然后使用获自BMG Labtech的PHERAstar Plus微量板读数仪测量时间分辨的荧光强度。IP1积累测量为在665nm和620nm处测量到的时间分别的荧光强度的比率变化。结果显示在下表2中。
表2:生物活性
注:无活性是指EC50大于10uM。
实施例4:钙动员测定
可以以许多方式测量G蛋白功效。当被激动剂激活时与异三聚体G蛋白的Gq亚类偶联的GPCR激活一系列广泛的信号转导。最常测量的一个途径是Gα-q对磷脂酶C的激活,其裂解磷脂酰肌醇二磷酸盐以释放IP3;IP3接着从细胞内储库经由IP3受体释放钙至胞质溶胶。因此我们测量细胞内游离钙以确定配体对G蛋白激活的功效。
用购自Invitrogen的Fluo-4NW试剂盒并根据生产厂商的说明书使用来测量由人和大鼠血管紧张素2-1型受体(分别为人AT1R和大鼠AT1aR)产生的细胞内游离钙。表达人AT1TR或大鼠AT1aR的稳定转染的克隆细胞系用于所有实验。
对于测定,在96孔微量培养板中每孔以90μL的体积接种25,000个细胞,并使其在37℃在5%CO2中生长过夜。Fluo-4NW染料与丙磺舒和测定缓冲液(含有20mM HEPES的Hank’s平衡盐溶液)混合,并用此混合物更换细胞生长培养基,紧接着在37℃在5%CO2中孵育30-45分钟。肽TRV-120,001-TRV-120,035溶解在去离子水中至1mM的浓度。然后将肽在测定缓冲液(含有20mM HEPES的Hank’s平衡盐溶液)中进一步稀释,从而将肽加入至细胞达到10μM-1pM范围的终浓度。将肽加入至细胞,同时使用购自BMGLabtech的NOVOstar微量板读数仪测量荧光强度。钙动员测量为相对荧光强度,所述相对荧光强度表示为在添加配体后5秒和20秒时基线上的倍数。
实施例5:SEQ ID NO:27在正常大鼠中的评价
SEQ ID NO:27对血管和心脏功能的效应通过在正常的麻醉大鼠中在初步定量给药实验中以0.1-10μg/kg/min范围的剂量静脉输注来测试。进行多种血液动力学测定,包括平均动脉压、心率和压力容积关系。SEQ ID NO:27产生平均动脉压的剂量依赖性地下降,对HR的作用很小至没有作用。另外,SEQ IDNO:27增加了收缩末期压力容积关系的斜率并维持了预先可恢复的搏出功,导致在血管收缩下降的背景下维持了每搏输出量。
实施例6:SEQ ID NO:27在急性心力衰竭的起搏犬(Paced Dog)模型中的评价
SEQ ID NO:27(0.01、0.1、1、10和100mcg/kg/min剂量递增,每个剂量30分钟)也在起搏的心力衰竭模型中给药。在起搏犬模型中,植入起搏器,并且将犬的心脏以每分钟240次心跳的速率起搏10天,导致左心室收缩功能下降,右侧充血和肾素-血管紧张素***活性升高。在心力衰竭犬中,SEQ ID NO:27产生平均动脉压、全身血管阻力、肺毛细血管楔压和右动脉压的剂量依赖性下降,且在这些动物中心输出量得到维持。在肾脏的水平,在肾血流量方面存在剂量依赖性地增加,导致肾血管阻力的显著下降。尿钠***中等程度地增加,尿排出量、尿钾和肾小球滤过率得到维持。
尽管已经参照特别优选的实施方案和实施例说明了本发明,但本领域熟练技术人员要认识到在不背离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明作出多种修改。
在本说明书中提及的和/或申请数据页中列举的所有上述美国专利、美国专利申请公开书、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物的全部内容通过引用合并入本文中。
Claims (21)
1.由下式的序列组成的肽:
Sar-Arg-Val-Ww-Zz-His-Pro-Cc,其中
Ww是L-酪氨酸、3-羟基-L-酪氨酸、3-氟-L-酪氨酸、2,6-二氟-L-酪氨酸、3-硝基-L-酪氨酸、3,5-二硝基-L-酪氨酸或3-氯-L-酪氨酸;
Zz是L-缬氨酸或L-异亮氨酸;并且
Cc是D-丙氨酸。
2.权利要求1的肽,其中Ww是L-酪氨酸。
3.权利要求1或2的肽,其中Zz是L-异亮氨酸。
4.权利要求1或2的肽,其中Zz是L-缬氨酸。
5.权利要求1的肽,其中所述肽由SEQ ID NO:27的序列组成。
6.权利要求1-5任一项的肽,其中所述肽是环状的、二聚化的或三聚化的。
7.包含权利要求1-6任一项的肽的组合物。
8.权利要求7的组合物,其中所述肽由SEQ ID NO:27的序列组成。
9.一种药物组合物,所述药物组合物包含权利要求1-6任一项的肽和药学可接受的载体。
10.权利要求9所述的药物组合物,其中所述药学可接受的载体是无菌水、磷酸盐缓冲盐水溶液或葡萄糖水溶液。
11.权利要求9所述的药物组合物,其中所述药学可接受的载体是无菌水。
12.权利要求9-11任一项的药物组合物,其还包含pH缓冲剂。
13.a)由SEQ ID NO:27组成的肽或(b)包含肽和药学可接受的载体的药物组合物,其中所述肽由SEQ ID NO:27组成,在制备用于治疗心力衰竭的药物中的用途。
14.权利要求13所述的用途,其中所述心力衰竭是急性充血性心力衰竭。
15.权利要求13所述的用途,其中所述心力衰竭是急性心力衰竭。
16.权利要求13-15任一项所述的用途,其中治疗导致肾血管阻力下降。
17.权利要求13-15任一项所述的用途,其中治疗导致肾小球滤过率得到维持。
18.权利要求13-15任一项所述的用途,其中所述药物通过静脉内注射施用。
19.权利要求13所述的用途,其中所述药学可接受的载体是无菌水、磷酸盐缓冲盐水溶液或葡萄糖水溶液。
20.权利要求13所述的用途,其中所述药学可接受的载体是无菌水。
21.权利要求13的的用途,其中所述药物组合物还包含pH缓冲剂。
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