CN102327615A - 一种骨靶向载体和药物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种骨靶向药物载体和药物，由下法制得：先用高碘酸钠将葡聚糖氧化为含多醛基的氧化葡聚糖；再将含氨基的双膦酸与含多醛基的氧化葡聚糖反应得到骨靶向药物载体，由所述的骨靶向药物载体与含氨基的药物反应得到骨靶向药物。以含多醛基的氧化葡聚糖为中间体，连接具有骨导向作用的双膦酸和含氨基的其他类药物（双膦酸除外），得到具有骨靶向性的药物。双膦酸与氧化葡聚糖醛基反应的物质量比为（0.4~0.6）：1时所制备的骨靶向药物既具备良好的亲骨性，又有较高的载药量。本发明的骨靶向药物通过双膦酸的导向作用定向作用于骨组织，搭载的药物不同，发挥不同的治疗作用。本发明载药量大，亲骨性佳，合成步骤简单，条件易于控制。

Description

一种骨靶向载体和药物

技术领域

    本发明涉及药物的靶向药物技术领域，具体涉及骨组织的靶向载体和骨靶向药物。

背景技术

骨是一种特殊的***，由大量钙化的细胞间质和细胞组成，钙化的细胞间质为骨基质，其中无机盐的含量占干重的65~70%，其主要成分是羟基磷灰石(hydroxyapative，HA)。因此骨组织硬度大，渗透性差，生理生化过程特殊，对于一般的药物治疗，药物难以有效地到达病变部位，致使局部药物浓度偏低，效果不明显。而提高给药浓度又会增加对其它组织和器官的毒副作用。骨组织相关性疾病，如骨质疏松、骨髓炎、原发性和继发性骨肿瘤等的药物治疗较为棘手。

1986年Pierce等首先明确提出了“骨靶向”的概念，即将药物与一定的骨靶向载体偶联，使该化合物分子具有沉积于骨并掺和到羟基磷灰石晶体中的趋势，同骨钙具有结合能力，使药物选择性地导向病变部位，提高局部骨组织的药物浓度，以达到增强药效，减少对其它组织的毒副作用。近二十多年来，许多学者致力于这方面的研究，发现、合成了多种亲骨性物质，并在此基础上开发出多种骨靶向药物。作者将这些骨靶向药物的载药模式分为三类：                                                

偶联载药模式，即亲骨性物质和药物通过化学结合的方法直接合成，或通过小分子中间物质桥接，合成骨靶向药物，是目前研究最多的一种合成方式，但其合成反应复杂、步骤多、产率低。

纳米药物载体，即将亲骨性物质修饰于包封药物的纳米粒表面，合成骨靶向药物。该方法合成步骤较简单；产物易于分离纯化；对所载药物有广泛的适应性，可实现对多种不同药物进行载药；对所载药物无化学结构上的改变，药效不变；但合成费用十分昂贵。

枝接载药模式，即亲骨性物质和药物按照一定的物质量比例通过化学结合的方法枝接于聚合物上，合成骨靶向药物，其合成方法简单、步骤少、有一定通用性。合成技术的关键点在于控制两种物质的比例，以期达到最佳的骨靶向性和最大的载药率。该设想由陈方舟等提出，其将亲骨性药物四环素（Tetracyline，TC）作为靶向物质，以氧化葡聚糖 (Dextran) 作为中间体，连接四环素与阿霉素 (Adr1amycin，ADM) 枝接于聚合物上，制备复合物ADM-DEX-TC，但其未对合成的复合物进行表征，且载药量低，对肿瘤的杀伤作用弱于原料药ADM。

发明内容

本发明的目的是提供一种双膦酸氧化葡聚糖骨靶向药物载体及其骨靶向药物，该药物载药量高，骨靶向性好。

本发明采用枝接载药模式，同样以氧化葡聚糖作为中间体，连接含氨基的双膦酸骨靶向物质，合成一种双膦酸氧化葡聚糖骨靶向药物载体。最佳骨靶向药物载体的合成条件为：氧化葡聚糖的醛基与双膦酸物质量之比为1：(0.4~0.6)。然后将帕珠沙星和表阿霉素分别连接于该药物载体，得到一种骨靶向抗生素和一种骨靶向抗肿瘤药物。

本发明以含有氨基的双膦酸作为导向物质，氧化葡聚糖为中间体连接双膦酸和含氨基的药物，其结构可用以下简式表示：B-D-M

B为含有氨基的双膦酸类化合物。

D为由葡聚糖氧化而来的含多个醛基的氧化葡聚糖。

M为含氨基的任何药物。

实现上述发明的技术方案为：

一种骨靶向药物载体，由下法制得：先用高碘酸钠将葡聚糖氧化为含多醛基的氧化葡聚糖；再将含氨基的双膦酸与含多醛基的氧化葡聚糖反应得到骨靶向药物载体，双膦酸与氧化葡聚糖醛基反应的物质量比为（0.4~0.6）：1。

含多醛基的氧化葡聚糖可由下法制得：称取葡聚糖(优选T-40)10.0g，高碘酸钠13.5g，分别溶于200ml 和150mlpH4．4磷酸盐缓冲液中，将高碘酸钠溶液加入葡聚糖溶液中，室温下1500r/min避光搅拌4.5 h，立即加入丙三醇4.5ml，室温1500r/min继续搅拌15 min，将反应混合液置于截流分子量3500的透析袋中，以蒸馏水为介质4℃透析48h，透析液冷冻干燥，得氧化葡聚糖。盐酸羟胺法测定5批100mg样品，醛基含量为(10.24±0.2)mmol／g(n=5)；骨靶向药物载体的制备：将含氨基的双膦酸0.4~0.6mmol溶于10ml蒸馏水中与5ml（醛基含量约为1mmol）氧化葡聚糖水溶液（20mg/ml）反应，4℃孵育24h，将反应混合液置于截流分子量3500的透析袋中，以蒸馏水为介质4℃避光透析48h，除去未结合的AEDP，透析液冷冻干燥，得到骨靶向药物载体。双膦酸与氧化葡聚糖醛基反应的物质量比为（0.4~0.6）：1。

含氨基的双膦酸的结构式如下：

R’为-CH3或-OH；R为氢、一价金属盐或含有1-4个碳的烷基；n为0~10的整数。

本发明含氨基的双膦酸可以为1-氨基-1-甲基-1, 1-二膦酸。

一种骨靶向药物，由上述的骨靶向药物载体与含氨基的药物反应得到。

所述的骨靶向药物载体与含氨基的药物反应步骤如下：称取葡聚糖10.0g，高碘酸钠13.5g，分别溶于200ml 和150mlpH4.4磷酸盐缓冲液中，将高碘酸钠溶液加入葡聚糖溶液中，室温下1500r/min避光搅拌4.5 h，加入丙三醇4.5ml，室温1500r/min继续搅拌15 min，将反应混合液置于截流分子量3500的透析袋中，以蒸馏水为介质4℃透析48h，透析液冷冻干燥，得醛基含量为(10.24±0.2)mmol／g的氧化葡聚糖；再将0.4~0.6mmol含氨基的双膦酸溶于10ml蒸馏水中与5ml 浓度为20mg/ml的氧化葡聚糖水溶液4℃反应24h得反应混合液，在反应混合液中加入含氨基的药物，4℃孵育24h，将反应液过Sephadex G-50凝胶柱，收集先段流份，冷冻干燥，得到骨靶向性药物。

含氨基的药物的加入量不低于氧化葡聚糖醛基摩尔量的1%。

含氨基的药物为帕珠沙星或表阿霉素。

本发明以1-氨基-1-甲基-1, 1-二膦酸 (1-amino-ethylene-1,1-dephosphate acid, AEDP)作为含氨基的双膦酸代表，将41mg、82mg、123mg、164mg、205mg的AEDP（分别相当于0.2mmol、0.4mmol、0.6mmol、0.8mmol、1.0mmol）溶于10ml蒸馏水中分别与100mg的氧化葡聚糖（20mg/ml）反应，4℃孵育24h，将反应混合液置于截流分子量3500的透析袋中，以蒸馏水为介质4℃避光透析48h，除去未结合的AEDP，透析液冷冻干燥，得到不同AEDP底物含量的骨靶向药物载体，以AEDP_0.2~1.0-Dex表示。取浓度为1mg/ml的ox.Dex，AEDP_0.2-1.0-Dex溶液各1ml，加入装有15mg羟基磷灰石的EP管中，每种合成产物做3个平行管，对双膦酸骨靶向药物载体的体外亲骨性作了探讨，其结果见表1。本发明以帕珠沙星（Pazufloxacin，PFX）作为含氨基的药物代表，探讨了AEDP_0.2~1.0-Dex对药物的结合能力，即载药量，合成的化合物以AEDP_0.2~1.0-Dex- PFX表示，其结果见表1。

表1：AEDP_0.2-1.0-Dex的体外亲骨性及载药量

合成物质	吸附百分率%	合成物质	载药量%
				ox.Dex	-3.81±2.07	-	-
AEDP0.2-Dex	51.18±5.79	AEDP0.2-Dex- PFX	5.13
				AEDP0.4-Dex	69.87±3.36	AEDP0.4-Dex- PFX	4.65
AEDP0.6-Dex	77.18±3.21	AEDP0.6-Dex- PFX	3.38
				AEDP0.8-Dex	83.23±1.76	AEDP0.8-Dex- PFX	1.97
AEDP1.0-Dex	85.42±3.44	AEDP1.0-Dex- PFX	1.45

从表1的结果中可以看出，当AEDP的底物浓度大于0.4mmol时，AEDP-Dex骨靶向药物载体的体外亲骨性可达70%以上；而当AEDP的底物浓度大于0.8mmol时，其载药量不足2%，因此AEDP与氧化葡聚糖上醛基反应的最佳物质量比为（0.4~0.6）：1。

本发明具有下列优点：

1）本发明以氧化葡聚糖作为中间体连接含氨基的双膦酸和含氨基的药物，合成步骤简单，反应速度快，条件易于控制；且较多药物均含有氨基基团，因此该方法具有一定的通用性。

2）本发明以氧化葡聚糖作为中间体，其基本单位为葡萄糖，安全无毒，生物相容性好，葡聚糖-药物结合物在体内释放出药物后，非药物部分逐渐分解为无毒副作用的小分子物质。

3）本发明以含氨基的双膦酸作物骨导向物质，除利用双膦酸的亲骨性能外，其自身也有一定的药理作用，如抗骨质疏松和抑制肿瘤和肿瘤骨转移等，因此将双膦酸用于作为骨靶向药物的导向物质，可谓一举数得。

附图说明

图1为本发明氧化葡聚糖ox.Dex的¹HNMR波谱图。

图2为本发明AEDP氧化葡聚糖骨靶向药物载体AEDP-Dex的¹HNMR波谱图。

图3为本发明骨靶向帕珠沙星AEDP-Dex- PFX的¹HNMR波谱图。

图4为本发明骨靶向表阿霉素AEDP-Dex- EPI的¹HNMR波谱图。

图5为本发明以表阿霉素（Epirubicin，EPI）作为模型药物合成的化合物AEDP-Dex-EPI的体内亲骨性的骨组织荧光切片（其中图5 A、图5B为空白对照组和AEDP – Dex组；图5C、图5D为EPI组和AEDP-Dex-EPI组）。

具体实施方式

实施例1：氧化葡聚糖的合成

称取葡聚糖(T-40)10.0g，高碘酸钠13.5g，分别溶于200ml 和150mlpH4．4磷酸盐缓冲液中分别得到葡聚糖溶液和高碘酸钠溶液，将高碘酸钠溶液加入葡聚糖溶液中，室温下1500r/min避光搅拌4．5 h，立即加入丙三醇4.5ml，室温1500r/min继续搅拌15 min，将反应混合液置于截流分子量3500的透析袋中，以蒸馏水为介质4℃透析48h，透析液冷冻干燥，得氧化葡聚糖5.1g。氧化葡聚糖的¹HNMR波谱图见图1，¹HNMR（600MHz，DMSO）：δ_H=9.61 ppm 为醛基质子产生的峰。

实施例2：双膦酸氧化葡聚糖骨靶向药物载体的合成

取0.6mmol AEDP，溶于10ml蒸馏水中。称取100mg氧化葡聚糖（醛基含量约1.0mmol），溶于5ml蒸馏水中，将AEDP溶液加入其中，4℃孵育24h后，将反应混合液置于截流分子量3500的透析袋中，以蒸馏水为介质4℃避光透析48h，除去未结合的AEDP，透析液冷冻干燥，得白色粉末状骨靶向药物载体。

¹HNMR（600MHz，DMSO）：δ_H=1.47 ppm出现多重峰，应为AEDP上的-CH₃引入。δ_H=7.72 ppm处的一峰为希弗碱结构-HC=N-质子产生的峰。（见附图2）

实施例3：骨靶向帕珠沙星AEDP-Dex- PFX的合成

步骤1同实施例1。

步骤2：取0.6mmol AEDP，溶于10ml蒸馏水中。称取100mg氧化葡聚糖（醛基含量约1.0mmol），溶于5ml蒸馏水中，将AEDP溶液加入其中，4℃孵育24h。

步骤3：称取PFX 20mg:用等摩尔盐酸助溶于10ml蒸馏水中，将其加入上述反应液中，并用磁力搅拌，4℃避光孵育24h。最后将反应液过Sephadex G-50凝胶柱，收集先段流份，冷冻干燥，得到淡黄色粉末状产物骨靶向帕珠沙星，其载药量为3.38%，体外HA吸附率为89.12%。

¹HNMR（600MHz，DMSO）：δ_H=1.30为PFX上环丙烷的亚甲基质子峰；δ_H=1.53、1.56、1.59、1.66 ppm处的多重峰则为AEDP和PFX的甲基质子峰；δ_H=7.86 ppm为PFX上苯环氢的双重峰；δ_H=8.954、8.962 ppm为PFX吡啶环上的质子峰；δ_H=7.67 ppm为醛基与氨基结合成-HC=N-希弗碱结构产生的质子峰；δ_H=9.62 ppm处的小峰则为氧化葡聚糖上尚未完全反应的醛基的质子峰。（见附图3）

实施例4：骨靶向表阿霉素AEDP-Dex- EPI的合成

步骤1同实施例1。

步骤2：取0.4mmolAEDP，溶于10ml蒸馏水中。称取100mg氧化葡聚糖（醛基含量约1.0mmol），溶于5ml蒸馏水中，将AEDP溶液加入其中，4℃孵育24h。

步骤3：称取表阿霉素20mg溶于10ml蒸馏水中，将其加入上述反应液中，并用磁力搅拌，4℃避光孵育24h。最后将反应液过Sephadex G-50凝胶柱，收集先段流份，冷冻干燥，得到红色粉末状产物，骨靶向表阿霉素。载药量为（5.31±0.20）%，HA吸附率分别为85.47%。

¹HNMR（600MHz，DMSO）：δ_H=1.23、1.52、1.55、1.57 ppm处的多重峰则为EPI和AEDP的甲基质子峰；δ_H=2.10、2.12、2.17为EPI上-CH2、-CH的质子峰；δ_H=7.80、7.95ppm为EPI上苯环氢的双重峰；δ_H=7.69 ppm为醛基与氨基结合成-HC=N-希弗碱结构产生的质子峰；δ9.62处的小峰则为氧化葡聚糖上尚未完全反应的醛基的质子峰。（见附图4）

实施例5：骨靶向表阿霉素SD-AEDP-Dex- EPI的合成（合成最终加入硼氢化钠还原剂）

步骤1为实施例1。

步骤2同实施例4的步骤2。

步骤3：称取表阿霉素20mg溶于10ml蒸馏水中，将其加于上述反应液中，并用磁力搅拌，4℃避光孵育24h后，加入50mg硼氢化钠水溶液（10mg/ml），反应3h后，最后将反应液过Sephadex G-50凝胶柱，收集先段流份，冷冻干燥，得到红色粉末状产物，骨靶向表阿霉素，以SD-AEDP-Dex-EPI表示。

实施例6：AEDP-Dex- EPI和SD-AEDP-Dex-EPI体外对骨肉瘤细胞MG-63凋亡的影响

取生长旺盛的MG-63成骨肉瘤细胞，0.25%的胰蛋白酶消化，含10%胎牛血清的DMED液漂洗2遍，然后配成5×10⁵m1^-1的细胞悬液，将细胞悬液加入6孔板内，每孔3ml，放入37℃培养箱中培养24h后细胞贴壁，细胞长满后加入药液，分别加入1μg·ml^-1的EPI，相当1μg·ml^-1EPI浓度的AEDP-Dex-EPI，相当1μg·ml^-1EPI浓度的SD-AEDP-Dex-EPI， 100μg·ml^-1氧化DEX和40μg·ml^-1AEDP，同时设不加药物的阴性对照，培养24h后取出。用0.25%的胰蛋白酶消化，含10%胎牛血清的DMED中止消化，反复吹打后取1ml细胞悬液移入离心管，1000rpm，4℃离心10分钟，弃上清；加入1ml冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮；1000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，重复洗涤2次；将细胞重悬于200ul Binding Buffer；加入10μl Annexin V-FITC和5μl PI，轻轻混匀，避光室温反应15分钟 或4℃反应30分钟。加入300ul Binding Buffer，在1小时内上机检测。重复3次。

表2：细胞凋亡测定结果（n=3）

     Annexin/PI双染法测定的凋亡结果表明（表2），AEDP-Dex-EPI 、EPI、SD-AEDP-Dex-EPI在EPI的终浓度为1μg·ml^-1时，AEDP-Dex-EPI 组的MG-63的坏死和凋亡细胞明显高于EPI和SD-AEDP-Dex-EPI（P<0.05）。且AEDP（40μg·ml^-1）对骨肉瘤细胞也有一定作用，而氧化葡聚糖的凋亡作用不明显。

以上结果说明AEDP-Dex-EPI由于希弗碱结构的不稳定性，可分解为游离的AEDP和EPI，故AEDP-Dex-EPI在AEDP的自身抗肿瘤和协同抗肿瘤的作用下，对肿瘤的杀伤作用强于EPI。SD-AEDP-Dex-EPI由于加入了还原剂-C=N双键结构被还原为稳定的-C-N结构，无法水解得到游离的AEDP和EPI，自身结构的改变可能导致AEDP和EPI药效的降低。因此不加入还原剂，保留希弗碱结构，在AEDP-Dex-EPI复合物通过双膦酸的导向作用到达骨组织后（实施例7将证明该点），能够水解为AEDP和EPI，充分发挥各自的作用。

实施例7：骨靶向表阿霉素的体内亲骨性

昆明小鼠12只，（18.7±2.1）g，雌雄不限，分为4组，每组3只。EPI单独用药时，成人剂量为按体表面积一次60～90mg/m² ，20g小鼠的体表面积为0.00436 m² ，故EPI的小鼠剂量为0.26~0.39mg/次，为方便计算取0.3mg/次，则AEDP-Dex-EPI的剂量为5.8mg/次（载药量5.31%）。A组：AEDP-Dex-EPI组，通过鼠尾静脉注射浓度为28.8mg/ml的AEDP -Dex-EPI 0.2ml；B组：EPI组，注射浓度为1.5mg/ml的EPI 0.2ml；C组：AEDP-Dex组，注射浓度为27.3mg/ml的AEDP - Dex 0.2ml；D组：空白对照组，注射0.9%生理盐水0.2ml。

24h后取小鼠股骨干骺端，丙酮固定24h，制作硬组织切片。在Leica DM4000B荧光显微镜下观察切片中EPI自体荧光，激发光源为波长488 nm氩离子激光，拍摄照片（拍摄条件：曝光时间1/3秒，感光度400），并用Image-Pro Plus 6.0软件分析得到A组和B组的荧光强度的IOD值分别为37.95±3.97和15.26±2.52，A组荧光强度约为B组2.5倍（P<0.05）（见附图5）。图5 A、图5B为空白对照组和AEDP – Dex组，只有极微弱的骨组织自发荧光；图5C、图5D为EPI组和AEDP-Dex-EPI组中EPI在骨组织中有强烈的激发荧光，图5D可看出股骨干骺端的皮质骨、松质骨均有EPI的存在，而骨骺因其自身的屏障作用，未结合EPI，无红色激发荧光。说明AEDP-Dex-EPI复合物通过双膦酸的导向作用再体内能够顺利到达骨组织。

Claims (8)

1.一种骨靶向药物载体，由下法制得：先用高碘酸钠将葡聚糖氧化为含多醛基的氧化葡聚糖；再将含氨基的双膦酸与含多醛基的氧化葡聚糖反应得到骨靶向药物载体，双膦酸与氧化葡聚糖醛基反应的物质量比为（0.4~0.6）：1。

2.根据权利要求1所述的骨靶向药物载体，其特征在于，含多醛基的氧化葡聚糖由下法制得：称取葡聚糖10.0g，高碘酸钠13.5g，分别溶于200ml 和150mlpH4.4磷酸盐缓冲液中得到葡聚糖溶液和高碘酸钠溶液，将高碘酸钠溶液加入葡聚糖溶液，室温下1500r/min避光搅拌4.5 h，加入丙三醇4.5ml，室温1500r/min继续搅拌15 min，将反应混合液置于截流分子量3500的透析袋中，以蒸馏水为介质4℃透析48h，透析液冷冻干燥，得醛基含量为(10.24±0.2)mmol／g的氧化葡聚糖；骨靶向药物载体的制备：将0.4~0.6mmol含氨基的双膦酸溶于10ml蒸馏水中与5ml 浓度为20mg/ml的氧化葡聚糖水溶液4℃反应24h得反应混合液，将反应混合液置于截流分子量3500的透析袋中，以蒸馏水为介质4℃避光透析48h，除去未结合的含氨基的双膦酸，透析液冷冻干燥，得到骨靶向药物载体。

3.根据权利要求1或2所述的骨靶向药物载体，其特征在于含氨基的双膦酸的结构式如下：

R’为-CH3或-OH；R为氢、一价金属盐或含有1-4个碳的烷基；n为0~10的整数。

4.根据权利要求3所述的骨靶向药物载体，其特征在于：含氨基的双膦酸为1-氨基-1-甲基-1, 1-二膦酸。

5.一种骨靶向药物，由权利要求1或2或3所述的骨靶向药物载体与含氨基的药物反应得到。

6.根据权利要求5所述的骨靶向药物，其特征在于：所述的骨靶向药物载体与含氨基的药物反应步骤如下：称取葡聚糖10.0g，高碘酸钠13.5g，分别溶于200ml 和150mlpH4.4磷酸盐缓冲液中，将高碘酸钠溶液加入葡聚糖溶液，室温下1500r/min避光搅拌4.5 h，加入丙三醇4.5ml，室温1500r/min继续搅拌15 min，将反应混合液置于截流分子量3500的透析袋中，以蒸馏水为介质4℃透析48h，透析液冷冻干燥，得醛基含量为(10.24±0.2)mmol／g的氧化葡聚糖；再将0.4~0.6mmol含氨基的双膦酸溶于10ml蒸馏水中与5ml 浓度为20mg/ml的氧化葡聚糖水溶液4℃反应24h得反应混合液，在反应混合液中加入含氨基的药物，4℃孵育24h，将反应液过Sephadex G-50凝胶柱，收集先段流份，冷冻干燥，得到骨靶向性药物。

7.据权利要求6所述的骨靶向药物，其特征在于：含氨基的药物的加入量不低于氧化葡聚糖醛基摩尔量的1%。

8.根据权利要求5或6或7所述的骨靶向药物，其特征在于：含氨基的药物为帕珠沙星或表阿霉素。

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