CN102321685A - 一种柠檬酸发酵液的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种柠檬酸发酵液的制备方法，该方法包括：调浆步骤：将调浆液与淀粉质原料混合，得到淀粉浆液；所述调浆液为含有柠檬酸的水溶液，所述含有柠檬酸的水溶液含有来自于将发酵步骤得到柠檬酸发酵液进行提纯的过程中产生的中和废液，所述淀粉质原料与所述调浆液的重量比为1∶1.86-3；酶解步骤：在酶解条件下，将调浆步骤得到的淀粉浆液与酶混合进行酶解，得到酶解产物；发酵步骤：在生成柠檬酸的条件下，将酶解步骤得到的酶解产物进行发酵，得到柠檬酸发酵液；发酵终点为发酵液残还原糖含量1-10g/L。本发明的方法能够大大降低工艺用水量，缩短生产周期，提高柠檬酸的生产效率，还达到了节省能源的目的，而且得到高浓度的柠檬酸发酵液。

Description

一种柠檬酸发酵液的制备方法

发明领域

本发明涉及一种柠檬酸发酵液的制备方法。

发明背景

柠檬酸是重要的工业有机酸，被称为第一食用酸味剂，在食品工业上被广泛应用，同时在药物、美容、化妆品、洗涤剂、工业领域也有广泛应用。自从1784年，瑞典化学家Scheel首次从柠檬汁中提取出柠檬酸并结晶出固体柠檬酸之后，经过国外科学家不断研究探索，实现了深层发酵法工业化，从而实现了大规模生产柠檬酸。

我国柠檬酸工业起步于上世纪50年代，经过数代人共同努力，柠檬酸技术水平已处于世界领先地位，实现了柠檬酸工业的迅速发展。柠檬酸的制备一般包括：将淀粉质的原料进行预处理并发酵得到发酵清液，并进一步从发酵清液中提纯柠檬酸，并进行后处理。

目前，工业上发酵法生产柠檬酸常用大量的水来对玉米淀粉质原料进行调浆，且由于发酵柠檬酸所用淀粉质原料在柠檬酸发酵成本中所占比例较大，所以柠檬酸发酵终点判断通常选择控制残还原糖的含量尽可能低。这样做一方面可以降低柠檬酸生产粮耗，一方面可以降低柠檬酸废水的COD值。但此方法会造成水资源的浪费，更重要的是，为了控制残还原糖的含量尽可能低，会造成发酵生产周期延长，能耗高的问题，且还会产生大量污染环境的废水，另外，在提高发酵液中的柠檬酸酸度上也存在着一定的困难。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明的发明目的在于提供一种节水、高效率、低能耗、低污染、且能够得到高酸度柠檬酸的柠檬酸发酵液的制备方法。

为达到上述目的，本发明提供了一种柠檬酸发酵液的制备方法，该方法包括：

调浆步骤：将调浆液与淀粉质原料混合，得到淀粉浆液；所述调浆液为含有柠檬酸的水溶液，所述含有柠檬酸的水溶液含有来自于将发酵步骤得到柠檬酸发酵液进行提纯的过程中产生的中和废液，所述淀粉质原料与所述调浆液的重量比为1∶1.86-3；

酶解步骤：在酶解条件下，将调浆步骤得到的淀粉浆液与酶混合进行酶解，得到酶解产物；

发酵步骤：在生成柠檬酸的条件下，将酶解步骤得到的酶解产物进行发酵，得到柠檬酸发酵液；发酵终点为发酵液残还原糖含量为1-10g/L。

本发明具有如下的优点：水耗低：由于将柠檬酸发酵液提纯过程中产生的中和废液回用于调配淀粉浆液，因此，可以减少调浆用水的用量；生产速率高：通过提高淀粉浆液中淀粉质原料的含量并通过改变发酵终点的判断标准，使得发酵周期比以残糖含量尽可能低的标准要缩短10％-20％，固而发酵生产效率得到很大提升；发酵液终点酸度高：由于高糖发酵会影响残糖，本法采用的中和废液回配较好解决残糖的问题，所以可以提高发酵初糖，进而提高发酵液终点酸度。同时由于发酵中和废液的回收利用，对糖耗影响极小，且极大程度降低排至环保中和废液COD，减轻环保压力。有利于钙盐法、ISEP(连续离子交换色谱)等方法提取柠檬酸。能耗低：由于发酵生产效率提高，单位产品所消耗的空气，电力成本也有一定幅度的降低。

具体实施方式

根据本发明提供的柠檬酸发酵液的制备方法，其中，所述调浆步骤中，所述调浆液为含有柠檬酸的水溶液，所述含有柠檬酸的水溶液含有来自于将所述发酵步骤中得到柠檬酸发酵液进行提纯的过程中产生的中和废液。采用含有柠檬酸的水溶液作为调浆液能够节约原来调浆用水的用量，以实现废水回用、节约水资源的目的，更重要的是，将所述发酵步骤中得到柠檬酸发酵液进行提纯的过程中产生的中和废液中还含有部分还原糖。因此，一方面，能够通过废水的回用重新将该部分未被发酵的还原糖与淀粉质原料混合用于进一步的酶解和发酵，从而不用等到发酵终点的残还原糖为零或接近零时才停止发酵，从而大大提高了发酵效率，缩短了生产周期，还可以节省能耗，另一方面还可以增加可用于发酵的还原糖的量，以达到提高柠檬酸酸度的目的。再者，所述含有柠檬酸的水溶液含有将所述发酵步骤中得到柠檬酸发酵液进行提纯的过程中产生的中和废液，可以减少废水的排放量，减轻对环境的污染。

按照本发明，所述调浆步骤中，含有柠檬酸的水溶液为含有来自所述发酵步骤中得到柠檬酸发酵液进行提纯的过程中产生的中和废液，例如，可以直接采用所述中和废液，或者是所述中和废液与水的混合物。对于中和废液和水的混合比例没有特别的限制，但是出于节水的目的考虑，本发明的含有柠檬酸的水溶液优选全部使用中和废液。

根据本发明提供的柠檬酸发酵液的制备方法，其中，所述调浆步骤中，以一水柠檬酸计，所述含有柠檬酸的水溶液中柠檬酸的含量可以在较大的范围内变动，由于为了达到废水回用的目的，所述含有柠檬酸的水溶液含有将发酵步骤得到柠檬酸发酵液进行提纯的过程中产生的中和废液，因此，以一水柠檬酸计，1升所述含有柠檬酸的水溶液中柠檬酸的含量可以为1-3克；优选情况下，1升所述含有柠檬酸的水溶液中柠檬酸的含量为1.5-3克；更优选情况下，1升所述含有柠檬酸的水溶液中柠檬酸的含量为2-2.5克。

根据本发明提供的柠檬酸发酵液的制备方法，其中，所述调浆步骤中，优选，所述淀粉质原料与所述调浆液的重量比为1∶1.86-3；更优选，所述淀粉质原料与所述调浆液的重量比为1∶2.13-2.7；最优选，所述淀粉质原料与所述调浆液的重量比为1∶2.3-2.57。

这里，在现有技术中由于选择发酵终点判断的标准为残还原糖为零或者酸度不再增加，使用高浓度浆液可能无限期的延长到达终点的时间，因此，淀粉浆液中淀粉质原料的用量较低，如淀粉质原料与水的重量比为1∶3.2-4左右，由于本发明只需要控制发酵终点为发酵液残还原糖含量为1-10g/L，因此，相应地可以使用较高浓度的淀粉浆液进行发酵，从而能够得到高酸度的发酵液。

根据本发明提供的柠檬酸发酵液的制备方法，其中，调浆步骤中，所述淀粉浆液的pH值优选为5.0-6.5；更优选为5.5-6.0。

根据本发明提供的柠檬酸发酵液的制备方法，其中，优选，发酵液的发酵终点的残还原糖为1-10g/L；更优选，发酵终点的残还原糖小于2-9g/L。这里，在现有技术中原料在成本中占较大比例，因此为了使原料充分得到发酵、节省粮耗在发酵终点标准选择为残还原糖为零或者酸度不再增加，这样就延长了发酵周期，效率低下；本发明由于将使用发酵液中和废液进行回配，中和废液中未转化的还原糖再次回到原料浆液中，进入发酵循环，因此不需要得到发酵液中的残还原糖完全转化，从而可以缩短生产周期，提高了效率，还可以节省能耗。

本发明中，将所述发酵步骤中得到柠檬酸发酵液进行提纯得到中和废液的方法可以为本领域技术人员公知的方法，例如，用钙盐法提纯柠檬酸发酵清液过程中得到的一次中和废液和/或二次中和废液，可以通过如下方法得到：将柠檬酸发酵液进行压滤以除去菌体，压滤后得到发酵清液，在75℃下，将碳酸钙缓慢加入到柠檬酸发酵清液中，控制pH值为3.8-4.1时，停止加入碳酸钙，反应4.8-5.1分钟，待反应液分层后，过滤，得到的滤液为一次中和废液。

按照本发明，所述淀粉浆液的制备方法可以采用本领域技术人员公知的各种常规的方法，例如，将淀粉质原料粉碎，将粉碎后的产物与水混合得到淀粉浆液。将淀粉质原料粉碎的条件和方式没有特别的限制，只要能够使淀粉质原料充分破碎即可，优选情况下，得到的粉碎后的产物的颗粒中50-60重量％的颗粒直径小于0.1cm。所述淀粉质原料可以为本领公知的各种可以用于酶解、发酵制备柠檬酸的含有淀粉的原料，例如，可以选自玉米、薯类(如木薯)、小麦和高粱中的一种或多种。

根据本发明，将淀粉浆液酶解的方法为本领域技术人员所公知。例如，将淀粉浆液与产酶微生物和/或酶混合，在产酶微生物的生长温度和/或酶有活力的温度下保温完成酶解得到酶解产物。

根据本发明，所述酶解产物的终点糖度的控制为本领域技术人员所公知，优选酶解产物的终点糖度为15-25g/L，更优选19-22g/L。

000000000000000000000000011111111111111111111111111111111111111111111111111111域技术人员所公知的制备柠檬酸的酶解条件，例如，所述酶解的温度可以为淀粉酶的任何最适作用温度，一般为70-98℃，更优选80-90℃；酶解的时间理论上越长越好，考虑到设备利用率，优选所述酶解的时间为60-180分钟，更优选为100-130分钟；所述酶解的pH值可以为淀粉酶的任何最适作用pH，一般为5.0-6.5，更优选pH值为5.3-6.3，最优选pH值为5.5-6.0。

由于微生物生长会产生副产物，因此优选直接加入酶。所述酶的用量越多越好，出于成本考虑，优选以每克淀粉质原料的干重计，所述淀粉酶的用量为10-60酶活力单位，更优选以每克淀粉质原料的干重计，所述淀粉酶的用量为15-50酶活力单位。

本发明所述酶的酶活力单位的定义为：在pH值为6.0、温度为70℃的条111萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

所述酶包括淀粉酶。

淀粉酶是指能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，所述淀粉酶一般包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。本发明所述酶包括淀粉酶。

α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，它能够任意地、不规则地切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖。生产此酶的微生物主要有枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。

β-淀粉酶又称淀粉1，4-麦芽糖苷酶，能够从淀粉分子非还原性末端切开1，4-糖苷键，生成麦芽糖。此酶作用于淀粉的产物是麦芽糖与极限糊精。此酶主要由曲霉、根霉和内孢霉产生。

糖化酶又称淀粉α-1，4-葡萄糖苷酶，此酶作用于淀粉分子的非还原性末端，以葡萄糖为单位，依次作用于淀粉分子中的α-1，4-糖苷键，生成葡萄糖。糖化酶0作用于支链淀粉后的产物有葡萄糖和带有α-1，6-糖苷键的寡糖；作用于直链淀粉后的产物几乎全部是葡萄糖。此酶产生菌主要是黑曲霉(左美曲霉、泡盛曲霉)、根霉(雪白根酶、德氏根霉)、拟内孢霉、红曲霉。

异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于枝链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将枝链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。此酶产生菌主要是嫌气杆菌、芽孢杆菌及某些假单孢杆菌等细菌。

按照本发明，在生成柠檬酸的条件下，将酶解产物进行发酵，得到柠檬酸发酵液的方法可以为本领域技术人员公知的方法，例如，在生成柠檬酸的条件下，将黑曲霉接种至含有酶解产物的发酵培养基中进行发酵。

根据本发明，所述发酵培养基可以为本领域常规的用于生产柠檬酸的发酵培养基。例如，可以将酶解产物进行固液分离得到酶解残渣和酶解清液，并用酶解清液与未经固液分离的酶解产物混合成一定比例配制发酵培养基。为了更易于发酵的进行，优选情况下，以培养基体积为基准，所述酶解清液的含量为70-90体积％，所述未经固液分离的酶解产物的含量为10-30体积％。更优选情况下，所述酶解清液含量为75-85体积％，未经固液分离的滤酶解产物体积为15-25体积％。

根据本发明所述的方法，该方法还可以包括向发酵培养基中添加氮源，添加氮源的时间在将黑曲霉接种至发酵培养基后24小时至发酵完成前5小时的时间段内，添加氮源的作用是为了更好的维持黑曲霉的生长和代谢。其中，所述氮源的种类为本领域技术人员所公知，例如，所述氮源可以为尿素、硫酸铵和硝酸铵中的一种或多种，所述氮源的加入量可以在很大范围内改变，优选情况下，以所述发酵培养基的总重量为基准，所述氮源的加入量为0.01-0.1重量％。

根据本发明，所述黑曲霉的接种量可以在很大范围内改变，优选情况下，以每升发酵培养基为基准，黑曲霉的接种量为5×10⁴-5×10⁵个孢子，更优选2.5×10⁵-3.5×10⁵个孢子。

所述孢子的个数可以通过本领域公知的方法测定，例如，通过血球计数板计数。具体可以通过如下方法测定：取一瓶培养黑曲霉的麸曲，将0.5％的吐温-80倒入瓶中定容到V1＝500mL，同时放入转子搅拌至悬液均匀。取V2＝5mL均匀孢子液稀释定容至V3＝100mL，超声分散10分钟，倒入烧杯内用磁力搅拌器使其均匀，取样采用血球计数板计数，计数得出每毫升稀释后孢子悬液孢子数N，则每瓶麸曲孢子数＝V1×(N×V3/V2)。

根据本发明，所述发酵步骤中发酵的条件可以在很大范围内改变，只要能够发酵得到柠檬酸即可，例如，发酵的条件包括：发酵的温度为25-45℃，pH值为1-7，罐压为0.05-0.1Mpa，通气量为0.15-0.5V/V·min，发酵的时间为45-75小时；更优选的情况下，所述发酵的条件包括：发酵的温度为30-40℃，pH值为2-4，罐压为0.06-0.09Mpa，通气量为0.2-0.3V/V·min，所述发酵的时间为55-60小时。

术语“通气量”一般以通气比来表示，通常以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示(V/V·min)，例如通气比为1∶0.05-0.5，简称通气量为0.05-0.5体积∶体积·分钟。

本发明发酵所使用的黑曲霉可以为商购的黑曲霉固体制剂或黑曲霉菌种，例如，黑曲霉Co827(上海新立工业微生物科技有限公司)、黑曲霉T01(天津工业微生物所)和黑曲霉菌株(中科院微生物所)。

所述黑曲霉可以采用常规的方法接种，例如，在被接种至发酵培养基中之前，将所述黑曲霉经过种子培养处理，之后将得到的种子液加入到发酵培养基中。黑曲霉种子培养的程度可以通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH在2.0-2.5、酸度0.5-2.0重量％、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时停止培养。

根据本发明，所述黑曲霉培养液的制备方法没有特别的限制，只要得到的培养液能够适用于黑曲霉的培养即可。

本发明中，所述黑曲霉的接种量可以在很大范围内改变，优选情况下，将黑曲霉接种在黑曲霉培养液中进行培养，接种后黑曲霉培养液中黑曲霉的浓度为每毫升黑曲霉培养液中1×10⁵-3×10⁵个孢子。

为了能够在将黑曲霉进行种子培养时，更好地为黑曲霉提供充足的养分，还可以向黑曲霉培养液中添加氮源，以所述黑曲霉培养液的总重量为基准，所述氮源的加入量可以为0.01-0.1重量％。

根据本发明，所述黑曲霉的培养条件可以在很大范围内改变，例如所述培养的条件可以包括：培养的温度可以为30-45℃，pH值可以为1-7，通气量可以为0.03-0.2体积∶(体积·分钟)，培养的时间可以为18-30小时；更优选的情况下，所述培养的条件可以包括：培养的温度可以为35-40℃，pH值可以为2-4，通气量可以为0.06-0.1体积∶(体积·分钟)，所述培养的时间可以为20-27小时。

所述培养的设备为本领域技术人员所公知，例如，可以使用发酵罐进行培养。

根据本发明，终点糖度为的测定方法可以是本领域公知的各种方法，优选，费林法参照国标GBT50099-2008。

根据本发明，残还原糖和每小时增酸的测定方法可以是本领域公知的各种方法，优选，费林法参照国标GBT50099-2008和Na(OH)滴定法参照国标GBT 8269-2006。

根据本发明，发酵液终点酸度的测定方法可以是本领域公知的各种方法，优选，Na(OH)滴定法参照国标GBT 8269-2006。

通过下列实施例进一步更详细地说明本发明，实施例是为了说明而非限制本发明。本领域中任何普通技术人员能够理解这些实施例不以任何方式限制本发明，可以适当的修改而不违背本发明的实质和偏离本发明的范围。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的柠檬酸发酵液的制备。

1)原料的粉碎：将收获的玉米在热水槽润焖，直至玉米的含水量为15重量％，然后通过粉碎机(江苏牧羊集团有限公司，968-3型)进行粉碎，得到淀粉质原料粉碎产物(粉碎颗粒中50重量％的颗粒直径小于0.1cm)；

2)调浆：用来自步骤8)的中和废液(1升中和废水中的水溶液中柠檬酸的含量为2.2克)作为调浆液与淀粉质原料混合进行调浆得到淀粉浆液，所述淀粉质原料与所述调浆液的重量比为1∶2.57，淀粉浆液的pH值为5.5；

3)酶解：在2)得到的淀粉浆液与淀粉酶(诺维信公司，α-淀粉酶，本发明实施例中均为此淀粉酶)混合，在90℃、pH为5.5的条件下进行酶解100分钟，相对于每克粉碎后的产物，淀粉酶的用量为40酶活力单位，得到酶解产物，终点糖度为20.2g/L；

4)过滤：将3)得到的80重量％的酶解产物通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出酶解清液和酶解残渣；

5)配制发酵培养基：将酶解清液和经固液分离的酶解产物以85∶15的体积比混合后加入到300L的发酵罐中，灭菌后得到发酵培养基，所述发酵培养基中碳源含量为19.6重量％，氮源含量为0.10重量％，磷源含量为350ppm，；

6)将步骤3)中的部分酶解产物加水稀释至重量的1/10，得到培养液，将培养液投入种子罐，加热到121℃消毒，维持30分钟后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种(黑曲霉T01，天津工业微生物所，本发明实施例中均为此黑曲霉菌种，接种量为：每升培养液为基准，接种3×10⁵个孢子)，在pH值为3、温度为36℃、0.4V/V·min的通气条件下进行菌种培养；通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，27小时之后，当pH在2.0、酸度10g/L、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养；

7)发酵：在5)所得的培养基中接入6)中培养的黑曲霉菌种(黑曲霉Co827，天津工业微生物所，本发明实施例中均为此黑曲霉菌种，接种量为：每升发酵培养基为基准，接种3×10⁵个孢子)，并通风供氧，在初始pH值为4、罐压为0.08Mpa、通气量0.15V/V·min左右、培养温度37℃的条件下，培养55h后，当残还原糖3g/L，停罐，终点酸度为177g/L；

8)中和废液的制备：将7)得到的柠檬酸发酵液进行压滤以除去菌体，压滤后得到发酵清液，在75℃下，将碳酸钙缓慢加入到柠檬酸发酵清液(每升柠檬酸发酵清液中柠檬酸的含量为179克)中，控制pH值为4.8时，停止加入碳酸钙，反应60分钟，待反应液分层后，过滤，得到滤液为一次中和废液。

实施例2

本实施例用于说明本发明提供的柠檬酸发酵液的制备。

1)原料的去皮及粉碎：将收获的玉米在热水槽润焖，直至玉米的含水量为15重量％，然后通过粉碎机(江苏牧羊集团有限公司，968-3型)进行粉碎，得到淀粉质原料(粉碎颗粒中52重量％的颗粒直径小于0.1cm)；

2)调浆：用来自步骤8)的中和废液(1升中和废水中的水溶液中柠檬酸的含量为2.3克)与原水调配调浆液，原水的用量占调浆液的50重量％，将所述调浆液与淀粉质原料混合进行调浆得到淀粉浆液，所述淀粉质原料与所述调浆液的重量比为1∶2.3，淀粉浆液的pH值为6.0；

3)酶解：在2)得到的淀粉浆液中加入淀粉酶(诺维信公司，α-淀粉酶，本发明实施例中均为此淀粉酶)进行酶解，相对于每克粉碎后的产物，淀粉酶的用量为40个酶活力单位，将该混合物在95℃、pH为5.0的条件下酶解120分钟，得到酶解产物，终点糖度为21.0g/L；

4)过滤：将3)得到的80％的酶解产物通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出酶解清液和酶解残渣；

5)配制发酵培养基，将酶解清夜和未过滤酶解产物以75∶25的体积比混合后加入到300L的发酵罐中，得到发酵培养基，其中，碳源含量为20.4重量％，氮源含量为0.12重量％，磷源含量为400ppm；

6)将步骤3)中的部分酶解产物加水稀释至重量的1/10，得到培养液，将培养液投入种子罐，加热到121℃消毒，维持30分钟后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种(黑曲霉T01，天津工业微生物所，本发明实施例中均为此黑曲霉菌种，接种量为：每升培养液为基准，接种3×10⁵个孢子)，在pH值为3、温度为36℃、0.4V/V·min的通气条件下进行菌种培养；通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，22小时之后，当pH在2.0、酸度10g/L、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养；

7)发酵：在5)所得的培养基中接入6)中培养的黑曲霉菌种(黑曲霉Co827，天津工业微生物所，本发明实施例中均为此黑曲霉菌种，接种量为：每升发酵培养基为基准，接种3×10⁵个孢子)，并通风供氧，在初始pH值为3.5、罐压为0.08Mpa、通气量0.15V/V·min左右、培养温度37℃的条件下，培养60h后，当残还原糖3g/L，停罐，终点酸度为183g/L。

8)中和废液的制备：将7)得到的柠檬酸发酵液进行压滤以除去菌体，压滤后得到发酵清液，在75℃下，将碳酸钙缓慢加入到柠檬酸发酵清液(每升柠檬酸发酵清液中柠檬酸的含量为181克)中，控制pH值为4.8时，停止加入碳酸钙，反应60分钟，待反应液分层后，过滤，得到的滤液为一次中和废液。

实施例3

本实施例用于说明本发明提供的柠檬酸发酵液的制备。

1)原料的去皮及粉碎：将收获的玉米在热水槽润焖，直至玉米的含水量为15重量％，然后通过粉碎机(江苏牧羊集团有限公司，968-3型)进行粉碎，得到淀粉质原料(粉碎颗粒中55重量％的颗粒直径小于0.1cm)；

2)调浆：用发酵液中和废液(1升中和废水中的水溶液中柠檬酸的含量为2.5克)与原水调配调浆液，原水的用量占调浆液的40重量％，将所述调浆液月淀粉质原料混合进行调浆得到淀粉浆液，所述淀粉质原料与所述调浆液的重量比为1∶2.45，淀粉浆液的pH值为5.8；

3)酶解：在2)得到的浆液中加入淀粉酶(诺维信公司，α-淀粉酶，本发明实施例中均为此淀粉酶)进行酶解，相对于每克粉碎后的产物，淀粉酶的用量为50个酶活力单位，进入喷射器，在95℃、pH为5.5的条件下酶解100分钟，得到酶解产物，终点糖度为21.0g/L；

4)过滤：将3)得到的80％的酶解产物通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出酶解清液和酶解残渣；

5)配制发酵培养基，将酶解清夜和未过滤酶解产物以8∶2的体积比混合后加入到300L的发酵罐中，得到发酵培养基，其中，碳源含量为20.3，氮源含量为0.11％，磷源含量为350ppm；

6)将步骤3)中的部分酶解产物加水稀释至重量的1/10，得到培养液，将培养液投入种子罐，加热到121℃消毒，维持30分钟后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种(黑曲霉T01，天津工业微生物所，本发明实施例中均为此黑曲霉菌种，接种量为：每升培养液为基准，接种3×10⁵个孢子)，在初始pH值为3.5、温度为36℃、0.4V/V·min的通气条件下进行菌种培养；通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，23小时之后，当pH在2.0、酸度10g/L、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养；

7)发酵：在5)所得的培养基中接入6)中培养的黑曲霉菌种(黑曲霉Co827，天津工业微生物所，本发明实施例中均为此黑曲霉菌种，接种量为：每升发酵培养基为基准，接种3×10⁵个孢子)，并通风供氧，pH值为2、罐压为0.08Mpa、通气量0.15V/V·min左右、培养温度37℃的条件下，培养57h后，当残还原糖5g/L，停罐，终点酸度为185g/L。

8)中和废液的制备：将7)得到的柠檬酸发酵液进行压滤以除去菌体，压滤后得到发酵清液，在75℃下，将碳酸钙缓慢加入到柠檬酸发酵清液(每升柠檬酸发酵清液中柠檬酸的含量为183克)中，控制pH值为4.8时，停止加入碳酸钙，反应60分钟，待反应液分层后，过滤，得到的滤液为一次中和废液。

实施例4

本实施例用于说明本发明提供的柠檬酸发酵液的制备。

1)原料的去皮及粉碎：将收获的玉米在热水槽润焖，直至玉米的含水量为15重量％，然后通过粉碎机(江苏牧羊集团有限公司，968-3型)进行粉碎，得到淀粉质原料(粉碎颗粒中57重量％的颗粒直径小于0.1cm)；

2)调浆：用发酵液中和废液(1升中和废水中的水溶液中柠檬酸的含量为2.3克)与原水调配调浆液，原水的用量占调浆液的60重量％，将所述调浆液与淀粉质原料混合进行调浆得到淀粉浆液，所述淀粉质原料与所述调浆液的重量比为1∶2.13，淀粉浆液的pH值为6.3；

3)酶解：在2)得到的浆液中加入淀粉酶(诺维信公司，α-淀粉酶，本发明实施例中均为此淀粉酶)进行酶解，相对于每克粉碎后的产物，淀粉酶的用量为40个酶活力单位，进入喷射器，在90℃、pH为6的条件下酶解130分钟，得到酶解产物，终点糖度为22.0g/L；

4)过滤：将3)得到的80％的酶解产物通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出酶解清液和酶解残渣；

5)配制发酵培养基，将酶解清液和未过滤酶解产物以7∶3的体积比混合后加入到300L的发酵罐中，得到发酵培养基，其中，碳源含量为21.0重量％，氮源含量为0.13重量％，磷源含量为450ppm；

6)将步骤3)中的部分酶解产物加水稀释至重量的1/10，得到培养液，将培养液投入种子罐，加热到121℃消毒，维持30分钟后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种(黑曲霉T01，天津工业微生物所，本发明实施例中均为此黑曲霉菌种，接种量为：每升培养液为基准，接种3×10⁵个孢子)，在pH值为3、温度为36℃、0.4V/V·min的通气条件下进行菌种培养；通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，20小时之后，当pH在2.0、酸度10g/L、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养；

7)发酵：在5)所得的培养基中接入6)中培养的黑曲霉菌种(黑曲霉Co827，天津工业微生物所，本发明实施例中均为此黑曲霉菌种，接种量为：每升发酵培养基为基准，接种3×10⁵个孢子)，并通风供氧，pH值为初始4.0、罐压为0.09Mpa、通气量0.5V/V·min左右、培养温度37℃的条件下，培养61h后，当残还原糖7g/L，终点酸度为186g/L。

8)中和废液的制备：将7)得到的柠檬酸发酵液进行压滤以除去菌体，压滤后得到发酵清液，在75℃下，将碳酸钙缓慢加入到柠檬酸发酵清液(每升柠檬酸发酵清液中柠檬酸的含量为182克)中，控制pH值为4.8时，停止加入碳酸钙，反应60分钟，待反应液分层后，过滤，得到的滤液为一次中和废液。

实施例5

本实施例用于说明本发明提供的柠檬酸发酵液的制备。

1)原料的去皮及粉碎：将收获的玉米在热水槽润焖，直至玉米的含水量为15重量％，然后通过粉碎机(江苏牧羊集团有限公司，968-3型)进行粉碎，得到淀粉质原料(粉碎颗粒中60重量％的颗粒直径小于0.1cm)；

2)调浆：用发酵液中和废液(1升中和废水中的水溶液中柠檬酸的含量为2.0克)与原水调配调浆液，原水的用量占调浆液的40重量％，将所述调浆液与淀粉质原料混合进行调浆得到淀粉浆液，所述淀粉质原料与所述调浆液的重量比为1∶2.7，淀粉浆液的pH值为5.3；

3)酶解：在2)得到的浆液中加入淀粉酶(诺维信公司，α-淀粉酶，本发明实施例中均为此淀粉酶)进行酶解，相对于每克粉碎后的产物，淀粉酶的用量为40个酶活力单位，进入喷射器，在80℃、pH为5.0的条件下酶解100分钟，得到酶解产物，终点糖度为19.0g/L；

4)过滤：将3)得到的80％的酶解产物通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出酶解清液和酶解残渣；

5)配制发酵培养基，将酶解清液和未过滤酶解产物以9∶1的体积比混合后加入到300L的发酵罐中，得到发酵培养基，其中，碳源含量为18.4重量％，氮源含量为0.07重量％，磷源含量为270ppm重量％；

6)将步骤3)中的部分酶解产物加水稀释至重量的1/10，得到培养液，将培养液投入种子罐，加热到121℃消毒，维持30分钟后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种(黑曲霉T01，天津工业微生物所，本发明实施例中均为此黑曲霉菌种，接种量为：每升培养液为基准，接种3×10⁵个孢子)，在36℃、初始pH值为4.0、0.4体积∶体积·分钟的通气条件下进行菌种培养；通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，25小时之后，当pH在2.0、酸度10g/L、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养；

7)发酵：在5)所得的培养基中接入6)中培养的黑曲霉菌种(黑曲霉Co827，天津工业微生物所，本发明实施例中均为此黑曲霉菌种，接种量为：每升发酵培养基为基准，接种3×10⁵个孢子)，并通风供氧，pH值为5、罐压为0.06Mpa、通气量0.3V/V·min左右、培养温度37℃的条件下，培养58h后，当残还原糖9g/L，停罐，终点酸度为167g/L。

8)中和废液的制备：将7)得到的柠檬酸发酵液进行压滤以除去菌体，压滤后得到发酵清液，在75℃下，将碳酸钙缓慢加入到柠檬酸发酵清液(每升柠檬酸发酵清液中柠檬酸的含量为16.4克)中，控制pH值为4.8时，停止加入碳酸钙，反应60分钟，待反应液分层后，过滤，得到的滤液为一次中和废液。

对比例1

本对比例用于说明现有技术的柠檬酸发酵液的制备。

根据实施例5的方法生产柠檬酸发酵液，不同的是，只用原水(新鲜水)进行调浆，所述淀粉质原料与所述调浆液的重量比为1∶3.2，另外，步骤7)中的发酵终点判断标准为，培养68h后，残还原糖为0g/L，停罐，终点酸度为141g/L。

从上述结果中可以看到，根据本发明的方法制备的实施例1-5的柠檬酸发酵液与通过现有技术的方法制备的对比例中的柠檬酸发酵液相比，由于使用中和废液代替水来进行调配，能够大大降低工艺用水量，且中和废液可重新利用于调浆过程，因此不需要等到完全发酵，缩短了生产周期，提高了生产效率，还达到了节省能源的目的，废水利用还有利于环保；而且由于中和废液回配解决了残糖高的问题，因此能够提高发酵糖度，最终得到高浓度的柠檬酸发酵液。

Claims (9)

1.一种柠檬酸发酵液的制备方法，其特征在于，该方法包括：

调浆步骤：将调浆液与淀粉质原料混合，得到淀粉浆液；所述调浆液为含有柠檬酸的水溶液，所述含有柠檬酸的水溶液含有来自于将发酵步骤得到柠檬酸发酵液进行提纯的过程中产生的中和废液，所述淀粉质原料与所述调浆液的重量比为1∶1.86-3；

酶解步骤：在酶解条件下，将调浆步骤得到的淀粉浆液与酶混合进行酶解，得到酶解产物；

发酵步骤：在生成柠檬酸的条件下，将酶解步骤得到的酶解产物进行发酵，得到柠檬酸发酵液；发酵终点为发酵液残还原糖含量1-10g/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，调浆步骤中，含有柠檬酸的水溶液为来自于将发酵步骤中得到柠檬酸发酵液进行提纯的过程中产生的中和废液或者该中和废液与水的混合物。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，以含有柠檬酸的水溶液的体积为基准，所述中和废液占40-60体积％，所述水占40-60体积％。

4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中，调浆步骤中，以一水柠檬酸计，所述1升含有柠檬酸的水溶液中柠檬酸的含量为1-3克。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，调浆步骤中，所述淀粉质原料与所述调浆液的重量比为1∶2.13-2.7。

6.根据权利要求1或5所述的方法，其中，调浆步骤中，所述淀粉浆液的pH值为5.0-6.5。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，酶解步骤中，所述酶解条件包括：酶解温度为70-98℃，酶解时间为60-180分钟，酶解的pH为5.0-6.5。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，发酵步骤中，发酵终点为发酵液残还原糖含量为2-9g/L。

9.根据权利要求1或8所述的方法，其中，发酵步骤中，所述发酵条件包括：发酵的温度为25-45℃，pH值为1-7，罐压为0.05-0.1Mpa，通气量为0.15-0.5体积∶体积·分钟，发酵的时间为45-75小时。