CN102321585A - miRNA-106a及其抑制剂在制备胶质瘤干细胞侵袭调控剂中的应用 - Google Patents
miRNA-106a及其抑制剂在制备胶质瘤干细胞侵袭调控剂中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及医学领域，特别涉及胶质瘤干细胞侵袭行为调控的调控剂，其技术方案为：miRNA-106a在制备胶质瘤干细胞侵袭促进剂中的应用；miRNA-106a的抑制剂在制备胶质瘤干细胞侵袭抑制剂中的应用；miRNA-106a在GSC中的表达显著高于GC，TIMP-2无论mRNA水平还是蛋白水平在GSC中的表达显著低于GC；miRNA-106a的抑制剂可以明显抑制GSC的侵袭能力；抑制miRNA-106a的表达后，TIMP-2mRNA水平和蛋白水平的表达显著升高，荧光素酶报告基因实验证实miRNA-106a不仅可以负调控TIMP-2的表达，而且是通过和TIMP-2的3’UTR相结合的方式直接调控TIMP-2的表达。
Description
技术领域
本发明涉及医学领域，特别涉及胶质瘤干细胞侵袭行为调控的调控剂。
背景技术
恶性胶质瘤(glioblastoma，GBM)是中枢神经***最常见的原发性恶性脑肿瘤。肿瘤细胞的侵袭性生长是恶性胶质瘤的重要生物学特性，这种侵袭特性使得手术难以彻底切除肿瘤组织，而且化疗和放疗效果差，术后复发率高，预后不佳。恶性胶质瘤的侵袭性生长和治疗抵抗机制尚不清楚。
最近大量的研究表明，肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)在肿瘤发生与发展中发挥重要作用。研究发现恶性胶质瘤中存在胶质瘤干细胞(glioma stem cells，GSCs)，这些GSCs具有自我更新能力、多向分化潜能以及形成肿瘤的能力。同时发现，GSCs具有高侵袭力，然而具体的分子机制不明。
microRNA(miRNA)是一类新近发现的长度约为21～23个核苷酸的非编码单链小分子RNA，通过调节靶基因的表达在发育和疾病中参与了增殖、迁移、分化和凋亡等生理性和病理性过程。越来越多的证据显示不同类型的miRNA参与了调控肿瘤的发生及转移。此外，目前已有研究发现CSCs中miRNA的表达谱与正常干细胞中的不同，并在肿瘤的诊断、治疗和预后中具有重要意义。miRNA的表达可能参与了恶性胶质瘤侵袭的调控，但是和GSCs生物学行为之间的关系还需要进一步深入研究。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种胶质瘤干细胞侵袭的促进剂，该促进剂为制备胶质瘤干细胞侵袭模型提供了有效的途径。
miRNA-106a在制备胶质瘤干细胞侵袭促进剂中的应用。
进一步，miRNA-106a在制备TIMP-2抑制剂中的应用。
进一步，miRNA-106a在制备MMP2促进剂中的应用。
进一步，miRNA-106a在制备MMP9促进剂中的应用。
本发明的目的之二在于提供一种胶质瘤干细胞侵袭的抑制剂，该抑制剂为治疗胶质瘤提供了新思路。
为实现上述方案，本发明的技术方案为：
miRNA-106a的抑制剂在制备胶质瘤干细胞侵袭抑制剂中的应用。
进一步，所述miRNA-106a为TIMP-2的抑制剂。
进一步，所述miRNA-106a为MMP2促进剂。
进一步，所述miRNA-106a为MMP9促进剂。
进一步，所述miRNA-106a的抑制剂为Anti-miR miRNA-106a inhibitors。
上述技术方案是通过如下方法得到的：首先分离了人胶质瘤细胞系U87和原代胶质瘤标本来源的CD133+胶质瘤细胞(glioma cells，GCs)，并通过鉴定证实了人胶质瘤细胞系U87和原代胶质瘤标本来源的CD133+胶质瘤细胞具有GSCs特性；然后，根据miRNA芯片结果(miRCURY LNATM microRNA array(v.10.0)，丹麦Exiqon Life Sciences公司)发现了两个功能性的miRNA，其中一个为miRNA-106a，检测了miRNA-106a和TIMP-2通路在GSCs和GCs中的表达；最后，通过研究miRNA-106a对TIMP-2的直接调控作用并证明这是miRNA-106a促进GSCs侵袭的重要机制。
本发明的有益效果在于：分离得到的CD133+细胞具有自我更新、多向分化潜能、形成肿瘤等的生物学特性；证明GSC较胶质瘤细胞(GC)具有高侵袭性；miRNA-106a在GSC中的表达显著高于GC(P＜0.05)，TIMP-2无论mRNA水平还是蛋白水平在GSC中的表达显著低于GC(P＜0.05)；miRNA-106a的抑制剂可以明显抑制GSC的侵袭能力(P＜0.05)；抑制miRNA-106a的表达后，TIMP-2mRNA水平和蛋白水平的表达显著升高(P＜0.05)，荧光素酶报告基因实验证实miRNA-106a不仅可以负调控TIMP-2的表达，而且是通过和TIMP-2的3’UTR相结合的方式直接调控TIMP-2的表达。所以，GSCs具有高侵袭特性，发现miRNA-106a高表达促进了GSCs的侵袭性，其机制至少是通过下调TIMP-2、上调MMP2和MMP9表达而实现的。
附图说明
图1为人胶质瘤细胞系U87和原代胶质瘤标本来源的GSCs的分离流式细胞结果图。
图2为为CD133-细胞在肿瘤干细胞培养基中培养36小时，CD133+细胞在肿瘤干细胞培养基中培养7天；光学显微镜观察，×200。
图3为CD133+细胞中CD133和nestin的表达免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜观察，DAPI标记细胞核，标尺＝50μm。
图4为CD133+细胞形成的细胞球诱导分化7天后，分化成表达GFAP、β-tubulin III和MBP的细胞。免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜观察，DAPI标记细胞核，标尺＝50μm。
图5为CD133+细胞和CD133-细胞在裸小鼠体内成瘤大小的照片。
图6为CD133+细胞和CD133-细胞在裸小鼠体内成瘤大小的定量分析结果，*P＜0.05，**P＜0.01。
图7为Transwell侵袭实验细胞数目图，光学显微镜观察，×200。
图8为Transwell侵袭实验细胞数目定量分析结果，*P＜0.05。
图9为定量PCR检测miRNA-20a和miR-106a在GSCs和GCs中的表达差异，**P＜0.01，***P＜0.001。
图10为miRNA-20a和miR-106a分别对GSCs侵袭能力的影响，Transwell侵袭实验细胞数目图，光学显微镜观察，×200。
图11为Transwell侵袭实验细胞数目定量分析结果，*P＜0.05，，其中miRNA-20aI代表miRNA-20a抑制剂，miRNA-106aI代表miRNA-106抑制剂。
图12为TIMP-2、MMP2和MMP9mRNA水平在GSCs和GCs中的表达差异，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
图13为TIMP-2、MMP2和MMP9蛋白水平在GSCs和GCs中的表达差异。
图14为分别转染miRNA-20a和miR-106a抑制剂后TIMP-2、MMP2和MMP9mRNA水平的表达变化，*P＜0.05，**P＜0.01。
图15为分别转染miRNA-20a和miR-106a抑制剂后TIMP-2、MMP2和MMP9蛋白水平的表达变化。
图16为荧光素酶报告基因实验检测miRNA-20a和miR-106a分别对TIMP-2的直接调控作用*P＜0.05。
图17为生物信息学预测的miRNA-20a和miR-106a与TIMP-2的结合位点的截图。
附图中U87具体为胶质瘤细胞系U87，Case1具体指原代胶质瘤细胞Case1，Case2具体指指原代胶质瘤细胞Case2；miR为miRNA的简写。
具体实施方式
实施例1胶质瘤干细胞
1材料
原代人胶质瘤细胞的培养
新鲜胶质瘤组织取自西南医院和大坪医院(重庆市第三军医大学)神经外科，先后共取2例，均为多形性胶质母细胞瘤(WHO IV级)。原代胶质瘤组织块用0.01M PBS清洗3次，仔细去除表面纤维和坏死组织；将组织块浸入少量DMEM培养基(美国Gibco公司)中，并用眼科剪将肿瘤组织块反复剪切至1mm3的碎块；加入混合胶原酶(美国Gibco公司)消化20～30分钟；边消化边用移液器吹打，获得单细胞悬液，置于DMEM培养基(含体积分数为10％胎牛血清)中培养；24小时后换液除去红细胞，待细胞长至80％～90％时用于分选CD133+细胞。
胶质瘤细胞系的培养
人胶质瘤细胞系U87来自美国菌种保藏中心(ATCC)，保藏号为HTB-14TM。人胶质瘤细胞系U87用含体积分数为10％胎牛血清(美国Gibco公司)的DMEM培养基，置37℃、体积分数为5％CO2孵箱(相对湿度为95％)中培养。细胞换液时间为2～3天，传代时间为3～5天，传代前用质量分数为0.25％胰蛋白酶+质量分数为0.02％EDTA(美国Sigma公司)混合消化液消化2～4分钟。
2CD133+细胞的分离和培养
原代胶质瘤细胞和胶质瘤细胞系U87长至80％～90％时，PBS清洗3次；加入胰蛋白酶+EDTA消化液消化5分钟，轻轻吹打使细胞脱落，成单细胞悬液；收集细胞悬液，1000rpm离心5min；弃去上清，PBS清洗2次，1000rpm离心5min；用流式Buffer将细胞浓度稀释为2×107/ml；每100μl细胞悬液加入10μl CD133/2-PE抗体(德国Miltenyi公司)，对照组只加10μl流式Buffer；4℃避光孵育30min，每10min吹打混匀一次，避免细胞沉淀；用10倍体积PBS稀释上述各组细胞悬液，洗涤2次后，1000rpm离心5min；用流式Buffer重悬细胞使浓度为2×107/ml，上流式细胞分选仪(美国Becton and Dickinson公司)进行检测和分选；分选后，用含有B27(1×，美国Gibco公司)、bFGF(20ng/ml，美国Upstate公司)和EGF(20ng/ml，美国Sigma公司)的DMEM/F12(美国Gibco公司)干细胞完全培养基重悬后培养，换液和传代均采取半量换液方式。
如图1所示，流式细胞技术检测分选前，CD133+细胞占胶质瘤细胞系U87以及原代胶质瘤细胞Case1、Case2的比例分别为0.5％、2.4％和1.5％。分选后回测，CD133+细胞比例高达95％以上，CD133-细胞中CD133的表达在1％以下。
3免疫荧光染色
将流式细胞技术检测分选所得到的5×104个CD133-细胞和CD133+细胞接种于DMEM/F12干细胞完全培养基中。免疫荧光染色检测培养的CD133+细胞中干细胞标记物CD133和nestin的表达。固定好的各组细胞片用0.01M PBS水化，5min×3次；滴加山羊血清(北京中杉金桥公司)37℃，封闭30min，吸去多余血清，勿洗；各组分别滴加小鼠抗人CD133单克隆抗体(1∶100，德国Miltenyi公司)、小鼠抗人nestin单克隆抗体(1∶100，美国Chemicon公司)，4℃过夜；0.01M PBS洗涤5min×3次；各组分别滴加FITC标记的山羊抗小鼠IgG(1∶100，美国Molecular Probes公司)，37℃孵育30min后，吸去多余二抗液体，勿洗；滴加20μl DAPI(美国Sigma公司)室温孵育10min；0.01M PBS洗涤5min×3次；滴加少许封片剂，反扣在载玻片上，注意勿产生气泡，激光共聚焦显微镜(德国Leica公司)下观察，免疫荧光染色显示，分选出的CD133+细胞广泛表达神经干细胞标记物CD133和nestin如图3所示。免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜观察，DAPI标记细胞核，标尺＝50μm。
4CD133+细胞成球培养和分化
将分选得到5×104个CD133-细胞和CD133+细胞接种于DMEM/F12干细胞完全培养基中培养，观察CD133-细胞和CD133+细胞形成细胞球的能力。将CD133+细胞形成的细胞球接种于DMEM培养基(含质量分数为10％胎牛血清)中进行诱导分化，7天后用免疫荧光染色方法检测分化细胞中GFAP、β-tubulin III和MBP的表达。固定好的各组细胞片用0.01M PBS水化，5min×3次；滴加山羊血清37℃，封闭30min，吸去多余血清，勿洗；各组分别滴加兔抗人GFAP多克隆抗体(1∶100，美国Dako公司)、兔抗人MBP多克隆抗体(1∶100，美国Chemicon公司)和小鼠抗人β-tubulinIII单克隆抗体(1∶100，美国Chemicon公司)，4℃过夜；0.01M PBS洗涤5min×3次；各组分别滴加FITC标记的山羊抗小鼠IgG(1∶100，美国Molecular Probes公司)、FITC标记的山羊抗兔IgG(1∶100，美国Molecular Probes公司)、Cy3标记的山羊抗小鼠IgG(1∶500，美国Molecular Probes公司)、Cy3标记的山羊抗兔IgG(1∶500，美国Molecular Probes公司)，37℃孵育30min后，吸去多余二抗液体，勿洗；滴加20μl DAPI室温孵育10min；0.01M PBS洗涤5min×3次；滴加少许封片剂，反扣在载玻片上，注意勿产生气泡，普通光学显微镜和激光共聚焦显微镜下观察。
有图2所示，在光学显微镜下观测：CD133+细胞于3～4天开始形成细胞球，7～10天后70％～80％CD133+细胞形成克隆性生长的细胞球，它们呈圆形或卵圆形，类似神经干细胞球，边界清楚，呈悬浮生长，折光性好，与现有技术报道一致。在相同培养条件下，大部分CD133-细胞于6小时左右贴壁，24小时左右可见分化的细胞，细胞呈梭形，与常规条件培养下的亲代细胞相似，培养3～4天后，细胞开始逐渐死亡。
如图4所示，光学显微镜观察，将CD133+细胞球接种于DMEM培养基(含体积分数为10％胎牛血清)中，细胞球约6小时左右开始贴壁，16小时左右细胞球外侧细胞最先发生分化，分化的细胞呈梭形生长；培养3天左右细胞球变小，内侧细胞开始分化；培养7天后，细胞球中大部分细胞发生分化。免疫荧光染色显示，这些细胞可表达星形胶质细胞标志物GFAP，少突胶质细胞标志物MBP和神经元标志物β-tubulinIII，如图4所示。
实施例2移植瘤动物模型的建立
1实验动物来源
实验用动物4～6周龄的雌性裸鼠，体重15～20g，由第三军医大学实验动物中心提供，标准条件饲养。
2实验分组
实验共分3组，每组5只，第一组为U87-CD133-细胞和U87-CD133+细胞组；第二组为原代Case1-CD133-细胞和原代Case1-CD133+细胞组；第三组为：原代Case2-CD133W细胞和原代Case2-CD133+细胞组。
3皮下移植瘤模型
皮下移植瘤模型用于分析GSCs成瘤能力。5×104个CD133+细胞(来源于U87细胞系和原代胶质瘤细胞)和CD133-细胞(来源于U87细胞系和原代胶质瘤细胞)，悬于100μl PBS中，分别注射于4～6周龄裸鼠左、右腹股沟下。接种后，动物全部饲养于SPF级环境中，每周观察移植瘤大小，共观察6周。
由图5和图6所示，体内成瘤实验显示，无论是U87细胞还是原代胶质瘤标本来源的CD133+细胞成瘤能力显著高于CD133-细胞，CD133-细胞几乎不成瘤。
实施例3GSCs和GCs的体外侵袭
研究GSCs和GCs侵袭能力的差异，我们采用Transwell体外侵袭实验观察了GSCs和GCs的侵袭能力。Transwell体外侵袭实验共分为2组，分别为GSCs组和GCs组，具体操作步骤为：将细胞弃去培养基，PBS洗涤细胞3次；贴壁细胞用胰蛋白酶+EDTA消化液消化后离心，悬浮细胞直接离心后，用培养基重悬，调整细胞浓度为5×105/ml；拆开transwell小室(美国BD公司)包装，用无菌镊子夹出transwell小室放入24孔板中；吸取10μl Matrigel胶(美国BD公司)混合液铺胶于transwell膜上，注意铺注均匀，动作迅速且温和，Matrigel胶于37℃会迅速凝固；将铺好胶的小室连同24孔板一起放入37℃培养箱30min；在小室下室加入500μl完全干细胞培养基，注意下室培养基与小室间不要有气泡产生；分别向小室上室内加入100μl上述各组细胞悬液，放入37℃培养箱孵育；24小时取出U87细胞和干细胞，48小时取出原代胶质瘤细胞和干细胞，将小室内的上室和下室培养基吸出，PBS洗涤3次；加入下室500μl 4％多聚甲醛，固定20min；PBS洗涤3次，每次5min；小室下室加入结晶紫(上海科兴生物科技有限公司)500μl，染色20min；染色完毕后，用自来水清洗终止染色，注意不能剧烈摇动小室，以免膜上细胞脱落，清洗4次；在显微镜下观察和计算穿过小室的细胞数目。
如图7、8示，来源于U87细胞系的GSCs穿过小室的细胞数目平均为360个左右，而对应的GCs穿过小室的细胞数目平均仅为20个左右；来源于原代胶质瘤细胞Case 1的GSCs穿过小室的细胞数目平均为250个左右，而对应的GCs穿过小室的细胞数目平均仅为21个左右；来源于原代胶质瘤细胞Case 2的GSCs穿过小室的细胞数目平均为309个左右，而对应的GCs穿过小室的细胞数目平均仅为52个左右。由此可见，GSCs侵袭的数量显著多于GCs(P＜0.05)。
实施例4miRNA-106a在GSCs和GCs中的表达差异
1microRNA芯片
采用Trizol试剂(美国Invitrogen公司)按其操作说明书从CD133-细胞和CD133+细胞中提取总RNA。采用酶标仪测定RNA浓度。然后将提取的总RNA送往上海康成生物工程有限公司，进行microRNA芯片检测(miRCURY LNATM microRNA array(v.10.0)，丹麦Exiqon LifeSciences公司)。
采用miRNA高通量芯片技术对人胶质瘤细胞系U87和原代胶质瘤标本来源的GSCs和GCs进行检测，总共638条成熟miRNA的探针。U87细胞系来源的GSCs和GCs中有62个miRNA表达有显著差异，其中59个显著上调，3个显著下调；原代胶质瘤标本来源的GSCs和GCs中有95个miRNA表达有显著差异，其中75个显著上调，20个显著下调。从中筛选出在U87细胞系和原代标本中表达均有显著差异(fold≥1.5)的miRNA共15条，均为在GSCs中表达上调的miRNA，下调的miRNA无交集(表1)。
miRNA-20a序列(SEQ ID NO：11)：5’-uaaagugcuuauagugcagguag-3’
miRNA-106a序列(SEQ ID NO：12)：5’-aaaagugcuuacagugcagguag-3’
表1GSCs和GCs中表达有显著差异的miRNAs
为了验证miRNA芯片结果，我们用定量PCR检测了miRNA-106a在GSCs和GCs中的表达差异。
2qRT-PCR
qRT-PCR检测miRNA的表达
采用Trizol试剂按其操作说明书从CD133-细胞和CD133+细胞中提取总RNA。采用酶标仪测定RNA浓度。采用美国Ambion公司microRNA Reverse Transcription Kit按其操作说明书进行反转录。采用日本Takara公司
Premix Ex TaqTM II Kit按其操作说明书进行qPCR反应。
根据文献(1.Morrison CJ，.Cellular activation of MMP-2(gelatinase A)by MT2-MMP occursvia a TIMP-2-independent pathway.J Biol Chem 2001；2.Lockwood CJ，Matrix metalloproteinase 9(MMP9)expression in preeclamptic decidua and MMP9 induction by tumor necrosis factor alphaand interleukin 1beta in human first trimester decidual cells.Biol Reprod 2008.)设计TIMP-2、MMP2和MMP9的qRT-PCR引物序列，GAPDH作为内参照物。由上海英俊生物技术有限公司合成。引物序列如下：
采用Trizol试剂按其操作说明书从CD133-细胞和CD133+细胞中提取总RNA。采用酶标仪测定RNA浓度。采用日本Takara公司PrimeScriptTM RT reagent Kit按其操作说明书进行反转录。采用日本Takara公司Premix Ex TaqTM II Kit按其操作说明书进行qPCR反应。
如图9示，miRNA-20a在U87细胞系来源的GSCs中上调了9倍左右较GCs，而在两个原代胶质瘤标本来源的GSCs中分别上调了7倍和15倍左右；miR-106a在U87细胞系来源的GSCs中上调了2倍左右较GCs，而在两个原代胶质瘤标本来源的GSCs中分别上调了4倍和35倍左右。由此可见，miRNA-20a和miR-106a在GSCs中的表达较GCs显著上调，与上述microRNA芯片结果相一致。如图12所示，与GCs相比，TIMP-2mRNA在U87细胞系和两个原代胶质瘤标本来源的GSCs中的表达均显著下降了约50％；MMP2mRNA在GSCs中的表达则明显上调，分别为GCs的1.3倍、3倍和1.75倍；MMP9mRNA在GSCs中的表达也明显上调，分别为GCs的2.75倍、11.5倍和1.3倍。
实施例5miRNA-106a对GSCs侵袭的调控
1miRNA-106a对GSCs的体外侵袭
体外侵袭的具体操作步骤详见“GSCs和GCs的体外侵袭”部分。
为了研究miRNA-106a对GSCs侵袭的影响，在GSCs中分别转染了miRNA-20a的抑制剂(Anti-miR miRNA-20a inhibitors，货号AM10057，美国Ambion公司)和miR-106a的抑制剂(Anti-miR miRNA-106a inhibitors，货号AM12567，美国Ambion公司)后，采用Transwell体外侵袭实验观察了GSCs侵袭能力的变化。
如图10、11所示，在转染了miR inhibitor negative control(货号AM17010，美国Ambion公司)的对照组，来源于U87细胞系、原代胶质瘤细胞Case 1和原代胶质瘤细胞Case 2的GSCs穿过小室的细胞数目平均为350个、245个和300个左右；转染了miRNA-20a抑制剂之后，来源于U87细胞系、原代胶质瘤细胞Case 1和原代胶质瘤细胞Case 2的GSCs穿过小室的细胞数目平均仅为101个、64个和81个左右；转染了miR-106a抑制剂之后，来源于U87细胞系、原代胶质瘤细胞Case 1和原代胶质瘤细胞Case 2的GSCs穿过小室的细胞数目平均仅为99个、70个和90个左右。由此可见，转染miRNA-20a和miR-106a抑制剂后，GSCs侵袭的数量显著下降(P＜0.05)。
2Western blot
为了研究miRNA-20a和miR-106a在GSCs和GCs中的表达有显著差异后其潜在靶基因TIMP-2通路的表达是否有差异，分别采用定量PCR和Western blot技术检测了TIMP-2、MMP2和MMP9mRNA水平和蛋白水平的表达情况。采用美国Thermo公司
Mammalian ProteinExtraction Reagent按其操作说明书提取细胞总蛋白。采用美国Pierce公司
BCA ProteinAssay Kit按其操作说明书测定总蛋白浓度，在酶标仪上测定蛋白的标准曲线和浓度。将提取出的细胞蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳；采用半干电转印***(美国Bio-Rad公司)电转NC膜(美国Amersham Biosciences公司)；用含质量分数为5％脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭4小时；将TIMP-2(1∶200，美国Chemicon公司)、MMP2(1∶1500，美国Abcam公司)和MMP9(1∶200，美国Santa Cruz公司)抗体与含质量分数为5％脱脂奶粉的TBST溶液按照需要的比例稀释后和膜一起孵育，4℃过夜；用TBST溶液洗涤3次后，将二抗与含质量分数为5％脱脂奶粉的TBST溶液按照体积比为1∶1500的比例稀释后和膜一起孵育，在摇床上轻摇，室温2小时；用TBST溶液洗涤3次后，采用美国Pierce公司SuperSignal West PicoChemiluminescent Substrae试剂盒，按照说明书操作，用凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)自动曝光记录成像。TIMP-2、MMP2和MMP9蛋白水平在GSCs和GCs中的表达与实施例4中TIMP-2、MMP2和MMP9的mRNA水平相一致，在GSCs和GCs存在显著性差异，详见图13。
3miRNA-20/106a调控TIMP-2通路的表达
为了研究miRNA-20a和miR-106a在GSCs中是否调控TIMP-2的表达，将miRNA-20a和miR-106a的抑制剂Anti-miR miRNA-20a inhibitors(货号AM10057，美国Ambion公司)和Anti-miR miRNA-106a inhibitors(货号AM12567，美国Ambion公司)分别转染进GSCs中，采用定量PCR和Western blot技术检测了TIMP-2、MMP2和MMP9mRNA水平和蛋白水平的表达变化。
TIMP-23’UTR结合片段的设计与合成
根据生物信息学预测(图17)，设计TIMP-23’UTR与miRNA-20a和miR-106a结合片段的序列以及突变序列。由宝生物工程(大连)有限公司合成(pMD-T Simple-miR-20/106-TIMP2-WT和pMD-T Simple-miR-20/106-TIMP2-MUT)。
片段序列如下：
miR-20/106-TIMP2-WT(SEQ ID NO：9)：
ggactagttaacatttactcctgtttctgctgattgtttttttaatgttttggtttgtttttgacatcagctgtaatcattcctgtgctgtgttttttattacccttggtaggtattagacttgcacttttttaaaaaaaggtttctgcatcgtggaagcatttgacccagagtggaacgcgtggcctatgcaggtggattccttcaggtctttcctttggttctttgaagcttgg
miR-20/106-TIMP2-MUT(SEQ ID NO：10)：
ggactagttaacatttactcctgtttctgctgattgtttttttaatgttttggtttgtttttgacatcagctgtaatcattcctgtgctgtgttttttattacccttggtaggtattagacttgcagatttttaaaaaaaggtttctgcatcgtggaagcatttgacccagagtggaacgcgtggcctatgcaggtggattccttcaggtctttcctttggttctttgaagcttgg
如图14所示，转染了miRNA-20a抑制剂后，TIMP-2mRNA在U87细胞系和两个原代胶质瘤标本来源的GSCs中的表达水平分别是转染了miR inhibitor negative control(货号AM17010，美国Ambion公司)的对照组的1.5倍、2.05倍和1.95倍左右，MMP2mRNA表达水平较对照组则分别下降了约50％、48％和30％，MMP9mRNA表达水平较对照组也分别下降了约74％、77％和38％；转染了miR-106a抑制剂后，TIMP-2mRNA的表达水平分别是转染了miR inhibitor negative control(货号AM17010，美国Ambion公司)的对照组的1.2倍、1.65倍和1.35倍左右，MMP2mRNA表达水平较对照组则分别下降了约52％、48％和28％，MMP9mRNA表达水平较对照组也分别下降了约87％、82％和25％。而在转染了miRNA-20a抑制剂和miR-106a抑制剂后，TIMP-2、MMP2和MMP9蛋白水平的表达与mRNA水平相一致，和转染了miR inhibitor negative control(货号AM17010，美国Ambion公司)的对照组相比均有显著性差异(图15)。
4miR-106a直接调控TIMP-2的机制研究
为了研究miR-106a是否直接调控TIMP-2的表达，我们构建了荧光素酶报告基因载体，采用荧光素酶报告基因实验进行检测。
用Hind III和Spe I(日本TaKaRa公司)双酶切pMIR-Reporter、pMD-TSimple-miR-20/106-TIMP2-WT和pMD-T Simple-miR-20/106-TIMP2-MUT质粒；琼脂糖凝胶电泳，采用胶回收试剂盒(美国OMEGA公司)胶回收pMIR-Reporter质粒大片段、miR-20/106-TIMP2-WT和miR-20/106-TIMP2-MUT片段；将回收的pMIR-Reporter质粒大片段与miR-20/106-TIMP2-WT、miR-20/106-TIMP2-MUT片段用T4DNA ligase(日本TaKaRa公司)连接，4℃过夜；将连接质粒转化DH5α感受态细胞，铺含氨苄青霉素LB平板，37℃培养过夜；挑取pMIR-miR-20/106-TIMP2-WT和pMIR-miR-20/106-TIMP2-MUT单克隆菌株37℃过夜培养后，采用质粒小量抽提试剂盒(美国OMEGA公司)进行质粒抽提；将抽提出的pMIR-miR-20/106-TIMP2-WT和pMIR-miR-20/106-TIMP2-MUT质粒再用Hind III和Spe I双酶切进行鉴定。
质粒转染和荧光素酶报告基因实验
分别将miRNA-20a抑制剂和模拟体(miR-20a mimics，货号PM10057，美国Ambion公司)、miR-106a抑制剂和模拟体(miR-106a mimics，货号PM12567，美国Ambion公司)以及pMIR-miR-20/106-TIMP2-WT、pMIR-miR-20/106-TIMP2-MUT和pRL-TK质粒用Lipofectamine2000(美国Invitrogen公司)转染试剂转染进CD133+细胞48h后，采用美国Promega公司Dual-Luciferase Reporter Assay System试剂盒按其操作说明书进行荧光素酶报告基因实验，计算海肾荧光/萤火虫荧光的比值，分析miRNA-20a和miR-106a对TIMP-2的调控作用。
如图16所示，含有野生型TIMP-23′UTR的报告载体荧光素酶活性较对照载体和突变型TIMP-23′UTR报告载体的荧光素酶活性分别显著降低了50％和40％左右(P＜0.05)。转染了miRNA-20a和miR-106a的抑制剂后，含有野生型TIMP-23′UTR的报告载体荧光素酶活性显著增加了50％和33％左右(P＜0.05)，转染miRNA-20a和miR-106a的模拟体后，报告载体荧光素酶活性则显著降低了35％和16％左右(P＜0.05)。而miRNA-20a和miR-106a的抑制剂和模拟体对含有突变型TIMP-23′UTR报告载体的荧光素酶活性无显著影响(P＞0.05)。
综上所述：恶性胶质瘤中存在的GSCs的发现有助于我们深入认识这种肿瘤的发生和发展进程，特别是GBM侵袭的机制。目前GSCs可以采用干细胞表面标记物CD133流式细胞分选技术和在特殊的干细胞培养条件下细胞成球实验这两种方法从胶质瘤细胞中分离得到。这群细胞可以通过体外和体内实验从干细胞自我更新能力、多向分化潜能和肿瘤形成能力等方面进行鉴定。GSCs已经被发现在胶质瘤血管生成和产生常规治疗抵抗中起重要作用。此外，GSCs还具有很高的侵袭能力，可能是胶质瘤复发的根源。
虽然GBM细胞高侵袭特性可能导致了目前治疗的失败，但是GSCs是否参与了胶质瘤的侵袭仍不十分清楚。因此，本发明将GSCs用流式细胞分选技术从人胶质瘤细胞系U87和原代人胶质瘤组织中分离出来，在无血清的干细胞培养条件下培养，并检测了它们的侵袭能力。结果证实GSCs的侵袭能力显著高于non-GSCs即CD133-细胞，GSCs是胶质瘤发生侵袭的重要原因。
miRNA通过与靶基因mRNA 3′非翻译区(3′UTR)相互作用导致靶mRNA降解或抑制蛋白质的合成，在肿瘤细胞癌基因和抑癌基因的调控中发挥重要作用。miRNA在各种肿瘤组织中的表达水平明显异常，这种表达异常与肿瘤细胞包括胶质瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、转移以及血管生成等方面密切相关，甚至也与GSCs的恶性生物学特性有关。然而，miRNA在GSCs侵袭中的作用仍未阐明清楚。
本发明采用miRNA芯片和qRT-PCR技术检测了成熟miR-20/106a的表达，发现miR-20a和miR-106a(简称miR-20/106a)在GSC中较胶质瘤细胞显著高表达，结果第一次证实了miR-20a和miR-106a在GSC中表达是增加的，提示miR-20a和miR-106a在GSC中可能发挥着癌基因的作用。
miR-20a和miR-106a在不同的细胞中有许多预测的靶基因，之所以选择TIMP-2、MMP2和MMP9这条通路是因为它们在肿瘤的侵袭中具有重要作用。大量研究表明在肿瘤侵袭转移中，最重要的步骤是肿瘤细胞突破ECM及基膜。MMPs介导的ECM降解处于关键作用，MMPs破坏基底膜完整性是肿瘤细胞发生侵袭的重要原因。ECM的降解过程主要依靠对基底膜的关键组成成分IV型胶原有降解作用的MMP2和MMP9。MMP2和MMP9属于MMPs家族中的明胶酶类。TIMP-2是MMPs的天然抑制物，TIMP-2以1∶1的共价形式与激活状态的MMPs结合并抑制MMPs的活性，通过抑制MMPs对ECM的降解，从而维持基底膜的完整性，被认为是一类肿瘤侵袭转移的抑制因子。但是，TIMP-2在肿瘤细胞包括胶质瘤细胞中的表达较低。
miRNA可以通过抑制蛋白质翻译或降解靶mRNA来抑制靶基因的表达。因此，本发明采用qRT-PCR和western blot技术来检测miR-20a和miR-106a是否调控TIMP-2的表达。实施例中可以看出：miR-20a和miR-106a被抑制后，TIMP-2无论是mRNA水平还是蛋白水平都显著增加，而它下游的MMP2和MMP9的mRNA水平和蛋白水平都显著降低。因此，结果显示miR-20a和miR-106a可以负性调控TIMP-2的表达。接着，通过研究miR-20a和miR-106a是否可以直接调控TIMP-2的表达，采用荧光素酶报告基因实验进行检测。实施例表明，当miR-20a和miR-106a被抑制后，含有野生型TIMP-23′UTR的报告载体荧光素酶活性较对照载体显著升高，而对突变型TIMP-23′UTR的报告载体则无影响。因此，结果第一次证明了miR-20a和miR-106a可以通过与TIMP-23′UTR相结合的方式直接下调TIMP-2的表达。
本发明观察到了miR-20a和miR-106a和GSCs的侵袭能力相关，发现miR-20a和miR-106a的下调可以显著地抑制GSCs的侵袭能力。因此，我们也是第一次证实了miR-20/106a可以通过直接下调GSCs中TIMP-2的表达从而促进了胶质瘤的侵袭能力。
综上所述，miRNA-106a具备在制备胶质瘤干细胞侵袭促进剂中的应用的能力，miRNA-106a的抑制剂具备在制备胶质瘤干细胞侵袭抑制剂中的应用的能力。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
Claims (9)
1.miRNA-106a在制备胶质瘤干细胞侵袭促进剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：miRNA-106a在制备TIMP-2抑制剂中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：miRNA-106a在制备MMP2促进剂中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：miRNA-106a在制备MMP9促进剂中的应用。
5.miRNA-106a的抑制剂在制备胶质瘤干细胞侵袭抑制剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述miRNA-106a为TIMP-2的抑制剂。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述miRNA-106a为MMP2促进剂。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述miRNA-106a为MMP9促进剂。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述miRNA-106a的抑制剂为Anti-miRmiRNA-106a inhibitors。
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