CN102309759B - 一种家禽冻干活疫苗耐热保护剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种家禽冻干活疫苗的耐热保护剂及其制备方法。本发明的冻干耐热保护剂由以下质量百分比的组分组成:磷酸二氢钾0.003%-0.006%、磷酸氢二钠0.01%-0.03%、氯化钾0.003%-0.005%、乳糖7%-8%、丙氨酸0.1%-0.3%、组氨酸0.3%-0.5%,剩余成份为蒸馏水。通过将以上各组分混合均匀,用孔径0.22μm的滤膜过滤除菌,即得本发明冻干耐热保护剂。本发明耐热保护剂对家禽冻干活疫苗的保护效果良好,可在2-8℃条件下保存24个月,病毒含量均高于《中华人民共和国兽医生物制品质量标准》的标准,且在使用过程中对环境无污染。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体地,涉及家禽生物制品的冻干耐热保护剂及制备方法。
背景技术
冷冻干燥技术是生物学的一个重要应用技术,常用于生物制品的科研和生产中,以保持菌、毒种的生物学特性,稳定生物原料和半成品的生物活性,延长成品的有效期。
国外活疫苗冻干制品在2~8℃的保存期为12~36个月,但保护剂配方属于专利,严格保密。我国同类产品在2~8℃的保存期与国外尚存在差距。我国现常用的兽医生物制品保护剂主要为5%蔗糖脱脂牛奶和1.5~3%明胶、5~10%蔗糖,制品要求低温保存(-15℃),2~8℃仅存3~6个月,在常温下要求尽快用完,这就为兽医生物制品的保存、运输、使用等带来许多困难和不便,同时造成大量的能源浪费和资金流失。从现有的关于冻干耐热保护剂的资料可以知道,国内发明的一些耐热冻干保护剂在2~8℃下可以保存24个月,但是有的保护剂配方复杂、成本高、不利于推广使用,例如中国专利CN1895675A“动物用冻干活疫苗耐热保护免疫增强剂及其制备方法”、CN1528457A“鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒冻干苗耐热保护剂及制备工艺”、CN1772302A“鸡新城疫活疫苗耐热冻干保护剂、其制备方法及应用”、CN1168503C“鸡新城疫弱毒冻干疫苗耐热冻干保护剂及制备工艺”、CN1426816A“兽医病毒类生物制品耐热冻干保护剂及制备工艺”、CN1528458A“鸡新城疫、鸡传染性支气管炎(H120、H52)二联冻干疫苗耐热冻干保护剂及制备工艺”等;有的保护剂配方简单,成本低,但是只适用于一种疫苗,例如中国专利CN101491680A“鸡传染性法氏囊病活疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法”;有的专利保护剂成分不多,但是制备过程既需要高压灭菌,又需要过滤除菌,例如中国专利CN101474410A;有的专利配方相对简单,制备过程也不复杂,但是成本高,例如中国专利CN101947321A“活疫苗用耐热冻干保护剂及其制备方法及新城疫活疫苗”,其中配方中需要海藻糖、维生素C等,成本较高。因此迫切需要一种配方简单、成本低、制备方法简便,且可作为多种动物活疫苗的耐热冻干保护剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种冻干耐热保护剂及其制备方法以克服现有技术的不足。
本发明的耐热冻干保护剂由以下质量百分比的各组分组成:磷酸二氢钾0.003%-0.006%、磷酸氢二钠0.01%-0.03%、氯化钾0.003%-0.005%、乳糖7%-8%、丙氨酸0.1%-0.3%、组氨酸0.3%-0.5%,剩余成份为蒸馏水。
本发明的冻干耐热保护剂,可以由以下质量百分比的各组分组成:磷酸二氢钾0.003%、磷酸氢二钠0.02%、氯化钾0.005%、乳糖8%、丙氨酸0.2%、组氨酸0.3%,剩余成份为蒸馏水。
本发明的冻干耐热保护剂还可以由以下质量百分比的各组分组成:磷酸二氢钾0.005%、磷酸氢二钠0.01%、氯化钾0.004%、乳糖7%、丙氨酸0.3%、组氨酸0.3%,剩余成份为蒸馏水。
本发明提供了制备上述冻干耐热保护剂的方法,是将上述各组分混合均匀,用孔径0.22μm的滤膜过滤除菌即得。
本发明冻干耐热保护剂的使用方法,是将本发明的冻干耐热保护剂与家禽疫苗以1∶1的体积比例进行配苗。
本发明提供了耐热保护剂在保护家禽冻干活疫苗中的应用,是将本发明的冻干耐热保护剂与家禽疫苗以1∶1的体积比例进行配苗。
上述家禽疫苗为鸡新城疫活疫苗、鸡传染性支气管炎活疫苗或鸡传染性法氏囊活疫苗。
本发明提供的耐热冻干保护剂配方中的乳糖能防止有效物质随水蒸气一起升华飞散,丙氨酸和组氨酸能将疫苗中的活病毒调整到活性最稳定区域。本发明通过调整各种成分的含量,经反复试验最终确定了保护剂的配比。采用本发明制备的耐热保护剂保护效果良好,且配方简单,制备方法简便、成本低,适用于多种动物活疫苗,在使用过程中对环境无污染。家禽活疫苗在2-8℃条件下可保存24个月,能达到《中华人民共和国兽医生物制品质量标准》中规定的要求。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
一、试验材料鸡新城疫病毒抗原(La Sota株)和鸡传染性支气管炎病毒抗原(H120株),均购自中国兽医药品监察所;SPF鸡胚,由乾元浩南京生物药厂提供。
二、耐热保护剂的制备 按照下述质量百分比的各组分:磷酸二氢钾0.003%、磷酸氢二钠0.02%、氯化钾0.005%、乳糖8%、丙氨酸0.2%、组氨酸0.3%,剩余成份为蒸馏水。配置方法为将上述比例的干物质溶于蒸馏水中,用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌即得到冻干耐热保护剂。
三、保护剂的毒性试验 用7日龄健康雏鸡10只,分别进行滴鼻、点眼、饮水及皮下注射10倍使用剂量,观察20天,雏鸡全部健活,且无任何不良反应。
四、疫苗的制备
1、新城疫耐热保护剂疫苗的制备
将新城疫抗原在SPF鸡胚上繁殖,收获病毒液后,按照1∶1的体积比与耐热保护剂混合均匀,分装后进行冷冻干燥。同时设5%蔗糖脱脂牛奶保护剂对照。疫苗置2~8℃条件下保存,同时将部分疫苗37℃保存7天。
2、传染性支气管炎耐热保护剂疫苗的制备
将传染性支气管炎抗原在SPF鸡胚上繁殖,收获病毒液后,按照1∶1的体积比与耐热保护剂混合均匀,分装后进行冷冻干燥。同时设5%蔗糖脱脂牛奶保护剂对照。疫苗置2~8℃条件下保存,同时将部分疫苗37℃保存7天。
五、疫苗检验
按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000年版)(以下简称《规程》)对上述新城疫耐热保护剂活疫苗和传染性支气管炎耐热保护剂活疫苗进行检验,包括:
1、产品的物理性质
2、无菌检验按照《规程》进行检验,应无菌生长。如有菌生长,应进行杂菌计数和病原性鉴定、禽沙门氏菌检验,应符合规定。每羽份疫苗含非病原菌应不超过1个。
3、支原体检验按照《规程》进行检验,应无支原体生长。
4、外源病毒检验按照《规程》进行检验,应无外源病毒污染。
5、特异性检验
(1)新城疫耐热保护剂活疫苗的特异性检验
将疫苗用生理盐水作适当稀释(0.1羽份/0.1mL),与等量的抗新城疫病毒特异性血清混合,在室温中和1小时,尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10枚,每胚0.1mL。置37℃孵育120小时。在24~120小时内应不出现特异性死亡及鸡胚病变,至少有8个鸡胚健活,对鸡胚液作红细胞凝集应试验应为阴性。
(2)传染性支气管炎耐热保护剂活疫苗的特异性检验
将疫苗用生理盐水作适当稀释(0.1羽份/0.1mL),与等量的抗传染性支气管炎病毒特异性血清混合,在室温中和1小时,尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10枚,每胚0.2mL。置37℃孵育144小时,在24~144小时内应不出现特异性死亡及鸡胚病变,至少有8个鸡胚健活。
6、安全检验
(1)新城疫耐热保护剂活疫苗的安全性检验
用7-10日龄SPF雏鸡20只,随机分成2组,每组10只。其中一组10只每只点眼或口服疫苗10羽份,作为免疫组,另外一组10只不接种,作为健康对照组。同样条件下,两组分别隔离饲养,观察14日,均应健活。如有非特异性死亡,两组总和不应超过3只,且免疫组死亡数不应超过对照组。
(2)传染性支气管炎耐热保护剂活疫苗的安全性检验
用7日龄SPF鸡20只,10只各滴鼻接种疫苗10羽份,另10只作对照。观察10日,应全部健活,且无呼吸异常及神经症状。任何一组非特异性死亡鸡应不超过1只,否则重检1次。
7、剩余水分测定按照《规程》进行检验,采用真空烘干法,应不超过4%。
8、病毒含量的测定
(1)新城疫耐热保护剂活疫苗中病毒含量测定
冻干前病毒含量测定:用灭菌生理盐水按实际含病毒液的量进行10倍系列稀释,取3个适宜稀释度,分别尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚,每胚0.1mL,置37℃继续孵育,48小时以前死亡的鸡胚弃去不计,在48~120小时死亡的鸡胚,随时取出,收获鸡胚液,将同一稀释度的鸡胚液等量混合,分别测定红细胞凝集价。至120小时,取出所有活胚,逐个收获鸡胚液,分别测定红细胞凝集价,凝集价不低于1∶160(微量法1∶128)者判为感染,计算半数感染量(EID50)。
冻干后病毒含量测定:按瓶签注明的羽份,将疫苗用灭菌生理盐水稀释至1羽份/0.1mL,再作10倍系列稀释,其他方法同冻干前病毒含量测定。按照《规程》要求,每羽份病毒含量应该不低于106.0EID50。
(2)传染性支气管炎耐热保护剂活疫苗中病毒含量测定
冻干前病毒含量测定:用灭菌生理盐水按实际含病毒液的量进行10倍系列稀释,取3个适宜稀释度,分别尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚,每胚0.1mL,置37℃继续孵育,24小时以内死亡的鸡胚弃去不计,根据接种后24~144小时的死胚及144小时的活胚中具有胎儿失水、蜷缩、发育小等特异性病痕的鸡胚总数计算半数胚致死量(ELD50)。
冻干后病毒含量测定:按瓶签注明的羽份,将疫苗用灭菌生理盐水稀释至1羽份/0.1mL,再作10倍系列稀释,其他方法同冻干前病毒含量测定。按照《规程》要求,每羽份病毒含量应该不低于103.5EID50。9、检验结果,新城疫疫苗检验结果见表1,传染性支气管炎疫苗检验结果见表2
表1新城疫疫苗检验结果
表2传染性支气管炎疫苗检验结果
由表1、表2结果可知,本发明制备的耐热冻干保护剂应用于新城疫疫苗和传染性支气管炎疫苗后,将疫苗放置37℃7天,病毒含量下降不超过1个滴度,疫苗在2-8℃保存24个月,病毒含量仍能够超过《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》的标准,可见本发明耐热冻干保护剂的保护效果明显优于传统的5%蔗糖脱脂牛奶保护剂的保护效果。
实施例2
一、试验材料鸡新城疫病毒抗原(La Sota株),购自中国兽医药品监察所;鸡传染性法氏囊病毒抗原(NF8株),由乾元浩南京生物药厂提供;SPF鸡胚,由乾元浩南京生物药厂提供。
二、耐热保护剂的制备 按照下述质量百分比的各组分:磷酸二氢钾0.005%、磷酸氢二钠0.01%、氯化钾0.004%、乳糖7%、丙氨酸0.3%、组氨酸0.3%,剩余成份为蒸馏水。配置方法为将上述比例的干物质溶于蒸馏水中,用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌即得到冻干耐热保护剂。
三、保护剂的毒性试验 按疫苗当中含耐热保护剂的10倍量,对7日龄健康雏鸡分别进行滴鼻、点眼、饮水及皮下注射各10只,观察20天,雏鸡全部健活,无任何不良反应。
四、疫苗的制备
1、新城疫耐热保护剂疫苗的制备
将新城疫抗原在SPF鸡胚上繁殖,收获病毒液后,按照1∶1的体积比与耐热保护剂混合均匀,分装后进行冷冻干燥。同时设5%蔗糖脱脂牛奶保护剂对照。疫苗置2~8℃条件下保存,同时将部分疫苗37℃保存7天。
2、传染性法氏囊耐热保护剂疫苗的制备
将传染性法氏囊抗原在SPF鸡胚上繁殖,收获病毒液后,按照1∶1的体积比与耐热保护剂混合均匀,分装后进行冷冻干燥。同时设5%蔗糖脱脂牛奶保护剂对照。疫苗置2~8℃条件下保存,同时将部分疫苗37℃保存7天。
五、疫苗检验
按照《规程》对上述新城疫耐热保护剂活疫苗和传染性支气管炎耐热保护剂活疫苗进行检验,包括:
1、产品的物理性质
2、无菌检验按照《规程》进行检验,应无菌生长。如有菌生长,应进行杂菌计数和病原性鉴定、禽沙门氏菌检验,应符合规定。每羽份疫苗含非病原菌应不超过1个。
3、支原体检验按照《规程》进行检验,应无支原体生长。
4、外源病毒检验按照《规程》进行检验,应无外源病毒污染。
5、特异性检验
(1)新城疫耐热保护剂活疫苗的特异性检验
将疫苗用生理盐水作适当稀释(0.1羽份/0.1mL),与等量的抗新城疫病毒特异性血清混合,在室温中和1小时,尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10枚,每胚0.1mL。置37℃孵育120小时。在24~120小时内应不出现特异性死亡及鸡胚病变,至少有8个鸡胚健活,对鸡胚液作红细胞凝集应试验应为阴性。
(2)传染性法氏囊耐热保护剂活疫苗的特异性检验
将疫苗用生理盐水作适当稀释(0.1羽份/0.1mL),与等量的抗传染性法氏囊病毒特异性血清混合,在室温中和1小时,尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚,每胚0.2mL,同时设对照胚5枚,每胚***接种未经中和的疫苗稀释液0.1mL,置37℃孵育168小时。对照鸡胚应至少4枚死亡,中和组鸡胚应全部健活,且尿囊液无血凝活性。
6、安全检验
(1)新城疫耐热保护剂活疫苗的安全性检验
用7-10日龄SPF雏鸡20只,随机分成2组,每组10只。其中一组10只每只点眼或口服疫苗10羽份,作为免疫组,另外一组10只不接种,作为健康对照组。同样条件下,两组分别隔离饲养,观察14日,均应健活。如有非特异性死亡,两组总和不应超过3只,且免疫组死亡数不应超过对照组。
(2)传染性法氏囊耐热保护剂活疫苗的安全性检验
用7日龄SPF鸡20只,10只各点眼接种疫苗10羽份,另10只不接种作对照。观察21日,应全部健活。试验结束后,剖检免疫组与对照组鸡,法氏囊色泽、弹性应无明显变化。如出现非特异性死亡,两组鸡死亡总数应不超过3只,且免疫组死亡数应不超过对照组死亡数。
7、剩余水分测定 按照《规程》进行检验,采用真空烘干法,应不超过4%。
8、病毒含量的测定
(1)新城疫耐热保护剂活疫苗中病毒含量测定
冻干前病毒含量测定:用灭菌生理盐水按实际含病毒液的量进行10倍系列稀释,取3个适宜稀释度,分别尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚,每胚0.1mL,置37℃继续孵育,48小时以前死亡的鸡胚弃去不计,在48~120小时死亡的鸡胚,随时取出,收获鸡胚液,将同一稀释度的鸡胚液等量混合,分别测定红细胞凝集价。至120小时,取出所有活胚,逐个收获鸡胚液,分别测定红细胞凝集价,凝集价不低于1∶160(微量法1∶128)者判为感染,计算半数感染量(EID50)。
冻干后病毒含量测定:按瓶签注明的羽份,将疫苗用灭菌生理盐水稀释至1羽份/0.1mL,再作10倍系列稀释,其他方法同冻干前病毒含量测定。按照《规程》要求,每羽份病毒含量应该不低于106.0EID50。
(2)传染性法氏囊耐热保护剂活疫苗中病毒含量测定
冻干前病毒含量测定:用灭菌生理盐水按实际含病毒液的量进行10倍系列稀释,取3个适宜稀释度,分别***接种10日龄SPF鸡胚5枚,每胚0.2mL,置37℃继续孵育,24小时以内死亡的鸡胚弃去不计,根据接种后24~168小时的死胚总数计算半数胚致死量(ELD50)。
冻干后病毒含量测定:按瓶签注明的羽份,将疫苗用灭菌生理盐水稀释至1羽份/0.1mL,再作10倍系列稀释,其他方法同冻干前病毒含量测定。按照《规程》要求,每羽份病毒含量应该不低于103.0ELD50。9、检验结果,新城疫疫苗检验结果见表3,传染性法氏囊疫苗检验结果见表4
表3新城疫疫苗检验结果
表4传染性法氏囊疫苗检验结果
由表3、表4结果说明,本发明制备的耐热冻干保护剂应用于新城疫疫苗和传染性法氏囊疫苗后,将疫苗放置37℃7天,病毒含量下降不超过1个滴度,疫苗在2-8℃保存24个月,病毒含量仍能够超过《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》的标准,可见本发明耐热冻干保护剂的保护效果明显优于传统的5%蔗糖脱脂牛奶保护剂的保护效果。
通过以上两个实施例,本发明保护剂冻干疫苗产品放在37℃保存7天,病毒含量下降不超过1个滴度,产品放在2-8℃保存24个月,每羽份病毒含量仍然符合《中华人民共和国生物制品质量标准》的要求。
Claims (7)
1.一种家禽冻干活疫苗耐热保护剂,其特征在于,该冻干耐热保护剂由以下质量百分比的各组分组成:磷酸二氢钾0.003%-0.006%、磷酸氢二钠0.01%-0.03%、氯化钾0.003%-0.005%、乳糖7%-8%、丙氨酸0.1%-0.3%、组氨酸0.3%-0.5%,剩余成份为蒸馏水;所述的家禽冻干活疫苗为鸡新城疫活疫苗、鸡传染性支气管炎活疫苗或鸡传染性法氏囊活疫苗。
2.如权利要求1所述的耐热冻干保护剂,其特征在于,该冻干耐热保护剂由以下质量百分比的各组分组成:磷酸二氢钾0.003%、磷酸氢二钠0.02%、氯化钾0.005%、乳糖8%、丙氨酸0.2%、组氨酸0.3%,剩余成份为蒸馏水。
3.如权利要求1所述的耐热冻干保护剂,其特征在于,该冻干耐热保护剂由以下质量百分比的各组分组成:磷酸二氢钾0.005%、磷酸氢二钠0.01%、氯化钾0.004%、乳糖7%、丙氨酸0.3%、组氨酸0.3%,剩余成份为蒸馏水。
4.一种制备权利要求1-3的冻干耐热保护剂的方法,其特征在于,将权利要求1-3之一所述的各组分混合均匀,用孔径0.22μm的滤膜过滤除菌即得。
5.权利要求1-3之一的冻干耐热保护剂的使用方法,其特征是将权利要求1所述的耐热保护剂与家禽疫苗以1:1的体积比例进行配苗;所述的家禽疫苗为鸡新城疫活疫苗、鸡传染性支气管炎活疫苗或鸡传染性法氏囊活疫苗。
6.权利要求1-3之一的耐热保护剂在保护家禽冻干活疫苗中的应用,包括将权利要求1所述的耐热保护剂与家禽疫苗以1:1的体积比例进行配苗;所述的家禽冻干活疫苗为鸡新城疫活疫苗、鸡传染性支气管炎活疫苗或鸡传染性法氏囊活疫苗。
7.含有权利要求1-3之一耐热保护剂的动物用疫苗;其为鸡新城疫活疫苗、鸡传染性支气管炎活疫苗或鸡传染性法氏囊活疫苗。
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Legal Events
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |