CN102307899A

CN102307899A - 炎症、自身免疫疾病和心血管疾病的嗜酸细胞活化趋化因子-2(ccl24)抑制剂

Info

Publication number: CN102307899A
Application number: CN2010800056420A
Authority: CN
Inventors: J·乔治; G·科伦
Original assignee: Medical Research Infrastructure and Health Services Fund of the Tel Aviv Medical Center
Current assignee: Medical Research Infrastructure and Health Services Fund of the Tel Aviv Medical Center
Priority date: 2009-01-28
Filing date: 2010-01-28
Publication date: 2012-01-04
Also published as: EP2391651B1; US9067989B2; US20110280832A1; CA2750952A1; JP2012516150A; KR20110117689A; WO2010086854A1; AU2010209273A1; EP2391651A1

Abstract

本发明基于发现多克隆体或单克隆抗体嗜酸细胞活化趋化因子-2抑制剂对炎症疾病的动物模型具有显著的保护作用，例如类风湿性关节炎，实验性自身免疫疾病性脑脊髓炎(EAE)，结肠炎，糖尿病和动脉粥样硬化。本发明提供一种药物组合物，包含特异性抗-嗜酸细胞活化趋化因子2抗体，其单独或者与其他治疗剂相结合治疗炎症、自身免疫性疾病和心血管疾病。本发明还提供一种特异性抗-嗜酸细胞活化趋化因子2抗体，以及使用该抗体的治疗方法。

Description

炎症、自身免疫疾病和心血管疾病的嗜酸细胞活化趋化因子-2(CCL24)抑制剂

技术领域

本发明涉及嗜酸细胞活化趋化因子-2(CCL24)抑制剂在治疗炎症、自身免疫疾病和心血管疾病中的应用，尤其是抗嗜酸细胞活化趋化因子-2的多克隆或者单克隆抗体。

背景技术

炎症趋化因子类是作为白细胞趋化因子的小型细胞因子类，协调体内细胞的平衡运输和炎症部位细胞群的恢复。趋化因子调节异常在涉及包括炎症和自身免疫疾病(1)的人类免疫***疾病中具有广泛的作用。

人嗜酸细胞活化趋化因子族包括3种已知的属于CC趋化因子族的细胞因子类：

嗜酸细胞活化趋化因子1(过敏响应嗜酸粒细胞趋化性因子蛋白1，也称嗜酸细胞活化趋化因子或者趋化因子(C-C基序)配基11(CCL11))已知的通过诱导产生趋化作用、有选择行地恢复嗜酸细胞，涉及过敏响应。

嗜酸细胞活化趋化因子2(过敏响应嗜酸粒细胞趋化性因子蛋白2，也称趋化因子(C-C基序)配基24(CCL24)，骨髓抑制因子2(MPIF-2))是炎症细胞包括嗜酸细胞(2-4)，嗜碱细胞(4)，Th2-类型淋巴细胞(5)和嗜中性白细胞的有效的化疗引诱剂。嗜酸细胞活化趋化因子-2在不同类型内皮细胞(5-9)里表达，并且在内皮(10)和平滑肌细胞(11)里诱导血管生成和迁徙响应。

嗜酸细胞活化趋化因子3(过敏响应嗜酸粒细胞趋化性因子蛋白3，趋化因子(C-C基序)配基26(CCL26)，巨噬细胞炎性蛋白4-α(MIP-4-α)，胸腺基质趋化因子1(TSC-1)和IMAC)是嗜酸细胞和嗜碱细胞的趋化性剂。

嗜酸细胞活化趋化因子-2与嗜酸细胞活化趋化因子的同源性仅为 39％，两种多肽在NH₂末端区域(12)几乎完全不同。嗜酸细胞活化趋化因子-2位于染色体7q11.23、嗜酸细胞活化趋化因子位于染色体17q21.1。嗜酸细胞活化趋化因子-3基因在染色体7上靠近嗜酸细胞活化趋化因子-2基因，但是与它仅具有33％的同源性。这些趋化因子与CCR3受体特异性结合。CCR3嗜酸细胞活化趋化因子受体，是7-横跨膜G蛋白偶联受体，其被嗜酸细胞及一系列包括巨噬细胞和内皮细胞(13)的细胞类型表达。

WO 97/00960公开了编码人嗜酸细胞活化趋化因子(CCL11)的核酸，以及隔离或者重组人嗜酸细胞活化趋化因子蛋白质。WO 97/00960也公开了使用嗜酸细胞活化趋化因子蛋白质在特定部位恢复嗜酸细胞或处理过敏响应的方法。

CCR3表达最初在哮喘和过敏性响应的发病机理中研究，也在其中继续作为一个处理靶点(14)。近年来，这种作用途径已经在包括炎性肠疾病(15)，多发性硬化(16)和类风湿性关节炎(RA)的炎症和自体免疫疾病的研究过程中出现。

类风湿性关节炎(RA)是普通，慢性炎症疾病，特征在于由范围很广的炎症细胞(17)对滑膜组织造成强烈的、破坏性的渗透。由巨噬细胞和成纤维细胞衍生的数倍的细胞因子类导致在(RA)(18)中细胞因子类和炎症趋化因子的分泌。在关节间隙白细胞的积累导致组织降解因子的分泌，包括细胞因子类和基质降解酶。

趋化因子抑制已经测试用作处理助剂项用以诱导关节炎，使用的动物模型为RA(19)常用模型。使用相同的模型，CCR3显示对滑膜组织(20)白细胞的恢复具有作用。很多趋化因子和趋化因子受体的不同表达也已经在RA患者(21)的血清和滑膜组织里进行了证明。

包含细胞因子类和炎症趋化因子类的炎症被认为在促进动脉粥样斑块块增长以及使其使不稳定、而后破裂(22，23)的过程中起到关键的作用。嗜酸细胞活化趋化因子/CCL 24受体(CCR3)在巨噬细胞斑块(24)里表达。临床研究证明在健康人群中，嗜酸性粒细胞趋化基因内不可逆的多态现象与增加心肌梗塞(25)的风险相关。在随后的一项研究里，发现增加嗜酸细胞活化趋化因子循环水平与冠状动脉粥样硬化和局部缺血(26，27)的存在相关。

动脉粥样硬化是一个过程，由于脂肪的沉积于动脉壁，导致的内腔狭窄。成熟的斑块由两个基本结构组成：脂质核和纤维壳。脂质核越小且纤维壳约厚，斑块越稳定，意思是使其破裂并且引起心肌梗塞或者不稳定性心绞痛的可能性减少。现在清楚的是，大部分引起急性冠状动脉综合症(例如，心肌梗塞和不稳定性心绞痛)的斑块，血管造影显示有＜70％的狭窄(在28，29检查)。约60％的损害是由于斑块破裂，其脂质和坏死碎屑形成一个大的血酸核造成(包括巨噬细胞，T细胞，陈旧性出血，血管生成和钙的聚集)。破裂的壳体是薄的，大概因为当巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶在移动穿过斑块时消化它们，并且由于由炎症细胞因子类及其它因素衰老或凋亡导致平滑肌细胞(斑块的支撑结构)被耗尽。

WO 06/93932公开了通过测定在个体血清中嗜酸细胞活化趋化因子的水平来检测或者诊断动脉粥样硬化的方法。申请更进一步启示，通过检测血清里嗜酸细胞活化趋化因子的上升水平的可提供一种在发病前诊断动脉粥样硬化的途径。

所述出版物均未教导或启示，将嗜酸细胞活化趋化因子-2作为处理炎症、自身免疫疾病或者心血管疾病的靶点。

发明内容

本发明基于发现多克隆体或单克隆抗体嗜酸细胞活化趋化因子-2抑制剂对炎症疾病的动物模型具有显著的保护作用，例如类风湿性关节炎，实验性自身免疫疾病性脑脊髓炎(EAE)，结肠炎，糖尿病和动脉粥样硬化。不希望受理论的约束，保护效应可能是间接的，至少部分，通过衰减活性炎症的细胞(淋巴细胞和单核细胞)的粘附性和流动性。本发明因此引入嗜酸细胞活化趋化因子-2作为一个新的靶点，用于发展炎症和/或自体免疫疾病的处理方法。本发明也提供特效的抗嗜酸细胞活化趋化因子2抗体，其单独或者与其他处理剂相结合应用于处理所述疾病。

炎症和/或自身免疫疾病疾病包括，例如，牛皮癣、炎性肠疾病(IBD)、(包括溃疡性结肠炎和克罗恩病)、类风湿性关节炎、糖尿病、多发性硬化、***性红斑块狼疮(SLE)、硬皮病和天疱疮。

因此，本发明的第一目的，提供一种用于处理炎症、自身免疫疾病疾病或者心血管疾病的药物组合物，包括至少一种嗜酸细胞活化趋化因子2拮抗剂和药学上可接受的载体或者赋形剂。

在一个实施方案中所述嗜酸细胞活化趋化因子-2拮抗剂是抗嗜酸细胞活化趋化因子-2抗体或者保留抗体结合活性的片段。

抗-嗜酸细胞活化趋化因子-2抗体可能是单克隆抗体或者多克隆抗体。在某些实施方案中抗-嗜酸细胞活化趋化因子-2抗体是人类抗体，人源化抗体或者嵌合抗体。

在某些具体实施方案中，所述抗-嗜酸细胞活化趋化因子-2抗体是由杂交瘤细胞D8(ECACC登录号D809081702)、杂交瘤细胞G7或者杂交瘤细胞G8(ECACC登录号G80908170)或者保留抗体的结合活的片段分泌的单克隆抗体。

在某些具体实施方案中，所述抗-嗜酸细胞活化趋化因子-2抗体是选自下列的单克隆抗体：

a.单克隆抗体，包括由与SEQ ID NO：1具有至少90％同源性的核酸编码的重链、以及由与SEQ ID NO：2具有至少90％同源性的核酸编码的轻链；

b.单克隆抗体，包括由与SEQ ID NO：3具有至少90％同源性的核酸编码的重链、以及由与SEQ ID NO：4具有至少90％同源性的核酸编码的轻链；

c.单克隆抗体，包括由与SEQ ID NO：5具有至少90％同源性的核酸编码的重链、以及由与SEQ ID NO：6具有至少90％同源性的核酸编码的轻链；

d.单克隆抗体，包括与由编码杂交瘤细胞D8(ECACC登录号D809081702)，杂交瘤细胞G7或者杂交瘤细胞G8(ECACC登录号G80908170)分泌的单克隆抗体的重链的核酸具有至少90％同源性的核酸编码的重链，以及与由编码杂交瘤细胞D8(ECACC登录号D809081702)，杂交瘤细胞G7或者杂交瘤细胞G8(ECACC登录号G80908170)分泌的单克隆抗体的轻链的核酸具有至少90％同源性的核酸编码的轻链；以及

e.保留所述抗体的结合活性的a-d抗体的片段。

在另一个实施方案中，嗜酸细胞活化趋化因子-2拮抗剂是针对嗜酸细胞活化趋化因子-2mRNA的反义分子或者siRNA分子。

在另一个实施方案中，嗜酸细胞活化趋化因子-2拮抗剂是化学小分子。

在某些实施方案中，所述炎症、自身免疫疾病或者心血管疾病选自动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、炎性肠疾病、多发性硬化和糖尿病。

另一个方面，本发明提供处理炎症或者自身免疫疾病的方法，包括给予需要的患者治疗有效剂量的本发明的嗜酸细胞活化趋化因子-2拮抗剂或药物组合物。

根据本发明的某些实施方案，所述所述自身免疫疾病选自类风湿性关节炎、炎性肠疾病(例如结肠炎)、多发性硬化和糖尿病。

再一个方面，本发明，提供一种抑制动脉粥样硬化斑块形成的方法，包括给予需要的患者治疗有效剂量的本发明的嗜酸细胞活化趋化因子-2拮抗剂或药物组合物。

本发明还提供一稳定动脉粥样斑块的方法，包括给予需要的患者治疗有效剂量的本发明的嗜酸细胞活化趋化因子-2拮抗剂或药物组合物。

本发明还提供一种预防急性冠状动脉综合症患者中重大心血管事件的方法，包括给予需要的患者治疗有效剂量的本发明的嗜酸细胞活化趋化因子-2拮抗剂或药物组合物。

本发明的方法还包括所述的嗜酸细胞活化趋化因子-2拮抗剂或者所述的药物组合物与至少一种另外的治疗剂联合给药。

根据某些实施方案，所述至少一种另外的治疗剂选自化疗药物、细胞因子类、肽类、抗体和抗生素。

对风湿性关节炎的处理来说，所述另外的治疗剂包括但不局限于氨甲蝶呤，类固醇，抗TNFα抗体，抗TNF受体抗体，抗-IL6的受体抗体或者抗-CD20抗体。

对处理IBD(炎性肠疾病)来说，所述另外的治疗剂包括但不局限于环孢菌素，NSAIDS(非类固醇抗炎药)，类固醇或者抗肿瘤坏死因子抗体(例如英利昔单抗)。

对处理多发性硬化来说，所述另外的治疗剂包括但不局限于Copaxone，干扰素β，静脉注射免疫球蛋白(IVIG)，或者VLA-4单克隆抗体(例如Tysabri)。

根据本发明的一个实施方案，所述至少一种另外的治疗剂与嗜酸细胞活化趋化因子-2拮抗剂或者所述药物组合物同时给药。

根据本发明的另一实施方案，所述至少一种另外的治疗剂与嗜酸细胞活化趋化因子-2拮抗剂或者所述药物组合物依次给药。

另一方面，本发明提供分泌抗嗜酸细胞活化趋化因子2单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其中所述杂交瘤细胞选自D8(ECACC登录号D809081702)，G7或者G8(ECACC登录号G809081701)。

本发明还提供一种针对嗜酸细胞活化趋化因子-2的单克隆抗体或者保留与嗜酸细胞活化趋化因子2结合活性的任意片段的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体由杂交瘤细胞D8(ECACC登录号D809081702)，G7或者G8(ECACC登录号G809081701)分泌。

在某些实施方案中，本发明提供针对嗜酸细胞活化趋化因子-2的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体选自下列的单克隆抗体：

e.保留所述抗体的结合活性的a-d抗体的片段。

本发明还涉及分离的核酸分子，其编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分，以及包括核酸分子的表达载体和包括表达载体的寄主细胞。

在某些实施方案中，表达载体能在原核或者真核细胞系内复制。

另一方面，本发明提供嗜酸细胞活化趋化因子-2拮抗剂在治疗炎症和自身免疫疾病中的应用。在一个实施方案中，所述嗜酸细胞活化趋化因子-2拮抗剂是抗体。

本发明还包括嗜酸细胞活化趋化因子-2拮抗剂在制备治疗炎症、自身免疫疾病和心血管疾病的药物组合物中的应用。在一个实施方案中，所述嗜酸细胞活化趋化因子-2拮抗剂是抗体。

附图说明

为了理解本发明以及如何实施，实施方案将被描述，并非限制于下述例子，关于附图，其中：

图1显示的是抗嗜酸细胞活化趋化因子-2mAb(D8)与嗜酸细胞活化趋化因子-2的结合以及与嗜酸细胞活化趋化因子的比较。结果显示光密度(OD)读数在405nm。测定了各种抗体浓度(5μ/ml到50μ/ml)。

图2A显示的是D8处理细胞与纤维连接蛋白粘附水平。结果显示的是与以小鼠IgG处理的对照细胞相比较的百分粘附行比。测试细胞包括3类，小鼠脾细胞，脾细胞，以及人PBMC。

图2B显示的是D8处理细胞向VEGF的迁移。结果显示的是与以小鼠IgG处理的对照细胞相比较的百分粘附行比(50μg)。图表证明结果有老鼠脾细胞和人PBMC获得，使用各种D8数量，(12.5，25和50μg)。

图3A显示的从疾病发作期将抗嗜酸细胞活化趋化因子-2单克隆抗体(G7，G8，D8)，IgG和PBS用于小鼠(标准误差)关节炎(AS)后的影响效果的函数。零天指的诱发关节炎当天。

图3B显示的是抗嗜酸细胞活化趋化因子-2单克隆抗体(G7，G8，D8)，IgG和PBS对小鼠(标准误差)迁移率后的影响效果。

图3C显示的是抗嗜酸细胞活化趋化因子-2单克隆抗体(G7，G8，D8)，IgG和PBS对小鼠(±标准误差)足踝直径的影响效果。

图4A显示的是使用PBS，IgG，D8，G7和G8抗体处理的老鼠关节的组织学评价。

图4B和4C显示的是用D8(图4B)或者PBS(图4C)(苏木精曙红(H&E)染色)处理的老鼠关节的代表性外表的照片。

图5显示的是用抗-嗜酸细胞活化趋化因子-2单克隆抗体(G7，G8，D8)，IgG和PBS以及助剂诱发关节炎(±标准误差)对小鼠体重(g)的影响效果，显示为一个时间函数(天)。

图6A显示的是以预防模型三种剂量(20μg、100μg和1000μg)的抗-嗜酸细胞活化趋化因子-2 D8抗体以及助剂诱发关节炎(±标准误差，百分比)对小鼠关节炎评价(AS；Y轴)的影响效果，显示为时间(天)的函数。

图6B显示的是以处理模型(给药予关节炎表面)三种剂量(20μg、100μg和1000μg)的抗-嗜酸细胞活化趋化因子-2D8抗体以及助剂诱发关节炎(±标准误差，百分比)对小鼠关节炎评价(AS；Y轴)的影响效果，显示为时间(天)的函数。

图7显示的是D8(100μg)，氨甲蝶呤(0.25mg/kg)和结合D8-氨甲蝶呤结合物100μg，与PBS处理对照的保护作用比较，预防模型(±标准误差)中助剂诱发关节炎的关节炎评价的时间(天)的函数。

图8显示的是用PBS(图8A)和D8(图8B)处理后老鼠关节验尸X-射线分析照片。显示PBS处理的老鼠(star)呈现强烈的关节周软组织肿胀，以及踝关节脱钙和早期博尼侵蚀(箭头方向)(代表性图示)。

图9A显示的DSS-诱导结肠炎小鼠体重减少/增加的百分比，时间(天)的函数。小鼠用5μ或25μ抗嗜酸细胞活化趋化因子-2抗体D8处理。对照动物用PBS或者IgG处理。

图9B显示的是DSS-诱导结肠炎小鼠％MPO活性。小鼠用5μ，25μ，100μg或200μg抗嗜酸细胞活化趋化因子-2抗体D8处理。对照动物用PBS或者IgG处理。

图9C显示的是用抗嗜酸细胞活化趋化因子-2抗体D8或对照(PBS)处理小鼠DSS-诱导结肠炎，小鼠血清中各种细胞因子类(IL-10，IL-12p70，IL 6，MCP-I(单核化学趋化蛋白子1)和TNF)的水平。

图9D显示的是用5μ，25μ，100μg或200μg抗嗜酸细胞活化趋化因子-2抗体D8处理，小鼠DSS-诱导结肠炎克隆的组织学分析图示。对照动物用PBS或者IgG处理。[I]代表损害的范围(大小)；[II]代表炎症(炎症细胞浸润)；[III]代表损害(组织损坏)。

图10显示的是疾病严重程度平均数的时间函数，小鼠用EAE诱导，用PBS，IgG，抗-嗜酸细胞活化趋化因子-2抗体D8(25μg)或抗-嗜酸细胞活化趋化因子-2抗体D8(100μg)处理。

图11A显示的是在NOD小鼠中疾病发生(糖尿病小鼠百分比)的时间的函数，用PBS或者抗-嗜酸细胞活化趋化因子-2抗体(D8)处理。

图11B显示的是在NOD小鼠血清中嗜酸细胞活化趋化因子2的水平(pg/ml)，用PBS或者抗嗜酸细胞活化趋化因子-2抗体(D8)处理。

图12A显示的是在稳定对不稳定的斑块中，炎症因子表达的定量分析。每组分析4个斑块。

图12B提供代表例的图像。

图13显示的是小鼠粥样斑中嗜酸细胞活化趋化因子-2免疫组织化学定位图像。图13A显示的是特有的脂纹(AHA I-II级)，图13B显示的是一个中间斑块(AHA II级)，图13C显示的是动脉粥样化损害(AHA HI-IV级)，图13D显示用IgG染色的阴性对照。粗箭头是代表性的对嗜酸细胞活化趋化因子-2阳性内皮细胞，而细箭头是在斑块巨噬细胞内各自的染色。

图14A显示的是在青年和老年KO ApoE小鼠主动脉中嗜酸细胞活化趋化因子-2和TGF βmRNA表达凝胶谱图。图14B显示的是在用oxLDL孵化的小鼠H5V内皮细胞里嗜酸细胞活化趋化因子-2和TGF-βmRNA表达的凝胶谱图。

图15A显示的是嗜酸细胞活化趋化因子-2阻滞对单核细胞(脾细胞)粘附到内皮上的影响。图15B显示在一份基本上相似的协议里由单核细胞巨噬细胞系执行的代表性结果。^*p＜0.05

图16A显示的是用抗嗜酸细胞活化趋化因子-2抗体处理4周后损害(斑块)尺寸图表。图16B显示的是用抗嗜酸细胞活化趋化因子-2抗体处理10周后损害(斑块)尺寸图表。图16C用抗嗜酸细胞活化趋化因子-2抗体处理10周后％纤维化区域的图表^*p＜0.01；^**p＜0.05。

图17显示的是来自于用嗜酸细胞活化趋化因子-2阻滞抗体处理的 apoE小鼠的代表性切片。图A-C分别显示来自于PBS、对照IgG、嗜酸细胞活化趋化因子-2ab处理的、油红O染色的代表性脂肪条纹。图17D-F显示的是在相似组小鼠经过长期处理研究后更重损伤的类似评价。图17G-I和J-L分别显示的是或是PBS处理、或是对照IgG-2处理的马森三色和von Giesson′s组织化学研究(分别地)。

具体实施方式

本发明涉及对嗜酸细胞活化趋化因子2(CCL24)特异性结合并且抑制其功能的抗体。进一步，本发明涉及包含抗体的药物组，以及它们在处理炎症，自身免疫疾病和心血管疾病中的应用。

为了本发明被更容易理解，对各种定义进行详细阐述。

一方面，本发明的处理方法通过向患者提供处理有效量的嗜酸细胞活化趋化因子-2拮抗剂，以降低嗜酸细胞活化趋化因子2的活性和/或表达，以降低炎症，自身免疫疾病或者动脉粥样硬化对患者的影响。

本文中所使用的术语“患者”指的可能受益于本发明的一个主体，例如哺乳动物(例如犬，猫，羊，猪，马，牛，或者人)。在具体的实施方案中患者是人。

本文中所使用的术语“处理”，指的是降低，防止，固化，抗转，减弱，减轻，最小化，抑制或者延缓由嗜酸细胞活化趋化因子2介导的疾病或者状况所带来的有害影响。

术语″嗜酸细胞活化趋化因子2″(过敏响应嗜酸粒细胞趋化性因子性蛋白2)，“CCL24”(趋化因子(C-C基序)配基24)或“MPIE-2”(骨髓抑制因子2)被可互换使用，并且由人CCL24基因编码的CC细胞因子族，其位于人染色体7，并且为本领域所公知。

CCL24与趋化因子受体CCR3相互作用。CCL24活性涉及在嗜酸细胞，嗜碱细胞，T淋巴细胞和嗜中性白细胞中诱导趋化性，同时在内皮和平滑肌细胞里诱导血管生成和迁徙。

本文中所使用的术语“炎症”涉及对有害刺激复杂的免疫***生物响应，例如病原体，受损细胞(例如由烧伤，创伤，瘤导致)，或者由化学制品、热、冷导致的刺激。术语″炎症疾病″指的是与炎症相关的疾病，包括但不限于动脉粥样硬化和各种各样的自身免疫疾病。

本文中所使用的术语“动脉粥样硬化”(也称为动脉硬化的血管病或者ASVD)是一种由像胆固醇样的脂肪族材料增厚导致动脉壁加厚的病理情形。这个过程是在动脉壁上慢性炎性响应的结果，在很大程度上，由于巨噬细胞的积累以及低密度脂蛋白的提升，以及没有通过功能的高密度脂蛋白(HDL)从巨噬细胞中充分的清除脂肪和胆固醇。在动脉内形成多重斑块引起动脉硬化或毛状痕迹。

动脉粥样斑块或者arethoma是在动脉壁上由细胞(大多为巨噬细胞)，或者细胞片段形成的沉积和膨胀物，包含类脂(胆固醇和脂肪酸)，钙和各种数量的纤维***。动脉粥样硬化及其变化在动脉壁里通常导致小动脉瘤(扩大的结果)，其过于巨大，导致血管壁过厚，致使血管内腔直径无法改变。成熟的斑块由两个基本结构组成：脂质核和纤维壳。脂质核越小且纤维壳越厚，斑块越稳定，意思是使其破裂并且引起心肌梗塞或者不稳定性心绞痛的可能性减少。现在清楚的是，大部分引起急性冠状动脉综合症(例如，心肌梗塞和不稳定性心绞痛)的斑块，血管造影显示有＜70％的狭窄(在28，29检查)。约60％的损害是由于斑块破裂，其脂质和坏死碎屑形成一个大的血酸核造成(包括巨噬细胞，T细胞，陈旧性出血，血管生成和钙的聚集)。

本文中所使用的术语“心血管疾病”(CVD)涉及可引起心脏(心)和/或体内血管(血管的)***的不适疾病。大部分心血管疾病反应慢性情形，这种情形已经发展或者存在较长一段时间。不过，一些心血管疾病可能是急性的，例如心脏病发作和供应到心脏或者大脑的一个血管阻滞时突然发生的卒中。CVD也包括与动脉粥样硬化，冠心病(CHD)和冠状动脉病(CAD)有关的疾病-为心脏供血的血管可能导致心绞痛(包括不稳定性心绞痛和新发作的心绞痛)-强烈的胸痛或者甚至心脏病发作-心肌梗塞，和ST-或NON-ST升高。

本文中所使用的术语“自身免疫疾病”指的身体对正常存在于体内的物质或组织过度的免疫响应的一种病理学情况。免疫***误将体内的一部分作为病原体、并对其攻击。可能局限于能影响肺和肾基膜的某些地方的磨某些器官或者某些组织中。自身免疫疾病的例子包括至少全部经证明的疾病(例如类风湿性关节炎，多发性硬化和结肠炎)，除此之外，还包括，腹部疾病，I型糖尿病(IDDM)，***性红斑块狼疮(SLE)，Sjorgen综合症，Churg-Strauss综合症，Hashimoto’s thyroditis，格雷夫斯病，牛皮癣，炎性肠疾病(溃疡结肠炎和克罗恩病)，硬皮病和天疱疮。

本文中所使用的术语“嗜酸细胞活化趋化因子2拮抗剂”指的是嗜酸细胞活化趋化因子2/CCL 24相互作用、阻碍或抑制细胞因子正常活性或表达的分子。本发明中可以各种药剂。因此，例如拮抗剂可能是抑制嗜酸细胞活化趋化因子2的抗体，小化学分子，siRNA，DNAzye，核糖酶或者反义多核苷酸。

本发明中术语“抗嗜酸细胞活化趋化因子-2抗体”包含多克隆抗体和单克隆抗体。而且，抗体可能例如是小鼠抗体，嵌合抗体，人源化抗体和人类抗体。术语指的是整个抗体分子及能结合嗜酸细胞活化趋化因子2功能的片段，例如单链(SC)抗体，Fab，F(ab′)₂或者Fv抗体片段，及其任何组合。

纯化血清免疫球蛋白(“多克隆抗体”)或者其活性部分的方法是本领域所公知的包括硫酸铵或者硫酸钠沉淀，随后进行渗析，离子交换色谱法，亲和色谱法和凝胶过滤。

本文中所使用的术语“单克隆抗体”(也称mAb或者moAb)指的是由单克隆细胞产生的相同的，单一的抗体。生成和分离单克隆抗体的方法是本领域公知的，例如，如下述例子所示。本发明也包括嵌合或者人源化抗体。本文中所使用的术语“人源化抗体”指的是有人主链并且载有非人得到的互补性决定区(CDR)的抗体或者其中片段。非人的CDR可以被从例如小鼠，鼠，棉尾兔或者山羊获得、抗体要求有特异性，姻亲关系和/或能力。在某些实施方案中，在人类抗体骨架中用非人的配对物替换附加氨基酸，以改进抗体的粘合性。本文中所使用的术语“嵌合抗体”是抗体或者其片段，含有多肽，起源于不同物种，例如，老鼠-人抗体嵌合体是通过用人抗体取代老鼠Fc区域获得。

制备人源化抗体的方法是本领域公知的。人源化抗体可以通过把合适的CDR编码片段(对被要求的粘合性负责)嵌入进人类抗体骨架进行制备。可以通过使用适当的载体在寄主细胞(例如哺乳动物细胞)里表达进行重组DNA实现。即，当符合要求性能的单克隆抗体在老鼠(或者其他非人类动物)里发育完成后，分离抗体DNA编码，植入载体并且进行排序。然后测定CDR抗体的DNA序列。一旦获知需求的CDR的精确序列，按计划，将这些序列适当地嵌入到包含人类抗体变异DNA的构架结构中。

本发明更进一步包括抗嗜酸细胞活化趋化因子2抗体的片段，其保留对嗜酸细胞活化趋化因子2的结合活性。

本文中所使用的术语“Fab”指的是片段，包含单个，抗体分子的单价的抗原结合段。Fab包括完整的轻链和重链的部分，可以通过木瓜蛋白酶消化整个抗体产生。

本文中所使用的术语“(Fab)₂”指的是通过胃蛋白酶消化抗体获得的抗体片段。胃蛋白酶消化导致抗体在Fc部分***，形成二价的片段，其包含两个Fab片段和小部分的Fc片段，且通过S-S连接。“Fab”’通过打开S-S连接、减少(Fab)₂获得。

本文中所使用的术语“Fv”指的是包含可变区轻链和可变区重链基因工程片段。

本文中所使用的术语“单链抗体”指的是基因工程分子，包含可变区轻链和可变区重链，与合适的连接体(例如多肽)键合。单链抗体通常通过表达同一多核苷酸编码融合多肽(包括可变区的轻和重链及连接体头)进行制备。制备单链抗体的方法是本领域公知的，例如参见美国专利4,946,778。

根据本发明的抗体片段可以使用合适的蛋白酶，例如木瓜蛋白酶或者胃蛋白酶，通过蛋白水解作用水解抗体获得，或者通过在寄主细胞里重组表达核酸编码抗体片段获得，例如细菌(例如大肠杆菌)或者哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)。

本发明的抗体可能是在寄主细胞里使用表达载体、表达核酸编码抗体获得的重组体。本文中所使用的术语“表达载体”涉及一种能够转录遗传学信息、编码抗嗜酸细胞活化趋化因子2抗体链到细胞的核酸骨架。***片段在靶细胞里表达，产生抗体，或者分泌到细胞介质，或者直接从细胞中提取。载体有多种来源，例如但不局限于质粒，噬菌体和其他病毒，装配型质粒和人工染色体。通常，本发明工程载体包括复制起点，克隆位点，选择标记和异源核酸编码抗体。病毒载体一般是载有非传染性的修饰病毒DNA或者RNA的基因工程病毒，但是仍然包含病毒启动子和异源核酸，因此允许使用病毒启动子转录异源核酸。病毒载体的非限制的例子是：逆转录病毒(包括慢病毒属)，腺病毒，腺伴随病毒，SV40，疱疹和牛痘病毒。

在某些实施方案中，本发明也包括组成本发明抗体的免疫轭合物和双特异分子。

本文中所使用的术语“反义疗法”指的是一种处理形式，其涉及对明确影响疾病的基因表达进行抑制。本发明反义疗法是针对抑制嗜酸细胞活化趋化因子2mRNA的表达。因此，反义疗法涉及核酸(DNA，RNA或者化学模拟物)的束的合成，其对嗜酸细胞活化趋化因子2mRNA或者其中片段(反义寡核苷酸)的顺序补充，有效，将结合被那种基因生产的信使RNA(mRNA)并且使它失去活性，改变那种基因“离开”。

本文中所使用的术语“siRNA”(小分子干扰RNA)，也称为短干扰RNA或者沉默RNA，是一种双链RNA分子，通常长20-25核苷酸，在生物学中具有多种作用。最值得注意的是，siRNA参与RNA干扰(RNAi)途径，干扰具体基因的表达。

本文中所使用的术语“小分子化学品”指的是一种有机化合物。分子重量上限是大约800道尔顿。

本文中所使用的术语“氨甲蝶呤”涉及一种用于处理癌症和自身免疫疾的抗代谢物和抗叶酸物药。

包括本发明抗体的药物组合物应用中进行非消化道给药，即，皮下给药，肌内注射和静脉内给药。非消化道给药的组合物通常包括将抗体溶于一个可接受的载体或者赋形剂，优选水性载体。可以使用多种水性载体，例如，水，缓冲水，盐，PBS(磷酸盐缓冲液)等等。这些溶液是无菌的，一般不含颗粒物质。组合物可以按照近似生理条件的要求包含药学上可接受的辅助物质，例如pH值调整和缓冲剂，毒性调整剂等等，例如醋酸钠，氯化钠，氯化钾，氯化钙，乳酸钠，组氨和精氨酸。

制备非消化道给药组合物的方法对本领域技术人员是熟知的或者参照本文的描述是显而易见的，例如Remington′s Pharmaceutical Science(15th Ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1980)。

本发明的抗体可以冷冻或者冻干和存储于合适的载体内，在使用之前可再生。这种技术显示可有效用于传统的免疫球蛋白，文献公开的冻干和再生技术可以被使用。

对处理目的来说，应给予有效量进行处理或者至少部分缓解症状。能实现的充足剂量在这里定义为“治疗有效剂量”使用的有效的剂量取决于疾病的严重程度和患者自己免疫***状态，通常每剂含有抗体从约0.01到约150mg。每天一次或多次给药，可在内科医生的指导下，选择每周或每月的剂量水平。

实施例

单克隆抗体的培养

按照标准对照培养一些mAbs克隆细胞。简而言之，Balb/C小鼠使用20μg嗜酸细胞活化趋化因子-2(Peprotec，USA)使其免疫，而后再进行4次增强。在确认多克隆体抗-嗜酸细胞活化趋化因子-2出现后，将小鼠处死，从脾中分离出细胞与NS/0骨髓瘤杂交，随后无性系筛选，结合嗜酸细胞活化趋化因子-2。然后杂交瘤细胞在无血清的培养基里生长2-3周，收集培养基，用100kDa微量离心浓缩器(Biological Industries，Israel)过滤集中。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)确认了鼠嗜酸细胞活化趋化因子-2与mAbs(D8)的交叉反应性。

下列先导物用于确定单克隆抗体D8，G8和G7的核酸序列：

重链(IgGγ1)：

正向(SEQ ID NO：：7)：

5′

CGAAGAGACAGTGACCAGAGTCCCTTGGCCCCAGTAAGCAAAGCTATTACCGAAGGTACAGTAATACACGGCCGTGTC 3′

反向(SEQ ID NO：：8)：

5′CGGGGAAGTAGTCCTTGACCAGGC 3′

轻链(Kappa)：

正向(SEQ ID NO：：：9)：

(变性)5′RR HRYY BWDMTVACHARWC 3′

或(SEQ ID NO：10)：

5′GATGTCTTGTGAGTGGCCTCAC 3′

反向(SEQ ID NO：11)：

5′TGGGATAGAAGTTATTCAGCAGGC 3′

结合测定

在平板上涂1μ/ml嗜酸细胞活化趋化因子或者嗜酸细胞活化趋化因子-2(在碳酸盐缓冲液中)，4℃下放置过夜。用PBS冲洗3次，在37℃下用2％的BSA封闭45分钟。抗嗜酸细胞活化趋化因子-2抗体(D8克隆)在37℃加入到PBS中连续稀释1.5小时。重复所述洗涤步骤，而后在37℃下将平板山羊抗鼠过氧化酶共轭抗体一起孵化1小时。重复所述洗涤步骤，然后用色度底物检测其结合情况。

脾细胞粘附测定

在粘附测定中，C57B1老鼠和Lewis老鼠脾细胞分布在蔗聚糖斜坡及平铺在10cm平皿上，进行过夜孵化。第二天，收获细胞，与浓度递增的D8或者全部的鼠IgG(5-50ug/ml)一起旋转预先处理2小时。细胞离心后，涂铺在用纤连蛋白预涂的96孔的平板上。在时孵化1小时后，非粘连的细胞被冲掉，并粘连细胞的数量用XTT工具(Biological Industries，Israe)进行统计。使用相似的粘附测定方法测定从健康志愿者收集的外周血单核细胞(PBMC)。

迁移测定

C57BL/6J得到的脾细胞，用Trans-Well***将鼠脾细胞以及用D8(30ug/ml)预先处理的人PBMC细胞涂铺到上层槽中。下层室含添加VEGF(血管内皮细胞生长因子)(20ng/ml)的无血清培养基。4小时后，收集下层槽里的培养基，使用流式细胞术计算细胞数量(每分钟收集细胞的数量)。

斑块和心血管体外试验：

I.制备人颈动脉斑块和蛋白序列

人动脉粥样斑块从两组患者中获取。稳定斑块(n-4)从无症状的严重的粥样动脉硬化患者中获得动脉内膜切除样本。不稳定斑块的代表性样本从有急性心肌梗死(n＝4)的患者病变血管中，通过经皮冠状动脉血管成形术获得。血栓切除术由专用抽吸设备完成。获得的材料包括红血栓，白色血栓和来自病变动脉的易损的斑块片段。而后进行水洗和溶胞，剩余组织主要包括动脉粥样硬化破裂斑块的片段。

用RayBio^TM Human Inflammation Antibody Array 3.1(Ray Biotech，USA)在稳定和脆弱的人斑块中测定40细胞因子类，趋化因子和增长因子。概括地说，斑块在裂解缓冲液中、在工具内使用球团研杵进行均匀处理。阵列中每份样品与500mg蛋白质一起孵化，随后在制造商的指导下培育。结果使用TINA2.0软件分析。

II.毛细管细胞

鼠毛细管细胞(H5V)在DMEM F-12(Biological Industries，Israel)中进行培养，添加10％的胎牛血清(FCS)(Invitrogen)和1％的青霉素/硫酸链霉素添加物(Biological Industries，Israel)。细胞在含有8％的二氧化碳的潮湿的保温箱里于37℃培养。单核细胞U937在完全培养基RPMI 1640里培养，浓度为10⁶细胞/ml，含有10％的FCS和1％的青霉素/硫酸链霉素。细胞在含有5％的二氧化碳的潮湿的保温箱里于37℃培养。

III.内皮细胞的粘附测定

在粘附测定中，H5V老鼠内皮细胞在含有oxLDL、1μg/ml(制备方法如前述，33)的条件下，培养72小时。然后，细胞在含有oxLDL的条件下，以4X10³细胞/ml的浓度、涂铺在96孔的平板上，过夜。第二天，在以8X10⁴的浓加入U937细胞或者从ApoE小鼠得到的脾获得淋巴细胞之前，细胞经山羊抗鼠嗜酸细胞活化趋化因子-2抗体(Cytolab，USA)或者山羊IgG预先处理1小时。在1小时的孵化后，非粘连细胞被冲掉，粘连细胞的数量被用XTT工具(Biological Industries，Israel)进行分析。

IV.主动脉和H5V内皮细胞聚合酶链响应分析

来自样品组织的RNA和H5V内皮细胞，在制备协议下、使用EZ-RNA工具(Biological Industries，Israe)、通过硫氰酸胍和酚氯仿方法分离。使用AMV反向转录酶(TaKaRa RNA PCR试剂盒，Takara，Japan)，在常规热循环仪里进行RT-PCR。具体的基因扩增使用热起动aKaRa Ex Taq DNA聚合酶。为小鼠嗜酸细胞活化趋化因子-2和TGF-β(表1)mRNA设计了扩展内含子序列的特异性先导物。下列PCR条件用于G3PDH和TGF-β的扩增：样品在95℃下孵化2分钟，95℃下30s进行27个周期(对G3PDH)或者35个周期(对TGFβ)；55℃下45s以及72℃下1min。降落PCR扩增协议用于嗜酸细胞活化趋化因子-2mRNA表达的分析：在初始温度70℃、退火温度60℃下，扩增30个周期。PCR样品在2％的琼脂糖凝胶中扩增，使用Gelstar核酸染色(Gambrex，USA)染色，PCR产品在300nm紫外灯下观察，使用偏光板照相机***拍照。染色体未染色的分离的RNA被确认，通过3-磷酸甘油醛脱氢酶(G3PDH)PCR反应操作，在抗转录作用之前。在所有药品扩增中使用无核酸酶的水作为阴性对照。每个RNA样本均经过多次分析。V.主动脉窦免疫组织化学分析

冷冻切片(5μm厚)通过使用间接免疫过氧化酶染色进行评价。载玻片用Mayer′s苏木精进行对照染色，然后用甘油(Dako)密封。免疫化学染色使用亲和纯山羊抗-鼠-嗜酸细胞活化趋化因子-2(Cytolab，Israel)。

统计分析

通过单向方差分析测试对各组进行比较。P＜0.05认为具有显著差异。结果以平均值和标准误差表示。

实施例1：抗嗜酸细胞活化趋化因子-2mAb(D8)的特异性和抗炎效应

如上所述方法制备多个抗嗜酸细胞活化趋化因子-2鼠单克隆抗体(mAbs)。

D8抗体重链的核酸序列编码如下所示：

SEQ ID NO：1：

GGGCAGCAGANCCGGGGCNGNGGATAGACAGANGGGGGNNGNCGTTTTGGCTGA

GGAGACGGTGACTGAGGTTCCTTGACCCCAGTTGTCCATAGCGTAGCTACTACCGTAGGA

ATGACTTGCACAGAAATATG

TAGCCGTGTCCTCATTTCTGAGGTTGTTGATCTGCAAATAGGCAGTGCTGGCAGAGGTTTC

CAAAGAGAGGGCAAACCGT

CCCTTGAAGTCATCAGTATATGTTGGCTCTCCATTGTAGGTGTTGATCCAGCCCATCCACTT

TAAACCCTTTCCTGGAGC

CTGCTTTACCCAGTTCATTCCAGAGTTTGTGAAGGGATACCCAGAAGCCCTGCAGGAGATC

TTGACTGTGTCTCCAGGCT

T℃TTCAGCTCANGTCCAGACTGCACCAACTGGATCTGGGCCATGGCCNGCTA

D8抗体轻链(kappa)的核酸序列编码如下所示：

SEQ ID NO：2：

GGGCCAATGGNNGAGGACGCGGATGGGGGTGTCGNNGTGC

CTTNGTCGNNNNCTNNTTGNNCANCNTCNACNNCNNNNANNNNANNGNNNNNTGNAANA

NNGATGGNNNTNNNCNACANN

NTGGNNTCCTNNNNNNNTNNNNTGNNNNNGACNNCANANACANNNNCNACNNNATGANC

NNCNNNCNNNNNTTGANNNNN

GNCNANTATGAACNANNNAANNNNNNTACCTGNNANGCCACTCACAAGACATCA

G8抗体重链的核酸序列编码如下所示：

SEQ ID NO：3：

GGGCAGCAGNTCCAGGGGCCAGNGGATAGACAGANGGGGGNGTCGTTTTGGCTG

AGGAGACGGTGACTGAGGTTCCTTGACCCCAGTTGTCCATAGCGTAGCTACTACCGTAGG

AATGACT

TGCACAGAAATAT

GTAGCCGTGTCCTCATTTCTGAGGTTGTTGATCTGCAAATAGGCAGTGCTGGCAGAGGTTT

CCAAAGAGAGGGCAAACCG

TCCCTTGAAGTCATCAGTATATGTTGGCTCTCCATTGTAGGTGTTGATCCAGCCCATCCACT

TTAAACCCTTTCCTGGAG

CCTGCTTTACCCAGTTCATTCCAGAGTTTGTGAAGGGATACCCAGAAGCCCTGCAGGAGAT

CTTGACTGTGTCTCCAGGC

TTCTTCAGCTCAGGTCCAGACTGCACCAACTGGATCTGGGCCATGGCCGGCTANN

G8抗体轻链(kappa)的核酸序列编码如下所示：

SEQ ID NO：4：

GGGCCAATGGNNGAGGACGCGGATGGGGGTGTCGNNGTGCCT

TNGTCGNGTGCTTNTTGAACAACTTCTACCCCNNANACNTNANNGTNNNNTGGAANATTG

ATGGCNGTGAACGACAAAAT

GGCGTCCTGAACANTTGGACTGATCCANGACAGCAAANACANCNCCTACAGCATGAGCAG

CACCCTCACGTTGACNNNNG

ACNANTNTGAACGACGTANNNNCNNTACCTGTNANGCCACTCACAAGACATCA

G7抗体重链的核酸序列编码如下所示：

SEQ ID NO：5：

GGGCAGCAGNTCCAGGGGCCAGNNGGATAGACAGANGGGGGNGNCGTTTTGGCT

GAGGAGACGGTGACTGAGGTTCCTTGACCCCAGTTGTCCATAGCGTAGCTACTACCGTAG

GAATGACTTGCACAGAAATA

TGTAGCCGTGTCCTCATTTCTGAGGTTGTTGATCTGCAAATAGGCAGTGCTGGCAGAGGTT

TCCAAAGAGAGGGCAAACC

GTCCCTTGAAGTCATCAGTATATGTTGGCTCTCCATTGTAGGTGTTGATCCAGCCCAT℃CA

CTTTAAACCCTTTCCTGGA

GCCTGCTTTACCCAGTTCATTCCAGAGTTTGTGAAGGGATACCCAGAAGCCCTGCAGGAG

ATCTTGACTGTGTCTCCAGG

CTTCTTCAGCTCAGGTCCAGACTGCACCAACTGGATCTGGGCCATGGCCGGCTANN

G7抗体轻链(kappa)的核酸序列编码如下所示：

SEQ ID NO：6：

GGGCCTTTGGNNGAGGACGCGGATGGGGGTGTCCNNGTGCCT

TNGTCGNGTGCTTNTTGAACAACTTCTACCCCNNANACNTNANNGTNNNNTGGAANATTG

ATGGCNGTGAACGACAAAAT

GGCGTCCTGAACANTTGGACTGATCCANGACAGCAAATACANCNCCTACAGCATGAGCAG

CACCCTCACGTTGACNNNNG

ACNANTNTGAACGACGTANNNNCNNTACCTGTNANGCCACTCACAAGACATCA

在所述核酸序列里的字母N表示任何一个核苷酸A，T，C或者G的存在。

杂交瘤细胞生产的D8单克隆抗体在2009年8月17日保藏于英国威尔特郡索尔兹伯里的欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，登录号D809081702。

杂交瘤细胞生产的G8单克隆抗体在2009年8月17日保藏于ECACC，登录号G809081701。

新的抗嗜酸细胞活化趋化因子-2抗体(D8)的特异性通过结合测定法评价。将克隆D8产生的mAbs经过连续稀释，涂铺到覆有或者嗜酸细胞活化趋化因子、或者嗜酸细胞活化趋化因子-2的平板上，过夜孵化。水洗后，平板与山羊抗-鼠过氧化酶共轭抗体一起孵化，再次水洗，使用色度底物检测其结合。

如图1中所示，克隆D8的mAbs显示与嗜酸细胞活化趋化因子-2有显著的结合，与嗜酸细胞活化趋化因子没有结合，在全部测试稀释范围内。

抗体也测试器抑制鼠或者老鼠脾细胞的粘附能力，以及抑制人PBMC与纤连蛋白粘附能力，或者减弱向VEGF迁徙的能力。D8(50μg)发现具有抑制鼠和老鼠脾细胞粘附能力，以及抑制人PBMC与纤连蛋白(FN)粘附能力的35-55％(图2A)。

向VEGF的迁徙也呈现以剂量依赖的方式(图2B)减弱，确认了抗体潜在的抗炎效应。

实施例2：克隆D8mAb的抗炎潜能(体内数据)

A.类风湿性关节炎模型

佐剂性关节炎通过注射不完全弗氏佐剂(incomplete Freund′s adjuvant)诱导Lewis小鼠(从Harlan，Israel获得的六周龄Lewis小鼠)。不完全弗氏佐剂通过在矿物油中热灭活结核分支杆菌(Difco，Detroit，MI)，浓度为10mg/ml。小鼠尾部皮下注射100μl佐剂。在注射10天后形成关节炎。

对抗影响的评估-嗜酸细胞活化趋化因子-2抗体，与作为对照的非特异性IgG和PBS相比较，佐剂诱导关节炎：

老鼠(每组8只)腹腔(IP)注射3单克隆抗体抗对嗜酸细胞活化趋化因子-2，(D8，G8，G7)3X/周。对照组所有老鼠(非特异)用IgG或者PBS处理。在佐剂给药后第三天进行注射，一周进行3次，直到老鼠被处死。

剂量响应实验：

在第二组实验中，D8，抗-嗜酸细胞活化趋化因子-2抗体显示对佐剂引起的关节炎模型具有最好的保护效果，以剂量-响应模型测试。佐剂关节炎通过所述描述方式进行诱导。所有动物(6只老鼠的每肢)在佐剂注射3天后，以剂量20μg、100μg或者1000μg腹膜内注射D8，3次每周(D8预防组)。另一组单独的动物(每组6只)在关节炎开始后使用相同的剂量处理，即当关节炎已经明显(D8处理组)时。

为了比较D8与已知效力的传统的炎药剂的抗炎效力，一组使用氨甲蝶呤(ip)进行处理，0.25mg/kg，每周1次，在佐剂注射(氨甲蝶呤预防组)之后第3天。另一组使用氨甲蝶呤、0.25mg/kg，与D8、100μg(ip注射)相结合进行处理，每周3次，在第3天开始(结合D8-氨甲蝶呤预防组)。对照组在整个实验期间均用进行PBS处理。

关节炎严重程度评估：

关节炎严重程度通过测量体重，爪子溶胀，关节炎得分和整个动物活动性进行评价。获取关节样品进行病理学评估，处死后进行X光照射踝关节、并记录其侵蚀度。

体重以克为单位计重，每隔一天测量，作为***炎症的一个指标。

爪子溶胀评估：通过卡尺测量踝和腕关节直径、并记录，单位为毫米(小数点之后精确位)，每周3次。

关节炎得分测量：每只爪子的溶胀度、红斑及畸形(每只动物4只爪子满分计为16)分成如下0-4度：0＝正常；1＝踝或腕关节的轻微的红斑和/或溶胀；2＝踝或腕关节的中度的红斑和/或溶胀；3＝踝或腕关节的严重的红斑和/或溶胀；4＝趾或指以及踝或腕关节完全红斑，并且踝或者腕关节不能弯曲。

按照指和趾溶胀各自贡献进行记录：踝(feet)：每个趾得0.2分；腕：每个指得0.25，计算全部关节的总数。

活动性得分：

动物全部活动性分为0-4度进行记录，根据下列定义：0＝正常；1＝轻微损伤；2＝较大损伤；3＝爪子无阶梯状；4＝无运动。

统计分析：使用QuickCalcs软件(Graph-Pad Software，San Diego，CA)进行统计分析。各实验组之间进行检验，以鉴定显著性差异。

结果：

A.关节炎模型

与免疫球蛋白(IgG)或者PBS相比较，在小鼠中，观察到抗-嗜酸细胞活化趋化因子-2个抗体对关节炎具有的显著抑制作用。如图3A-3C所示，通过全部测验参数(关节炎得分，活动性得分和踝直径)证明抗体的抑制作用。标记为D8的抗体显示具有最显著的效应。小鼠使用D8进行处理，与小鼠用PBS处理或者小鼠用IgG处理相比，从第13到第21天，每次测量得到的关节炎得分(图3A)具有显著的统计学差异(P＜0.05)。在诱导之后的第17天，关节炎出现时保护效应立即显现。在第21天，持续增加强度直到实验结束。

从第17天开始用D8处理的小鼠与用PBS处理的小鼠相比、从第18天开始用D8处理的小鼠与用PBS或IgG处理的小鼠相比，每次测量得到的活动性得分具有显著的统计学差异(P＜0.05)。因此，用D8处理的动物其平均活动性得分在第21天的平均值为1.37，相比较，用PBS处理的动物为2.43(p＝0.05)。

在第19天，D8和PBS在踝直径测试中具有显著的统计学差异(p＜0.05)。D8和IgG之间没有显著的差异。

如上所述，D8处理的小鼠，其关节炎得分比用PBS处理的小鼠关节炎得分低2.6到3.0(图4A)。组织学评价，对每只爪子的程度分为0-4度进行记录：0＝正常；1＝炎症渗入物和关节增生；2＝血管翳形成和软骨侵蚀；3＝重度的软骨侵蚀和骨损坏；4＝关节失去完整性。关节炎老鼠的关节组织学分析揭示D8的小鼠具有滑膜增生和分散的炎症渗入物(图4B)，而用PBS(对照组)处理的大多数老鼠有严重的非化脓性***炎性滑膜炎和强烈的炎症渗入物(图4C)。

为了评价使用抗-嗜酸细胞活化趋化因子-2抗体处理对***炎性响应的影响，记录动物的平均重量。如图5中所示，抗-嗜酸细胞活化趋化因子-2处理显著改善由佐剂关节炎引起的***炎性响应引起的体重减轻。再次，观察到用D8抗体处理的动物具有最强的保护效，在整个实验期间体重持续增加。在第17天，D8和PBS之间，重量具有显著的统计学差异(p＜0.05)。剂量响应实验：

D8预防关节炎：

在一系列剂量响应实验中，D8在剂量100μg下，具有显著的优越的保护效应，与低剂量组(20μg)和高剂量组(1000μg)相比(图6A)。在获得的活动性得分，踝直径和动物体重(不显示的数据)中，具有相似的结果。每次测量均具有显著的统计学差异(P＜0.05)，从第17天到第24天，与D8 100μ处理的小鼠和用PBS处理的小鼠相比。

D8处理关节炎：

与PBS处理动物相比较，在关节炎出现时用D8抗体腹膜内处理，其结果也明显减少关节炎得分(图6B)。在获得的活动性得分，踝直径和动物体重中，具有相似的结果。如图6B所示，实验中，100μg和1000μg剂量组，具有相似的结果。

结合D8-氨甲蝶呤(MTX)预防关节炎：

通过关节炎测量得分(与PBS处理对照组相比)，氨甲蝶呤和D8100μg在抗关节炎发展中作用均明显，氨甲蝶呤和D8的结合产生增强(协同作用)保护效应，如图7所示。

在第13天，与PBS相比较，D8 100μg和MTX处理均具有显著的统计学效果(p＜0.05)。在实验结束之前，在第24天，观察到单独使用MTX处理小鼠与MTX+D8 100μg处理小鼠，其关节得分具有显著的统计学差异。在第24天，观察到平均踝宽度在两组之间也有明显的不同(未显示)。

X-射线结果：

死亡后，X-射线显示，用PBS处理的小鼠其关节周软组织具有强烈的溶胀，与用D8(图8)处理的老鼠具有最小溶胀相比。另外，对照组小鼠有脱钙和早期现象，在D8动物里不明显。这表明，D8处理小鼠炎症明显减少。

足前段X-射线具有相似的结果(未示出)。

B.结肠炎模型

为了诱导慢性结肠炎，在10周龄C57BL小鼠饮用水中添加葡萄糖硫酸盐(DSS)，反复3个循环，每循环5天，间隔10天给予自来水。在第一次循环结束之前，老鼠被随机分成6个组：赋形剂对照组(PBS)，所有IgG小鼠组，以及逐渐递增给予25μM，100μM和200μM D8组。通过腹腔(ip)注射，每周3次。体重每周记录两次。在最有一次循环结束后，处死小鼠；结肠近端免疫组织化学分析、末端进行髓过氧酶(MPO)活性测定(根据标准协议)，以确定引起的炎症的程度。通过流式细胞仪测定动物血清里的炎症因子水平。

用IgG或者D8处理的动物显著减弱体重的减轻，与用赋形剂处理组相比。在整个研究期间，观察到最高的体重出现在D8 5μg处理组(图9A)。在第34天，5μg D8处理组MPO活性显著降低，与包括mlgG(图9B)的全部其他处理组相比。另外，在D8处理动物血清里的炎症因子的水平比在对照动物(图9C)里测定的更低。结肠近端免疫组织化学分析确认显示对结肠组织损害和在炎症(图9D)范围均减少。通过病理学专家评价了炎症渗入物程度。

C.动物模型

EAE作为一种典型的动物模型为人类疾病多发性硬化研究潜在的疗法(30)。

10周龄的C57BL小鼠皮下注射(sc)200μg悬浮于弗氏完全佐剂里的MOG(Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein)肽，一周以后进行第二注射。在疾病诱导一天后(即，在第二次注射一天后)开始用赋形剂对照(PBS)，全部小鼠IgG、25μg D8以及100μg D8(3次/周，腹膜内注射)进行处理。通过标准EAE记分***(31)记录疾病的严重程度和发展程度，每周3次。

用25μg，更显著的用100μgD8处理，在实验的整个期间能够减弱EAE特征的发展。而且，D8在高剂量组(100μg)可以把发病率从大约90％(在全部的其他处理组)降低到仅有55％(图10)，因此可以清楚表明D8在处理EAE发展中潜在的治疗优势。

D.糖尿病

非肥胖糖尿病(NOD)小鼠作为自身免疫疾病性糖尿病(32)的动物模型。

6周龄非肥胖糖尿病(NOD)小鼠用D8或者赋形剂对照(PBS)处理，每周3次。在第49到112天之间的疾病发病率使用商业尿检进行测试，第112天血清中嗜酸细胞活化趋化因子-2的水平，通过使用酶联免疫吸附测定(Mouse CCL24/eotaxin-2/MPIF-2 DuoSet；R&D)。

D8处理组糖尿病发病率显著降低，与未处理的对照组(图11A)相比。与临床发展一致，在抗-嗜酸细胞活化趋化因子-2处理动物的血清中，嗜酸细胞活化趋化因子-2水平与对照组(图11B)相比极大地降低。

E.动脉粥样硬化斑块形成的抑制作用

在动脉粥样硬化病变(斑块)处测定了系列炎症因子和趋化因子的表达水平。比较从急性心肌梗死患者冠状动脉病变处获得的易损斑块和从动脉内膜切除术样本获得的稳定斑块。对斑块蛋白质阵列的分析如图12所示。处理方法按照材料和方法部分描述。

在差异表达蛋白中，发现下列蛋白质的一个显著改变：VCAM-I，嗜酸细胞活化趋化因子-2，IL-10，MCP-I和TIMP-2；全部显示出，在易损对稳定斑块中，其表达超过双倍的减弱(图12A)。

在动脉粥样硬化倾向小鼠(apoE KO小鼠)免疫组织化学研究过程中，如同所述材料和方法部分描述，对来自青年和老年小鼠的脂脂肪条纹和早期损害用抗-嗜酸细胞活化趋化因子-2ab染色。显示，嗜酸细胞活化趋化因子-2在内皮细胞和斑块巨噬细胞(图13)中存在。

测量青年(6周龄)和动脉粥样硬化的apoE KO小鼠mRNA表达。从小鼠中获取，按照材料和方法部分描述进行RT-PCR。对嗜酸细胞活化趋化因子-2和TGF-β的mRNA水平进行比较分析。老年小鼠相比、青年小鼠嗜酸细胞活化趋化因子-2mRNA水平显著较高，这种表达方式与观察到抗动脉粥样硬化剂TGF-β一致。图14A显示来自每组的代表性的例子。

氧化LDL在动脉粥样硬化形成中起关键作用。鼠H5V内皮细胞通过氧化LDL(oxLDL)(1μg/ml)诱导。在鼠的H5V内皮细胞里oxLDL对嗜酸细胞活化趋化因子-2mRNA水平具有显著的正调节作用(图14B)。

为了确定嗜酸细胞活化趋化因子-2是否在斑块炎症细胞成分粘附性中起作用，对培养的内皮细胞进行了粘附测定。从青年或老年动脉粥样硬化apoE KO小鼠的脾上分离脾细胞。小鼠内皮细胞用oxLDL(1μg/ml)进行诱导，在嗜酸细胞活化趋化因子2或对照IgG抗体存在的情况下，测定脾细胞和上内皮细胞的粘附性(图15A)。用嗜酸细胞活化趋化因子-2的封闭抗体对内皮细胞预孵化，发现减弱脾细胞对这些细胞的粘附(图15A)。与从年轻的非动脉粥样硬化小鼠(6周龄)相比，这种在影响在从动脉粥样硬化apoE KO小鼠(6月龄)淋巴细胞中更坚固。发现证实了，单核-巨噬细胞系(U937细胞)可以粘附到内皮细胞(H5V鼠内皮细胞)上(图15B)。

嗜酸细胞活化趋化因子-2阻滞对早期和高等的动脉粥样斑块的影响，通过使用商业上可用的抗嗜酸细胞活化趋化因子-2抗体以及本发明的单克隆抗体进行测量。在初步研究中，发现给予5μg的封闭抗-嗜酸细胞活化趋化因子-2抗体(Peprotech)、每周两次，足以显著地降低老鼠主动脉中嗜酸细胞活化趋化因子-2mRNA的水平。下一步，检测了短期给药抗嗜酸细胞活化趋化因子2的影响。青年apoE KO小鼠给药嗜酸细胞活化趋化因子-2抗体，每周两次(i.p注射5μg)，或者对照IgG，或者PBS给药4周，测量对脂肪条纹的影响。在用油红O染色后，将小鼠处死，惊醒斑块尺寸分析。与IgG小鼠相比，抗-嗜酸细胞活化趋化因子-2显著降低脂肪条纹形成大约72％(图16A)。这种影响与作为总胆固醇的脂质分布改变无关，且甘油三酯在两个组(不显示的数据)中均相似。而且，与PBS注射相比，用对照处理的小鼠IgG没有影响斑块的发展。

下一步嗜酸细胞活化趋化因子-2阻滞的影响在长期模型中测试，其中斑块结构更复杂。在此，在注射嗜酸细胞活化趋化因子-2抗体(5μg/剂)两周后，经过10周，对老年apoE KO小鼠心脏中斑块大小进行测量，没有明显的变化(图16B)。但是，通过纤维化区域分析测量斑块稳定时，发现嗜酸细胞活化趋化因子-2的抗体诱导产生明显的更稳定的斑块表型，呈现较小的脂质核心和大面积的纤维化区域(图16C)。再次，发现不考虑脂质的水平，两组之间没有差异。代表性的油红O和马森三色染切片如图17所示。

动脉粥样硬化是一个过程，由于脂肪的沉积于动脉壁，导致的内腔狭窄。成熟的斑块由两个基本结构组成：脂质核和纤维壳。脂质核越小且纤维壳约厚，斑块越稳定，意思是使其破裂并且引起心肌梗塞或者不稳定性心绞痛的可能性减少。现在清楚的是，大部分引起急性冠状动脉综合症(例如，心肌梗塞和不稳定性心绞痛)的斑块，血管造影显示有＜70％的狭窄(在28，29中综述)。约60％的损害是由于斑块破裂，其脂质和坏死碎屑形成一个大的血酸核造成(包括巨噬细胞，T细胞，陈旧性出血，血管生成和钙的聚集)。破裂的壳体是薄的，大概因为当巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶在移动穿过斑块时消化它们，并且由于由炎症细胞因子类及其它因素衰老或凋亡导致平滑肌细胞(斑块的支撑结构)被耗尽。

其中一个方面，本发明基于发现在易损和稳定人动脉粥样斑块中，嗜酸细胞活化趋化因子-2呈差异化表达。通过在apoE灭活(KO)[20]小鼠模型里阻滞嗜酸细胞活化趋化因子-2途径，发明者证明能够抑制脂肪条纹形成(表示早期动脉粥样硬化损害)斑块稳定性的延长。

本发明的发明人发现嗜酸细胞活化趋化因子-2在动脉粥样硬化和非动脉粥样硬化小鼠动脉内皮里表达支持了本发明中前述的记载。不过，发明人也发现嗜酸细胞活化趋化因子-2在斑块巨噬细胞里表达。与动脉粥样硬化的apoE KO小鼠相比较，嗜酸细胞活化趋化因子-2能够更充分地在青年apoE KO小鼠的动脉里表达。表明嗜酸细胞活化趋化因子-2涉及动脉粥样硬化的初始步骤，包括单核细胞/巨噬细胞对内皮细胞的细胞对细胞粘附。事实上，如下述的体外研究显示封闭嗜酸细胞活化趋化因子-2降低oxLDL诱导的淋巴细胞对内皮细胞的粘附，从而支持了在体内斑块形成过程中嗜酸细胞活化趋化因子-2具有一定作用。

尽管进行了重点研究，但决定稳定到易损斑块的转录因子仍然没有明晰。基于对稳定对易损人斑块炎症性蛋白阵列分析，本发明提供潜在的靶蛋白，嗜酸细胞活化趋化因子-2，涉及在稳定对易损表型斑块之间的转录。鉴于存在的固定数据联合VCAM-I，IL-10及MCP-I动脉粥样硬化，发明者也发现稳定与易损斑块的差异化表达，嗜酸细胞活化趋化因子-2不存在这样的数据。

另外，本发明的发明人发现嗜酸细胞活化趋化因子-2在动脉粥样硬化和非动脉粥样硬化小鼠动脉内皮里表达支持了本发明中前述的记载。不过，发明人还发现了斑块巨噬细胞里的表达。有趣的是，嗜酸细胞活化趋化因子-2能够更充分在年轻动脉粥样硬化apoE KO小鼠的包括单核细胞/巨噬细胞到内皮的细胞到细胞粘附的初始步骤动脉粥样硬化中表达。事实上，体外试验支持嗜酸细胞活化趋化因子-2具有阻滞oxLDL介导粘附的作用，如同在体内那样。嗜酸细胞活化趋化因子-2在小鼠早期动脉粥样硬化强大的表达也解释了在短期脂肪条纹模型阻滞这种途径的深刻效应。本非为了限制本理论，阻滞内皮炎症细胞向内皮细胞粘附在这种效应中起主要作用。

对于嗜酸细胞活化趋化因子-2阻滞对斑块稳定性影响的效应体现在纤维面积上，如果炎症细胞的移植由于嗜酸细胞活化趋化因子-2阻滞的减弱，可能预期细胞因子环境将更有利于趋向稳定表型。这些发现不一定能反映到降低动脉粥样硬化程度上，因为斑块的生成很可能由于脂质分布受嗜酸细胞活化趋化因子-2的阻而未改变的影响。

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表1