CN102307594A - 用激肽释放酶抑制剂治疗粘膜炎 - Google Patents

用激肽释放酶抑制剂治疗粘膜炎 Download PDF

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Abstract

公开了用于治疗粘膜炎的包括分离的激肽释放酶抑制剂的方法、试剂盒和组合物。

Description

用激肽释放酶抑制剂治疗粘膜炎
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年1月6日提交的美国临时申请序号61/142,746的优先权。在先申请的公开内容被认为是本申请公开内容的部分(并且通过引用并入本申请公开内容中)。
背景技术
粘膜炎是高剂量化疗(CT)和/或放疗(RT)方案常见的严重副作用，通常表现为口腔、食管、咽和胃肠道的红斑和疼痛的溃疡性损伤，威胁全世界至少600,000人的成功治疗。这些旨在杀伤癌细胞的细胞减少性疗法还可以无差别地破坏其他快速生长的细胞，例如口腔和咽喉以及胃肠道的内表面。
粘膜炎的发展是一个复杂的过程。通常，粘膜炎症状在施用CT后5至8天发展并持续大约7至14天。粘膜炎病变目前被确定为5阶段过程：开始、产生信使而传导信号、扩增、溃疡和最后愈合。
口腔和胃肠(GI)粘膜炎可以影响达100％经历高剂量化疗和造血干细胞移植(HSCT)的患者、80％接受放疗的头颈恶性肿瘤患者、以及大范围的接受化疗的患者。对于大多数癌症治疗来说，大约5-15％患者患有粘膜炎。然而，使用5-氟尿嘧啶(5-FU)时，达40％患有粘膜炎并且10-15％患有3-4级粘膜炎。依立替康治疗在超过20％患者中伴有严重的GI粘膜炎。75-85％骨髓移植接受者经历粘膜炎，其中口腔粘膜炎是最常见且最使人虚弱的，特别是使用苯丙氨酸氮芥时。在3级口腔粘膜炎中，患者不能吃固体食物，并且在4级口腔粘膜炎中，患者也不能食用液体。对头颈或对骨盆或腹部的放疗分别伴随3级和4级的口腔或GI粘膜炎，通常超过50％的患者。在经历头颈放疗的患者中，疼痛和降低的口腔功能可以在放疗结束后长期持续。在大多数试验中，分次放射剂量增加粘膜炎风险至＞70％患者。
口腔粘膜炎已经被在经历造血干细胞移植的骨髓毒性疗法的同时经历抗癌疗法的患者认定为是抗癌疗法的最使人虚弱的副作用，骨髓毒性疗法伴随最高级别的粘膜毒性，70％-80％患者罹患口腔粘膜炎。严重的口腔粘膜炎的并发症可以包括：严重程度需要阿片样物质止痛的疼痛；由于口腔和咽喉溃疡而难以或不能吞咽，如果严重可能需要完全胃肠外营养(TPN)和补水；难以或不能讲话，这可能妨碍患者的交流能力。重要的是，口腔粘膜炎的发展通常阻碍肿瘤学家开出化疗或放射疗法的完全剂量和方案，使得该疾病常常限制可能治愈性治疗的潜在完全益处。据估计，口腔粘膜炎发展的负担增加头颈癌患者$4,000的医院成本，并且增加骨髓移植患者$43,000的医院成本。
控制口腔粘膜炎是首要的。有许多不同的方法来帮助缓解疼痛，包括吸允冰块、抗氧化剂和口腔清洗剂。几种口腔清洗剂是可用的，组合了抗组胺药、麻醉剂、抗炎药(例如皮质激素)、抗生素和抗真菌剂。麻醉性镇痛药也可以证明帮助缓解疼痛。其他方法包括抗微生物剂、抗炎剂和良好的口腔护理。
帕利夫明(KEPIVANCE
Figure BPA00001394925800021
)(人角质形成细胞生长因子(KGF))是唯一被批准用于口腔粘膜炎的药物，并且适用于降低接受需要造血干细胞支持/移植的骨髓毒性疗法的恶性血液病患者严重口腔粘膜炎的发病和持续时间。然而，HSCT代表了癌症群体的小亚群，并且大多数实体瘤带有KGF受体，藉此，该物质可能具有潜在不期望的激动效应。因此，将帕利夫明(KEPIVANCE
Figure BPA00001394925800022
)应用于癌症及随后其治疗产生的口腔粘膜炎的较大市场是极不可能的。除了HSCT的其他适应症研究目前被进行，并且包括药物在移植物抗宿主疾病、头颈癌、2/3期结肠癌多发性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病和小儿HSCT群体中的使用。
因此，在治疗粘膜炎中存在明显的未满足的需求。
发明概述
本文公开了治疗粘膜炎、特别是口腔粘膜炎的方法。在一个方面，本发明提供了用于治疗粘膜炎的方法，包括施用治疗有效量的分离的激肽释放酶抑制剂，任选与另一种物质例如帕利夫明(KEPIVANCE
Figure BPA00001394925800031
)(人角质形成细胞生长因子(KGF))组合。本文描述的方法包括施用有效量的激肽释放酶抑制剂。这种量可以是足以产生可检测的改善、减少或缓解至少一种症状、调节(例如改善)至少一个生理参数或预防更严重级别疾病发展至统计学上显著的程度的量。
本文公开了预防粘膜炎特别是口腔粘膜炎的方法。一个方面，本发明提供了预防粘膜炎(例如有风险发展粘膜炎的患者中)的方法，包括施用预防有效量的分离的激肽释放酶抑制剂，任选与另一种物质例如帕利夫明(KEPIVANCE)(人角质形成细胞生长因子(KGF))组合。本文描述的方法包括施用有效量的激肽释放酶抑制剂。这种量可以是足以减少或延迟或缓解至少一种症状或一个生理参数的量。有风险发展粘膜炎的受试者(例如患者)可以是例如将经历、正在经历或将经历化疗(例如高剂量化疗)和/或放疗方案的受试者。作为另一个实例，有风险发展粘膜炎的受试者(例如患者)可以是例如已被诊断患有癌症例如头或颈癌的受试者。
用于方法、组合物和试剂盒的激肽释放酶抑制剂可以是例如血浆激肽释放酶(pKal)或组织激肽释放酶抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是血浆激肽释放酶抑制剂。
用于方法、组合物和试剂盒的激肽释放酶抑制剂可以是本文描述的Kunitz结构域多肽的任何一个、包括任何此类Kunitz结构域的更大多肽(条件是通过标准测定法测定，激肽释放酶抑制剂多肽结合并抑制激肽释放酶)、激肽释放酶结合蛋白(例如抗体，例如抗血浆激肽释放酶抗体)或本文描述的其他激肽释放酶抑制剂。
在一些实施方案中，激肽释放酶抑制剂包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp AspGly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg GlnCys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu SerLeu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp(SEQ ID NO：2)或其片段，例如SEQ ID NO：2的氨基酸3-60。
在一些实施方案中，激肽释放酶抑制剂包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly ProCys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys GluGlu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu GluGlu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp(SEQ ID NO：2的氨基酸3-60)。
在一些实施方案中，激肽释放酶抑制剂包括血浆激肽释放酶结合蛋白(例如抗体，例如本文描述的抗血浆激肽释放酶抗体)。
在一些实施方案中，结合蛋白(例如抗体，例如人抗体)结合相同的表位或者竞争结合本文描述的蛋白。
在一些实施方案中，本文描述的蛋白选自由以下组成的组：M162-A04，M160-G12，M142-H08，X63-G06，X81-B01，X67-D03和X67-G04。
在一些实施方案中，血浆激肽释放酶结合蛋白与X81-B01竞争或结合相同表位。
在一些实施方案中，血浆激肽释放酶结合蛋白与X67-D03竞争或结合相同表位。
在一些实施方案中，血浆激肽释放酶结合蛋白不结合前激肽释放酶(例如人前激肽释放酶)，但是结合血浆激肽释放酶(例如人血浆激肽释放酶)的活性形式。
在某些实施方案中，蛋白在血浆激肽释放酶或其片段的催化结构域的活性位点或附近结合，或者结合与血浆激肽释放酶活性位点重叠的表位。
在一些实施方案中，蛋白结合形成血浆激肽释放酶的催化三联体的一个或多个氨基酸：His434、Asp483和/或Ser578(编号基于人序列)。
在一些实施方案中，蛋白结合Ser479、Tyr563和/或Asp585(编号基于人序列)的一个或多个氨基酸。
在一些实施方案中，血浆激肽释放酶结合蛋白使因子XIIa和/或缓激肽生产减少超过约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％，与标准相比较，例如在相同条件下但不存在所述蛋白时的因子XIIa和/或缓激肽生产。
在一些实施方案中，血浆激肽释放酶结合蛋白具有小于1000、500、100或10nM的表观抑制常数(Ki，app)。
在一个实施方案中，HC和LC可变结构域序列是相同多肽链的组成部分。
在另一个实施方案中，HC和LC可变结构域序列是不同多肽链的组成部分。例如，血浆激肽释放酶结合蛋白是IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。血浆激肽释放酶结合蛋白可以是可溶性Fab(sFab)。
在其他实施方式中，血浆激肽释放酶结合蛋白包括Fab2′、scFv、迷你抗体、scFv::Fc融合体、Fab::HSA融合体、HSA::Fab融合体、Fab::HSA::Fab融合体或者包括本文结合蛋白之一的抗原结合位点的其他分子。这些Fab的VH和VL区可以提供为IgG、Fab、Fab2、Fab2′、scFv、PEG化Fab、PEG化scFv、PEG化Fab2、VH::CH1::HSA+LC、HSA::VH::CH1+LC、LC::HSA+VH::CH1、HSA::LC+VH::CH1或其他适当的构建体。
在一个实施方案中，血浆激肽释放酶结合蛋白是人或人源化抗体或者在人中是非免疫原性的。例如，蛋白包括一个或多个人抗体构架区，例如所有人构架区。
在一个实施方案中，血浆激肽释放酶结合蛋白包括人Fc结构域或与人Fc结构域至少95、96、97、98或99％相同的Fc结构域。
在一个实施方案中，血浆激肽释放酶结合蛋白是灵长类或灵长类化抗体或者在人中是非免疫原性的。例如，蛋白包括一个或多个灵长类抗体构架区，例如，所有灵长类构架区。
在一个实施方案中，血浆激肽释放酶结合蛋白包括灵长类Fc结构域或者与灵长类Fc结构域至少95、96、97、98或99％相同的Fc结构域。“灵长类”包括人(Homo sapiens)、黑猩猩(Pan troglodytes和Panpaniscus(倭猩猩))、大猩猩(Gorilla gorilla)、长臂猿、猴子、狐猴、指猴(Daubentonia madagascariensis)和眼镜猴。
在一个实施方案中，血浆激肽释放酶结合蛋白包括人构架区或与人构架区至少95、96、97、98或99％相同的构架区。
在某些实施方案中，血浆激肽释放酶结合蛋白不包括来自小鼠或兔的序列(例如，不是鼠或兔抗体)。
在一些实施方案中，粘膜炎选自由口腔粘膜炎、食管粘膜炎、咽粘膜炎和胃肠粘膜炎组成的组。
在一些实施方案中，粘膜炎是口腔粘膜炎。
在一些实施方案中，所述方法还包括施用帕利夫明。
在一些实施方案中，结合蛋白(例如抗体，例如人抗体)包括重链免疫球蛋白可变结构域序列和轻链免疫球蛋白可变结构域序列，其中：
所述重链免疫球蛋白可变结构域序列包括来自本文描述的蛋白的重链可变结构域的一个、两个或三个(例如三个)CDR区，和/或
所述轻链免疫球蛋白可变结构域序列包括来自本文描述的蛋白的轻链可变结构域的一个、两个或三个(例如三个)CDR区，
其中所述蛋白结合(例如，并且抑制)血浆激肽释放酶。
在一些实施方案中，所述重链免疫球蛋白可变结构域序列包括来自M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X81-B01、X67-D03或X67-G04的重链可变结构域的一个、两个或三个(例如三个)CDR区，和/或
所述轻链免疫球蛋白可变结构域序列包括来自M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X81-B01、X67-D03或X67-G04的轻链可变结构域的一个、两个或三个(例如三个)CDR区(分别地)。
在一些实施方案中，来自所述重链可变结构域的一个、两个或三个(例如三个)CDR区来自X81-B01，和/或来自轻链可变结构域的一个、两个或三个(例如三个)CDR区来自X81-B01。
在一些实施方案中，来自所述重链可变结构域的一个、两个或三个(例如三个)CDR区来自X67-D03，和/或来自轻链可变结构域的一个、两个或三个(例如三个)CDR区来自X67-D03。
在一些实施方案中，所述重链免疫球蛋白可变结构域序列包括本文描述蛋白的重链可变结构域，和/或所述轻链免疫球蛋白可变结构域序列包括本文描述蛋白的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，所述重链免疫球蛋白可变结构域序列包括M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X81-B01、X67-D03或X67-G04的重链可变结构域，和/或所述轻链免疫球蛋白可变结构域序列包括M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X81-B01、X67-D03或X67-G04的轻链可变结构域(分别地)。
在一些实施方案中，所述重链免疫球蛋白可变结构域序列包括X81-B01的重链可变结构域，和/或所述轻链免疫球蛋白可变结构域序列包括X81-B01的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，所述重链免疫球蛋白可变结构域序列包括X67-D03的重链可变结构域，和/或所述轻链免疫球蛋白可变结构域序列包括X67-D03的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，蛋白包括本文描述蛋白的重链和/或本文描述蛋白的轻链。
在一些实施方案中，蛋白包括M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X81-B01、X67-D03或X67-G04的重链和/或M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X81-B01、X67-D03或X67-G04的轻链(分别地)。
在一些实施方案中，蛋白包括X81-B01的重链和/或X81-B01的轻链。
在一些实施方案中，蛋白包括X67-D03的重链和/或X67-D03的轻链。
在一些实施方案中，蛋白包括下述特征的一个或多个：(a)人CDR或人构架区；(b)HC免疫球蛋白可变结构域序列包括与本文描述的HC可变结构域的CDR至少85、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同的一个或多个(例如1、2或3)CDR；(c)LC免疫球蛋白可变结构域序列包括与本文描述的LC可变结构域的CDR至少85、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同的一个或多个(例如1、2或3)CDR；(d)LC免疫球蛋白可变结构域序列与本文描述的LC可变结构域至少85、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同(例如，总体上或在构架区或CDR中)；(e)HC免疫球蛋白可变结构域序列与本文描述的HC可变结构域至少85、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同(例如，总体上或在构架区或CDR中)；(f)蛋白结合本文描述蛋白结合的表位，或者与本文描述的蛋白竞争结合；(g)灵长类CDR或灵长类构架区；(h)HC免疫球蛋白可变结构域序列包括与本文描述的HC可变结构域的CDR1至少一个氨基酸但不超过2或3个氨基酸差异的CDR1；(i)HC免疫球蛋白可变结构域序列包括与本文描述的HC可变结构域的CDR2至少一个氨基酸但不超过2、3、4、5、6、7或8个氨基酸差异的CDR2；(j)HC免疫球蛋白可变结构域序列包括与本文描述的HC可变结构域的CDR3至少一个氨基酸但不超过2、3、4、5或6个氨基酸差异的CDR3；(k)LC免疫球蛋白可变结构域序列包括与本文描述的LC可变结构域的CDR1至少一个氨基酸但不超过2、3、4或5个氨基酸差异的CDR1；(l)LC免疫球蛋白可变结构域序列包括与本文描述的LC可变结构域的CDR2至少一个氨基酸但不超过2、3或4个氨基酸差异的CDR2；(m)LC免疫球蛋白可变结构域序列包括与本文描述的LC可变结构域的CDR3至少一个氨基酸但不超过2、3、4或5个氨基酸差异的CDR3；(n)LC免疫球蛋白可变结构域序列与本文描述的LC可变结构域至少一个氨基酸但不超过2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异(例如，总体上或在构架区或CDR中)；和(o)HC免疫球蛋白可变结构域序列与本文描述的HC可变结构域至少一个氨基酸但不超过2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异(例如，总体上或在构架区或CDR中)。
在一些实施方案中，蛋白具有小于1000、500、100或10nM的表观抑制常数(Ki，app)。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有选自由以下组成的组的抗体的轻链和重链的抗体(例如人抗体)：M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X81-B01、X67-D03和X67-G04。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有选自由以下组成的组的抗体的重链的抗体(例如人抗体)：M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X81-B01、X67-D03和X67-G04。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有选自由以下组成的组的抗体的轻链的抗体(例如人抗体)：M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X81-B01、X67-D03和X67-G04。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有选自由以下组成的组的抗体的轻链和重链抗体可变区的抗体(例如人抗体)：M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X81-B01、X67-D03和X67-G04。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有选自由以下组成的组的抗体的重链抗体可变区的抗体(例如人抗体)：M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X81-B01、X67-D03和X67-G04。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有选自由以下组成的组的抗体的轻链抗体可变区的抗体(例如人抗体)：M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X81-B01、X67-D03和X67-G04。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有选自由以下组成的重链组的相应CDR的一个或多个(例如1、2或3)重链CDR的抗体(例如人抗体)：M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X81-B01、X67-D03和X67-G04。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有选自由以下组成的轻链组的相应CDR的一个或多个(例如1、2或3)轻链CDR的抗体(例如人抗体)：M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X81-B01、X67-D03和X67-G04。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有选自由M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X81-B01、X67-D03和X67-G04组成的重链组的相应CDR的一个或多个(例如1、2或3)重链CDR和选自由M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X81-B01、X67-D03和X67-G04组成的轻链组的相应CDR的一个或多个(例如1、2或3)轻链CDR(分别地)的抗体(例如人抗体)。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有X81-B01的轻链和重链的抗体(例如人抗体)。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有X81-B01的重链的抗体(例如人抗体)。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有X81-B01的轻链的抗体(例如人抗体)。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有选自X81-B01的抗体的轻链和重链抗体可变区的抗体(例如人抗体)。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有X81-B01的重链抗体可变区的抗体(例如人抗体)。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有X81-B01的轻链抗体可变区的抗体(例如人抗体)。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有来自X81-B01的重链的相应CDR的一个或多个(例如1、2或3)重链CDR的抗体(例如人抗体)。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有来自X81-B01的轻链的相应CDR的一个或多个(例如1、2或3)轻链CDR的抗体(例如人抗体)。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有来自X81-B01的重链的一个或多个(例如1、2或3)重链CDR和来自X81-B01的轻链的相应CDR的一个或多个(例如1、2或3)轻链CDR的抗体(例如人抗体)。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有X67-D03的轻链和重链的抗体(例如人抗体)。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有X67-D03的重链的抗体(例如人抗体)。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有X67-D03的轻链的抗体(例如人抗体)。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有选自X67-D03的抗体的轻链和重链抗体可变区的抗体(例如人抗体)。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有X67-D03的重链抗体可变区的抗体(例如人抗体)。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有X67-D03的轻链抗体可变区的抗体(例如人抗体)。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有来自X67-D03的重链的相应CDR的一个或多个(例如1、2或3)重链CDR的抗体(例如人抗体)。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有来自X67-D03的轻链的相应CDR的一个或多个(例如1、2或3)轻链CDR的抗体(例如人抗体)。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有来自X67-D03的重链的一个或多个(例如1、2或3)重链CDR和来自X67-D03的轻链的相应CDR的一个或多个(例如1、2或3)轻链CDR的抗体(例如人抗体)。
在一些实施方案中，血浆激肽释放酶结合蛋白不结合前激肽释放酶(例如，人前激肽释放酶)，但是结合血浆激肽释放酶(例如人血浆激肽释放酶)的活性形式。
在一些实施方案中，血浆激肽释放酶结合蛋白使因子XIIa和/或缓激肽生产减少超过约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％，与标准相比较，例如在相同条件下但不存在所述蛋白时的因子XIIa和/或缓激肽生产。
在一些实施方案中，血浆激肽释放酶结合蛋白具有小于1000、500、100或10nM的表观抑制常数(Ki，app)。
在一个实施方案中，HC和LC可变结构域序列是相同多肽链的组成部分。
在另一个实施方案中，HC和LC可变结构域序列是不同多肽链的组成部分。例如，蛋白是IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。蛋白可以是可溶性Fab(sFab)。
在其他实施方式中，蛋白包括Fab2′、scFv、迷你抗体、scFv::Fc融合体、Fab::HSA融合体、HSA::Fab融合体、Fab::HSA::Fab融合体或者包括本文结合蛋白之一的抗原结合位点的其他分子。这些Fab的VH和VL区可以提供为IgG、Fab、Fab2、Fab2′、scFv、PEG化Fab、PEG化scFv、PEG化Fab2、VH::CH1::HSA+LC、HSA::VH::CH1+LC、LC::HSA+VH::CH1、HSA::LC+VH::CH1或其他适当的构建体。
在一个实施方案中，蛋白是人或人源化抗体或者在人中是非免疫原性的。例如，蛋白包括一个或多个人抗体构架区，例如所有人构架区。
在一个实施方案中，蛋白包括人Fc结构域或与人Fc结构域至少95、96、97、98或99％相同的Fc结构域。
在一个实施方案中，蛋白是灵长类或灵长类化抗体或者在人中是非免疫原性的。例如，蛋白包括一个或多个灵长类抗体构架区，例如，所有灵长类构架区。
在一个实施方案中，蛋白包括灵长类Fc结构域或者与灵长类Fc结构域至少95、96、97、98或99％相同的Fc结构域。“灵长类”包括人(Homosapiens)、黑猩猩(Pan troglodytes和Pan paniscus(倭猩猩))、大猩猩(Gorilla gorilla)、长臂猿、猴子、狐猴、指猴(Daubentonia madagascariensis)和眼镜猴。
在一个实施方案中，蛋白包括人构架区或与人构架区至少95、96、97、98或99％相同的构架区。
在某些实施方案中，蛋白不包括来自小鼠或兔的序列(例如，不是鼠或兔抗体)。
在一些实施方案中，粘膜炎选自由口腔粘膜炎、食管粘膜炎、咽粘膜炎和胃肠粘膜炎组成的组。
在一些实施方案中，粘膜炎是口腔粘膜炎。
在一些实施方案中，所述方法还包括施用帕利夫明。
一方面，本发明提供了用于治疗粘膜炎的试剂盒。该试剂盒包括激肽释放酶抑制剂以及给患有粘膜炎或有风险发展粘膜炎的受试者(例如患者)施用所述抑制剂的使用说明书。在一个实施方案中，所述试剂盒还包括施用治疗粘膜炎的其他治疗剂(例如帕利夫明)的使用说明书，并且可以任选包含其他治疗剂。在一个实施方案中，所述使用说明书提供了激肽释放酶抑制剂的给药方案、给药时间表和/或施用途径，不同于在缺乏其他治疗剂时抑制剂的给药方案、给药时间表和/或施用途径。有风险发展粘膜炎的受试者(例如患者)可以是例如将经历、正在经历或将经历化疗(例如，高剂量化疗)和/或放疗方案的受试者。作为另一个实例，有风险发展粘膜炎的受试者(例如患者)可以是例如已被诊断患有癌症例如头或颈癌的受试者。
在一些实施方案中，粘膜炎选自由口腔粘膜炎、食管粘膜炎、咽粘膜炎和胃肠粘膜炎组成的组。
在一些实施方案中，粘膜炎是口腔粘膜炎。
在一些方面，本公开特征为试剂盒，其中该试剂盒包括：
包含分离的激肽释放酶抑制剂的容器；和
所述激肽释放酶抑制剂用于治疗粘膜炎的使用说明书。
在一些实施方案中，试剂盒还包括包含帕利夫明的容器。
在一些实施方案中，粘膜炎选自由口腔粘膜炎、食管粘膜炎、咽粘膜炎和胃肠粘膜炎组成的组。
在一些实施方案中，粘膜炎是口腔粘膜炎。
在一些方面，本公开特征为包含治疗有效量的本文描述的分离的激肽释放酶抑制剂和治疗有效量的帕利夫明的组合物。
在另一方面，本文提供了分离的激肽释放酶抑制剂在生产用于治疗和/或预防粘膜炎的药剂中的用途。
本发明一个或多个实施方案的细节在附图和以下描述中提出。本发明的其他特征、目的和优点将根据说明书和附图以及根据权利要求书而明显。
本申请引用的所有参考文献、待决的专利申请和公布的专利的内容在此明确通过引用并入。
附图简述
图1显示了质粒pPIC-K503中的一部分DNA和相应的针对示例性激肽释放酶抑制剂多肽推导的氨基酸。***的DNA编码与具有加框区包围的氨基酸的PEP-1(DX-88)多肽的氨基末端框内融合的酿酒酵母的matαPrepro信号肽(加下划线)。加框区中显示的PEP-1多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO：2，并且相应的核苷酸编码序列是SEQ ID NO：3。虚线箭头指示用于产生测序模板的AOX区中两个PCR引物的位置和方向。图中整个核苷酸序列的DNA序列包括融合蛋白的结构编码序列并且指定为SEQ ID NO：27。该序列加双下划线的部分指示诊断探针序列。BstBI和EcoR I指示序列中其各自回文、六聚、限制内切酶位点的位置。星号指示翻译终止密码子。详情参见正文。
图2A和2B显示了示例性氨基酸序列、衍生这些变体的天然LACI序列(SEQ ID NO：32)和其他已知Kunitz结构域(SEQ ID NOS：29-31和33-53)的比对。显示了半胱氨酸残基。
图3描绘了使用ROLIC亲和力成熟发现的相同抗体的非种系化的形式(X63-G06)和种系化、密码子优化的形式(X81-B01)的轻链DNA序列的比对。星号(*)指示的位置是保守的，而空位对应于X81-B01中由于密码子优化或种系化而改变的碱基。
图4描绘了使用ROLIC亲和力成熟发现的相同抗体的非种系化的形式(X63-G06)和种系化、密码子优化的形式(X81-B01)的轻链氨基酸序列的比对。星号(*)指示的位置是保守的，而空位对应于X81-B01中由于种系化而改变的氨基酸。在非种系化的抗体(X63-G06)和种系化、密码子优化的抗体(X81-B01)之间总共11个氨基酸不同。
图5描绘了使用ROLIC亲和力成熟发现的相同抗体的非种系化的形式(X63-G06)和种系化、密码子优化的形式(X81-B01)的重链DNA序列的比对。星号(*)指示的位置是保守的，而空位对应于X81-B01中由于密码子优化而改变的DNA碱基。
图6描绘了使用ROLIC亲和力成熟发现的相同抗体的非种系化的形式(X63-G06)和种系化、密码子优化的形式(X81-B01)的重链氨基酸序列的比对。星号(*)指示的位置是保守的。两个抗体在重链中具有相同的氨基酸序列。
图7A描绘了EPI-KAL2与X81-B01竞争结合pKal。X81-B01(IgG)被捕获在CM5 BIACORE
Figure BPA00001394925800151
芯片上的抗人Fc片段特异性表面。pKal(100nM)在1μM EPI-KAL2存在(图中的下方的传感图)或不存在(图中上方的传感图)下流经所述表面。
图7B描绘了EPI-KAL2与X67-D03竞争结合pKal。X67-D03(IgG)被捕获在CM5 BIACORE芯片上的抗人Fc片段特异性表面。pKal(100nM)在1μM EPI-KAL2存在下(图中的下方的传感图)或不存在下(图中上方的传感图)流经所述表面。
图8描绘了表15所列抗体的CLIPS表位作图结果。
图9A-9C描绘了来自不同物种的pKal序列的ClustalW比对。“*”指示的位置在物种之间是保守位置，而“：”指示的位置指示物种之间的保守取代。“.”指示的位置在一些物种中是非保守取代。符号“”指示的氨基酸区段通过溶剂可及表面积计算被显示是高度溶剂暴露的。“+”指示的氨基酸区段被鉴定为表15所列抗体的潜在表位。灰色凸显的氨基酸通过溶剂可及表面积计算被发现在与Kunitz结构域活性位点抑制剂复合时被包埋。加下划线的位置是形成催化三联体的氨基酸(His434、Asp483和Ser578，编号基于人序列)。
发明详述
发明人在本文提出了通过施用分离的激肽释放酶抑制剂来治疗粘膜炎例如口腔粘膜炎、食管粘膜炎、咽粘膜炎和/或胃肠粘膜炎的新方法。
定义
为了方便，在进一步描述本发明之前，说明书、实施例和所附权利要求书中采用的某些术语在此定义。
除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数提及物。
术语“抗体”指包括至少一种免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白。例如，抗体可以包括重(H)链可变区(在本文缩写为VH)和轻(L)链可变区(在本文缩写为VL)。在另一实例中，抗体包括两个重(H)链可变区和两个轻(L)链可变区。术语“抗体”涵盖抗体的抗原结合片段(例如，单链抗体、Fab和sFab片段、F(ab′)2、Fd片段、Fv片段、scFv和结构域抗体(dAb)片段(de Wildt等，Eur J Immunol.1996；26(3)：629-39.))以及完整抗体。抗体可以具有IgA、IgG、IgE、IgD、IgM(及其亚型)的结构特征。抗体可以来自任何来源，但是灵长类(人和非人灵长类)和灵长类化的抗体是优选的。
VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为“互补决定区”(“CDR”)，介于称为“构架区”(“FR”)的更保守的区域之间。构架区和CDRP的范围已经被精确确定(参见，Kabat，E.A.，等(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Healthand Human Services，NIH Publication No.91-3242，和Chothia，C.等(1987)J.Mol.Biol.196：901-917，还参见www.hgmp.mrc.ac.uk)。本文使用Kabat定义。每个VH和VL通常包括三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端以如下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。
抗体的VH或VL链可以进一步包括重链或轻链恒定区的全部或部分，从而分别形成免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，抗体是两个免疫球蛋白重链和两个免疫球蛋白轻链的四聚体，其中免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链通过例如二硫键相互连接。在IgG中，重链恒定区包括三个免疫球蛋白结构域，CH1、CH2和CH3。轻链恒定区包括CL结构域。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子的结合，包括免疫***的各种细胞(例如效应细胞)核经典补体***的第一成分(Clq)。免疫球蛋白轻链可以是κ或γ型。在一个实施方案中，抗体是糖基化的。抗体可以对抗体依赖性细胞毒性和/或补体介导的细胞毒性而言是功能性的。
抗体的一个或多个区可以是人的或实际上是人的。例如，可变区的一个或多个可以是人或实际上是人的。例如，CDR的一个或多个可以是人的，例如HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。轻链CDR的每一个可以是人的。HC CDR3可以是人的。构架区的一个或多个可以是人的，例如HC或LC的FR1、FR2、FR3和FR4。例如，Fc区可以是人的。在一个实施方案中，所有构架区是人的，例如，具有人体细胞产生的抗体的构架区序列，所述人体细胞例如产生免疫球蛋白的造血细胞或非造血细胞。在一个实施方案中，人序列是种系序列，例如由种系核酸编码。在一个实施方案中，选定Fab的构架(FR)残基可以被转换为最相似的灵长类种系基因、特别是人种系基因中相应残基的氨基酸类型。恒定区的一个或多个可以是人的或实际上是人的。例如，免疫球蛋白可变结构域、恒定区、恒定结构域(CH1，CH2，CH3，CL1)或完整抗体的至少70、75、80、85、90、92、95、98或100％可以是人的或实际上是人的。
抗体的全部或部分可以通过免疫球蛋白基因或其区段编码。示例性的人免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因以及许多免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白“轻链”(约25KDa或约214个氨基酸)由NH2-末端的可变区基因(约110个氨基酸)和COOH-末端的κ或λ恒定区基因编码。类似地，全长免疫球蛋白“重链”(约50KDa或约446个氨基酸)由可变区基因(约116个氨基酸)和其他前述恒定区基因之一例如γ(编码约330个氨基酸)编码。人HC的长度被显著改变，因为HC CDR3从约3个氨基酸残基变为超过35个氨基酸残基。
术语全长抗体的“抗原结合片段”指保持与感兴趣的靶特异性结合能力的全长抗体的一个或多个片段。术语全长抗体的“抗原结合片段”结合片段内涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的一价片段；(ii)F(ab′)2片段，包括通过二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)；和(vi)保留功能性的分离的互补决定区(CDR)。而且，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独基因编码，但是它们可以使用重组方法由合成连接体结合，所述连接体使它们能够成为单个蛋白链，其中VL和VH区配对形成一价分子，成为单链Fv(scFv)。参见例如美国专利5,260,203、4,946,778和4,881,175；Bird等(1988)Science 242：423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883。
抗体片段可以使用任何适当的技术获得，包括本领域技术人员已知的常规技术。术语“单特异性抗体”指对特定靶例如表位表现出单一结合特异性和亲和力的抗体。该术语包括“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”，其在本文用来指单分子组合物的抗体或其片段制品，不论该抗体是如何产生的。
抑制常数(Ki)提供了抑制剂效价的量度，它是使酶活性减少一半所需的抑制剂浓度，并且不依赖于酶或底物浓度。表观Ki(Ki，app)以不同底物浓度获得，通过测量不同浓度抑制剂(例如抑制性结合蛋白)对反应程度(例如酶活性)的抑制效果；将作为抑制剂浓度的函数的假一级速率常数变化拟合为Morrison方程(方程1)，产生对表观Ki值的估计。Ki是从Ki，app与底物浓度曲线的线性回归分析提取的y轴截距获得的。
v = v 0 - v 0 ( ( K i , app + I + E ) - ( K i , app + I + E ) 2 - 4 · I · E 2 · E )
方程1
其中v＝测量的速度；v0＝不存在抑制剂时的速度；Ki，app＝表观抑制常数；I＝总抑制剂浓度；和E＝总酶浓度。
本文使用的“结合亲和力”指表观回归常数或Ka。Ka是解离常数(Kd)的倒数。结合蛋白可以例如对特定靶分子具有至少105、106、107、108、109、1010和1011M-1的结合亲和力。结合蛋白对第一靶相对于第二靶较高的亲和力结合可以由比结合第二靶Ka(或数值Kd)更高的结合第一靶的Ka(或更小的数值Kd)表明。在此类情况下，结合蛋白对第一靶(例如，第一构象蛋白或其模拟物)相对于第二靶(例如第二构象的相同蛋白或其模拟物；或第二蛋白)具有特异性。结合亲和力差异(例如，特异性或其他对比)可以是至少1.5、2、3、4、5、10、15、20、37.5、50、70、80、91、100、500、1000或105倍。
结合亲和力可以通过许多方法测定，包括平衡透析、平衡结合、凝胶过滤、ELISA、表面等离子体共振或光谱(例如，使用荧光测定)。评估结合亲和力的示例性条件是在TRIS缓冲液(50mM TRIS，150mM NaCl，5mM CaCl2，pH7.5)中。这些技术可以用于测量作为结合蛋白(或靶)浓度的函数的结合的和游离的结合蛋白的浓度。结合的结合蛋白([结合的])的浓度通过以下方程与游离的结合蛋白([游离的])浓度和靶上结合蛋白的结合位点浓度相关联，其中(N)是每个靶分子结合位点数目：
[结合的]＝N·[游离的]/((1/Ka)+[游离的])。
不总是需要精确测定Ka，但因为有时足以获得亲和力的定量测量，例如使用诸如ELISA或FACS分析测定的，与Ka成正比，因此可以用于比较，例如测定较高的亲和力是否是例如2倍高，以获得亲和力的定量测量，或者获得亲和力的推断，例如通过功能测定例如体外或体内测定的活性。
术语“结合蛋白”指可以与靶分子相互作用的蛋白。该术语与“配体”互换使用。“血浆激肽释放酶结合蛋白”指可以与血浆激肽释放酶相互作用(例如结合)的蛋白，并且包括特别是优选或特异性地与血浆激肽释放酶相互作用和/或抑制血浆激肽释放酶的蛋白。如果与不存在蛋白的相同条件下的血浆激肽释放酶活性相比，蛋白导致血浆激肽释放酶活性减少，则蛋白抑制血浆激肽释放酶。在一些实施方案中，血浆激肽释放酶结合蛋白是抗体。
术语“激肽释放酶抑制剂”指抑制激肽释放酶的任何物质或分子。
术语“组合”指使用两种或多种物质或疗法治疗相同患者，其中所述物质或疗法的使用或作用在时间上重叠。物质或疗法可以同时(例如，作为被施用给患者的单一制剂，或者作为共时施用的分开制剂)或以任何顺序依次施用。
“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基取代的取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族在本领域已经被定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
结合蛋白的一个或多个构架和/或CDR氨基酸残基相对于本文描述的结合蛋白可能包括一个或多个突变(例如取代(例如保守取代或非必需氨基酸取代))、***或缺失)。血浆激肽释放酶结合蛋白相对于本文描述的结合蛋白可以具有突变(例如取代(例如保守取代或非必需氨基酸的取代))、***或缺失)(例如至少1、2、3或4个、和/或少于15、12、10、9、8、7、6、5、4、3或2个突变)，例如对蛋白功能没有实质影响的突变。突变可以存在于构架区、CDR和/或恒定区。在一些实施方案中，突变存在于构架区。在一些实施方案中，突变存在于CDR。在一些实施方案中，突变存在于恒定区。特定取代是否被耐受，即不负面影响生物性质，例如结合活性，可以例如通过评估突变是否是保守的或者通过Bowie，等(1990)Science 247：1306-1310的方法来预测。
“实际上人的”免疫球蛋白可变区是包括足够数目的人构架氨基酸位置使得免疫球蛋白可变区在正常人中不引起免疫原性反应的免疫球蛋白可变区。“实际上人的”抗体是包括足够数目的人氨基酸位置使得抗体在正常人中不引起免疫原性反应的抗体。
“表位”指被结合蛋白(例如抗体，例如Fab或全长抗体)结合的靶化合物上的位点。在靶化合物是蛋白的情况下，位点可以完全由氨基酸成分组成，完全由蛋白氨基酸的化学修饰(例如糖基部分)组成，或者由其组合组成。重叠表位包括至少一个常见氨基酸残基、糖基、磷酸基、硫酸基或其他分子特征。
如果第一结合蛋白结合靶化合物上第二结合蛋白结合的相同位点，或者结合与第二结合蛋白结合位点重叠(例如，50％、60％、70％、80％、90％或100％重叠，例如就氨基酸序列或其他分子特征(例如糖基、磷酸基或硫酸基)而言)的位点，则第一结合蛋白(例如抗体)与第二结合蛋白(例如抗体)“结合相同表位”。
如果第一结合蛋白与其表位的结合减少(例如，减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多)与其表位结合的第二结合蛋白的量，则第一结合蛋白(例如抗体)与第二结合蛋白(例如抗体)“竞争结合”。竞争可以是直接的(例如，第一结合蛋白结合与第二结合蛋白结合的表位相同或重叠的表位)或间接的(例如，第一结合蛋白与其表位的结合导致降低第二结合蛋白与其表位结合能力的靶化合物的空间变化)。
两个序列之间“同源性”或“序列同一性”(两个术语在本文互换使用)的计算如下进行。为最佳比较目的来比对序列(例如，为最佳比对可以在第一和第二氨基酸或核酸序列之一或两者中引入空位，并且非同源序列可以为比较目的而不考虑)。最佳比对被测定为最佳评分，使用GCG软件包中的GAP程序，Blossum 62评分矩阵，空位罚分12，空位延伸罚分4，并且移码空位罚分5。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被第二序列中相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置具有同一性(如本文使用，氨基酸或核苷酸“同一性”与氨基酸或核酸“同源性”等同)。两个序列之间的百分比同一性是序列共有的同一性位置数目的函数。
在一个优选实施方案中，参考序列为比较目的而比对的长度是参考序列长度的至少30％、优选至少40％、更优选至少50％、甚至更有选至少60％和甚至更有选至少70％、80％、90％、92％、95％、97％、98％或100％。例如，参考序列可以是免疫球蛋白可变结构域序列的长度。
“人源化”免疫球蛋白可变区是被修饰为包括足够数目的人构架氨基酸位置而使得免疫球蛋白可变区在正常人中不引发免疫原性反应的免疫球蛋白可变区。“人源化”免疫球蛋白的描述包括例如U.S.6,407,213和U.S.5,693,762。
如本文使用的，术语“在低严格、中严格、高严格或非常高严格条件下杂交”描述了杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指导原则可以见Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。该参考文献中描述了水性和非水性方法并且任何一种可以被使用。本文提及的具体杂交条件如下：(1)低严格杂交条件，在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，约45℃，随后在至少50℃下0.2X SSC，0.1％SDS中两次洗涤(对于低严格条件，洗涤温度可以被增加至55℃)；(2)中严格杂交条件，在6X SSC中，约45℃，随后在60℃下0.2X SSC，0.1％SDS中一次或多次洗涤；(3)高严格杂交条件，在6X SSC中，约45℃，随后在65℃下0.2X SSC，0.1％SDS中一次或多次洗涤；和(4)非常高严格杂交条件是65℃下0.5M磷酸钠7％SDS，随后在65℃下0.2X SSC，1％SDS洗涤一次或多次。非常高严格条件(4)是优选条件和应该被使用的条件，除非另有规定。本公开包括低、中、高或非常高严格杂交本文描述的核酸或其互补物的核酸，例如编码本文描述的蛋白的核酸。核酸可以与参考核酸长度相同或是参考核酸长度的30、20或10％内。核酸可以对应于编码本文描述的免疫球蛋白可变结构域序列的区域。
“分离的组合物”指从可以获得分离的组合物的天然样品的至少一个组分的至少90％取出的组合物。如果感兴趣的物质或物质群是按重量计至少5、10、25、50、75、80、90、92、95、98或99％纯，则人工或天然产生的组合物可以是“至少”某种纯度的组合物。
“分离的”蛋白指从可以获得分离的蛋白的天然样品的至少一个组分的至少90％取出的蛋白。如果感兴趣的物质或物质群是按重量计至少5、10、25、50、75、80、90、92、95、98或99％纯，则人工或天然产生的蛋白可以具有“至少”某种纯度。
术语“粘膜炎”指从口腔向下到***的消化道内表面的任何粘膜的炎症。粘膜炎是涉及消化道任何部分的化疗和放疗的常见副作用。“口腔粘膜炎”指影响口腔内表面粘膜的粘膜炎。“食管粘膜炎”指影响食管粘膜的粘膜炎，而“咽粘膜炎”指影响咽粘膜的粘膜炎。“胃肠粘膜炎”指影响胃肠道粘膜的粘膜炎。
“非必需”氨基酸残基是可以从结合剂例如抗体的野生型序列改变的残基，不消除或更优选地不实质改变生物活性，而改变“必需”氨基酸残基导致活性的实质丧失。
本方法要治疗的“患者”、“受试者”或“宿主”(这些术语可互换使用)可以指人或非人动物。
术语“激肽释放酶”(例如，组织和血浆激肽释放酶)指肽酶(切割蛋白肽键的酶)、丝氨酸蛋白酶家族亚组。存在15种已知的组织激肽释放酶(KLK1、KLK2、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK9、KLK10、KLK11、KLK12、KLK13、KLK14和KLK15)和单一血浆激肽释放酶(KLKb1)。血浆激肽释放酶和组织激肽释放酶1(KLK1)切割激肽原以产生激肽、有效促炎肽。DX-88(在本文还称为“PEP-1”)是有效(Ki＜1nM)和特异性血浆激肽释放酶抑制剂(NP_000883)。(还参见例如WO95/21601或WO 2003/103475)。
KLKb1(血浆激肽释放酶)的氨基酸序列：
KLKb1
＞gi|78191798|ref|NP_000883.2|血浆激肽释放酶B1前体[人]
MILFKQATYFISLFATVSCGCLTQLYENAFFRGGDVASMYTPNAQYCQMRCTFHPRCLLFSFLPASSINDMEKRFGCFLKDSVTGTLPKVHRTGAVSGHSLKQCGHQISACHRDIYKGVDMRGVNFNVSKVSSVEECQKRCTSNIRCQFFSYATQTFHKAEYRNNCLLKYSPGGTPTAIKVLSNVESGFSLKPCALSEIGCHMNIFQHLAFSDVDVARVLTPDAFVCRTICTYHPNCLFFTFYTNVWKIESQRNVCLLKTSESGTPSSSTPQENTISGYSLLTCKRTLPEPCHSKIYPGVDFGGEELNVTFVKGVNVCQETCTKMIRCQFFTYSLLPEDCKEEKCKCFLRLSMDGSPTRIAYGTQGSSGYSLRLCNTGDNSVCTTKTSTRIVGGTNSSWGEWPWQVSLQVKLTAQRHLCGGSLIGHQWVLTAAHCFDGLPLQDVWRIYSGILNLSDITKDTPFSQIKEIIIHQNYKVSEGNHDIALIKLQAPLNYTEFQKPICLPSKGDTSTIYTNCWVTGWGFSKEKGEIQNILQKVNIPLVTNEECQKRYQDYKITQRMVCAGYKEGGKDACKGDSGGPLVCKHNGMWRLVGITSWGEGCARREQPGVYTKVAEYMDWILEKTQSSDGKAQMQSPA
DX-2300和相关抗体是组织激肽释放酶1(AAH05313.1)的有效且特异性抑制剂。DX-2300(还称为“M0131-F07”)描述于美国专利号7,329,737。
KLK1
＞gi|13529059|gb|AAH05313.1|激肽释放酶1[人]
MWFLVLCLALSLGGTGAAPPIQSRIVGGWECEQHSQPWQAALYHFSTFQCGGILVHRQWVLTAAHCISDNYQLWLGRHNLFDDENTAQFVHVSESFPHPGFNMSLLENHTRQADEDYSHDLMLLRLTEPADTITDAVKVVELPTQEPEVGSTCLASGWGSIEPENFSFPDDLQCVDLKILPNDECKKVHVQKVTDFMLCVGHLEGGKDTCVGDSGGPLMCDGVLQGVTSWGYVPCGTPNKPSVAVRVLSYVKWIEDTIAENS
本文使用的术语“胃肠外施用”和“胃肠外地施用”指非肠内和局部施用的施用方式，通常通过注射，并且包括但不限于：静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心脏内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
术语“预防”受试者疾病指使受试者接收药物治疗，例如药物施用，使得疾病的至少一个症状得到预防，即，在不想要的病症(例如，宿主动物的疾病或其他不想要的状态)临床表现之前施用，使得它防止宿主发展不想要的病症。“预防”疾病还可以称为“预防(prophylaxis)”或“预防性治疗”。
“预防性有效量”指有效实现预期预防结果所必需的量、剂量和时间段。通常，因为预防性剂量在疾病早期之前或疾病早期在受试者中使用，预防性有效量可能但不一定小于治疗有效量。
如本文使用的，术语“基本上同一的”(或“基本上同源的”)在本文用来指第一氨基酸或核酸序列，含有足够数目的与第二氨基酸或核酸序列同一或等同的(例如，具有类似侧链，例如保守氨基酸取代)氨基酸残基或核苷酸，使得第一和第二氨基酸或核酸序列具有相似活性例如结合活性、结合优先性或生物活性，或者编码具有相似活性例如结合活性、结合优先性或生物活性的蛋白。在抗体的情况下，第二抗体对于相同抗原具有相同的特异性，并且具有至少50％、至少25％或至少10％的亲和力。
与本文公开的序列类似或同源(例如至少约85％序列同一性)的序列也是本申请的部分。在一些实施方案中，序列同一性可以是约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。在一些实施方案中，血浆激肽释放酶结合蛋白可以与本文描述的结合蛋白具有约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。在一些实施方案中，血浆激肽释放酶结合蛋白可以与本文描述的结合蛋白在HC和/或LC构架区(例如，HC和/或LCFR 1、2、3和/或4)具有约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。在一些实施方案中，血浆激肽释放酶结合蛋白可以与本文描述的结合蛋白在HC和/或LC CDR(例如，HC和/或LC CDR 1、2和/或3)具有约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。在一些实施方案中，血浆激肽释放酶结合蛋白可以与本文描述的结合蛋白在恒定区(例如，CH1、CH2、CH3和/或CL1)具有约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。
此外，当核酸区段在选择性杂交条件(例如高严格杂交条件)下与该链的互补物杂交时存在基本上的同一性。核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解物或部分纯化的或基本纯化的形式中。
生物聚合物的基序序列可以包括可以是改变的氨基酸的位置。例如，除非另外规定，否则在这种环境中的符号“X”一般指任何氨基酸(例如，20个天然氨基酸的任何一个)，例如指任何非半胱氨酸氨基酸。其他允许的氨基酸还可以例如使用括号和斜线指示。例如“(A/W/F/N/Q)”表示在该特定位置允许丙氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。
可以通过本领域已知的任何方法确定统计学显著性。示例性统计学检验包括：Students T检验、Mann Whitney U非参数检验和Wilcoxon非参数统计学检验。一些统计学显著关系具有小于0.05或0.02的P值。特定结合蛋白可以显示例如特异性或结合差异，其是统计学上显著的(例如，P值＜0.05或0.02)。术语“诱导”、“抑制”、“加强”、“提高”、“增加”、“减少”或诸如此类指示两个状态之间可区分的定性或定量差异，并且可以指两个状态之间的差异，例如统计学显著的差异。
“治疗有效量”指实现预期治疗结果所必需的有效量、剂量和时间段。治疗有效量的组合物可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及蛋白在个体中引发预期应答的能力等因素改变。治疗有效量也是其中组合物的治疗有益效应超过任何毒性或有害效应的量。
“治疗有效剂量”优选以统计学显著的程度调节可测量的参数，例如视觉评价的粘膜炎程度。例如，与治疗前症状相比，治疗有效剂量可以使粘膜炎症状的程度下降至少约20％、更优选至少约40％、甚至更优选至少约60％并且更优选至少约80％。化合物调节可测量参数例如疾病相关参数的能力可以在预测人疾患和病症(例如仓鼠或啮齿类模型中的口腔粘膜炎)效力的动物模型***中评价。可选地，组合物的这种性质可以通过检查化合物调节体外参数的能力来评估。
“治疗”受试者粘膜炎或“治疗”患有粘膜炎的受试者指使受试者经受药物治疗，例如药物施用，使得疾病的至少一个症状得到治愈、缓解或减少。“治疗”粘膜炎可以通过下述参数任何一个评价：
●粘膜炎发生频率降低(或)
●任何给定水平的疾病严重度的粘膜炎的持续时间减少(或)
●治疗期间任何时程的粘膜炎发展的严重度(1-4级)的降低(或)
●粘膜炎相关迹象或症状的任何一个的减少，包括但不限于：
○疼痛
○水肿
○红斑
○继发性细菌定植
○食物消耗的限制(固体、液体)
○疲劳
○聚集的治疗群中相比于聚集的非治疗患者群耐受更高或重复剂量的化疗或放疗的能力
激肽释放酶抑制剂
Kunitz结构域抑制剂。许多有用的激肽释放酶抑制剂，组织和/或血浆激肽释放酶，包括Kunitz结构域。
如本文使用的，“Kunitz结构域”是具有至少51个氨基酸并且含有至少两个和优选三个二硫键的多肽结构域。该结构域是折叠的，使得第一和第六半胱氨酸、第二和第四半胱氨酸、以及第三和第五半胱氨酸形成二硫键(例如，在具有58个氨基酸的Kunitz结构域中，半胱氨酸可以存在于相应于根据下文提供的BPTI同源序列编号的氨基酸5、14、30、38、51和55的位置，并且二硫键可以在位置5和55、14和38、以及30和51的半胱氨酸之间形成)，或者如果存在两个二硫键，它们可以在其相应半胱氨酸亚组之间形成。各自半胱氨酸之间的间隔可以在下述相应于根据下文提供的BPTI序列编号的5至55、14至38、和30至51的位置之间的间隔的7、5、4、3、2、1或0个氨基酸内。BPTI序列可以用作参考来提及任何种属Kunitz结构域中的具***置。感兴趣的Kunitz结构域与BPTI的比较可以通过鉴定其中比对的半胱氨酸数目最大的最适比对来进行。
BPTI的Kunitz结构域的3D结构(高分辨率)是已知的。X射线结构之一以″6PTI″保存在Brookhaven蛋白数据库。一些BPTI同源物的3D结构(Eigenbrot等，(1990)Protein Engineering，3(7)：591-598；Hynes等，(1990)Biochemistry，29：10018-10022)是已知的。至少81个Kunitz结构域序列是已知的。已知的人同源物包括LACI的三个Kunitz结构域(Wun等，(1988)J.Biol.Chem.263(13)：6001-6004；Girard等，(1989)Nature，338：518-20；Novotny等，(1989)J.Biol.Chem.，264(31)：18832-18837)、间-α-胰蛋白酶抑制剂APP-I的两个Kunitz结构域(Kido等，(1988)J.Biol.Chem.，263(34)：18104-18107)、来自胶原蛋白的Kunitz结构域、TFPI-2的三个Kunitz结构域(Sprecher等，(1994)PNAS USA，91：3353-3357)、1型肝细胞生长因子激活物抑制剂的Kunitz结构域、2型肝细胞生长因子激活物抑制剂的Kunitz结构域、美国专利公布号2004-0152633中描述的Kunitz结构域。LACI是含有三个Kunitz结构域的分子量为39kDa的人血清磷糖蛋白(表1中的氨基酸序列)。
表1：示例性天然Kunitz结构域
Figure BPA00001394925800291
上述Kunitz结构域被称为LACI-K1(残基50至107)、LACI-K2(残基121至178)和LACI-K3(213至270)。LACI的cDNA序列报道于Wun等(J.Biol.Chem.，1988，263(13)：6001-6004)。Girard等(Nature，1989，338：518-20)报道了其中三个Kunitz结构域的每一个的P1残基被改变的的突变研究。当F.VIIa与组织因子复合并且LACI-K2抑制因子Xa时，LACI-K1抑制因子VIIa(F.VIIa)。
含有示例性Kunitz结构域的蛋白包括以下，括号内是SWISS-PROT访问号：
A4_HUMAN  (P05067)，A4_MACFA  (P53601)，A4_MACMU  (P29216)，
A4_MOUSE  (P12023)，A4_RAT    (P08592)，A4_SAISC  (Q95241)，
AMBP_PLEPL(P36992)，APP2_HUMAN(Q06481)，APP2_RAT  (P15943)，
AXP1_ANTAF(P81547)，AXP2_ANTAF(P81548)，BPT1_BOVIN(P00974)，
BPT2_BOVIN(P04815)，CA17_HUMAN(Q02388)，CA36_CHICK(P15989)，
CA36_HUMAN(P12111)，CRPT_BOOMI(P81162)，ELAC_MACEU(O62845)，
ELAC_TRIVU(Q29143)，EPPI_HUMAN(O95925)，EPPI_MOUSE(Q9DA01)，
HTIB_MANSE(P26227)，IBP_CARCR (P00993)，IBPC_BOVIN(P00976)，
IBPI_TACTR(P16044)，IBPS_BOVIN(P00975)，ICS3_BOMMO(P07481)，
IMAP_DROFU(P11424)，IP52_ANESU(P10280)，ISC1_BOMMO(P10831)，
ISC2_BOMMO(P10832)，ISH1_STOHE(P31713)，ISH2_STOHE(P81129)，
ISIK_HELPO(P00994)，ISP2_GALME(P81906)，IVB1_BUNFA(P25660)，
IVB1_BUNMU(P00987)，IVB1_VIPAA(P00991)，IVB2_BUNMU(P00989)，
IVB2_DABRU(P00990)，IVB2_HEMHA(P00985)，IVB2_NAJNI(P00986)，
IVB3_VIPAA(P00992)，IVBB_DENPO(P00983)，IVBC_NAJNA(P19859)，
IVBC_OPHHA(P82966)，IVBE_DENPO(P00984)，IVBI_DENAN(P00980)，
IVBI_DENPO(P00979)，IVBK_DENAN(P00982)，IVBK_DENPO(P00981)，
IVBT_ERIMA(P24541)，IVBT_NAJNA(P20229)，MCPI_MELCP(P82968)，
SBPI_SARBU(P26228)，SPT3_HUMAN(P49223)，TKD1_BOVIN(Q28201)，
TKD1_SHEEP(Q29428)，TXCA_DENAN(P81658)，UPTI_PIG  (Q29100)，
AMBP_BOVIN(P00978)，AMBP_HUMAN(P02760)，AMBP_MERUN(Q62577)，
AMBP_MESAU(Q60559)，AMBP_MOUSE(Q07456)，AMBP_PIG  (P04366)，
AMBP_RAT  (Q64240)，IATR_HORSE(P04365)，IATR_SHEEP(P13371)，
SPT1_HUMAN(O43278)，SPT1_MOUSE(Q9R097)，SPT2_HUMAN(O43291)，
SPT2_MOUSE(Q9WU03)，TFP2_HUMAN(P48307)，TFP2_MOUSE(O35536)，
TFPI_HUMAN(P10646)，TFPI_MACMU(Q28864)，TFPI_MOUSE(O54819)，
TFPI_RABIT(P19761)，TFPI_RAT  (Q02445)，YN81_CAEEL(Q03610)
许多方法可用于鉴定序列数据库中的Kunitz结构域。例如，Kunitz结构域、共有序列或基序(例如ProSite基序)的已知氨基酸序列可以针对以下数据库检索：GenBank序列数据库(National Center forBiotechnology Information，National Institutes of Health，Bethesda MD)，例如使用BLAST；HMM的Pfam数据库(隐马尔可夫模型)(例如，使用Pfam检索的缺省参数；SMART数据库；或ProDom数据库。例如，Pfam Release9的Pfam访问号PF00014提供了许多Kunitz结构域和鉴定Kunitz结构域的HMM。Pfam数据库的描述可见于Sonhammer等(1997)Proteins28(3)：405-420，HMM的详细描述可见于例如Gribskov等(1990)Meth.Enzymol.183：146-159；Gribskov等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：4355-4358；Krogh等(1994)J.Mol.Biol.235：1501-1531；和Stultz等(1993)Protein Sci.2：305-314。HMM的SMART数据库(Simple ModularArchitecture Research Tool，EMBL，Heidelberg，DE)描述于Schultz等(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：5857和Schultz等(2000)Nucl.AcidsRes 28：231。SMART数据库含有通过用HMMer2检索程序的隐马尔可夫模型分析鉴定的结构域(R.Durbin等(1998)Biological sequenceanalysis：probabilistic models of proteins and nucleic acids.CambridgeUniversity Press)。数据库还被注解和监测。ProDom蛋白结构域数据库由同源结构域的自动编译组成(Corpet等(1999)，Nucl.Acids Res.27：263-267)。ProDom的当前形式使用SWISS-PROT 38和TREMBL蛋白数据库的递归PSI-BLAST检索构建(Altschul等(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389-3402；Gouzy等(1999)Computers and Chemistry23：333-340.)。数据库自动产生每个结构域的共有序列。Prosite列出Kunitz结构域作为基序，并鉴定包括Kunitz结构域的蛋白。参见，例如Falquet等Nucleic Acids Res.30：235-238(2002)。
Kunitz结构域与靶蛋白酶相互作用，主要使用两个环区中的氨基酸(“结合环”)。第一环区在大概对应于BPTI的氨基酸13-20的残基之间。第二环在大概对应于BPTI的氨基酸31-39的残基之间。示例性Kunitz结构域文库在第一和/或第二环区中的一个或多个氨基酸位置改变。当筛选与激肽释放酶相互作用的Kunitz结构域或筛选亲和力提高的变体时，特别有用的是改变位置：BPTI序列的位置13、15、16、17、18、19、31、32、34和39。预期这些位置的至少一些与靶序列紧密接触。改变其他位置也是有用的，例如与三维结构中前述位置相邻的位置。
Kunitz结构域的“构架区”被定义为Kunitz结构域的部分的那些残基，但是特别排除在第一和第二结合环区中的残基，即大概对应于BPTI的氨基酸13-20和BPTI的31-39的残基。相反，不在结合环中的残基可以耐受大范围的氨基酸取代(例如，保守和/或非保守取代)。
在一个实施方案中，这些Kunitz结构域是包括人脂肪蛋白相关凝血抑制剂(LACI)蛋白的Kunitz结构域1的环状结构的变体形式。LACI含有三个内部完全确定的肽环结构，其是范例Kunitz结构域(Girard，T.等，1989.Nature，338：518-520)。本文描述的LACI的Kunitz结构域1的变体已经被筛选、分离并以增强的亲和力和特异性结合激肽释放酶(参见，例如美国专利号5,795,865和6,057,287)。这些方法还可用于其它Kunitz结构域构架以获得与激肽释放酶例如血浆激肽释放酶相互作用的其他Kunitz结构域。激肽释放酶功能的有用调节剂通常结合和/或抑制激肽释放酶，使用激肽释放酶结合和抑制分析来测定。
包括抑制血浆激肽释放酶的Kunitz结构域的示例性多肽具有或包括由SEQ ID NO：2的氨基酸3-60确定的氨基酸序列。包括抑制血浆激肽释放酶的Kunitz结构域的另一个示例性多肽具有或包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
示例性多肽包括氨基酸序列：
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Cys Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 GlyXaa13 Cys Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 Xaa29 Cys Xaa31 Xaa32 Phe Xaa34Xaa35 Gly Gly Cys Xaa39 Xaa40 Xaa41 Xaa42 Xaa43 Xaa44 Xaa45 Xaa46Xaa47 Xaa48 Xaa49 Xaa50 Cys Xaa52 Xaa53 Xaa54 Cys Xaa56 Xaa57Xaa58(SEQ ID NO：1)。
″Xaa″指可以是许多不同氨基酸的任何一个的肽链位置。在第一实例中，Xaa可以是除了半胱氨酸之外的任何氨基酸。在另一实例中，下述一个或多个适用：Xaa10可以是Asp或Glu；Xaa11可以是Asp、Gly、Ser、Val、Asn、Ile、Ala或Thr；Xaa13可以是Pro、Arg、His、Asn、Ser、Thr、Ala、Gly、Lys或Gln；Xaa15可以是Arg、Lys、Ala、Ser、Gly、Met、Asn或Gln；Xaa16可以是Ala、Gly、Ser、Asp或Asn；Xaa17可以是Ala、Asn、Ser、Ile、Gly、Val、Gln或Thr；Xaa18可以是His、Leu、Gln或Ala；Xaa19可以是Pro、Gln、Leu、Asn或Ile；Xaa21可以是Trp、Phe、Tyr、His或Ile；Xaa31可以是Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、Ala、Val、Leu、Ile或Thr；Xaa32可以是Glu、Gln、Asp Asn、Pro、Thr、Leu、Ser、Ala、Gly或Val；Xaa34可以是Ile、Thr、Ser、Val、Ala、Asn、Gly或Leu；Xaa35可以是Tyr、Trp或Phe；Xaa39可以是Glu、Gly、Ala、Ser或Asp。氨基酸Xaa6、Xaa7、Xaa8、Xaa9、Xaa20、Xaa24、Xaa25、Xaa26、Xaa27、Xaa28、Xaa29、Xaa41、Xaa42、Xaa44、Xaa46、Xaa47、Xaa48、Xaa49、Xaa50、Xaa52、Xaa53和Xaa54可以是任何氨基酸。
此外，SEQ ID NO：1的前四个(Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4)和后三个9 Xaa56、Xaa57或Xaa58)氨基酸的每一个可以任选地存在或不存在，并且如果存在，可以是任何氨基酸例如任何非半胱氨酸氨基酸。
在一个实施方案中，多肽具有带有下述性质的一种或多种的序列：Xaa11可以是Asp、Gly、Ser或Val；Xaa13可以是Pro、Arg、His或Asn；Xaa15可以是Arg或Lys；Xaa16可以是Ala或Gly；Xaa17可以是Ala、Asn、Ser或Ile；Xaa18可以是His、Leu或Gln；Xaa19可以是Pro、Gln或Leu；Xaa21可以是Trp或Phe；Xaa31是Glu；Xaa32可以是Glu或Gln；Xaa34可以是Ile、Thr或Ser；Xaa35是Tyr；并且Xaa39可以是Glu、Gly或Ala。
示例性多肽可以包括下述氨基酸：Xaa10是Asp；Xaa11是Asp；Xaa13可以是Pro或Arg；Xaa15是Arg；Xaa16可以是Ala或Gly；Xaa17是Ala；Xaa18是His；Xaa19是Pro；Xaa21是Trp；Xaa31是Glu；Xaa32是Glu；Xaa34可以是Ile或Ser；Xaa35是Tyr；并且Xaa39是Gly。
还可能使用本文描述的多肽的部分。例如，多肽可以包括特定激肽释放酶表位的结合结构域。例如，Kunitz结构域的结合环可以被环化，并且用于分离，或者可以被移植到另一Kunitz结构域的另一结构域，例如构架。还可能从本文描述的氨基酸序列的N末端去除一个、两个、三个或四个氨基酸，和/或从本文描述的氨基酸序列的C末端去除一个、两个、三个、四个或五个氨基酸。
SEQ ID NO：1包括的序列的实例如下(当不指明时，″Xaa″指任何非半胱氨酸氨基酸)：
Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Xaa10 Xaa11 Gly Xaa13 CysXaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Arg Xaa21 Phe Phe Asn Ile Phe Thr ArgGln Cys Xaa31 Xaa32 Phe Xaa34 Xaa35 Gly Gly Cys Xaa39 Gly Asn GlnAsn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp(SEQID NO：33)，
Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg AlaAla His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe IleTyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu CysLys Lys Met Cys Thr Arg Asp(SEQ ID NO：2的氨基酸3-60)，
Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Lys AlaAsn His Leu Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe SerTyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu CysLys Lys Met Cys Thr Arg Asp(SEQ ID NO：4)，
Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys AlaAsn His Gln Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe ThrTyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu CysLys Lys Met Cys Thr Arg Asp(SEQ ID NO：5)，
Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys AlaAsn His Gln Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Gln Phe ThrTyr Gly Gly Cys Ala Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu CysLys Lys Met Cys Thr Arg Asp(SEQ ID NO：6)，
Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys AlaSer Leu Pro Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe IleTyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu CysLys Lys Met Cys Thr Arg Asp(SEQ ID NO：7)，
Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys AlaAsn His Gln Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe SerTyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu CysLys Lys Met Cys Thr Arg Asp(SEQ ID NO：8)，
Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Lys GlyAla His Leu Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe IleTyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu CysLys Lys Met Cys Thr Arg Asp(SEQ ID NO：9)，
Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Arg Cys Lys GlyAla His Leu Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe IleTyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu CysLys Lys Met Cys Thr Arg Asp(SEQ ID NO：10)，
Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Gly Gly Arg Cys Arg GlyAla His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe SerTyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu CysLys Lys Met Cys Thr Arg Asp(SEQ ID NO：11)，
Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg AlaAla His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe SerTyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu CysLys Lys Met Cys Thr Arg Asp(SEQ ID NO：12)，
Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Val Gly Arg Cys Arg GlyAla His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe SerTyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu CysLys Lys Met Cys Thr Arg Asp(SEQ ID NO：13)，
Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Val Gly Arg Cys Arg GlyAla Gln Pro Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe SerTyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu CysLys Lys Met Cys Thr Arg Asp(SEQ ID NO：14)，
Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Ser Cys Arg AlaAla His Leu Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe SerTyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu CysLys Lys Met Cys Thr Arg Asp(SEQ ID NO：15)，
Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Glu Gly Gly Ser Cys Arg Ala AlaHis Gln Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ser TyrGly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys LysLys Met Cys Thr Arg Asp(SEQ ID NO：16)，
Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg GlyAla His Leu Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe SerTyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu CysLys Lys Met Cys Thr Arg Asp(SEQ ID NO：17)，
Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly His Cys Arg GlyAla Leu Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe SerTyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu CysLys Lys Met Cys Thr Arg Asp(SEQ ID NO：18)，
Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Ser Gly Asn Cys Arg GlyAsn Leu Pro Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe SerTyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu CysLys Lys Met Cys Thr Arg Asp(SEQ ID NO：19)，
Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Ser Gly Arg Cys Arg GlyAsn His Gln Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe SerTyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu CysLys Lys Met Cys Thr Arg Asp(SEQ ID NO：20)，
Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Gly Gly Arg Cys Arg Ala IleGln Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ser TyrGly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys LysLys Met Cys Thr Arg Asp(SEQ ID NO：21)，
Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Arg Cys Arg GlyAla His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe SerTyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu CysLys Lys Met Cys Thr Arg Asp(SEQ ID NO：22)，
Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro CysArg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu GluPhe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu GluCys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp(SEQ ID NO：2)。
序列的其他实例包括与本文描述的氨基酸序列例如上面提供的氨基酸序列相差至少一个氨基酸、但少于七个、六个、五个、四个、三个或两个氨基酸差异的那些。在一个实施方案中，少于三个、两个或一个差异在结合环之一中。例如，第一结合环可以与本文描述的氨基酸序列例如上面提供的氨基酸序列没有差异。另一实例中，第一结合环或第二结合环与本文描述的氨基酸序列例如上面提供的氨基酸序列都没有差异。
图2A和2B提供了这些序列、衍生这些变体的天然LACI序列(SEQID NO：32)和其他已知Kunitz结构域(SEQ ID NO：29-31和33-53)的氨基酸序列比对。抑制血浆激肽释放酶的其他多肽包括SEQ ID NO：2的氨基酸3-60的约58-氨基酸序列或具有SEQ ID NO：2的60-氨基酸序列的PEP-1多肽。本文使用的术语“PEP-1”和“DX-88”都指SEQ ID NO：2的60-氨基酸序列。编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核苷酸序列提供于SEQID NO：3(参见例如图1中的核苷酸309-488)。要理解，基于已知的遗传密码，SEQ ID NO：3的核苷酸序列的简并形式可以通过简单地用一个或多个已知的简并密码子取代核苷酸序列编码的每个氨基酸来获得。SEQID NO：3的核苷酸7-180及其简并形式编码非天然存在的Kunitz结构域多肽，包括SEQ ID NO：2的氨基酸3-60的58-氨基酸序列、相关序列或其功能片段。
在一个实施方案中，多肽不同于抑蛋白酶肽，例如，与抑蛋白酶肽相差至少一个、两个、三个、五个、十个或十五个氨基酸。
本文描述的多肽可以使用任何标准多肽合成方案和设备合成制备。例如，多肽的逐步合成可以通过如下进行：从最初(即，羧基末端)氨基酸去除氨基(N)末端保护基，并将其偶联至多肽序列中下一氨基酸羧基末端。该氨基酸也被适当保护。引入的氨基酸的羧基可以被活化而与结合的氨基酸N末端反应，通过形成反应性基团，例如形成碳二亚胺、合成的酸酐或“活性酯”基团，例如羟基苯并***或五氟苯基酯。优选的固相肽合成方法包括：BOC方法，其利用叔丁基氧羟基作为I氨基保护基；和FMOC方法，其利用9-芴甲氧羰基保护氨基酸残基的α氨基。两种方法对于本领域技术人员而言是公知的(Stewart，J.和Young，J.，Solid-Phase Peptide Synthesis(W.H.Freeman Co.，San Francisco 1989)；Merrifield，J.，1963.Am.Chem.Soc.，85：2149-2154；Bodanszky，M.和Bodanszky，A.，The Practice of Peptide Synthesis(Springer-Verlag，NewYork 1984))。如果需要，其他氨基和/或羧基末端氨基酸可以被设计入氨基酸序列并在多肽合成期间添加。
多肽还可以使用重组技术产生。重组方法可以采用许多细胞的任何一种和相应的表达载体，包括但不限于细菌表达载体、酵母表达载体、杆状病毒表达载体、哺乳动物病毒表达载体等。本文描述的多肽可以由转基因动物产生，例如在转基因动物的乳腺中。在一些情况下，使抑制激肽释放酶的多肽(例如，包括Kunitz结构域的多肽)的编码序列与表达载体中另一编码序列融合形成融合多肽可能是必要或有利的，融合多肽容易在宿主细胞中表达。其他序列的部分或全部可以例如通过蛋白酶消化被去除。
产生抑制激肽释放酶的多肽(例如，包括Kunitz结构域的多肽)的示例性重组表达***是酵母表达载体，其允许编码抑制剂多肽的氨基酸序列的核酸序列与编码酿酒酵母的MATα前原前导肽的核苷酸序列在相同读码框中连接，其转而受到可操作酵母启动子的控制。得到的重组酵母表达质粒可以通过标准方法转化入适当的相容的酵母宿主细胞中，所述细胞能够从重组酵母表达载体表达重组蛋白。优选地，用此类重组表达载体转化的宿主酵母细胞还能够加工融合蛋白以提供活性抑制剂多肽。用于产生重组多肽的其他示例性酵母宿主是毕赤酵母。
如上所示，抑制激肽释放酶的多肽可以包括本文描述的Kunitz结构域多肽。一些多肽可以包括在氨基和/或羧基末端的其他侧翼序列，优选长度为1至6个氨基酸，条件是所述其他氨基酸不显著降低激肽释放酶结合亲和力或激肽释放酶抑制活性而妨碍在本文描述的方法和组合物中使用。此类其他氨基酸可以被有意地添加以在特定重组宿主细胞中表达多肽，或者可以被添加以提供其他功能，例如，提供与另一分子的连接体，或提供促进多肽纯化的亲和力部分。优选地，其他氨基酸不包括半胱氨酸，半胱氨酸可能干扰Kunitz结构域的二硫键。
示例性Kunitz结构域多肽包括SEQ ID NO：2的残基3-60的氨基酸序列。当在酵母融合蛋白表达***中表达和加工时(例如，基于整合的表达质粒pHIL-D2)，此类Kunitz结构域多肽保留来自与酿酒酵母的MATα-前原前导肽序列融合的其他氨基末端Glu-Ala二肽。当从酵母宿主细胞分泌时，大部分前导肽从融合蛋白加工而产生具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列(参见图1的加框区)的功能性多肽(在本文称为″PEP-1″)。
包括SEQ ID NO：1的典型Kunitz结构域含有许多不变的位置，例如对应于BPTI编号方案中位置5、14、30、33、38、45、51和55的位置是半胱氨酸。这些位置之间的位置可以在Kunitz结构域折叠内允许的程度改变，例如，使得形成三个二硫键。对应于那些位置的其他位置，例如位置6、7、8、9、20、24、25、26、27、28、29、41、42、44、46、47、48、49、50、52、53和54可以是任何氨基酸(包括非遗传编码的存在的氨基酸)。在特别优选的实施方案中，一个或多个氨基酸对应于天然序列的氨基酸(例如，SEQ ID NO：32，参见图2A和2B)。在另一个实施方案中，至少一个可变位置不同于天然序列。在另一个优选实施方案中，氨基酸可以各自独立地或集合地被保守或非保守氨基酸取代所取代。
保守氨基酸取代用具有相似化学性质的另一氨基酸取代一个氨基酸，并且可以不影响蛋白功能。非保守氨基酸取代用具有不相似化学结构的另一氨基酸取代一个氨基酸。保守氨基酸取代的实例包括例如Asn-＞Gln，Arg-＞Lys和Ser-＞Thr。在一个优选实施方案中，这些氨基酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20和/或21个可以独立地或集合地以任何组合被选择对应于SEQID NO：2的相应位置。
对应于这些位置的其他位置，例如位置10、11、13、15、16、17、18、19、21、22、23、31、32、34、35、39、40、43和45，可以是选定组的氨基酸。例如，SEQ ID NO：1定义了一组可能的序列。该组的每个成员例如在位置5、14、30、51和55含有半胱氨酸，并且在位置10、11、13、15、16、17、18、19、21、22、23、31、32、34、35、39、40、43和45或对应于那些位置的位置含有特定组氨基酸的任何一个。在一个优选实施方案中，这些氨基酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和/或19可以独立地或集合地以任何组合被选择对应于SEQ ID NO：2的相应位置。多肽优选具有与SEQ IDNO：2至少80％、85％、90％、95、97、98或99％同一性。
两个序列之间的序列比较和百分比同源性测定可以使用数学算法来实现。在一个优选实施方案中，两个氨基酸序列之间的百分比同源性使用Needleman和Wunsch(1970)，J.Mol.Biol.48：444-453来测定，该算法已经被加入GCG软件包中的GAP程序，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。在另一优选实施方案中，两个核苷酸序列之间的百分比同源性使用GCG软件包中的GAP程序测定，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及40、50、60、70或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。特别优选的一组参数(以及医生不确定哪些参数应该被用于测定分子是否在同源性限制内时应该被使用的参数)是Blossum 62评分矩阵，空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5。
结合蛋白抑制剂。在其他实施方案中，激肽释放酶的抑制剂是结合蛋白，例如抗体。
一方面，本公开特征为结合血浆激肽释放酶(例如人血浆激肽释放酶)并且包括至少一个免疫球蛋白可变区的蛋白(例如，分离的蛋白)。例如，蛋白包括重链(HC)免疫球蛋白可变结构域序列和/或轻链(LC)免疫球蛋白可变结构域序列。蛋白可以结合并抑制血浆激肽释放酶，例如人血浆激肽释放酶。
蛋白可以包括下述特征的一个或多个：(a)人CDR或人构架区；(b)(b)HC免疫球蛋白可变结构域序列包括与本文描述的HC可变结构域的CDR至少85、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同的一个或多个(例如1、2或3)CDR；(c)LC免疫球蛋白可变结构域序列包括与本文描述的LC可变结构域的CDR至少85、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同的一个或多个(例如1、2或3)CDR；(d)LC免疫球蛋白可变结构域序列与本文描述的LC可变结构域至少85、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同(例如，总体上或在构架区或CDR中)；(e)HC免疫球蛋白可变结构域序列与本文描述的HC可变结构域至少85、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同(例如，总体上或在构架区或CDR中)；(f)蛋白结合本文描述蛋白结合的表位，或者与本文描述的蛋白竞争结合；(g)灵长类CDR或灵长类构架区；(h)HC免疫球蛋白可变结构域序列包括与本文描述的HC可变结构域的CDR1至少一个氨基酸但不超过2或3个氨基酸差异的CDR1；(i)HC免疫球蛋白可变结构域序列包括与本文描述的HC可变结构域的CDR2至少一个氨基酸但不超过2、3、4、5、6、7或8个氨基酸差异的CDR2；(j)HC免疫球蛋白可变结构域序列包括与本文描述的HC可变结构域的CDR3至少一个氨基酸但不超过2、3、4、5或6个氨基酸差异的CDR3；(k)LC免疫球蛋白可变结构域序列包括与本文描述的LC可变结构域的CDR1至少一个氨基酸但不超过2、3、4或5个氨基酸差异的CDR1；(l)LC免疫球蛋白可变结构域序列包括与本文描述的LC可变结构域的CDR2至少一个氨基酸但不超过2、3或4个氨基酸差异的CDR2；(m)LC免疫球蛋白可变结构域序列包括与本文描述的LC可变结构域的CDR3至少一个氨基酸但不超过2、3、4或5个氨基酸差异的CDR3；(n)LC免疫球蛋白可变结构域序列与本文描述的LC可变结构域至少一个氨基酸但不超过2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异(例如，总体上或在构架区或CDR中)；和(o)HC免疫球蛋白可变结构域序列与本文描述的HC可变结构域至少一个氨基酸但不超过2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异(例如，总体上或在构架区或CDR中)。
血浆激肽释放酶结合蛋白可以是分离的蛋白(例如至少70、80、90、95或99％不含其他蛋白)。
血浆激肽释放酶结合蛋白可以抑制血浆激肽释放酶，例如人血浆激肽释放酶。
在一些实施方案中，血浆激肽释放酶结合蛋白不结合前激肽释放酶(例如，人前激肽释放酶)，但结合血浆激肽释放酶(例如人血浆激肽释放酶)的活性形式。
在某些实施方案中，蛋白在血浆激肽释放酶或其片段的催化结构域的活性位点或附近结合，或者结合与血浆激肽释放酶活性位点重叠的表位。
在一些方面，蛋白与本文描述的蛋白结合相同表位或与本文描述的蛋白竞争结合。
在一些实施方案中，蛋白与M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X81-B01、X67-D03或X67-G04竞争或结合相同表位。
在一些实施方案中，蛋白结合(例如血浆激肽释放酶上相应位置)CLIPS肽C1、C2、C3、C4、C5、C6或C7或这些肽中多于一个，例如蛋白结合C5和C6。CLIPS肽C1-C7是通过CLIPS表位作图鉴定的血浆激肽释放酶中的肽(参见图8和9A-9C)。C1对应于血浆激肽释放酶催化结构域位置55-67，C2对应于位置81-94，C3对应于位置101-108，C4对应于位置137-151，C5对应于位置162-178，C6对应于位置186-197，并且C7对应于位置214-217。
在一些实施方案中，蛋白结合图8所示表位。
在一些实施方案中，蛋白结合形成血浆激肽释放酶的催化三联体的一个或多个氨基酸：His434、Asp483和/或Ser578(编号基于人序列)。
在一些实施方案中，蛋白结合Ser479、Tyr563和/或Asp585的一个或多个氨基酸(编号基于人序列)。
血浆激肽释放酶的活性位点裂缝含有形成催化三联体的三个氨基酸(His434、Asp483和Ser578)并且导致结合底物的酶促水解(催化三联体残基在图9A-9C中加下划线)。被选择用于CLIPS表位作图分析的肽被测定为是表面可及的并且形成或围绕活性位点附近。肽C1含有活性位点组氨酸434。肽C3含有活性位点天冬氨酸483。肽C6含有活性位点丝氨酸578。抗体可能结合暴露于在氨基酸序列中不连续的氨基酸的多个表面。例如，通过CLIP分析，X81-B01似乎结合C2、C3、C5和C6肽。
在一些实施方案中，蛋白结合包括来自CLIPS肽C1、肽C2、肽C3、肽C4、肽C5、肽C6或肽C7的一个或多个氨基酸的表位。
在一些实施方案中，蛋白结合包括来自至少两个不同CLIPS肽例如来自肽C1、肽C2、肽C3、肽C4、肽C5、肽C6或肽C7的至少两个的氨基酸的表位。
蛋白可以结合血浆激肽释放酶、例如人血浆激肽释放酶，结合亲和力为至少105、106、107、108、109、1010和1011M-1。在一个实施方案中，蛋白以低于1×10-3、5×10-4s-1或1×10-4s-1的Koff结合人血浆激肽释放酶。在一个实施方案中，蛋白以高于1×102、1×103或5×103M-1s-1的Kon结合人血浆激肽释放酶。在一个实施方案中，蛋白结合血浆激肽释放酶，但是不结合组织激肽释放酶和/或血浆前激肽释放酶(例如，蛋白以比其结合血浆激肽释放酶更低效率(例如，与阴性对照相比低5-、10-、50-、100-或1000-倍或根本不)结合组织激肽释放酶和/或血浆前激肽释放酶。
在一个实施方案中，蛋白抑制人血浆激肽释放酶活性，例如以小于10-5、10-6、10-7、10-8、10-9和10-10M的Ki。蛋白可以具有例如小于100nM、10nM或1nM的IC50。例如，蛋白可以调节血浆激肽释放酶活性以及因子XIIa(例如，来自因子XII)和/或缓激肽(例如，来自高分子量激肽原(HMWK))的生产。蛋白可以抑制血浆激肽释放酶活性，和/或因子XIIa(例如，来自因子XII)和/或缓激肽(例如，来自高分子量激肽原(HMWK))的生产。蛋白对人血浆激肽释放酶的亲和力特征为小于100nm、小于10nM或小于1nM的KD。在一个实施方案中，蛋白抑制血浆激肽释放酶，但是不抑制组织激肽释放酶(例如，蛋白以比其抑制血浆激肽释放酶更低的效率(例如，与阴性对照相比低5-、10-、50-、100-或1000-倍或根本不)抑制组织激肽释放酶。
在一些实施方案中，蛋白具有小于1000、500、100或10nM的表观抑制常数(Ki，app)。
血浆激肽释放酶结合蛋白可以是抗体。血浆激肽释放酶结合抗体可以具有包含在单一多肽(例如scFv)中或不同多肽(例如IgG或Fab)上的其HC和LC可变结构域序列。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有选自由M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X81-B01、X67-D03和X67-G04组成的组的抗体的轻链和重链的抗体(例如人抗体)。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有选自由M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X81-B01、X67-D03和X67-G04组成的组的抗体的重链的抗体(例如人抗体)。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有选自由M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X81-B01、X67-D03和X67-G04组成的组的抗体的轻链的抗体(例如人抗体)。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有选自由M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X81-B01、X67-D03和X67-G04组成的组的抗体的轻链和重链抗体可变区的抗体(例如人抗体)。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有选自由M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X81-B01、X67-D03和X67-G04组成的组的抗体的重链抗体可变区的抗体(例如人抗体)。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有选自由M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X81-B01、X67-D03和X67-G04组成的组的抗体的轻链抗体可变区的抗体(例如人抗体)。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有选自由M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X81-B01、X67-D03和X67-G04组成的重链组的相应CDR的一个或多个(例如1、2或3)重链CDR的抗体(例如人抗体)。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有选自由M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X81-B01、X67-D03和X67-G04组成的轻链组的相应CDR的一个或多个(例如1、2或3)轻链CDR的抗体(例如人抗体)。
在一个优选实施方案中，蛋白是具有选自由M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X81-B01、X67-D03和X67-G04组成的轻链组的相应CDR的一个或多个(例如1、2或3)重链CDR和一个或多个(例如1、2或3)轻链CDR的抗体(例如人抗体)。
在一个实施方案中，HC和LC可变结构域序列是相同多肽链的组分。在另一实施方案中，HC和LC可变结构域序列是不同多肽链的组分。例如，蛋白是IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。蛋白可以是可溶性Fab。在其他实施方式中，蛋白包括Fab2′、scFv、迷你抗体、scFv::Fc融合体、Fab::HSA融合体、HSA::Fab融合体、Fab::HSA::Fab融合体或者包括本文结合蛋白之一的抗原结合位点的其他分子。这些Fab的VH和VL区可以提供为IgG、Fab、Fab2、Fab2′、scFv、PEG化Fab、PEG化scFv、PEG化Fab2、VH::CH1::HSA+LC、HSA::VH::CH1+LC、LC::HSA+VH::CH1、HSA::LC+VH::CH1或其他适当的构建体。
在一个实施方案中，蛋白是人或人源化抗体或者在人中是非免疫原性的。例如，蛋白包括一个或多个人抗体构架区，例如所有人构架区，或与人构架区具有至少85、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％同一性的构架区。在一个实施方案中，蛋白包括人Fc结构域或与人Fc结构域至少95、96、97、98或99％相同的Fc结构域。
在一个实施方案中，蛋白是灵长类或灵长类化抗体或者在人中是非免疫原性的。例如，蛋白包括一个或多个灵长类抗体构架区，例如所有灵长类构架区，或与灵长类构架区具有至少85、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％同一性的构架区。在一个实施方案中，蛋白包括灵长类Fc结构域或与灵长类Fc结构域至少95、96、97、98或99％相同的Fc结构域。“灵长类”包括人(Homo sapiens)、黑猩猩(Pantroglodytes和Pan paniscus(倭猩猩))、大猩猩(Gorilla gorilla)、长臂猿、猴子、狐猴、指猴(Daubentonia madagascariensis)和眼镜猴。
在一些实施方案中，灵长类抗体对人血浆激肽释放酶的亲和力特征为小于1000、500、100或10nM，例如小于10nM或小于1nM的KD。
在某些实施方案中，蛋白不包括来自小鼠或兔的序列(例如，不是鼠或兔抗体)。
在一些方面，本公开内容提供了结合血浆激肽释放酶(例如人血浆激肽释放酶)并且包括至少一个免疫球蛋白可变区的蛋白(例如，结合蛋白，例如抗体)(例如，本文描述的蛋白)在治疗(或预防)粘膜炎的方法中的使用。例如，血浆激肽释放酶结合蛋白包括重链(HC)免疫球蛋白可变结构域序列和轻链(LC)免疫球蛋白可变结构域序列。许多示例性血浆激肽释放酶结合蛋白在本文描述。
抗体可以通过使用激肽释放酶靶筛选文库以及通过其他方法来发现。例如，激肽释放酶蛋白或其区可以在非人动物例如啮齿类动物中用作抗原。人源化抗体可以通过用来自人Fv可变区的等同序列替代不直接参与抗原结合的Fv可变区的序列来产生。产生人源化抗体的一般方法提供于Morrison，S.L.，1985，Science 229：1202-1207，Oi等，1986，BioTechniques 4：214和Queen等美国专利号5,585,089、US 5,693,761和US 5,693,762。那些方法包括分离、操纵和表达编码来自至少一个重链或轻链的免疫球蛋白Fv可变区的全部或部分的核酸序列。此类核酸的许多来源是可用的。例如，核酸可以获自产生针对预定靶的抗体的杂交瘤，如上文所述。编码人源化抗体及其片段的重组DNA然后可以被克隆入适当的表达载体。
免疫球蛋白激肽释放酶结合蛋白(例如IgG或Fab激肽释放酶结合蛋白)可以被修饰以减少免疫原性。减少的免疫原性在预期用作治疗剂的激肽释放酶结合蛋白中是需要的，因为这减少了受试者发生针对治疗分子的免疫应答的机会。用于减少激肽释放酶结合蛋白免疫原性的技术包括检测/修饰潜在的人T细胞表位和CDR外序列的“种系化”(例如构架和Fc)。
激肽释放酶结合抗体可以通过人T细胞表位的特定缺失来修饰或者通过WO 98/52976和WO 00/34317中公开的方法“去免疫化”。简言之，分析结合II类MHC的肽的抗体重链和轻链可变区；这些肽代表潜在的T细胞表位(如WO 98/52976和WO 00/34317中定义的)。为了检测潜在的T细胞表位，可以使用称为“肽线程”的计算机模拟方法，慈爱，可以检索人II类MHC结合肽的VH和VL序列中存在的基序，如WO98/52976和WO 00/34317所述。这些基序结合18个主要II类MHC DR同种型的任何一个，因此构成潜在的T细胞表位。检测的潜在T细胞表位可以通过取代可变区中小数目的氨基酸残基或优选地通过单氨基酸取代来消除。尽可能进行保守取代，通常但非穷尽性地，可以使用人种系抗体序列中该位置的常见氨基酸。人种系序列公开于Tomlinson，I.A.等，1992，J.Mol.Biol.227：776-798；Cook，G.P.等，1995，Immunol.TodayVol.16(5)：237-242；Chothia，D.等，1992，J.Mol.Bio.227：799-817。VBASE目录提供了人免疫球蛋白可变区序列的综合目录(由Tomlinson，I.A.等MRC Centre for Protein Engineering，Cambridge，UK汇编)。在鉴定去免疫化变化之后，可以通过诱变或其他合成方法(例如，从头合成、盒替代等等)构建编码VH和VL的核酸。诱变的可变序列可以任选地与人恒定区例如人IgG1或κ恒定区融合。
在一些情况下，潜在T细胞表位将包括已知或预测对于抗体功能重要的残基。例如，潜在T细胞表位通常偏向CDR。此外，潜在T细胞表位可以存在于对于抗体结构和结合重要的构架残基。消除这些潜在表位的改变有时将需要更多研究，例如通过制备和测试有和没有改变的链。需要时，重叠CDR的潜在T细胞表位通过CDR外的取代来消除。一些情况下，CDR内的改变是唯一选择，因此，应该测试有和没有该取代的变体。在其他情况下，去除潜在T细胞表位所需的取代在构架内可能对于抗体结合关键的残基位置。在这些情况下，应该有和没有该取代的变体。因此，在一些情况下，设计了几种变体的去免疫化重链和轻链可变区并测试了各种重链/轻链组合以鉴定最佳的去免疫化抗体。然后，最终去免疫化抗体的选择可以通过考虑不同变体的结合亲和力以及区免疫化程度(即，可变区中保持潜在T细胞表位的数目)来进行。区免疫化可用来修饰任何抗体，例如包括非人序列的抗体，例如合成抗体、鼠抗体、其他非人单克隆抗体或从展示文库分离的抗体。
激肽释放酶结合抗体通过将构架区中一个或多个非种系氨基酸回文成抗体相应种系氨基酸而被“种系化”，只要基本保留结合性质。类似方法还可用于恒定区，例如恒定区免疫球蛋白结构域。
结合激肽释放酶例如本文描述抗体的抗体可以被修饰以使得抗体可变区更类似于一种或多种种系序列。例如，抗体可以例如在构架区、CDR或恒定区包括一个、两个、三个或多个氨基酸取代，使得其更类似于参考种系序列。一种示例性种系化方法可以包括鉴定与分离的抗体序列类似(例如，在特定数据库中大部分类似)的一种或多种种系序列。然后在分离的抗体中进行突变(在氨基酸水平上)，增加或与其他突变组合。例如，制备了包括编码一些或所有可能种系突变的序列的核酸文库。然后评估突变的抗体，例如以鉴定相对于分离的抗体具有一个或多个其他种系残基并且依然有用(例如，具有功能活性)的抗体。在一个实施方案中，尽可能多的种系残基被引入分离的抗体。
在一个实施方案中，使用诱变来取代或***一个或多个种系残基进入构架和/或恒定区。例如，种系构架和/或恒定区残基可以来自与被修饰的非可变区类似(例如大部分类似)的种系序列。诱变后，可以评估抗体活性(例如，结合或其他功能活性)来确定种系残基是否被耐受(即，不废除活性)。类似的诱变可以在构架区中进行。
选择种系序列可以不同方式进行。例如，如果种系序列满足预定的选择性或相似性标准，例如至少某个百分比同一性，例如至少75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或99.5％同一性，则它可以被选择。选择可以使用至少2、3、5或10个种系序列进行。在CDR1和CDR2的情况下，鉴定相似种系序列可以包括选择一个此类序列。在CDR3的情况下，鉴定相似种系序列可以包括选择一个此类序列，但是可以包括使用分别延续氨基末端部分和羧基末端部分的两个种系序列。在其他实施方式中，使用了超过一个或两个种系序列，例如以形成共有序列。
在一个实施方案中，就特定参考可变结构域序列、例如本文所述序列而言，相关可变结构域序列具有至少30、40、50、60、70、80、90、95或100％与参考CDR序列中的残基不同的CDR氨基酸位置，与人种系序列(即，由人种系核酸编码的氨基酸序列)中相应位置残基相同的残基。
在一个实施方案中，就特定参考可变结构域序列例如本文所述序列而言，相关可变结构域序列具有至少30、50、60、70、80、90或100％与来自人种系序列、例如与参考可变结构域序列相关的种系序列的FR序列相同的FR区。
因此，可能分离与给定的感兴趣抗体具有相似活性、但与一种或多种种系序列、特别是一种或多种人种系序列更相似的抗体。例如，抗体可以与CDR外区域(例如构架区)中种系序列至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或99.5％相同。而且，抗体可以包括CDR区中至少1、2、3、4或5个种系残基，所述种系残基来自与被修饰的可变区相似(例如，大部分相似)的种系序列。主要感兴趣的种系序列是人种系序列。抗体的活性(例如通过KA测量的结合活性)可以是原始抗体的100、10、5、2、0.5、0.1和0.001倍。
人免疫球蛋白基因的种系序列已经被确定，并且可获自许多来源，包括可通过万维网在imgt.cines.fr获得的国际ImMunoGeneTicsinformation system
Figure BPA00001394925800501
(IMGT)以及V BASE目录(Tomlinson，I.A.等汇编，MRC Centre for Protein Engineering，Cambridge，UK，可通过万维网在vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk获得)。
Vκ的示例性种系参考序列包括：O12/O2、O18/O8、A20、A30、L14、L1、L15、L4/18a、L5/L19、L8、L23、L9，L24、L11、L12、O11/O1、A17、A1、A18、A2、A19/A3、A23、A27、A11、L2/L16、L6、L20、L25、B3、B2、A26/A10和A14。参见例如Tomlinson等，1995，EMBO J.14(1HC 8)：4628-3。
可变结构域的种系参考序列可以基于具有特定正则结构例如H1和H2超变环中1-3个结构的序列。免疫球蛋白可变结构域的超变环中的正则结构可以从其序列推导，如Chothia等，1992，J.Mol.Biol.227：799-817；Tomlinson等，1992，J.Mol.Biol.227：776-798)；和Tomlinson等，1995，EMBO J.14(18)：4628-38所述。具有1-3结构的示例性序列包括：DP-1、DP-8、DP-12、DP-2、DP-25、DP-15、DP-7、DP-4、DP-31、DP-32、DP-33、DP-35、DP-40、7-2、hv3005、hv3005f3、DP-46、DP-47、DP-58、DP-49、DP-50、DP-51、DP-53和DP-54。
有用的多肽还可以由与编码本文所述多肽的核酸杂交的核酸编码。核酸可以在中、高或非常高严格条件下杂交。本文使用的术语“在低严格、中严格、高严格或非常高严格条件下杂交”描述了杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指导原则可以见Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6，其通过引用并入。该参考文献中描述了水性和非水性方法并且任何一种可以被使用。本文提及的具体杂交条件如下：(1)低严格杂交条件，在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，约45℃，随后在至少50℃下0.2X SSC，0.1％SDS中两次洗涤(对于低严格条件，洗涤温度可以被增加至55℃)；(2)中严格杂交条件，在6X SSC中，约45℃，随后在60℃下0.2X SSC，0.1％SDS中一次或多次洗涤；(3)高严格杂交条件，在6X SSC中，约45℃，随后在65℃下0.2X SSC，0.1％SDS中一次或多次洗涤；和(4)非常高严格杂交条件是65℃下0.5M磷酸钠7％SDS，随后在65℃下0.2X SSC，1％SDS洗涤一次或多次。
蛋白生成。标准重组核酸方法可用于表达结合血浆激肽释放酶的蛋白。一般，编码该蛋白的核酸序列被克隆入核酸表达载体。当然，如果蛋白包括多个多肽链，每个链可以被克隆入表达载体，例如在相同或不同细胞中表达的相同或不同载体。
抗体生成。一些抗体例如Fab可以在细菌细胞例如大肠杆菌细胞中产生。例如，如果Fab由在展示实体和噬菌体蛋白(或其片段)之间包括可抑制终止密码子的噬菌体展示载体中的序列编码，载体核酸可被转移入不能抑制终止密码子的细菌细胞。在这种情况下，Fab不与基因III蛋白融合并分泌入外周质和/或培养基。
抗体还可以在真核细胞中产生。在一个实施方案中，抗体(例如scFv)在酵母细胞例如毕赤酵母(参见例如Powers等，2001，J.Immunol.Methods.251：123-35)、汉森酵母或酿酒酵母中表达。
在一个优选实施方案中，抗体在哺乳动物细胞中产生。用于表达克隆抗体或其抗原结合片段的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220，与DHFR选择性标记一起使用，例如Kaufman和Sharp，1982，Mol.Biol.159：601 621中所述)，淋巴细胞细胞系，例如NS0骨髓瘤细胞和SP2细胞、COS细胞、HEK293T细胞(J.Immunol.Methods(2004)289(1-2)：65-80)，和来自转基因动物例如转基因哺乳动物的细胞。例如，细胞是哺乳动物上皮细胞。
除了编码多种免疫球蛋白结构域的核酸序列，重组表达载体可以携带其他序列，例如调节宿主细胞中载体复制的序列(例如复制起点)和选择性标记基因。选择性标记基因促进已经引入载体的宿主细胞的选择(参见例如美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，通常，选择性标记基因赋予已经引入载体的宿主细胞药物抗性，所述药物例如G418、潮霉素或氨甲喋呤。优选的选择性标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于氨甲喋呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。
在用于重组表达抗体或其抗原结合部分的示例性***中，编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体通过磷酸钙介导的转染被引入dhfr-CHO细胞。在重组表达载体内，抗体重链和轻链基因各自可操作连接至增强子/启动子调节元件(例如，源自SV40、CMV、腺病毒等，例如CMV增强子/AdMLP启动子调节元件或SV40增强子/AdMLP启动子调节元件)以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，其允许使用氨甲喋呤选择/扩增来选择被载体转染的CHO细胞。被选择的转化宿主细胞被培养以允许抗体重链和轻链的表达，并且从培养基回收完整抗体。使用标准分子生物学技术制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化子，培养宿主细胞并从培养基回收抗体。例如，一些抗体可以通过亲和色谱分离，使用蛋白A或蛋白G偶联基质。
对于包括Fc结构域的抗体来说，抗体生成***可以产生其中Fc区被糖基化的抗体。例如，IgG分子的Fc结构域在CH2结构域中天冬酰胺297处被糖基化。该天冬酰胺是双触角型寡糖修饰位点。已经证明，该糖基化是Fcg受体和补体C1q介导的效应功能所需的(Burton和Woof，1992，Adv.Immunol.51：1-84；Jefferis等，1998，Immunol.Rev.163：59-76)。在一个实施方案中，Fc结构域在哺乳动物表达***中产生，适当地糖基化对应于天冬酰胺297的残基。Fc结构域还可以包括其他真核翻译后修饰。
抗体还可以由转基因动物产生。例如，美国专利No.5,849,992描述了在转基因哺乳动物乳腺中表达抗体的方法。构建了包括乳特异性启动子和编码感兴趣抗体的核酸和分泌信号序列的核酸的转基因。此类转基因哺乳动物的雌性产生的乳包括在其中分泌的感兴趣的抗体。抗体可以从乳中纯化，或者直接用于一些应用。
血浆激肽释放酶
血浆激肽释放酶结合蛋白可以针对其产生的示例性血浆激肽释放酶序列可以包括人、小鼠或大鼠血浆激肽释放酶氨基酸序列，其与例如下文提供的序列的这些序列之一或其片段具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
用于选择和后续的结合蛋白筛选的人血浆激肽释放酶序列显示如下(登录号NP_000883.2)。使用的人血浆激肽释放酶(86kDa)从人血浆纯化并通过商业供应商的因子XIIa激活。因子XIIa通过在单位点(Arg371-Ile372之间，下文序列中标记“/”的切割位点)切割多肽序列而激活前激肽释放酶，以产生活性血浆激肽释放酶，其由两个二硫键连接的多肽组成；大约52kDa的重链和大约34kDa的催化结构域[Colman和Schmaier，(1997)“Contact System：A Vascular Biology Modulator WithAnticoagulant，Profibrinolytic，Antiadhesive，and ProinflammatoryAttributes”Blood，90，3819-3843]
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人、小鼠和大鼠前激肽释放酶氨基酸序列和编码其的mRNA序列显示如下。前激肽释放酶的序列与血浆激肽释放酶相同，除了活性血浆激肽释放酶(pkal)具有在单个位置(由“/”指示)切割以产生两条链的单个多肽链。下文提供的序列是包括信号序列的完整序列。从表达细胞分泌时，预期信号序列被去除。
人血浆激肽释放酶(ACCESSION：NP_000883.2)
＞gi|78191798|ref|NP_000883.2|血浆激肽释放酶B1前体[人]
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人血浆激肽释放酶mRNA(ACCESSION：NM_000892)
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小鼠血浆激肽释放酶(ACCESSION：NP_032481.1)
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小鼠血浆激肽释放酶mRNA(ACCESSION：NM_008455.2)
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大鼠血浆激肽释放酶(ACCESSION：NP_036857.2)
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大鼠血浆激肽释放酶mRNA(ACCESSION：NM_012725)
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修饰
可能以多种方式修饰抑制激肽释放酶的多肽。例如，多肽可以连接于一个或多个聚乙二醇部分以稳定化合物或延长保留时间例如至少2、4、5、8、10、15、20、50、100、500或1000倍。
在一个实施方案中，激肽释放酶结合蛋白与提高其在循环例如血液、血清、淋巴或其他组织中稳定性和/或保留例如至少1.5、2、5、10或50倍的部分物理缔合。
例如，激肽释放酶结合蛋白可以与聚合物例如基本上无抗原性的聚合物例如聚烷撑氧或聚环氧乙烯缔合。适合的聚合物将在重量上明显变化。可以使用范围从约200至约35,000(或约1,000至约15,000、和2,000至约12,500)的数均分子量的聚合物。例如，激肽释放酶结合蛋白可以轭合至水溶性聚合物，例如亲水性聚乙烯聚合物，例如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。多种聚合物部分可以连接至一个多肽，例如至少两个、三个或四个这种部分，例如平均分子量约2,000至7,000道尔顿。此类聚合物的非限制性列表包括聚烷撑氧均聚物，例如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙基化多元醇、其共聚物及其嵌段共聚物，条件是保持嵌段共聚物的水溶解度。
例如，多肽可以轭合至水溶性聚合物，例如亲水性聚乙烯聚合物，例如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。此类聚合物的非限制性列表包括聚烷撑氧均聚物，例如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙基化多元醇、其共聚物及其嵌段共聚物，条件是保持嵌段共聚物的水溶解度。其他有用的聚合物包括聚氧化烯，例如聚氧乙烯、聚氧丙烯和聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物(Pluronics)；聚甲基丙烯酸酯；卡波姆；支链或直链多糖，其包括糖单体D-甘露糖、D-和L-半乳糖、岩藻糖、果糖、D-木糖、L-***糖、D-葡糖醛酸、唾液酸、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖醛酸(例如，多聚甘露糖醛酸或藻酸)、D-葡糖胺、D-半乳糖胺、D-葡萄糖和神经氨糖酸，包括同多糖和杂多糖，例如乳糖、支链淀粉、淀粉、羟乙基淀粉、直链淀粉、硫酸葡聚糖、葡聚糖、糊精、糖原或酸性粘多糖的多糖亚基，例如透明质酸；糖醇聚合物，例如聚山梨糖醇和聚甘露糖醇；肝素或类肝素。
其他化合物还可以连接至相同聚合物，例如细胞毒素、标记或另一靶向剂或不相关的剂。单激活的烷氧基末端的聚烷撑氧(PAO)，例如单甲氧基末端的聚乙二醇(mPEG)；C1-4烷基末端的聚合物；和双激活的聚环氧乙烯(糖醇)可以用于交联。参见例如U.S.5,951,974。
激肽释放酶结合蛋白还可以与载体蛋白例如血清白蛋白例如人血清白蛋白缔合。例如，翻译融合体可以用于缔合载体蛋白和激肽释放酶结合蛋白。
方法
本文提供了通过给患有或怀疑患有或有风险患有粘膜炎的受试者施用分离的激肽释放酶抑制剂来治疗和/或预防粘膜炎的方法和组合物。有风险发展粘膜炎的受试者(例如患者)可以是例如将经历、正在经历或将经历化疗(例如高剂量化疗)和/或放疗方案的受试者。作为另一个实例，有风险发展粘膜炎的受试者(例如患者)可以是例如已被诊断患有癌症例如头或颈癌的受试者。
所述方法可以在需要治疗粘膜炎的人或非人受试者中实施。
在一个实施方案中，治疗方法包括施用作为激肽释放酶抑制剂的、包含Kunitz结构域的分离的多肽。该方法的一个实施方案利用含有对激肽释放酶具有亲和力的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽，其是许多丝氨酸蛋白酶例如抑蛋白酶肽的大约30倍或更高，从牛肺分离并且目前被批准用于冠状动脉旁路移植术(TRASYLOLTM，Bayer CorporationPharmaceutical Division，West Haven，Conn.)。
分离的激肽释放酶抑制剂的施用导致至少一种粘膜炎症状的严重度降低、预防或稳定，所述症状例如疼痛、水肿、红斑、继发性细菌定植或事物消耗限制。用于治疗或预防粘膜炎的此类方法的成功和/或进展可以通过下述参数的任何一个评估：
●粘膜炎发生频率降低(或)
●任何给定水平的疾病严重度的粘膜炎的持续时间减少(或)
●治疗期间任何时程的粘膜炎发展的严重度(1-4级)的降低(或)
●粘膜炎相关迹象或症状的任何一个的减少，包括但不限于：
○疼痛
○水肿
○红斑
○继发性细菌定植
○食物消耗的限制(固体、液体)
○疲劳
○聚集的治疗群中相比于聚集的非治疗患者群耐受更高或重复剂量的化疗或放疗的能力
组合疗法
分离的激肽释放酶抑制剂可以与作为粘膜炎组合疗法的部分的另一治疗剂一起施用。其他治疗剂可以是支持性疗法或治疗剂，例如帕利夫明(KEPIVANCE
Figure BPA00001394925800591
)(人角质形成细胞生长因子(KGF))。支持性治疗包括冰管上吸允、抗氧化剂和口腔清洗剂(例如GELCLAIR
Figure BPA00001394925800592
CAPHOSOL
Figure BPA00001394925800593
MUGARD
Figure BPA00001394925800594
)。几种口腔清洗剂是可用的，组合了抗组胺药、麻醉剂、抗炎药(例如皮质激素)、抗生素和抗真菌剂。麻醉性镇痛药也可以证明帮助缓解疼痛。其他支持性治疗包括抗微生物剂、抗炎剂和良好的口腔护理。
激肽释放酶抑制剂和另一种治疗剂的组合疗法可以多种不同形式提供。在其中激肽释放酶抑制剂通过关节内注射施用的情况下，激肽释放酶抑制剂和治疗剂可以作为单一组合物共施用，或者它们可以通过分开注射来施用。在一些情况下，激肽释放酶抑制剂和治疗剂在靠近的时空距离内施用(例如，注射之间的短时间间隔，例如在同一疗程期间)，或者更大间隔施用，取决于组合疗法两个组成部分需要的施用时间表。当激肽释放酶抑制剂通过***(胃肠外)施用来施用时，激肽释放酶抑制剂和治疗剂可以在靠近的时空距离内或更大间隔施用，取决于组合疗法两个组成部分预期的给药时间表。
施用
激肽释放酶抑制剂(单独或作为组合疗法的部分)可以在粘膜炎临床症状出现之前、期间和/或之后施用给患者。患者一般是人，但也可以是非人哺乳动物。人患者包括成人，例如年龄为19-25、26-40、41-55、56-75、和76至更老的患者，和儿童患者，例如年龄为0-2、3-6、7-12、和13-18的患者。
术语″药学可接受的″组合物指可以与本文描述的激肽释放酶抑制剂一起施用给患者的非毒性载体或赋形剂。载体或赋形剂被选择为与组合物的生物或药理活性相容。本文描述的激肽释放酶抑制剂(和在组合疗法的情况下其他治疗剂)可以通过递送抑制量的抑制剂和/或其他治疗剂给患者的任何适当方式局部或***施用，所述方式包括但不限于***施用，例如静脉内和吸入。胃肠外施用是激肽释放酶抑制剂特别优选的。
对于胃肠外施用，激肽释放酶抑制剂可以静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下注射。皮下注射和i.v.施用是胃肠外施用的优选途径。还有用的是局部(关节内)注射。
通常，用于注射施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液(例如，磷酸钠/磷酸钾缓冲盐水)中的溶液。其他药学可接受的载体包括但不限于无菌水、盐水溶液和缓冲盐水(包括如磷酸盐或乙酸盐的缓冲剂)、醇、植物油、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、石蜡等。必要时，组合物还可以包括增溶剂和缓解注射部位疼痛的局部***例如利多卡因、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、盐、润滑剂等，只要它们不与活性化合物有害地反应。类似地，组合物可以包括适合胃肠外、肠内或鼻内应用的常规赋形剂，例如药学可接受的有机或无机载体物质，其不与活性化合物有害地反应。一般，成分被单独提供或者以单位剂量形式混合在一起，例如作为冻干粉末或无水浓缩物，在气密容器例如安瓿、药囊或管形瓶中，以活性单位表明活性剂的量。当组合物通过输注施用时，其可以用含有无菌药物级“注射水”或盐水的输注瓶分散。当组合物通过注射施用时，可以提供无菌注射水或盐水的容器(例如安瓿或管形瓶)，使得成分可以在施用之前混合。
皮下施用分离的激肽释放酶抑制剂的示例性制剂包括含有缓冲剂(例如组氨酸或磷酸盐缓冲液)和冷冻保护剂(例如蔗糖或蔗糖和甘露醇，任选包括葡聚糖例如葡聚糖40)的缓冲溶液，并且可以冷冻贮存并如美国公开申请No.2007-0213275(美国序号11/716,278，2007年3月9日提交)所描述的分配。
在一个实施方案中，激肽释放酶抑制剂根据任何批准的程序作为静脉内输注被施用给患者。在另一个实施方案中，激肽释放酶抑制剂作为皮下浓注施用给患者。在另一个实施方案中，激肽释放酶抑制剂通过关节内注射施用给患者。I.V.和关节内施用通常在临床环境(例如，医院、急救或医生办公室)下由健康护理人员进行，但是皮下注射可以自施用或由健康护理人员施用。
可以被评估以确定***施用的激肽释放酶抑制剂的剂量的参数参考DX-88(一种非天然存在的激肽释放酶抑制剂，SEQ ID NO：2)在下文描述。血浆中循环前激肽释放酶的总量被报道为大约500nM至600nM(Silverberg等，“The Contact System and Its Disorders，”in Blood：Principlesand Practice of Hematology，Handin，R.等，eds，J B Lippincott Co.，Philadelphia，1995)。如果所有前激肽释放酶被活化，约520纳摩尔/LDX-88(DX88)可以用于以剂量方式抑制激肽释放酶。具有5L血浆的个体将需要2.6毫摩尔DX-88或者基于DX-88分子量7,054道尔顿大约18mg的DX-88的剂量。这计算如下：DX88的Ki是0.044nM。当需要具有例如1nM的血浆激肽释放酶(PK)浓度时，式Ki＝0.044nM＝[DX88]x[PK]/[DX88-PK]＝[DX88]x1nm/499nM表示游离DX-88的浓度是22.0nM。因此，所需DX-88的总量是499+22或521nM。如果并非所有前激肽释放酶被激活，或者一部分激肽释放酶通过内源性抑制剂例如C1酯酶抑制剂(C1INH)被失活，则剂量可以按比例减少。因此，在某些实施方案中，5、10、15、20、30、40、60、80、120、250、500、600、700、800、1000mg DX-88可以单剂或一个或多个剂经24小时时段施用给受试者。几种其他因素的考虑可以提供对实践所需DX-88剂量的更准确的估计，例如患者年龄、体重和粘膜炎严重度和相关症状。
在一些实施方案中，激肽释放酶抑制剂多肽以约1-500mg/m2、优选约1-250mg/m2、1-100mg/m2的剂量施用。
装置和试剂盒
包括激肽释放酶抑制剂的药物组合物可以用医疗装置施用。装置可以被设计为具有如下特征：便携性、室温贮存和易于使用，使得其可以在医院或急救室/急救中心之外的环境下使用(例如在家里或医生办公室由患者或看护者进行)。装置可以包括例如用于贮存包括分离的激肽释放酶抑制剂的药物制剂的一个或多个容器，并且可以被配置为递送一个或多个单位剂量的物质。
I.V.施用可以通过单次浓注或输注，使用适当的注射或输注装置(例如导管、输注泵、植入物等)。皮下注射可以为输注，例如使用导管和输注泵或可植入装置。许多其他装置、植入物、递送***和组件也是已知的。
当激肽释放酶抑制剂作为冻干粉末分配时，其必须在使用前重构。可以使用手工重构(例如，经注射孔注射入含有冻干制剂的容器中来手工添加稀释剂至冻干制剂)，或者激肽释放酶抑制剂可以在用于自动重构的装置中提供(例如，自动添加稀释剂至冻干制剂)，例如BECTON-DICKINSON BDTM液体干喷器。
分离的激肽释放酶抑制剂可以在试剂盒中提供。在一个实施方案中，试剂盒包括(a)含有包括分离的激肽释放酶抑制剂的组合物的容器，和(b)与本文所述方法和/或物质为治疗溢出的使用有关的信息材料。
在某些实施方案中，试剂盒还包括另一种治疗剂。例如，试剂盒包括含有包括分离的激肽释放酶抑制剂的组合物的第一容器，和包括其他治疗剂的第二容器。分离的激肽释放酶抑制剂和其他治疗剂可以提供在同一容器中，用于其中激肽释放酶抑制剂和治疗剂作为单一组合物施用的方法。
试剂盒的信息材料的形式不受限制。在一个实施方案中，信息材料可以包括有关化合物生产的信息、化合物分子量、浓度、有效期、批号或生产地点信息等。在一个实施方案中，信息材料涉及例如以适合剂量、剂型或施用方式(例如本文描述的剂量、剂型或施用方式)施用分离的激肽释放酶抑制剂以治疗患有粘膜炎的受试者的方法。信息可以多种形式提供，包括印刷文本、计算机可读材料、视频记录或音频记录或提供实质材料的链接或地址的信息。
除了分离的激肽释放酶抑制剂(和可能存在的其他治疗剂)，试剂盒中组合物可以包括其他成分，例如溶剂或缓冲液、稳定剂或防腐剂。分离的激肽释放酶抑制剂(和可能存在的其他治疗剂)可以任何形式提供，例如液体、干燥或冻干形式，优选基本纯和/或无菌的。当物质以液体溶液提供时，液体溶液优选是水溶液。当物质以干形式提供时，重构一般通过添加适合的溶剂。溶剂，例如无菌水或缓冲液可以任选地提供在试剂盒中。
试剂盒可以包括含有物质的组合物的一个或多个容器。在一些实施方案中，试剂盒含有组合物和信息材料的单独的容器、分配器或区室。例如，组合物可以包含在瓶、管形瓶或注射器中，信息材料可以包含在塑料套或袋中。在其他实施方案中，试剂盒的单独元件包含在一个未分开的容器中。例如，组合物包含在瓶、管形瓶或注射器中，其上贴有标签形式的信息材料。在一些实施方案中，试剂盒包括多个(例如一包)个体容器，每个含有物质的一个或多个单位剂量形式(例如本文描述的剂量形式)。容器可以包括组合单位剂量，例如包括分离的激肽释放酶抑制剂和另一种治疗剂的单位，例如以需要的比例。例如，试剂盒包括多个注射器、安瓿、箔袋、泡罩或医疗装置，例如每个含有单个组合单位剂量。试剂盒的容器可以是气密的、防水的(例如，不会湿度改变或蒸发)和/或光密的。
试剂盒任选地包括适合组合物施用的装置，例如注射器或其他适合的递送装置。装置可以提供为预装一种物质或两种物质，或者可以是空的但适合装载。
实施例
以下实施例提供了进一步示例说明并且是非限制性的。
预先实施例1：确定DX-88预防和治疗口腔粘膜炎的效力
该临床前研究计划的主要目标是确定DX-88(和/或相关化合物)作为由用于治疗癌症的化疗或放射疗法引起的口腔粘膜炎的介入的最佳制剂和时间表的效力。该计划由一系列将在验证的预测性动物模型中进行的逻辑顺序实验(下述)组成，情况如下：
效力筛选(步骤1).使用急性放射诱导的粘膜炎来筛选化合物和制剂。在该模型中，动物接受针对分离的颊粘膜的单一大剂量放射。发生的溃疡性粘膜炎的动力学和程度遵循一贯过程。溃疡性粘膜炎的弱化是将用于定义DX-88效力的有效终点。使用该模型，DX-88的皮下、腹膜内和局部制剂将以剂量范围形式被评价。
剂量范围优化和时间表筛选(步骤2).步骤1中建立的首要制剂使用以变化的时间表方案(即，放射前并持续7天，放射后，和14天每天，等)应用的其他剂评价。
临床决策点：确定产品的目标群体(循环化疗、放疗、HSCT)。随后的临床前试验围绕预期的产品要求/市场重点来进行。
剂量时间表确定(步骤3).如果放射疗法诱导的粘膜炎是首要适应症，时间表研究将在分级放射模型中进行，其模拟人中的给药方案。另一方面，如果循环化疗被选为主要适应症，则将使用化疗(像5-氟尿嘧啶)模型。集中于最佳方案的该研究的较小版本可以被进行以确认最初研究的观察。
注意：任何支持性肿瘤产品的要求在于其保护正常组织而不改变对细胞毒性疗法的肿瘤应答。因此，平行地进行研究以证明DX-88作为肿瘤生长或疗法应答的调节剂的惯性。
研究1.粘膜炎急性放射.这将是比较2-3个制剂的剂量范围研究。这将是对8个组(64只动物)的30天研究。剂量给药将在第-1天至第20天进行。如果我们在一个或多个治疗组观察到效力，我们将能够直接进入优化研究。如果没有效力，我们可能不得不以递增剂量或改变的制剂重复研究。
研究2.粘膜炎急性放射.这将是最佳制剂的剂量范围研究。在该研究中，我们将扩展剂量范围并且检查替代的给药时间表。这将是对8个组(64只动物)的30天研究。如果两个研究进展良好并且我们确定了最佳剂量/时间表方案，我们将进入改进研究以解决具体的临床群体。可能的是，并非剂量和时间表的所有问题可以在前2个研究中得到解决。这种情况下，第三个研究可能是必要的。
研究3.粘膜炎急性放射(必要性取决于研究1+2的结果).在前2个研究之后留下的有关最佳剂量、制剂和/或时间表的任何模糊性问题将在该实验中解决。这将是对8个组(64只动物)的30天研究。该研究可能或多或少取决于有待解决的问题。
研究4.针对临床群体的粘膜炎研究.该研究将是分级放射研究或组合化疗/放射研究，取决于Dyax的研究重点。该研究目标将是确定特定临床适应症的最佳剂量和时间表。该研究中，我们包括最佳剂量和时间表以获得最佳匹配。化疗/放射研究将进行40天并评价7个实验组(70只动物)。分级放射研究也应该用40天完成，将具有类似规模。
研究5.针对临床群体的粘膜炎研究.该研究将是研究4的验证性研究。该研究目标将是确认特定临床适应症的最佳剂量和时间表。该研究中，我们将包括最佳剂量和时间表以获得最佳匹配。该研究将小于研究4，并且将根据涉及的动物数目报价。
预先实施例2：确定Epi-KAL2预防和治疗口腔粘膜炎的效力
研究目的
该研究的目的是说明EPI-KAL2对急性放射诱导的口腔粘膜炎的频率、严重度和持续时间的效力。EPI-KAL2是pKal的有效(Ki，app＝0.1nM)活性位点抑制剂和基于组织因子途径抑制剂的第一结构域的Kunitz结构域抑制剂(Markland(1996)Iterative optimization of high-affinityprotease inhibitors using phage display.2.Plasma kallikrein andthrombin.Biochemistry.35(24)：8058-67)
EPI-KAL2的序列是：
EAMHSFCAFKA
Figure BPA00001394925800661
FFNIFTRQC
Figure BPA00001394925800662
QNRFESLEECKKMCTRD
(斜体氨基酸是不同于TFPI的那些)
在该最初研究中，将研究两个施用途径。该研究的主要目标时获得每个施用途径的效力的信号。该研究结果将提供未来对口腔粘膜炎治疗中剂量和时间表的优化的基础。
材料和方法
表2：试验***
Figure BPA00001394925800663
Figure BPA00001394925800671
表3：试验产品
Figure BPA00001394925800672
表4：试验产品的施用
Figure BPA00001394925800673
实验设计
二十四(24)只雄性叙利亚金黄仓鼠将在第0天针对其左面颊囊施用急性放射剂量40Gy。这通过麻醉动物并使左面颊囊外翻来实现，同时用铅屏蔽保护动物其余部分。试验材料通过针对左面颊囊的局部施用或IP注射来施用。在第6天开始并隔日继续直至第28天临床评估粘膜炎。
第28天，动物通过吸入CO2而被安乐死，通过根据USDA指导原则监测心率来确认死亡。在尸检时，左和右颊囊将被收集并快速冷冻在液氮中。这些样品将在-80℃贮存并在干冰上运送至生物标记分析。
表5.研究设计
Figure BPA00001394925800681
实验程序
粘膜炎诱导
粘膜炎使用在第0天施用给所有动物的单剂放射(40Gy/剂)被诱导。放射将使用21cm焦距的160千伏电势(15-ma)产生，用3.0mm A1过滤***加强。辐射将以2.5Gy/分钟的速率靶向左面颊囊。在辐射之前，动物将通过腹膜内注射***(160mg/kg)和甲苯噻嗪(8mg/kg)来麻醉。左面颊囊被外翻、固定并使用铅屏蔽分离。
粘膜炎评分
在第6天开始并在其后每两天继续(第8、10、12、14、16、18、20、22、24、26 & 28天)，每只动物被照相并评价粘膜炎评分。待测量的参数包括粘膜炎评分、体重变化和存活。为了评估粘膜炎，动物通过吸入麻醉剂而被麻醉，左面颊囊被外翻。粘膜炎最终通过与验证的照相量表对比来视觉评分，范围从正常的0到严重溃疡的5(临床评分)。在描述性术语中，该量表被定义如下：
评分：描述：
0颊囊完全健康。无红斑或血管舒张。
1轻至严重的红斑和血管舒张。无粘膜侵蚀。
2严重的红斑和血管舒张。离开裸露区的粘膜前表面侵蚀。粘膜点彩减少。
3形成一处或多处白色溃疡。溃疡可能由于假膜而具有黄色/灰色外观。溃疡的累积尺寸应该等于颊囊的约1/4。严重的红斑和血管舒张。
4溃疡的累积尺寸应该等于颊囊的约1/2。柔韧性丧失。严重的红斑和血管舒张。
5视觉上颊囊全部溃疡。柔韧性丧失(颊囊仅可以部分从口腔提取)。
1-2分被认为代表疾病轻微阶段，而3-5分被认为表示中度到严重的粘膜炎。根据该初步临床评分，使用标准化技术对每只动物的粘膜照相。在实验结束时，对胶片显影，照片被随机编号用于盲评分。此后，两个独立的训练观察者使用上述量表以盲方式对照片分级。对于每张照片，实际的盲评分将基于评估者评分的平均值。只有来自该盲照片评价的分数被统计学分析并在最终研究报告中报导。
粘膜炎评估
使用盲照片，粘膜炎等级被评分，第6天开始，此后每两天一次，持续至第28天。与媒介物对照相比，每种药物治疗对粘膜炎的效应将根据下述参数评估：
每组中仓鼠具有严重(评分≥3)粘膜炎的天数差异。
每天评分动物(评价日)，每药物治疗组中具有评分≥3的盲粘膜炎的动物数目将与媒介物对照组比较。每日以及累积分析差异。通过卡方分析测定，如果与对照相比，药物治疗组中评分＞3的仓鼠数目统计学上显著更低，则认为治疗成功。
每日粘膜炎评分的轶和差。
对于每个评价日，媒介物对照组的评分将使用非参数轶和分析与治疗组的评分相比较。成功治疗被认为是从第6天至第28天2天或更多天的治疗组评分统计学上显著降低。
为了评价试验剂对粘膜炎解决的影响，比较了试验与对照之间的愈合时间。解决被定义为不存在溃疡性损伤(评分＜3)。
体重
研究期间每天，每只动物被称重并记录其存活，以评估治疗组间动物体重的可能差异，作为粘膜炎严重度和/或治疗产生的可能毒性的指示。
发现死亡或垂死的动物
该模型中动物死亡一般作为麻醉过量或药物毒性的结果出现。动物每天被监测，表现出超过20％体重减轻的那些被安乐死。任何不良影响或非预期死亡将被立即报告。
数据分析和报告
统计学分析治疗组之间的统计学差异将使用Student t检验、Mann-Whitney U检验和卡方分析来确定，临界值0.05。预期可能发生最多10％的动物死亡，主要是施用麻醉剂的结果。然而，预期在第28天存活的动物数目(每治疗组6只)被认为是统计学评价可接受的。
实施例3：抑制性抗血浆激肽释放酶结合蛋白
我们已经发现了几种抗体抑制剂和血浆激肽释放酶(pKal)结合剂。这些中最有效的被进一步鉴定并显示具有＜10nM的表观抑制常数(Ki，app)，就其他试验的丝氨酸蛋白酶来说是特异性pKal抑制剂，并且不结合前激肽释放酶。抑制剂的CDR的氨基酸序列显示于表6。
Figure BPA00001394925800721
Figure BPA00001394925800731
pKal抗体抑制剂的轻链(LC)和重链(HC)可变结构域的氨基酸序列显示如下。
M6-D09              LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQSI RNYLNWYQQK PGKAPNLLIY AASTLQSGVP  60
ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QLSGYPHTFG QGTKLEIK              108
M6-D09              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS FYYMVWVRQA PGKGLEWVSV IYPSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDK WAVMPPYYYY AMDVWGQGTT 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                          142
M7-B04              LC
QSALTQPASV SGSPGQSITI SCTGTNSDVG NYNLVSWYQQ HPGEAPKLLI YEVNKRPSGV  60
SNRFSGSKSG NTASLTISGL QAEDEADYLC CSYAGNRNFY VFGAGTKVTV L          111
M7-B04              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYSMVWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGGLTNY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARHT AARPFYYYYM DVWGKGTTVT 120
VSSASTKGPS VFPLAPSSKS                                             140
M7-E07              LC
QSELTQPPSV SVSPGQTASI TCSGDKLGDK YACWYQQKPG QSPVLVIYQD SKRPSGIPER  60
FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCQAW DSSTGVFGGG TKLTVL                106
M7-E07              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYLMIWVRQA PGKGLEWVSY IYPSGGFTYY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED MAVYYCARTE GPLSWGYGMD VWGQGTTVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                              139
M8-A09              LC
QCELTQPPSE SVSPGQTANI TCSGDKLGNK YAYWYQQKPG QSPVLVIYQD NNRPSGIPER  60
FSGSNSGNTA TLTISGTQAI DEANYYCQAW DSRTVVFGGG TKLTVL                106
M8-A09              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYFMLWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGNTVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARAA SPVRNYYYYG MDVWGQGTTV 120
TVSSASTKGP SVFPLAPSSK S                                           141
M10-F10              LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQSI SVYLNWYQHK PGKAPKLLIY GASNLQFGVP  60
SRFSGSGYGT DFTLTISSLQ PEDFATYHCQ QTFSLFTFGG GTKVEIK               107
M10-F10              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS FYNMNWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGGETNY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG GAYRNNWWGG FDIWGLGTMV 120
TVSSASTKGP SVFPLAPSSK S                                           141
M10-H05              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRASQSV SSSYLAWYQQ KPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGSGSG TDFTLTISRL EPEDFAVYYC QQYGSSPFTF GPGTKVDIK             109
M10-H05              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYNMYWVRQA PGKGLEWVSS IRPSGGGTVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAGGF IAARWYYFDY WGQGTLVTVS 120
SASTKGPSVF PLAPSSKS                                               138
M12-B05              LC
QSALTQPPTV SVSPGQTARI TCSGNKLGDK YVAWYQQKPG QSPMLVIYQD TKRPSRVSER  60
FSGSNSANTA TLSISGTQAL DEADYYCQAW DSSIVIFGGG TRLTVL                106
M12-B05              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYTMVWVRQA PGKGLEWVSY IYPSGGATFY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAMGS YDYIWGFYSD HWGQGTLVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                              139
M12-D05              LC
QSVLTQPPSV SVSPGQTATI TCSGDQLGDK YVGWYQQKPG QSPILVIYQD TKRPSGIPER  60
FSGSNSGNTA TLTISGTHTV DEAHYYCQAW DTSTAGFGGG TKLTVL                106
M12-D05              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYTMVWVRQA PGKGLEWVSR IYPSGGWTKY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TATYYCAREG LLWFGENAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                              139
M27-E05              LC
QSELTQPPSV SVSPGQTASI TCSGDKLGDK YACWYQQKPG QSPVLVIYQD SKRPSGIPER  60
FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCQAW DSSTGVFGGG TKLTVL                106
M27-E05              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYLMIWVRQA PGKGLEWVSY IYPSGGFTYY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED MAVYYCARTE GPLSWGYGMD VWGQGTTVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                              139
M28-B11              LC
QSVLTQPPSV SVSPGQTATI TCSGDQLGDK YVGWYQQKPG QSPILVIYQD TKRPSGIPER  60
FSGSNSGNTA TLTISGTHTV DEAHYYCQAW DTSTAGFGGG TKLTVL                106
M28-B11              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYTMVWVRQA PGKGLEWVSR IYPSGGWTKY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TATYYCAREG LLWFGENAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                              139
M29-D09              LC
QSALTQPPTV SVSPGQTARI TCSGNKLGDK YVAWYQQKPG QSPMLVIYQD TKRPSRVSER  60
FSGSNSANTA TLSISGTQAL DEADYYCQAW DSSIVIFGGG TRLTVL                106
M29-D09              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYTMVWVRQA PGKGLEWVSY IYPSGGATFY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAMGS YDYIWGFYSD HWGQGTLVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                              139
M29-E09              LC
QYELTQPPSV SVSPGQTATI TCSGDNLGNK YNSWYQQKPG QSPLLVIYQD TKRPSAIPER  60
FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCQAW DGNVVFGGGT KLTVL                 105
M29-E09              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYEMGWVRQA PGKGLEWVSS IYSSGGGTMY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARNP QYSGYDRSLS DGAFDIWGQG 120
TMVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKS                                        144
M35-G04              LC
QDIQMTQSPA TLSLSPGERA TLSCRASQSV SSYLAWYQQK PGQAPRLLIY DASNRATGIP  60
ARFSGSGSGT DFTLTISSLE PEDFAVYYCQ QRSNWPRGFT FGPGTKVDIK            110
M35-G04              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS YYHMSWVRQA PGKGLEWVSV ISPSGGSTKY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG SSDYAWGSYR RPYYFDYWGQ 120
GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKS                                       145
M38-F02              LC
QSVLTQPPSV SVSPGQTASI TCSGEKLGDK YVSWYQQKPG QSPSLVICED SRRPSGIPER  60
FSGSNSGNTA TLTISGAQPM DEADYYCQAW DSSTAIFGPG TKVTVL                106
M38-F02              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS YYMMVWVRQA PGKGLEWVSY IYSSGGHTVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDL FLYDFWSKGA FDIWGQGTMV 120
TVSSASTKGP SVFPLAPSSK S                                           141
M41-A11              LC
QSVLTQPPSV SVSPGQTASI TCSGDKLGDK YTSWYQQRPG QSPVLVIYQD IKRPSGIPER  60
FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCQAW DSPNARVFGS GTKVTVL               107
M41-A11              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYRMSWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGRTVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKDK FEWRLLFRGI GNDAFDIWGQ 120
GTMVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKS                                       145
M73-D06              LC
QSELTQPPSA SETPGQRVTI SCSGSSSNIG SNTVSWFQQL PGSAPRLLIY NDHRRPSGVP  60
DRFSGSKSGT SASLVISGLQ SQDEADYYCS AWDDSLNGVV FGGGTKLTVL            110
M73-D06              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYEMYWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGGPTAY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAMYYCAKGT PKWELLLRSI YIENAFDIWG 120
QGTMVTVSSA STKGPSVFPL APSSKS                                      146
M76-D01              LC
QDIVMTQTPP SLPVNPGEPA SISCRSSQSL SDDGNTYLDW YLQRPGQSPQ LLIHTLSYRA  60
SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCMQGTHWP PTFGQGTKVE IK         112
M76-D01              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS FYAMHWVRQA PGKGLEWVSG IVPSGGRTHY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCATDS SGSPNPLFDY WGQGTLVTVS 120
SASTKGPSVF PLAPSPKS                                               138
M110-C12              LC
QDIQMTQSPL SLSVTPGEPA SISCRSSLSL LHSNGYNYLD WYVQRPGQSP QLLMYLSSTR  60
ASGVPDRFSG SGSGTDFTLE ISRVEAEDVG VYYCMQPLET PPTFGGGTKV EIK        113
M110-C12              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS YYEMDWVRQA PGKGLEWVSG ISSSGGHTAY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TATYYCARER RSSSRARYYY GMDVWGQGTT 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                          142
M137-E12              LC
QSVLIQPPSV SGIPGQRVTI SCSGNNSNFG SNTVTWYQQL PGTAPKLLIY SDSRRPSGVP  60
DRFSGSRSDT SASLAISGLQ SEDEAEYHCA AWDDSLNGVF GGGTKLTVL             109
M137-E12              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYRMQWVRQA PGKGLEWVSV IVPSGGNTMY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG PGSSIAARRA PTGYYGMDVW 120
GQGTTVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKS                                     147
M142-H08              LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP  60
SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR              108
M142-H08              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFRELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS                                         143
M145-D01              LC
QDIQMTQSPA TLSLSPGERA TLSCRASQSV SSYLAWYQQK PGQAPRLLIY DASNRATGIP  60
ARFSGSGSGT DFTLTISSLE PEDFAVYYCQ QRSNWPRGFT FGPGTKVDIK            110
M145-D01              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS YYHMSWVRQA PGKGLEWVSV ISPSGGSTKY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG SSDYAWGSYR RPYYFDYWGQ 120
GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKS                                       145
M145-D11              LC
QSVLTQPPSV SVSPGQTASI TCSGDKLGDK YTSWYQQRPG QSPVLVIYQD IKRPSGIPER  60
FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCQAW DSPNARVFGS GTKVTVL               107
M145-D11              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYRMSWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGRTVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKDK FEWRLLFRGI GNDAFDIWGQ 120
GTMVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKS                                       145
M146-E12              LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASGDI GNALGWYQQK PGKAPRLLIS DASTLQSGVP  60
LRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PEDFATYYCL QGYNYPRTFG QGTKLEIR              108
M146-E12              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYIMHWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGGLTSY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAREF ENAYHYYYYG MDVWGQGTTV 120
TVSSASTKGP SVFPLAPSSK S                                           141
M152-A12              LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQSI SSYLSWYQQR PGKAPNLLIY AASSLQSGVP  60
SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSISIPRTFG QGTKVEVK              108
M152-A12              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYFMGWVRQA PGKGLEWVSG IGPSGGSTTY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAREG PPYSSGWYRG LRQYHFDYWG 120
QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKS                                      146
M160-G12              LC
QDIQMTQSPS FLSASVGDRV TITCRASQGI SSYLAWYQQK PGKAPKLLIY AASTLQSGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QLNSYPLTFG GGTKVEIK              108
M160-G12              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                          142
M161-C11              LC
QSALTQPPSV SVSPGQTASI TCSGDKLGDK YVSWYQQRPG QSPVLVIYQD TKRPSGIPER  60
FSGSNSGNTA TLTISGTQAV DEADYYCQAW DSSTYVFGGG TKVTVL                106
M161-C11              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYAMKWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGGVTQY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAREE DYSSSWYSRR FDYYYGMDVW 120
GQGTTVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKS                                     147
M162-A04              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
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M162-A04              HC
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X67-B03 LC
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X67-F10 LC
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X67-H04 HC
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LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS                                         143
注意：X81-B01的可变序列与X63-G06(X81-B01的Fab形式，其是IgG)相同并且显示于表11。
实施例4：首要抗体抑制剂
基于表观抑制常数(Ki，app)、就对其他丝氨酸蛋白酶缺乏抑制而言的特异性、抑制缓激肽产生、和缺乏对血浆前激肽释放酶的结合，抗体被选作首要的血浆激肽释放酶抑制剂(表7)。血浆激肽释放酶作为无活性酶原(前激肽释放酶)以大约500nM的浓度在血浆中循环。结合前激肽释放酶的抗体可能达不到活性血浆激肽释放酶抑制，并且明显增加效力所需的体内剂量。因此，使用表面等离子体共振(SPR)分析来鉴定不结合前激肽释放酶的抗体(数据未显示)。具体说，使用抗人Fc表面和100nM血浆激肽释放酶或100nM或500nM前激肽释放酶将人IgG(X81-B01、M162-A04(R84-H05)；M160-G12(R84-D02)；和M142-H08)捕获在CM5芯片上。前激肽释放酶用抑蛋白酶肽-琼脂糖处理以去除活性血浆激肽释放酶。用于X81-B01的前激肽释放酶被缓冲液交换成SPR电泳缓冲液(HEPES缓冲盐水)的确切制品，以避免在试验的三种其他抗体中发现的折光率变化：M162-A04(R84-H05)；M160-G12(R84-D02)；和M142-H08。
表7所列抗体中，仅M142-H08以亚纳摩尔Ki，app抑制人血浆激肽释放酶。然而，当M142-H08作为IgG被产生时，发现其在重链的CDRJ被切割。因此，我们决定采用两种方法来提高亲和力：1)使用称为ROLIC(轻链快速优化)的轻链改组新形式亲和力成熟M162-A04和M160-G12(参见，例如WO 2009/102927和U.S.2009-0215119)；和2)M142-H08的序列优化以防止IgG发生裂解，同时保留M142-H08的结合和抑制剂性质。
表7.在亲和力成熟或序列优化之前PKal的最佳抗体抑制剂
Figure BPA00001394925800801
a当M142-H08作为IgG产生时，其被确定在其重链的CDR3(GGLLLWFR-ELKSNYFDY)中被切割。
实施例5：M142-H08的序列优化
表7所列抗体中，仅M142-H08以亚纳摩尔Ki，app抑制人血浆激肽释放酶。然而，当M142-H08作为IgG被产生时，发现其在重链的CDR3被切割。通过质谱发现，M142-H08在HC-CDR3序列(GGLLLWFRELKSNYFDY)的“WFR”序列中精氨酸后切割。该切割表明，来自用于表达抗体的细胞(CHO和293T人肾细胞)的蛋白酶在单特异性位点酶促切割抗体。我们突变了M142-H08的HC-CDR3序列以鉴定防止IgG切割发生同时保留M142-H08的结合和抑制剂性质的氨基酸取代。类似“剪辑”抗体的之前经验表明，单纯地关注推定的P1位置(蛋白酶亚位点1，参见表8)可能不足以鉴定保持对靶酶有效抑制同时不被宿主蛋白酶剪辑的抗体。因此，我们制作了切割位点周围区域中单点突变的小文库，以鉴定不被剪辑但依然是有效pKal抑制剂的M142-H08的变体。我们称该文库为“CDR3设计”文库。该小文库使用在P3、P2、P1或P1’位点含有随机密码子NNK的PCR引物构建。这导致其中4个位置每一个可以含有20种氨基酸的任何一个的小文库(20+20+20+20＝80成员)。使用PCR，该文库被克隆入pMid21载体的M142-H08Fab序列，其是标准的噬菌粒载体。
表8.引物序列
Figure BPA00001394925800811
通过DNA测序，我们回收可能的80个抗体中的61个(表9)。这些抗体以小规模(～20μg)作为Fab片段产生并在体外蛋白酶切割分析中测试对人pKal的抑制，使用Pro-Phe-Arg-氨基甲基香豆素作为合成肽底物。发现是人pKal抑制剂的Fab被亚克隆入我们的pBRH1f载体(用于在293T细胞中瞬时表达IgG的载体)以转变为全长的人IgG1抗体。然后五种抗体在293T细胞中表达并通过蛋白A琼脂糖色谱纯化。通过SDS-PAGE分析抗体以确定哪种抑制性变体未被宿主细胞蛋白酶切割(数据未显示)。切割抗体(559A-X67-G05、559A-X67-H01、559A-X67-G09)具有迁移在38和49kDa分子量标志之间的额外条带。该条带在559A-X67-H04和559A-X67-D03抗体中不存在，表明这些抗体是完整的。
通过稳态酶动力学测定通过SDS-PAGE显示未被切割的那些的Ki，app值(表9)。有趣的是，P2位置是唯一其中氨基酸取代产生pKal的完整抗体抑制剂的位置。在P3回复的14种不同突变(表9)中，发现仅一个突变体(W至L)是作为Fab的pKal抑制剂，但是随后显示它被剪辑为IgG。发现P1位置的16种突变(表9)中没有一个是pKal抑制剂。在P1’位置的15种不同突变中每一个是作为Fab的pKal抑制剂，但全部被剪辑为IgG。因此，只有在P2位置的突变导致在表达过程中未被剪辑的抗体抑制剂。在P2位置回复的16种不同突变(表9)中，发现8个突变体是作为Fab的pKal抑制剂，但是随后显示它被剪辑为IgG。发现在P2位置的4个突变体具有亚纳摩尔Ki，app值：X67-G04(F至A)、X67-C03(F至M)、X67-F01(F至Q)和X67-D03(F至N)。最高效价的抗体是X67-D03(Ki，app＝0.1nM)。表10所示两种抗体在作为IgG表达时未被切割，并且被发现以亚纳摩尔Ki，app抑制pKal。
使用ROLIC亲和力成熟发现的相同抗体的非种系(X63-G06)和种系化密码子优化(X81-B01)形式的轻链的DNA和氨基酸序列比对分别示于图3和4。使用ROLIC亲和力成熟发现的相同抗体的非种系(X63-G06)和种系化密码子优化(X81-B01)形式的重链的DNA和氨基酸序列比对分别示于图5和6。
表9.从“CDR3设计”文库*获得的HV-CDR3序列
Figure BPA00001394925800831
Figure BPA00001394925800841
Figure BPA00001394925800851
*所有这些抗体是M142-H08序列的单点突变。
具有设计的HC CDR3的pKal抗体的轻链(LC)和重链(HC)可变结构域的氨基酸序列显示如下。
X68-E07 LC
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X68-E12 LC
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X68-A03 LC
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X68-E03 LC
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X68-D11 LC
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X68-E01 LC
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X68-F05 LC
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X68-F05 HC
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X68-D10 LC
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X68-D10 HC
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X68-F10 LC
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X68-G01 LC
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X68-G05 LC
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X68-F12 LC
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X68-H04 LC
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X67-G04 LC
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X67-G01 LC
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X67-E04 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP  60
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X67-E04 HC
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X67-H04 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP  60
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X67-H04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY  60
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X66-E09 LC
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X66-E09 HC
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X66-B05 LC
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X66-B05 HC
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X66-D03 HC
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X69-D09 LC
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LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS                                  143
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X67-B04 HC
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X67-G09 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP  60
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X67-G09 HC
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X67-C03 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP  60
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X67-C03 HC
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X67-D03 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP  60
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X67-D03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY  60
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QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP  60
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X67-B03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWSRELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS                                  143
X67-F10 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP  60
SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR            108
X67-F10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWTRELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS                                  143
X67-H01 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP  60
SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR            108
X67-H01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWWRELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS                                  143
X67-F08 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP  60
SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR            108
X67-F08 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWYRELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS                                  143
Figure BPA00001394925800961
使用ROLIC发现的pKal的亲和力成熟的抗体抑制剂的轻链(LC)和重链(HC)可变结构域的氨基酸序列显示如下。
X59-C07 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TVTCRAGRSI STYVNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP  60
SRFSGSRSGT DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSQSTPYTFG QGTKLEVK            108
X59-C07 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
X60-D01 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRASQIV SSRYLAWYQQ RPGQAPRLLI YGAASRATGI  60
PDRFSGSGSG TDFTLTISSL QAEDFATYYC QQTYSSPFTF GQGTKMEIK           109
X60-D01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
X63-G06 LC(X81-B01 IgG的Fab形式)
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
X63-G06 HC(X81-B01 IgG的Fab形式)
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
X63-G10 LC
QDIQMTQSPD SLSASVGDRV TITCRASQSI SNYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP  60
SRFSGSGSGT DFTLTISGLQ PEDFASYYCQ QSYTSPYTFV QGTKLEIKRT         110
X63-G10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
X64-F04 LC
QDIQMTQSPA TLSLSPGERA TLSCRASQIV SSNYLAWYQQ KPGQAPRLLI YGASNRATGI  60
PDRFSGSGSG TEFTLTISSL QSEDFAIYYC QQSFNIPYTF GQGTRVDIK           109
X64-F04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
X81-B01是X63-G06 Fab的IgG形式，如上所示。
实施例6：亲和力成熟
除了优化剪辑抗体(M142-H08)的序列外，我们还对通过噬菌体展示鉴定的两个抗体(M162-A04和M160-G12)进行亲和力成熟。这些抗体都以单位数纳摩尔效价抑制人pKal，表现出对pKal特异性，并且不结合前激肽释放酶(表7)。我们首先对M162-A04和M160-G12进行称为ROLIC(轻链快速优化)的新形式的轻链改组(参见，例如WO2009/102927和U.S.2009-0215119)。通过筛选通过ROLIC发现的抗体，我们鉴定了具有亚纳摩尔效价的一种抗体(X63-G06)，它与M160-G12共享相同的重链。然后，我们基于M162-A04和X63-G06中的CDR3序列构建HV-CDR3掺杂的亲和力成熟文库(下文描述)。
通过ROLIC的亲和力成熟。我们使用ROLIC来亲和力成熟来自表7的两种不被切割的首要抗体(M162-A04和M160-G12)。该过程鉴定了以亚摩尔Ki，app抑制pKal的一种抗体(表11)。X63-G06作为Fab片段以大约0.4nM的Ki，app抑制pKal。当该抗体被转变为种系化并且为CHO细胞表达而序列优化的IgG(X81-B01)时，发现它以大约0.2nM的Ki，app抑制pKal。
实施例7：重链CDR1/2和CDR3的亲和力成熟
我们使用了两种其他亲和力成熟策略来鉴定基于两种不同的亲本抗体抑制剂先导的高度有效的抗体：M162-A04和X63-G06。一种方法是产生改组针对其他CDR1/2多样性的两种不同亲本抗体抑制剂先导(M162-A04和X63-G06)的HC的CDR1/2的文库。另一种方法是产生基于这些先导的重链CDR3掺杂文库。
根据M162-A04中由于CDR1/2和CDR3区任一个的修饰的改善而发现的82种抗体示于表12。使用10nM抗体(作为Fab片段)的抑制筛选揭示，有33种抗体抑制pKal活性超过90％。显示几种抗体是人pKal的亚纳摩尔抑制剂。
根据X63-G06中由于CDR1/2和CDR3区任一个的修饰的改善而发现的62种抗体示于表13。使用10nM抗体(作为Fab片段)的抑制筛选揭示，有24种抗体抑制pKal活性超过90％。显示几种抗体是人pKal的亚纳摩尔抑制剂。
Figure BPA00001394925801011
Figure BPA00001394925801021
从基于M162-A04的CDR1/2和CDR3掺杂亲和力成熟文库获得的pKal抗体的轻链(LC)和重链(HC)可变结构域的氨基酸序列。
M195-A02              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M195-A02              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS QYMMMWVRQA PGKGLEWVSG ISSSGGHTDY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M195-A12              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK            107
M195-A12              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYMMMWVRQA PGKGLEWVSG IYPSGGYTVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M195-B02              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M195-B02              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYLMWWVRQA PGKGLEWVSY IGPSGGPTHY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M195-B12              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M195-B12              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS KYWMYWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGQTYY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M195-C12              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M195-C12              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS MYQMFWVRQA PGKGLEWVSS ISPGGGTQYA  60
DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCAYRRT GIPRRDAFDI WGQGTMVTVS 120
SASTKGPSVF PLAPSSKS                                       138
M195-D12              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M195-D12              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYGMFWVRQA PGKGLEWVSG IGPSGGPTKY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M195-E12              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M195-E12              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS YYIMFWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGYTHY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M195-F12              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M195-F12              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYVMMWVRQA PGKGLEWVSY IVPSGGVTAY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M0195-G02              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M195-G02              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYNMMWVRQA PGKGLEWVSS IWPSGGTTDY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M196-C06              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M196-C06              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYSMHWVRQA PGKGLEWVSS IYPSRGMTWY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M196-D02              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M196-D02              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS VYSMHWVRQA PGKGLEWVSV IGPSGGITLY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M196-D12              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M196-D12              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYSMRWVRQA PGKGLEWVSV IYPSGGQTYY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M196-G12              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M196-G12              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYSMDWVRQA PGKGLEWVSR IYSSGGGTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M196-H03              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M196-H03              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYVMWWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGDTHYA  60
DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCAYRRT GIPRRDAFDI WGQGTMVTVS 120
SASTKGPSVF PLAPSSKS                                       138
M197-A01              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M197-A01              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYDMIWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGNTSY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M197-A08              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M197-A08              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYSMQWVRQA PGKGLEWVSS IGSSGGKTLY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M197-A09              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M197-A09              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS VYNMHWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGMTTY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M197-C12              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M197-C12              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYDMLWVRQA PGKGLEWVSY IVSSGGLTKY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M197-E12              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M197-E12              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYTMRWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGKTQY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M197-F01              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M197-F01              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYHMYWVRQA PGKGLEWVSS IGPSGGPTGY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M197-F03              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M197-F03              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYSMFWVRQA PGKGLEWVSS IGPSGGVTHY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M197-G10              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M197-G10              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS VYAMRWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGKTWY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M197-G11              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M197-G11              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMVWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGITTY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M197-H10              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M197-H10              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYNMHWVRQA PGKGLEWVSS IVPSGGKTNY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M197-H11              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M197-H11              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYNMIWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGWTTY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M198-A01              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M198-A01              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYTMIWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGGMTPY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M198-A02              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M198-A02              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYSMIWVRQA PGKGLEWVSS IWSSGGATEY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M198-A06              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M198-A06              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYSMHWVRQA PGKGLEWVSS IYSSGGPTKY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M198-A07              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M198-A07              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYQMHWVRQA PGKGLEWVSW ISPSGGITGY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M198-A08              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M198-A08              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYMMQWVRQA PGKGLEWVSR ISPSGGTTYA  60
DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCAYRRT GIPRRDAFDI WGQGTMVTVS 120
SASTKGPSVF PLAPSSKS                                       138
M198-A09              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M198-A09              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYFMSWVRQA PGKGLEWVSS IRSSGGPTWY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M198-B09              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M198-B09              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS VYSMTWVRQA PGKGLEWVSS IGSSGGSTTY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M198-B12              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M198-B12              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS KYSMAWVRQA PGKGLEWVSG IYPSGGRTLY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M198-C03              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M198-C03              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYSMSWVRQA PGKGLEWVSG ISPSGGETSY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M198-C05              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M198-C05              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYKMYWVRQA PGKGLEWVSV IGPSGGATFY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M198-C06              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M198-C06              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS QYFMHWVRQA PGKGLEWVSY IYPSGGMTEY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M198-C09              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M198-C09              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYTMYWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGGWTYY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M198-C10              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M198-C10              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYMGMNWVRQ APGKGLEWVS SIVPSGGWTQ  60
YADSVKGRFT ISRDNSKNTL YLQMNSLRAE DTAVYYCAYR RTGIPRRDAF DIWGQGTMVT 120
VSSASTKGPS VFPLAPSSKS                                     140
M198-D12              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M198-D12              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS LYVMYWVRQA PGKGLEWVSY IVPSGGPTAY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M198-E02              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M198-E02              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYSMYWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGNTKY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M198-E09              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M198-E09              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYDMNWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGRTRY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M198-E11              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M198-E11              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYSMYWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGLTWY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M198-F04              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M198-F04              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYDMWWVRQA PGKGLEWVSS IRPSGGITKY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M198-F08              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M198-F08              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS VYSMWWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGGMTEY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M198-F09              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M198-F09              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS VYNMHWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGMTYY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M198-F12              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M198-F12              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYTMMWVRQA PGKGLEWVSS IWSSGGQTKY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M198-G03              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M198-G03              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS QYTMVWVRQA PGKGLEWVSW IYSSRANYAD  60
SVKGRFTISR DNSKNTLYLQ MNSLRAEDTA VYYCAYRRTG IPRRDAFDIW GQGTMVTVSS 120
ASTKGPSVFP LAPSSKS                                        137
M198-G07              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M198-G07              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYDMTWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGQTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M198-H02              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M198-H02              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYNMYWVRQA PGKGLEWVSW IVPGGVTKYA  60
DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCAYRRT GIPRRDAFDI WGQGTMVTVS 120
SASTKGPSVF PLAPSSKS                                       138
M198-H08              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M198-H08              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYDMYWVRQA PGKGLEWVSS IGPSGGPTAY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M198-H09              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M198-H09              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYLMIWVRQA PGKGLEWVSY IGPSGGPTEY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M199-A08              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M199-A08              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR IGVPRRDEFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M199-A11              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M199-A11              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR RGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M199-B01              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M199-B01              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAFRR TGIPRRDAFD NWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M200-A10              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M200-A10              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGVPRRDSFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M200-B01              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M200-B01              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD SWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M200-D03              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK            107
M200-D03              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAWRR IGVPRRDSFD MWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M200-E11              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M200-E11              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGVPRRDAFD NWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M200-F01              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M200-F01              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR MGIPRRNAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M200-H07              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M200-H07              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGVPRRNAFD NWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M201-A06              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M201-A06              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDVFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M201-A07              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M201-A07              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGVPRRDEFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M201-F11              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M201-F11              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR SGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M201-H06              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M201-H06              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGVPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M201-H08              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M201-H08              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGVPRRDALD NWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M202-A01              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK            107
M202-A01              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR IGVPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M202-A04              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M202-A04              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR KGIPRRDDFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M202-A08              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK            107
M202-A08              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRWDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M202-A10              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M202-A10              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAFRR TGIPRRDSFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M202-A12              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M202-A12              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYQR TGVPRRDSFN IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M202-B03              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M202-B03              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGVPRRDDFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M202-B04              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M202-B04              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR SGVPRRDDFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M202-C01              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M202-C01              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGVPRWDDFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M202-C02              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M202-C02              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR PGVPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M202-C09              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M202-C09              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR IGVPRRDDFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M202-D09              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M202-D09              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR IGVPRRDSFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M202-E03              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK            107
M202-E03              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFE IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M202-E06              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M202-E06              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR RGVPRRDDFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M202-F06              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M202-F06              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGVPRWDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M202-G03              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK            107
M202-G03              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAFRR TGVPRRDSFE IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M202-H03              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M202-H03              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAFRR TGVPRWDDFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
M202-H05              LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQSI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP  60
SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK             107
M202-H05              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAFRR TGVPRRDVFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS                                      139
Figure BPA00001394925801171
Figure BPA00001394925801181
Figure BPA00001394925801191
从基于X63-G06的CDR1/2和CDR3掺杂亲和力成熟文库获得的pKal抗体的轻链(LC)和重链(HC)可变结构域的氨基酸序列。
M203-A01              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M203-A01              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYLMAWVRQA PGKGLEWVSW IVPSGGYTEY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M203-A03              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M203-A03              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS VYMMIWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGGQTTY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M204-A02              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M204-A02              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYMMTWVRQA PGKGLqWVSY ISPSGGLTSY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M204-E12              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M204-E12              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYMMqWVRQA PGKGLEWVSY IGPSGGKTDY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M205-A02              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M205-A02              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYLMAWVRQA PGKGLEWVSG IVSSGGRTLY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M205-A12              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M205-A12              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS QYDMIWVRQA PGKGLEWVSY ISSSGGFTRY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M205-B04              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M205-B04              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYDMIWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGGTTKY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M205-C11              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M205-C11              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS QYMMMWVRQA PGKGLEWVSR ISPSGGSTLY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M205-D04              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M205-D04              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYKMqWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGGPTNY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M205-E11              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M205-E11              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYTMGWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGGKTDY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M205-F03              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M205-F03              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SqQMVWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGNTYY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M205-H01              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M205-H01              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYTMQWVRQA PGKGLqWVSY ISPSGGYTGY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M205-H08              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M205-H08              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYMMMWVRQA PGKGLEWVSS IVPSGGHTqY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M206-A06              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M206-A06              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYMMGWVRQA PGKGLqWVSS ISPSGGLTKY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M206-B10              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M206-B10              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS qYLMAWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGWTKY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M206-C03              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M206-C03              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS qYMMVWVRQA PGKGLEWVSS IYSSGGNTPY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M206-E02              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M206-E02              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS EYMMMWVRQA PGKGLEWVSV ISPSGGQTHY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M206-F01              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M206-F01              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS GYMMVWVRQA PGKGLEWVSR ISPSGGPTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M206-F09              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M206-F09              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS VYMMSWVRQA PGKGLEWVSS IVPSGGSTTY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M206-H01              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M206-H01              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS EYMMVWVRQA PGKGLEWVSR ISPSGGTTEY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M206-H04              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M206-H04              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYMMVWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGGYTIq  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M206-H05              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M206-H05              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS GYKMqWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGGITMY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M206-H08              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M206-H08              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYMMAWVRQA PGKGLEWVSS IVPSGGHTHY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M207-A01              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M207-A01              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGISARSRTS CFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M207-A02              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M207-A02              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TALYYCARVA RGIAARSRTI NLDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M207-A04              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M207-A04              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTR SFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M207-C05              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
R0121-D02＝M0207-C05               HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVG RGIAARSRTS YFDKWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M208-A10              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M208-A10              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS qFDHWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M208-B01              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M208-B01              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS FFDqWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M208-C06              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M208-C06              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS FIDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M208-D12              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M208-D12              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
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VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M208-E10              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M208-E10              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA QGISARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M208-F04              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M208-F04              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS FFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M208-F10              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M208-F10              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDqWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M208-G02              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M208-G02              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIADRSRTS YSDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M208-G03              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M208-G03              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YLDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M208-H02              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M208-H02              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIASRSRTR YCDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M209-B01              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M209-B01              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIVARSRTS NFDqWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M209-B09              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M209-B09              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA QGIVARSRTS YLHqWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M209-B11              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M209-B11              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTR YIDqWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M209-C02              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M209-C02              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAYRRRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M209-C11              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M209-C11              HC
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ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAMVG QGIRGRSRTS YFAqWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M209-C12              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M209-C12              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVG RGIAARSRTS qLDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M0209-D02              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M209-D02              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGITARSRTS YFDDWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M209-D03              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M209-D03              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVG RGIAARSRTS FFDqWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M209-D12              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M209-D12              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCATVA RGIAARSRTS YFDqWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M209-E02              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M209-E02              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTI LLDqWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M209-E03              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M209-E03              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARqA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M209-F04              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M209-F04              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YLDqWSQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M209-G01              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M209-G01              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA qGISGRSRLS YVDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M209-G07              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M209-G07              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDTWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M209-H03              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M209-H03              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA QGIAARSRTT qFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M209-H07              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M209-H07              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARqRTS YYDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M209-H09              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI  60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M209-H09              HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY  60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTV YFDHWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS                                   142
M210-A06              LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI   60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK           109
M210-A06              HC
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实施例8：选择的血浆激肽释放酶的抗体抑制剂的评估
选择的优化抗体(X81-B01和X67-D03)的评价示于表14。任一抗体都不具有任何推定的脱酰胺、异构化或氧化位点。
表14
Figure BPA00001394925801331
*未进行；两种抗体的胃肠外形式显示在血清中稳定
实施例9：表位作图
pKal被选择的抗pKal抗体结合的区域使用几种方法来考察。首先，使用竞争分析来确定抗体是否与已知的活性定点抑制剂竞争结合pKal。第二，根据它们是pKal抑制剂还是仅仅pKal结合剂来对抗体分组。第三，使用合成肽和基于pKal的序列和三维结构的肽结构来考察表位。这些肽结构称为“CLIPS”(支架上化学连接肽)，通过对称为Pepscan的服务公司付费来进行试验。
第四，测试抗体抑制来自除人以外其他物种的pKal的能力，其中pKal的氨基酸序列已经被确定以鉴定可能解释抑制差异的氨基酸。
竞争分析
使用BIACORE
Figure BPA00001394925801332
SPR分析，测试感兴趣的抗体与已知的pKal活性位点抑制剂的竞争。EPI-KAL2是pKal的有效的(Ki，app＝0.1nM)活性位点抑制剂和基于组织因子途径抑制剂的第一结构域的Kunitz结构域抑制剂(Markland(1996)Iterative optimization of high-affinity protease inhibitorsusing phage display.2.Plasma kallikrein and thrombin.Biochemistry.35(24)：8058-67)。Kunitz结构域是丝氨酸蛋白酶例如pKal的已知活性位点抑制剂。
EPI-KAL2的序列是：
EAMHSFCAFKAFFNIFTRQC
Figure BPA00001394925801342
NRFESLEECKKMCTRD
(斜体氨基酸是不同于TFPI的那些)
如图7A-7B所示，抗体X81-B01和X67-D03在EPI-KAL2存在下竞争结合pKal。这一结果表明，这些抗体在活性位点附近结合，或者pKal-EPI-KAL2复合体构象的异构变化预防抗体结合。
抗体结合剂与抑制剂
抑制pKal活性的抗体在活性位点附近结合并排除底物相互作用(竞争性抑制剂)，或者远离活性位点结合并诱导活性位点结构的异构变化(非竞争性抑制剂)。如表15所示，对于所列抗体，证明了它们是否作为抑制剂与小鼠pKal交叉反应以及它们是否结合前激肽释放酶。
表15.选择的抗pKal抗体的结合性质
Figure BPA00001394925801343
C1-C7：CLIPS表位作图鉴定的pKal中的肽(参见图8和9A-9C)。C1对应于催化结构域的位置55-67，C2对应于位置81-94，C3对应于位置101-108，C4对应于位置137-151，C5对应于位置162-178，C6对应于位置186-197，并且C7对应于位置214-217。
使用CLIPS的表位作图
如下在芯片方法CLIP方法部分描述，Pepscan测试了表15所列抗pKal抗体加上一个阴性对照(A2)和结合但不抑制pKal的三种抗体对5000种不同的合成CLIPS(支架上化学连接的肽)的结合。该分析导致鉴定pKal中可能是受试抗体每一个的抗体表位的一部分的肽区域(图8)。
CLIPS方法
线性和CLIPS肽基于靶蛋白的氨基酸序列使用标准Fmoc化学合成，并使用含有清除剂的三氟酸脱保护。约束的肽在化学支架上合成以重建构象性表位，使用支架上化学连接肽(CLIPS)技术(Timmerman等(2007)。例如，单环肽被合成为含有胱氨酸，其通过用α，α’-二溴二甲苯处理来环化，环大小通过在可变间距引入半胱氨酸残基来改变。如果存在除了新引入半胱氨酸以外的其他半胱氨酸，它们被丙氨酸替代。肽中多个半胱氨酸的侧链通过在***形式的聚乙烯PEPSCAN卡(455肽形式/卡)上与0.5mMCLIPS模板溶液例如1，3-双(溴甲基)苯的碳酸氢铵(20mM，pH 7.9)/乙腈(1∶1(v/v))溶液反应而偶联至CLIPS模板。卡在溶液中温和摇晃30至60分钟，同时完全浸入溶液中。最后，卡用过量水充分洗涤并在70℃下含有1％SDS/0.1％β-巯基乙醇的PBS(pH 7.2)溶液的破坏缓冲液中声处理30分钟，随后在水中声处理另外45分钟。抗体与每种肽的结合在基于PEPSCAN的ELISA中测试。含有共价连接肽的455孔***形式聚乙烯卡与第一抗体溶液孵育过夜，第一抗体溶液例如1微克/mL稀释于称为SQ的封闭溶液(4％马血清、5％卵白蛋白(w/v)，于PBS/1％吐温中或稀释于PBS，例如20％SQ)。洗涤后，肽与1/1000稀释的兔抗人抗体过氧化物酶或山羊抗人FAB过氧化物酶在25℃孵育1小时。洗涤后，添加过氧化物酶底物2，2’-连氮基-二-3-乙基苯并噻唑啉硫酸酯(ABTS)和2微升3％水。1小时后，测量颜色显示。颜色显示用电荷偶联装置(CCD)-照相机和图像处理***定量(首次描述于Slootstra等，1996)。
数据计算
原始数据：光密度(任意OD单位)
原始数据是通过CCD照相机获得的光学值。这些值主要在0至3000，类似于标准96孔板elisa读书器的1至3的对数量表。首先，CCD照相机在过氧化物酶显色前拍照，然后再过氧化物酶显色后再次拍照。这两幅照片彼此减去，得到称为原始数据的数据。将它拷贝到Peplabtm数据库。然后，这些值被拷贝至excel，并且该文件被标记为原始数据文件。允许一个后续操作。有时，孔含有气泡，导致假阳性值，卡经人工检查，气泡引起的任何值被记录为0。
通常，分析重复进行两次(仅应客户请求)。两次重复试验通常非常相似。此外，数千肽的数据集含有类似的许多肽，因此，结果从不基于一个肽的识别而是基于类似肽的家族。如果一个或几个肽不结合或表现出低结合，在重复实验中，不同的表位作图不是正常属性。
Timmerman等(2007).Functional reconstruction and synthetic mimicry of aconformational epitope using CLIPSTM technology.J.Mol.Recognit.20：283-99
Slootstra等(1996).Structural aspects of antibody-antigen interaction revealedthrough small random peptide libraries，Molecular Diversity，1，87-96.
实施例10：来自不同物种的pKal序列的分析
所有可用的pKal序列获自公开的数据库并使用ClustalW比对，并且区域基于溶剂可及性、与活性位点Kunitz抑制剂的接触和CLIPS分析鉴定的那些肽凸显(图9A-9C)。来自这些物种每一个的柠檬酸化血浆被获得并使用商业可获得的前激肽释放酶活化剂(来自Enzyme Research Laboratories)根据生产商说明来活化。然后在X81-B01存在或不存在下在每种样品中测量激肽释放酶活性。
发现X81-B01抑制来自所有物种的pKal，除了猪pKal。因为CLIPS分析鉴定了X81-B01结合的四种pKal肽：C2(位置81-94)、C3(位置101-108)、C5(位置162-178)和C6(位置186-197)，对应于这些肽的猪pKal序列中的差异被检查以鉴定解释缺乏X81-B01对猪pKal抑制的潜在氨基酸改变。肽C2和C3序列接近并且在不同物种中序列高度相似。然而，在位置479存在差异。除了猪、蛙和狗之外的所有物种在位置479具有丝氨酸。蛙和狗pKal序列在位置479分别具有丙氨酸和苏氨酸；两者被认为是丝氨酸的保守取代。相反，猪pKal序列在位置479具有亮氨酸，其是丝氨酸的相当不保守的取代。猪pKal中肽C5高度类似于来自其他物种的序列。然而，在位置563，仅在猪pKal中存在组氨酸(图9C中粗体)。除了蛙之外所有其他物种的该位置是酪氨酸。在被X81-B01抑制的蛙pKal中，该位置是苏氨酸。猪pKal中的肽C6再次高度类似于其他序列。然而，仅在猪pKal序列中位置585是谷氨酸(图9C中粗体)。在所有其他物种中，该位置是天冬氨酸。该分析可以表明与X81-B01相互作用的pKal中的潜在关键残基。
参考文献
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等同替代
已经描述了本发明的许多实施方案。然而，要理解，可以做出各种改变而不背离本发明的精神和范围。因此，其他实施方案在下述权利要求书的范围内。

Claims (27)

1.一种用于治疗或预防粘膜炎的方法，该方法包括：
给患有粘膜炎或者有风险发展粘膜炎的受试者施用治疗有效量的分离的激肽释放酶抑制剂。
2.权利要求1所述的方法，其中所述激肽释放酶抑制剂是血浆激肽释放酶抑制剂。
3.权利要求2所述的方法，其中所述血浆激肽释放酶抑制剂包括含有下述氨基酸序列的多肽：Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Cys Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9Xaa10 Xaa11 Gly Xaa13 Cys Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 Xaa29 Cys Xaa31 Xaa32 PheXaa34 Xaa35 Gly Gly Cys Xaa39 Xaa40 Xaa41 Xaa42 Xaa43 Xaa44 Xaa45Xaa46 Xaa47 Xaa48 Xaa49 Xaa50 Cys Xaa52 Xaa53 Xaa54 Cys Xaa56 Xaa57Xaa58(SEQ ID NO：1)，
其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa56、Xaa57或Xaa58各自独立为任何氨基酸或者不存在；
Xaa10是选自由以下组成的组的氨基酸：Asp和Glu；
Xaa11是选自由以下组成的组的氨基酸：Asp、Gly、Ser、Val、Asn、Ile、Ala和Thr；
Xaa13是选自由以下组成的组的氨基酸：Arg、His、Pro、Asn、Ser、Thr、Ala、Gly、Lys和Gln；
Xaa15是选自由以下组成的组的氨基酸：Arg、Lys、Ala、Ser、Gly、Met、Asn和Gln；
Xaa16是选自由以下组成的组的氨基酸：Ala、Gly、Ser、Asp和Asn；
Xaa17是选自由以下组成的组的氨基酸：Ala、Asn、Ser、Ile、Gly、Val、Gln和Thr；
Xaa18是选自由以下组成的组的氨基酸：His、Leu、Gln和Ala；
Xaa19是选自由以下组成的组的氨基酸：Pro、Gln、Leu、Asn和Ile；
Xaa21是选自由以下组成的组的氨基酸：Trp、Phe、Tyr、His和Ile；
Xaa22是选自由以下组成的组的氨基酸：Tyr和Phe；
Xaa23是选自由以下组成的组的氨基酸：Tyr和Phe；
Xaa31是选自由以下组成的组的氨基酸：Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、Ala、Val、Leu、Ile和Thr；
Xaa32是选自由以下组成的组的氨基酸：Glu、Gln、Asp Asn、Pro、Thr、Leu、Ser、Ala、Gly和Val；
Xaa34是选自由以下组成的组的氨基酸：Thr、Ile、Ser、Val、Ala、Asn、Gly和Leu；
Xaa35是选自由以下组成的组的氨基酸：Tyr、Trp和Phe；
Xaa39是选自由以下组成的组的氨基酸：Glu、Gly、Ala、Ser和Asp；
Xaa40是选自由以下组成的组的氨基酸：Gly和Ala；
Xaa43是选自由以下组成的组的氨基酸：Asn和Gly；
Xaa45是选自由以下组成的组的氨基酸：Phe和Tyr；并且其中所述多肽抑制激肽释放酶。
4.权利要求3所述的方法，其中Xaa10是Asp。
5.权利要求3所述的方法，其中Xaa11是Asp。
6.权利要求3所述的方法，其中Xaa13是Pro，Xaa15是Arg，Xaa16是Ala，Xaa17是Ala，Xaa18是His，并且Xaa19是Pro。
7.权利要求3所述的方法，其中Xaa21是Trp。
8.权利要求3所述的方法，其中Xaa31是Glu。
9.权利要求3所述的方法，其中Xaa32是Glu。
10.权利要求3所述的方法，其中Xaa34是Ile。
11.权利要求3所述的方法，其中Xaa35是Tyr。
12.权利要求3所述的方法，其中Xaa39是Glu。
13.权利要求3所述的方法，其中所述多肽包括：Met His Ser Phe CysAla Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe PheAsn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly AsnGln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp(SEQID NO：2的氨基酸3-60)。
14.权利要求13所述的方法，其中所述多肽还包括在氨基末端Mct残基之前的Glu-Ala序列。
15.权利要求3所述的方法，其中所述多肽由以下组成：Met His SerPhe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg TrpPhe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys GluGly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr ArgAsp(SEQ ID NO：2的氨基酸3-60)。
16.权利要求3所述的方法，其中所述多肽包括：Glu Ala Met His SerPhe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg TrpPhe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys GluGly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr ArgAsp(SEQ ID NO：2)。
17.权利要求3所述的方法，其中所述多肽由以下组成：Glu Ala MetHis Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His ProArg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly CysGlu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys ThrArg Asp(SEQ ID NO：2)。
18.权利要求2所述的方法，其中所述血浆激肽释放酶抑制剂包括血浆激肽释放酶结合蛋白，所述血浆激肽释放酶结合蛋白包括重链免疫球蛋白可变结构域序列和轻链免疫球蛋白可变结构域序列，其中：
所述重链免疫球蛋白可变结构域序列包括来自本文描述的蛋白的重链可变结构域的一个、两个或三个CDR区，并且
所述轻链免疫球蛋白可变结构域序列包括来自本文描述的蛋白的轻链可变结构域的一个、两个或三个CDR区，
其中所述蛋白结合血浆激肽释放酶。
19.权利要求18所述的方法，其中所述重链免疫球蛋白可变结构域序列包括来自M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X81-B01、X67-D03或X67-G04的重链可变结构域的一个、两个或三个CDR区，并且
所述轻链免疫球蛋白可变结构域序列包括来自M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X81-B01、X67-D03或X67-G04的轻链可变结构域的一个、两个或三个CDR区(分别地)。
20.权利要求18所述的方法，其中来自所述重链可变结构域的一个、两个或三个CDR区来自X81-B01，并且来自轻链可变结构域的一个、两个或三个CDR区来自X81-B01。
21.权利要求18所述的方法，其中来自所述重链可变结构域的一个、两个或三个CDR区来自X67-D03，并且来自轻链可变结构域的一个、两个或三个CDR区来自X67-D03。
22.权利要求1所述的方法，其中所述粘膜炎选自由口腔粘膜炎、食管粘膜炎、咽粘膜炎和胃肠粘膜炎组成的组。
23.权利要求22所述的方法，其中所述粘膜炎是口腔粘膜炎。
24.权利要求1所述的方法，还包括施用帕利夫明。
25.一种组合物，包括治疗有效量的权利要求1所述的分离的激肽释放酶抑制剂和治疗有效量的帕利夫明。
26.一种试剂盒，其中所述试剂盒包括：
包含分离的激肽释放酶抑制剂的容器；和
用于治疗粘膜炎的所述激肽释放酶抑制剂的使用说明书。
27.权利要求26所述的试剂盒，还包括包含帕利夫明的容器。
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