CN102292440B

CN102292440B - 一种用于遗传转化藻类的新型启动子

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Publication number: CN102292440B
Application number: CN201080005172.8A
Authority: CN
Inventors: 足立真佐雄; 长崎庆三; 外丸裕司
Original assignee: Kochi University NUC
Current assignee: Kochi University NUC
Priority date: 2009-01-23
Filing date: 2010-01-22
Publication date: 2014-02-12
Anticipated expiration: 2030-01-22
Also published as: US8765929B2; EP2383337A4; JP5733609B2; CN102292440A; EP2383337A9; US20110300633A1; JPWO2010084969A1; WO2010084969A1; EP2383337A1; EP2383337B1

Abstract

本发明的目的在于提供一种可适用于广泛种类的藻类的、且高效的遗传转化技术。本发明涉及的启动子以具有构成非编码区域的多核苷酸等为特征，所述非编码区域位于编码与CdebDNA病毒的复制相关的蛋白质的基因的上游。

Description

一种用于遗传转化藻类的新型启动子

技术领域

本发明涉及用于遗传转化藻类的新型的启动子、含有该启动子的载体、以及使用该载体的藻类的遗传转化方法。

背景技术

利用作为恒久的且稳定的能源的太阳光在能源对策考虑上是非常重要的。植物类的光合成是能够最有效地将太阳光能量转化为化学能量的良好的***，不但吸收同化环境中的二氧化碳或过剩的营养盐，还释放出氧气。因此，利用植物的技术的开发作为能够解决能源问题的技术，备受期待。

在植物类中，藻类由于生存在大量存在的海水和淡水中，因此，藻类的量也是相当大的，另外，藻类具有显著光合成能力。并且，在藻类中还有产生不饱和脂肪酸或抗肿瘤化合物等有用化合物的种类。另外，硅藻类中有产生有用的无机物的藻，因此，利用硅藻类的被称为生物矿化作用的技术备受关注。因此，藻类可以称得上是作为有用资源的重要的生物。

通常，在产业上利用生物的情况下，可使用导入有用的基因的遗传转化技术。为了阐明基因的功能，该遗传转化技术还可用于敲除特定基因并抑制其功能的用途。

到目前为止，以硅藻和绿藻为中心进行着藻类的遗传转化。但是，相关的方法是将内在性的启动子分离，使基因与其结合并导入藻类中。其中，在内在性的启动子的分离上花费大量的精力和实践，因此，并非有效的方法。另外，还存在藻类、尤其是海产藻类的遗传转化效率本身极其低的问题。

另外，在藻类以外的植物或动物的遗传转化中，广泛应用的并非内在性的启动子，而是来自病毒的启动子。例如，从十字花科植物感染的花椰菜花叶病毒(CaMV)分离的CaMV35S启动子不仅限于十字花科植物，还可以用于广泛植物的遗传转化。另外，动物细胞的遗传转化广泛利用从细胞巨化病毒(CMV)分离的CMV启动子、从猿猴空泡病毒40(SV40)分离的SV40启动子。

与此相对，在藻类的遗传转化中，基本上还没有使用外来性的病毒启动子的例子。

例如，在非专利文献1中，记载了使用CaMV35S启动子进行硅藻Cycrotela cryptica遗传转化的实验例，但是没有得到遗传转化体。

另一方面，在非专利文献2中，记载了：使用CMV启动子、CaMV35S启动子以及劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子向硅藻三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)导入GUS基因后，所有的情况下，GUS(β-葡萄糖苷酸酶)均得到表达。

另外，在非专利文献3中，记载了使用CaMV35S启动子膝沟藻(鞭毛藻)Amphidinium和Symbiodinium中导入GUS基因后，GUS均得到表达。但是，根据其它文献(非专利文献4)，无论多么拼命努力，其它的组均没有出现膝沟藻的遗传转化成功的报告。

在先技术文献

非专利文献

非专利文献1：Dunahay，T.G.等，Journal of Phycology(藻类学杂志)，vol.31，pp.1004-1012(1995)

非专利文献2：Sakaue，K等，Physiologia plantarum(フイジオロジア·プランタラム)vol.133，pp.59-67(2008)

非专利文献3：Lohuis，M.R.等，The Plant Journal(植物杂志)，vol.13，pp.427-435(1998)

非专利文献4：Walker，T.L.等，Journal of Phycology(藻类学杂志)，vol.41，pp.1077-1093(2005)

发明内容

如上所述，虽然数量极少，但是存在使用来自花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子等的病毒启动子来遗传转化藻类的报告例。

但是，也有得不到遗传转化体或者无再现性的报告。另外，根据本发明的发明人的见解，广泛应用于其它的植物类的遗传转化的CaMV35S启动子对藻类的适用范围极其窄。从藻类的存在量极大，另外，存在藏有各种有用性的种类出发，作为用于遗传转化的启动子，期望能够适用于广泛种类的藻类的启动子。进一步，从通常藻类、尤其是海产藻类的遗传转化效率非常低考虑，亟待高效的遗传转化技术的开发。

因此，本发明所要解决的课题是提供能够适用于广泛种类的藻类、且高效的遗传转化技术。

本发明的发明人为了解决上述课题，进行了深入的研究。其结果发现位于被认为是编码柔弱角毛藻(Chaetoceros debilis)DNA病毒(CdebBNAV)的复制蛋白质的基因的上游的启动子，能够有效地遗传转化超出目的多种藻类，从而完成了本发明。

本发明涉及的新型启动子，其特征在于具有下述(1)-(3)中任意一种碱基序列。

(1)构成非编码区域的多核苷酸，所述非编码区域位于编码与CdebDNA病毒的复制相关的蛋白质的基因的上游；

(2)缺失、置换或添加了上述多聚核苷酸(1)的一个或多个核苷酸的多聚核苷酸，并且使编码任意蛋白质的基因的表达在藻类细胞内活化的多聚核苷酸；

(3)在严格的条件下与上述多聚核苷酸(1)杂交，并且使编码任意蛋白质的基因的表达在藻类细胞内活化的多聚核苷酸。

本发明涉及的载体的特征在于，该载体含有上述新型的启动子，以及编码任意蛋白质的基因。

另外，本发明涉及的藻类的遗传转化方法，其特征在于，该遗传转化方法包括制备上述载体的工序，以及将上述载体导入藻类细胞的工序。

附图说明

图1为表示含有本发明涉及的启动子的质粒载体的结构的一例子的图；

图2为表示含有本发明涉及的启动子的质粒载体的结构的一例子的图；

图3为表示确认通过本发明的方法遗传转化的藻类细胞等中所包含的导入基因的有无的实验的结果的电泳照片；

图4为表示确认通过本发明的方法遗传转化的藻类细胞等中所包含的导入基因的有无的实验的结果的电泳照片；

图5是表示用于确定本发明的启动子的核心元件的实验结果的图；由该结果可知在编码与CdebDNA病毒的复制有关的蛋白质的基因的上游区域的-72到-33之间的序列中含有核心元件；

图6为表示含有本发明的启动子的质粒载体的结构的一个例子的图；

图7为表示海产藻类筒柱藻(C.fusiformis)的遗传转化实验的结果的照片；(1)表示使用了本发明的启动子的情况的结果，(2)表示未使用本发明的启动子的情况的结果。

具体实施方式

本发明涉及的第一启动子具有(1)构成位于编码与CdebDNA病毒的复制有关的蛋白质的基因的上游的非编码区域的多聚核苷酸。

CdebDNA病毒是感染硅藻柔弱角毛藻的病毒。迄今为止，对藻类、尤其是海产藻类显示感染性的病毒的报告例很少，近年来，本发明的发明人成功地从赤潮异弯藻(ラフイド)、膝沟藻、硅藻等的藻类中分离了各种病毒。本发明涉及的CdebDNA病毒便是本发明的发明人分离的海产藻类感染性病毒之一。

编码与复制相关的蛋白质的基因，只要是与CdebDNA病毒的复制相关的基因并且积极地表达的基因，就没有特别的限定。

在本发明中，编码区域是指经过mRNA翻译成蛋白质的部分，非编码区域是指编码区域以外的部分。即，非编码区域是指位于ATG等的起始密码子的上游的部分，除了未被mRNA转录的部分，还包括被mRNA转录但未翻译成蛋白质的部分。

通常，启动子具有转录的关键的核心元件和促进或抑制转录的调控元件，在导入基因时，特别重要的是利用核心元件。作为核心元件已知的有TATA框、启动子元件(Inr)、下游(ダウンストリ一ト)元件等，作为调控元件已知的有CAAT框、GATA框等。本发明的发明人调查了编码与CdebDNA病毒的复制相关的蛋白质的基因的上游区域的碱基序列，发现了作为CAAT框I的5’-CAAT-3’、作为GATA框的5’-WGATAR-3’(式中，W表示A或T，R表示A或G)、以及作为启动子元件(Inr)的5’-YYA₊₁N(A/T)YY-3’(式中，Y表示C或T)，但是没有发现常见于真核生物等的启动子的TATA框。因此，上述基因的上游序列中发现的Inr在羽纹目硅藻(羽状目硅藻)和辐射目硅藻(中心目硅藻)两者中作为核心元件发挥作用，认为可以遗传转化，但是另一方面，使用含有与上述Inr序列酷似的Inr的羽纹目硅藻内在性启动子(Cf fcpA-1A)时，不能遗传转化辐射硅藻目硅藻。结论认为：用本发明涉及的多聚核苷酸(1)能够较高地发挥遗传转化，至少不是TATA框或启动子元件等的原因，极有可能是完全未知的序列作为核心元件在发挥作用。

作为上述多聚核苷酸(1)可以举出具有序列号1和序列号5的碱基序列的多聚核苷酸。并且，序列号5的碱基序列相当于编码与CdebDNA病毒的复制相关的蛋白质的基因的上游序列中的从Inr上游的大约30个碱基开始的大约40个碱基，在该序列中，Inr根本不能认为是CAAT框或GATA框。

本发明涉及的第二启动子为(2)缺失、置换或添加了上述多聚核苷酸(1)的一个或多个核苷酸的多聚核苷酸，并且使编码任意蛋白质的基因的表达在藻类细胞内活化的多聚核苷酸。

在上述多聚核苷酸(2)中，缺失、置换或添加的核苷酸的数目优选为1以上200以下，更优选为1以上100以下，进一步优选为1以上70以下，进一步优选为1以上30以下，进一步优选为1以上20以下，进一步优选为1以上10以下，特别优选为1以上5以下。

本发明涉及的第三启动子为(3)在严格的条件下与上述多聚核苷酸(1)杂交，并且使编码任意蛋白质的基因的表达在藻类细胞内活化的多聚核苷酸。

在上述多聚核苷酸(3)中，所谓严格的条件是指在含有0.1％SDS的2×SSC中、在65℃下杂交后，用0.1×SSC-0.1SDS洗涤2次。

另外，在上述多聚核苷酸(2)和(3)中，所谓使编码任意蛋白质的基因的表达在藻类细胞内活化的多聚核苷酸是指通过导入到藻类细胞内，可以使结合于其下游的编码任意蛋白质的基因表达的多聚核苷酸。

在上述多聚核苷酸(2)和(3)中，与上述多聚核苷酸(1)的同源性优选为50％以上，更优选为70％以上，进一步优选为80％以上，进一步优选为90％以上，进一步优选为95％以上，进一步优选为98％以上，特别优选为99％以上。

上述多聚核苷酸(1)-(3)可以从编码与CdebDNA病毒或其变异体的复制相关的蛋白质的基因的上游分离。但是，也可以化学合成。这些多聚核苷酸(1)-(3)可以从模板通过PCR扩增使用。

本发明的载体含有上述启动子和编码任意的蛋白质的基因。

载体的种类只要是能够导入藻类细胞的载体，就没有特别的限定，可以使用质粒载体和病毒载体中的任意一种。但是，由于很难说感染藻类、尤其是海产藻类的病毒的研究已经得到充分发展，因此优选使用质粒载体。

在此，“任意的蛋白质”没有特别的限定，只要是期望生产的有用的蛋白质即可。

本发明涉及的载体还可以含有通常的载体所含有的其它的序列。作为相关的序列，例如可以举出用于确定导入了本发明的载体的藻类的标记基因、或在藻类细胞中作用的终止子。

作为本发明的载体的制备方法，可以使用通常的方法。例如，将上述各序列与供体载体用限制性内切酶剪切后退火(アニ一リング)，通过DNA连接酶连接即可。或者，也可以通过利用了clonase(クロナ一ゼ)反应的简单的公知方法，将各序列克隆到载体。

本发明涉及的藻类的遗传转化方法，特征在于，包括制备上述载体的工序，以及将上述载体导入藻类细胞的工序。

本发明的载体的制备方法如上所述，可以使用本领域技术人员公知的方法。

作为本发明的载体导入藻类细胞的方法，可以使用基因枪法、玻璃珠搅拌法、微量注射法、农杆菌法(アグロバクテリウム法)、醋酸锂法、磷酸钙法、原生质体法等公知的方法。但是，在海产藻类的情况下，需要在高盐浓度的培养基中增殖，因此，电穿孔法不适合。

利用本发明的载体遗传转化的藻类细胞能够通过利用与导入的标记基因相应的选择性培养基进行培养来确定。

实施例

以下通过列举实施例来更具体地说明本发明，但是本发明根本不受下述实施例的限制，可以在符合前述和后述的宗旨的范围内适当地增加变更进行实施，它们均包含在本发明的技术范围内。

实施例1本发明涉及的CdebDNA病毒启动子的分离

(1)感染海产藻类的病毒的基因组DNA的提取

按照Tomaru，Y.等，Aquatic Microbial Ecology，vol.50，pp.103-112(2008)记载的方法，从以辐射硅藻目硅藻柔弱角毛藻为宿主的柔弱角毛藻DNA病毒(CdebDNAV)CdebDNAV 18株提取基因组。

具体地，首先，通过用0.22μm过滤器(MILLIPORE社制，Millex-GS，孔径：0.22μm)将病毒液(10mL)过滤，除去藻细胞的碎片等。向得到的滤液中添加40％聚乙二醇6000溶液(Woko社制)使得最终浓度为10w/v％，在4℃下静置一晚。将该液转移至离心分离用试管(Nalgen社制，UltraBottleAssemblies)中，使用超速离心机(BECKMAN社制，Ultracentrifuge L8-70M)在57000×g、4℃下离心分离1.5小时后，除去其上清液。通过向得到的沉淀中添加混合磷酸缓冲液(10mM磷酸二氢钠、10mM磷酸氢钠，pH 7.2，5mL)，洗涤病毒粒子。再次，在217000×g、4℃下离心分离4小时，同样地除去其上清液后，将得到的沉淀溶解到灭菌后的精制水(Millipore社制，milliQ(注册商标)，300μL)中。将该溶液转移至1.5mL容量的微量离心管(eppendorf管)，添加蛋白水解酶K和10％肌氨酰使得各自最终浓度为1mg/mL和1w/v％，在55℃下恒温放置1.5小时。然后，使用通常的方法进行苯酚/氯仿处理和氯仿处理，在得到的上清液中添加其十分之一量的3M醋酸钠(pH 4.8)，进一步添加其2.5倍量的乙醇。将该溶液在-80℃下静置1小时。然后，使用微量高速离心机(KUBOTA社制，KUBOTA3740)在14000rpm、4℃下离心分离10分钟，将得到的沉淀用70％乙醇洗涤后，干燥。将其溶解到灭菌milliQ水(20μL)中，得到DNA溶液。进一步，使用上述文献(Tomaru，Y.等(2008))记载的十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB法)进行精制。首先，向上述DNA溶液中添加TE缓冲液(10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA(pH 8.0))，使其总量为200μL。向该DNA溶液中添加CTAB溶液(1.6M NaCl，0.1M EDTA，2w/v％CTAB，200μL)，在65℃下恒温放置1小时。向该溶液添加氯仿(400μL)，振动搅拌5分钟后，使用前述的微量高速离心机在14000rpm、4℃下离心分离10分钟。向该溶液中添加2倍量的乙醇，在-80℃下静置1小时。然后，使用相同的微量高速离心机，在14000rpm、4℃下离心分离10分钟，将得到的沉淀用70％乙醇洗涤后，干燥。将该沉淀溶解到灭菌milliQ水(300μL)中，得到DNA溶液。

(2)CdebDNA病毒启动子的分离

将上述(1)得到的CdebDNA病毒的基因组DNA的序列信息使用Blast(DDBJ)与数据库比较，进一步使用ORF finder(NCBI)，检索CdebDNA病毒DNA所含的ORF，检测出编码可认为与病毒的复制有关的蛋白质的区域。将该序列中的认为是翻译起始点的ATG序列的上游+107至-370的区域，通过使用了CdP1L/attB1引物(序列号2)和CdP1-2R/attB4引物(序列号3)的PCR反应进行扩增。并且，在序列号2中5-31的碱基序列和序列号3中5-29的碱基序列，显示为用于后述的质粒的构筑的BP clonase反应所必要的attB序列。另外，得到的CdebDNA病毒启动子的碱基序列如序列号1所示。并且，序列号1中所示的ATG为起动密码子，不含在启动子中。

PCR反应的条件如以下所示。作为PCR反应液，混合10×缓冲液(TaKaRa社制，5μL)、dNTP Mix(TaKaRa社制，4μL)、Ex Taq(TaKaRa社制，0.25μL，5U/μL)、CdebDNA病毒的基因组DNA(1μL)、以及2种引物(10pmol/μL，各5μL)，最后添加混合灭菌milliQ水使总量为50μL。接着，重复在98.0℃下10秒、在45.0℃下30秒、72.0℃下60秒的循环40次，最后在72.0℃下反应5分钟。

为了确认片断的扩增，进行了电泳。电泳使用TAE缓冲液(三醋酸缓冲液)和琼脂糖S(ニツポンジ一ン社制)1.5％凝胶。作为电泳用试剂，使用向PCR产物各9μL分别添加10×加样缓冲液(TaKaRa社制)1μL混合而成的混合物。另外，作为DNA分子量标记使用100bp Ladder(ラダ一)(TOYOBO社制，代码No.DNA-030x，2μL)，同时进行电泳。另外，使用Mupid电泳槽(ADVANCE社制)，在100V的条件下电泳约30分钟。电泳结束后，使用溴化乙锭，通过常规方法(Sambrook and Russell 2001)染色，在紫外线照射下拍摄照片。

实施例2

含有本发明涉及的CdebDNA病毒启动子的载体的制备

(1)各输入性克隆质粒的制备

使用Multisite Gateway(注册商标)Pro Kit(invitrogen社制)制备分别导入了由上述实施例1得到的CdebDNA病毒启动子、作为导入基因的耐博莱霉素基因(ble)(Drocourt，D.等，Nucleic Acids Research，18，p.4009(1990))、以及筒柱藻(Cylindrotheca fusiformis)的fcp终止子(Poulsen，N.等，FEBSJournal，272，pp.3413-3423(2005))的输入性克隆质粒。

具体地，利用30％PEG8000/30mM氯化镁溶液(invitrogen社制)将具有用于质粒的构筑的clonase反应所必要的attB序列的、上述实施例1中得到的CdebDNA病毒启动子溶液精制。即，向CdebDNA病毒启动子溶液(25μL)中添加灭菌milliQ水(75μL)形成100μL的溶液。向该溶液中添加混合30％PEG8000/30mM氯化镁溶液(50μL)，使用微量高速离心分离机(KUBOTA社制，KUBOTA3740)在14000rpm下离心分离15分钟。然后，取出上清液，将得到的沉淀溶解到灭菌milliQ水(10μL)中。接着，将该溶液(50fmoles)与供体载体(invitrogen社制，pDONR221 P1-P4，100ng/μL)混合，通过向该溶液中添加灭菌milliQ水形成总量为8μL的混合液。并且，该供体载体具有用于质粒的构筑的BP clonase反应所必要的attP序列。向该混合液中进一步添加混合BP clonase(商标)‖酶混合物(Enzyme Mix)(invitrogen社制，2μL)，在25℃下反应1小时。然后，向反应液中添加蛋白水解酶K(invitrogen社制，1μL)，在37℃下处理10分钟。将该反应液(2.5μL)混合到One Shot(注册商标)Mach 1(注册商标)T1^R化学感受态细胞(T1^R chemically competent cells)(invitrogen社制，25μL)中，在冰上静置30分钟。然后，在42℃下进行30秒热激处理后，立刻转移至冰上，静置2分钟。然后，添加SOC(invitrogen社制，250mL)，在37℃下振动培养1.5小时。将培养的菌液(275μL)涂抹到含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、1.5％琼脂)。将该培养基在マルチシエ一カ一恒温箱(タイテツク社制)内在37℃下倒置培养一晚(10小时左右)。将得到的菌落用接种环接种到LB液体培养基(10mL)上，在37℃下振动培养一晚。使用Pure Yield质粒中量纯化***(PlasmidMiniprep System)(Promega社制)从该培养液(3mL)提取导入了具有LRclonase反应所必要的attL序列的CdebDNA病毒启动子的输入性克隆质粒。

另外，与上述实施例1同样地扩增具有用于质粒的构筑的BP clonase反应所必要attB序列的耐博莱霉素基因(ble)，与上述同样地导入到作为具有BP clonase反应所必要的attP序列的供体载体的pDONR221 P4r-P3r，得到导入了具有LR clonase反应所必要的attL序列的抗生素耐药性基因的输入性克隆质粒。

进一步，与上述实施例1同样地扩增具有用于质粒的构筑的BP clonase反应所必要attB序列的筒柱藻的fcp终止子，与上述同样地导入到作为具有BP clonase反应所必要的attP序列的供体载体的pDONR221 P3-P2，得到导入了具有LR clonase反应所必要的attL序列的终止子的输入性克隆质粒。

(2)目标质粒的制备

通过使用Gateway(注册商标)Vector Conversion System with One Shot(注册商标)ccdB Survival(注册商标)感受态细胞(invitrogen社制)，向pBluescript SK-(Stratagene社制)中组合具有LR clonase反应所必要的attR序列的Reading Frame Casette，制备目标质粒。

首先，对于pBluescript SK-(2μg)，使用限制性内切酶EcoRI 20U(TOYOBO社制，10U/μL)在37℃下消化3小时。通过按照常规方法向该反应液中添加乙醇，使DNA沉淀回收。接着，使用T4DNA聚合酶使末端平滑化。即，向回收的DNA中添加10×缓冲溶液(5μL)、2.5mM dNTP(TAKARA社制，2μL)、T4DNA聚合酶(TOYOBO社制，0.5U/μL，1μL)以及灭菌milliQ水(42μL)，制备总量为50μL的反应液。将该反应液在12℃下恒温放置15分钟。立刻向该反应液中添加灭菌milliQ水(350μL)，按照常规方法进行苯酚/氯仿处理和氯仿处理后，持续进行乙醇沉淀回收DNA。接着，为了防止用限制性内切酶剪切后的质粒再次环化，使用CIAP(TaKaRa社制，Calfintestine Alkaline Phosphatase)进行该剪切碎片的5’末端的脱磷酸处理。向实施了平滑化处理的DNA中添加10×CIAP缓冲液(5μL)和CIAP(0.1U/μL，1μL)，制备反应液，利用灭菌milliQ水使得总量为50μL。将该反应液在37℃下恒温放置15分钟，继续在56℃下恒温放置15分钟后，再次添加CIAP(0.1U/μL，1μL)，在37℃下恒温放置15分钟，继续在56℃下恒温放置15分钟。向该反应液中分别添加10％SDS溶液(2.5μL)、500mM EDTA溶液(0.5μL)、蛋白水解酶K溶液(20mg/μL，0.5μL)后，在56℃下恒温放置30分钟，继续在75℃下恒温放置10分钟。然后，按照常规方法实施苯酚/氯仿处理和氯仿处理。接着，通过乙醇沉淀回收DNA，溶解到灭菌milliQ水(10μL)中。

将得到的具有平滑末端的pBluescript SK-和Reading Frame Casette A(invitrogen社制，RfA)混合，使用pGEM-T Vector Systems Kit(Promega社制)附带的T4DNA连接酶连接。首先，向高压釜灭菌后的0.2mL容量的PCR用试管中添加2×快速连接缓冲液(Promega社制，5μL)、pBluescriptSK-(100ng/μL，0.5μL)、RfA(5ng/μL，2μL)、T4DNA连接酶(Promega社制，3U/μL，1μL)和灭菌milliQ水(1.5μL)，制备总计为10μL的反应液。将该反应液在室温下保存1小时，在4℃下恒温放置一晚(16小时以上)。将该连接性(ライグ一シヨン)溶液(5μL)混合到ccdB SurvivalCompetent Cells(invitrogen社制，50μL)，在冰上静置30分钟。然后，在42℃进行30秒热激处理后，立刻转移到冰上，静置2分钟。接着，添加SOC(250mL)，在37℃下振动培养1.5小时。将培养的菌液(300μL)涂抹到含有25μg/mL氯霉素和50μg/mL氨苄西林的LB琼脂培养基上。将该培养基在マルチシエ一カ一恒温箱内在37℃下倒置培养一晚。

将得到的菌落用接种环接种到LB液体培养基(10mL)上，在37℃下振动培养一晚。使用Pure Yield质粒中量纯化***(Promega社制)从该培养液(3mL)提取目标质粒。

(3)表达克隆质粒载体的制备

通过使用Multisite Gateway Pro Kit(invitrogen社制)在上述实施例2(1)中得到的输入性克隆质粒与上述实施例2(2)中得到目标质粒之间进行LRclonase反应，制备启动子、抗生素耐药性基因以及终止子连接而成的表达克隆质粒载体。

具体地，将分别组合了启动子、抗生素耐药性基因、终止子的三种输入性克隆质粒(分别10fmoles)和目标载体(20fmoles)混合，进一步通过添加灭菌milliQ水制备总量为8μL的混合液。向该溶液中添加混合LR ClonaseII PLUS Enzyme Mix(invitrogen社制，2μL)，在25℃下反应16小时。然后，向该反应液中添加蛋白水解酶K(invitrogen社制，1μL)，在37℃处理10分钟。将该反应液(2.5μL)混合到One Shot(注册商标)Mach 1(注册商标)T1^R化学感受态细胞(invitrogen社制，25μL)中，在冰上静置30分钟。然后，在42℃下进行30秒热激处理后，立刻转移至冰上，静置2分钟。然后，添加SOC(250mL)，在37℃下振动培养1.5小时。将培养的菌液(275μL)涂抹到含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂培养基。将该培养基在マルチシエ一カ一恒温箱内在37℃下倒置培养一晚。将得到的菌落用接种环接种到LB液体培养基(10mL)上，在37℃下振动培养一晚。使用Pure Yield质粒中量纯化***(Promega社制)从该培养液(3mL)提取表达克隆质粒载体。

(4)DNA序列的确认

为了确认制备得到了作为目标的表达克隆质粒载体，使用双脱氧法(Dideoxy)确定碱基序列。

使用上述实施例2(3)制备的表达克隆质粒载体(200ng)为模板，进行循环序列测定PCR。其反应条件如以下所示。反应液(10μL)由模板DNA(100ng/μL，2μL)、Big Dye终结者循环测序(Big Dye Terminator CycleSequencing)ver. 3.1(AppliedBiosystems社制，0.5μL)、5×序列测定缓冲液(2μL)、引物(1.6pmol/μL，0.66μL)、灭菌蒸馏水(4.84μL)构成。引物使用M13M3引物(序列号4)。作为反应条件，在95℃下加热5分钟后，进行96℃下10秒、50℃下5秒、60℃下4分钟的反应40个循环。反应后，将反应液转移至1.5mL容量的微量离心管，添加3M醋酸钠(1μL)、99.5％乙醇(25μL)和125mM EDTA溶液(1μL)，用手指弹的方式进行充分混合后，在室温下放置15分钟。在14000rpm、4℃下离心分离20分钟后，用黄色枪头(イエロ一チツプ)小心除去上清液，添加70％乙醇(35μL)，充分混合。再次，在14000rpm、4℃下离心分离10分钟后，用黄色枪头将上清液完全除去，在开盖的状态下，在室温下放置10分钟，使沉淀干燥。

向干燥的颗粒中添加甲酰胺(Applied Biosystems社制，10μL)，使用高知大学综合研究中心基因实验设施内的ABI PRISM(注册商标)3100-Avant Genetic Analyzer(Applied Biosystems社制)进行解析。预先，使用基因解析软件Vector NTI Advance Ver 10.0(invitrogen社制，http://www.invitrogen.com/vntigateway)，向目标质粒的碱基序列中组合启动子、抗生素耐药性基因以及终止子的碱基序列，由此，制作表达基因质粒载体的碱基序列。接着，通过使用Vector NTI Advance Ver 10.0的AlignX进行校正(アライメント)，将该在计算机上制作的表达克隆质粒载体的碱基序列与通过上述方法实验确定的表达克隆质粒载体的碱基序列进行比较，确认到上述实施例2(3)制备的表达克隆质粒载体中导入了目标基因。

得到的表达克隆质粒载体的结构如图1所示。

实施例3含有本发明涉及的CdebDNA病毒启动子的载体的制备

使用耐ノ一ルセオスリシン基因(nat)(Krugel等，1993年)作为抗生素耐药性基因，作为终止子使用来自假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)的fcp终止子(Poulsen，N.等，Journal of Phycology，42，pp.1059-1065(2006))，与上述实施例2同样地制备含有CdebDNA病毒启动子的载体。

得到的表达克隆质粒载体的结构如图2所示。

比较例1-4含有以往病毒启动子的载体的制备

与上述实施例2同样地操作，制备具有羽纹目硅藻的内在性启动子，另外，导入了耐博莱霉素基因(ble)作为抗生素耐药性基因和筒柱藻的fcp终止子作为终止子的质粒载体(比较例1)、以及制备具有辐射目硅藻的内在性启动子，另外，导入了耐ノ一ルセオスリシン基因(nat)作为抗生素耐药性基因和来自假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)的fcp终止子作为终止子的质粒载体(比较例2)。

另外，与上述实施例2同样地操作，制备具有来自花椰菜花叶病毒的启动子(CaMV启动子)，另外，导入了耐博莱霉素基因(ble)作为抗生素耐药性基因和筒柱藻的fcp终止子作为终止子的质粒载体(比较例3)、以及制备导入了耐ノ一ルセオスリシン基因(nat)作为抗生素耐药性基因和来自假微型海链藻的fcp终止子作为终止子的质粒载体(比较例4)。

实施例4羽纹目硅藻的遗传转化

使用上述实施例2、上述比较例1以及上述比较例3的质粒载体，将羽纹目硅藻三角褐指藻进行遗传转化。

具体地，使各质粒载体附着到平均粒径1.1μm的钨粒子M17上。另外，将羽纹目硅藻三角褐指藻以每个培养基5×10⁷细胞涂抹到固体培养基上。使用粒子枪(Bio-Rad社制，Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System)，将上述钨粒子以He气压1350psi或1100psi打入细胞内。接着，用含有博莱霉素150μg/mL的1.0％琼脂f/2培养基培养该细胞。结果如表1所示。

另外，用PCR确认用上述含抗生素培养基繁殖的细胞的菌落进行了遗传转化。使用100mL的培养基培养繁殖的菌落，回收藻类细胞后，通过与上述实施例1(1)同样的方法，提取基因组DNA。以得到的基因组DNA作为模板，使用与导入的抗生素基因(ble)特异性结合的引物进行PCR。PCR反应的条件基本上与上述实施例1(2)同样地操作，使循环次数为40次，退火温度为60℃。对得到的扩增DNA分析后的电泳照片如图3所示。图3中，“M”为分子量标记，“1”为导入了抗生素基因(ble)的质粒载体的泳道，“2”为三角褐指藻野生菌株的泳道，“3-5”为用含有来自花椰菜花叶病毒的启动子和抗生素基因(ble)的质粒载体进行遗传转化的菌株的泳道，“6-8”为用含有本发明涉及的启动子和抗生素基因(ble)的质粒载体进行遗传转化的菌株的泳道。

实施例5辐射硅藻目硅藻的遗传转化

使用实施例3、上述比较例2以及上述比较例4的质粒载体，与上述实施例4同样地操作，将辐射目硅藻角毛藻进行遗传转化。但是，向培养细胞的培养基添加500μg/mLノ一ルセオスリシン。结果如表1所示。

[表1]

另外，与上述实施例4同样地用PCR确认将用上述含抗生素培养基繁殖的细胞的菌落进行了遗传转化。对得到的扩增DNA分析后的电泳照片如图4所示。

图4中，“M”为分子量标记，“1”为导入了抗生素基因(nat)的质粒载体的泳道，“2”为角毛藻野生菌株的泳道，“3-4”为用含有本发明涉及的启动子和抗生素基因(nat)的质粒载体进行遗传转化的菌株的泳道。

实施例6本发明涉及的启动子的核心元件区域的确认

除了在序列号3的引物基础上，使用序列号6-9的引物以外，与上述实施例1同样地操作，分别扩增作为编码可认为与CdebDNA病毒的复制相关的蛋白质的区域的翻译起始点上游部位的从+107至-72、-32、-2以及+34的碱基的DNA碎片。使用这些输入性克隆(entry clone)、含有在上述实施例3中制备的耐ノ一ルセオスリシン基因(nat)的输入性克隆以及来自假微型海链藻的fcp终止子的输入性克隆，与上述实施例2同样地操作，制备连接了上述各输入性克隆、nat以及fcp终止子的质粒。这些质粒具有与图2同样的结构。在这些质粒的基础上，使用比较例2的质粒、未连接启动子的质粒(pNat/TpfcpTer)，利用与上述实施例4同样的方法进行遗传转化。结果如图5所示。

如图5所示，在使用上述复制蛋白质基因的翻译起始点的上游部位的从+107至-370的碱基序列(序列号1)以及从+107至-72的碱基序列作为启动子的情况下，能够进行遗传转化，另一方面，在使用从+107至-32、-2以及+34的碱基序列作为启动子的情况下，不能进行遗传转化。由该结果可以得到对藻类的遗传转化有用的核心元件存在于上述复制蛋白质基因的翻译起始点的上游部位的-72至-33之间的序列(序列号5)的可能性很高的结论。并且，由于存在遗传转化为偶然发生的可能性，用不具有启动子的质粒进行同样的实验，但是为可以无视遗传转化率程度的质粒。另外，使用辐射目硅藻的启动子进行同样的实验后，发现使用本发明的启动子的情况的遗传转化率明显高。

实施例7利用本发明的启动子进行的各种海产藻类的遗传转化

为了确认本发明的启动子是否适用于各种各样的硅藻种类，使用于上述实施例不同的羽纹目硅藻筒柱藻进行遗传转化。使用除了作为编码可认为与CdebDNA病毒的复制相关的蛋白质的区域的翻译起始点的上游部位的从+107至-72的碱基以外，还组合了耐博来霉素基因(ble)和来自筒柱藻的fcp基因的终止子的质粒(图6)。与上述实施例4同样地，将上述质粒固定到钨粒子，进行遗传转化。作为对照，使用除了未组合上述启动子以外同样的质粒(pBle/CffcpTer)，进行同样的实验。使用组合了本发明的启动子的质粒时的硅藻的照片如图7(1)所示，使用未组合本发明的启动子的质粒时的硅藻的照片如图7(2)所示。

如图7(2)所示，未组合本发明的启动子时，由于可能未进行遗传转化，抗生素导致硅藻死亡。与此相对，使用了本发明的启动子时，如图(1)所示，硅藻发生了遗传转化，获得了抗生素耐药性，因此良好地生存。由此可知，使用本发明的启动子时，上述实施例中使用的硅藻以外的硅藻也能进行遗传转化。

实验结果的考察

(1)对于遗传转化能力

如上述实施例4-5的结果所示，使用羽纹目硅藻的内在性启动子时，羽纹目硅藻能够良好地进行遗传转化，而另一方面，辐射目硅藻全部不能进行遗传转化。植物通常的遗传转化中经常使用的花椰菜花叶病毒启动子的情况也同样，羽纹目硅藻能够进行遗传转化，而辐射目硅藻全部不能进行遗传转化。

与此相对，使用了本发明涉及的启动子时，对于羽纹目硅藻，三角褐指藻和筒柱藻两种都能够进行遗传转化，对于辐射目硅藻，角毛藻能够进行遗传转化。这三种硅藻在硅藻纲整体的分子***树中，在各自的目中属于***地分离的分类属。由此可知，能够适用于这些种类的本发明的启动子能够适用于各种各样的硅藻。

由以上结果可知，硅藻主要分类为羽纹目和辐射目，与以往的启动子的特异性高相对，本发明涉及的启动子的启动子的特异性低，能够广泛用于各种各样的硅藻的有效的遗传转化。

(2)对于本发明的启动子的碱基序列

通常，在真核生物的启动子区域，存在开始转录的转录结合因子结合的核心启动子区域和位于其上游的基因转录调节区域。已知在病毒启动子中也同样地存在所谓TATA框(5’-TATAWAW-3’(式中，W表示A或T))或启动子元件(Inr)的在真核生物的核心启动子区域经常见到的基序序列。在此基础上，使用PLACE Signal Scan Search(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)对本发明涉及的序列号1的启动子的碱基序列进行了解析、比较。

其结果，在本发明的启动子中没有发现TATA框，在上游区域发现了作为CAAT框I的5’-CAAT-3’(-97～-94)、作为GATA框的5’-WGATAR-3’(-162～-167)，进一步发现了可认为是启动子元件的5’-CCA₊₁TACC-3’(-2～+5)。

该启动子元件与所谓的哺乳类的5’-YYA₊₁NWYY-3’(Javahery，R等，Molecular and Cellular Biology，14，pp.116-127(1994)、卵菌类的5’-YCA₊₁TTYY-3’(Mcleod，A等，Eukaryotic Cell，3，pp.91-99(2004))、果蝇5’-TCA₊₁KTY-3’的(式中，K表示G或T)(Purnell，B.A.等，Genes &Development，8，pp.830-842(1994))、毛滴虫属的5’-TCA₊₁YW-3’(Liston，D.R.等，Molecular and Cellular Biology，19，pp.2380-2388(1999))、以及作为筒柱藻的启动子的fcpA-1A中的5’-CCA₊₁TTCC-3’(Poulsen，N.等，FEBS Journal，272，pp.3413-3423(2005))的Inr序列类似。

从这些信息可以认为，序列号1中的启动子中发现的启动子元件作为核心元件能够在羽纹目硅藻和辐射目硅藻两者中发挥作用，进行遗传转化。但是，即使使用作为与该启动子元件类似的筒柱藻的启动子的fcpA-1A，也不能使辐射目硅藻进行遗传转化。

由此，本发明涉及的多聚核苷酸(1)显示出较高的遗传转化能力，至少不是TATA框或启动子元件的原因，是由完全未知的序列作为核心元件起作用的可能性很高。

(3)对于本发明的启动子的核心元件

通过上述实施例6的结果，可以认为本发明的启动子的核心元件存在于编码可以认为与CdebDNA病毒的复制有关的蛋白质的区域的从-72至-33之间的序列(序列号5)的可能性很高。序列号5的序列位于启动子元件的大致30-70碱基的上游侧，所述启动子元件位于该复制蛋白质基因的上流区域，由此，很难认为该启动子元件作为核心元件发挥功能。使用PLACE SignalScan Search(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)对该序列号5的序列进行解析，未能发现已知的基序序列。由此，可以认为本发明的启动子的核心元件是至今未知的新型的元件。

如上述实验结果所示，使用本发明的启动子能够在超出目的范围内将硅藻遗传转化的理由，可以认为是序列号5的序列中所含的新的序列作为核心元件发挥功能。

工业实用性

使用含有本发明涉及的启动子的载体时，能够有效地使各种各样种类的藻类进行有效地遗传转化。由此，使用本发明时，不但具有高的光合成能力、具有有用物质的生产能力等良好的特性，对于大量存在的、遗传转化难的且至今该技术仍未充分研究的藻类，能够在超出“目”等的范围内，广泛地且有效地进行遗传转化。

Claims

1.一种启动子，其特征在于，该启动子的结构如下，

构成非编码区域的多聚核苷酸，所述非编码区域位于编码与柔弱角毛藻DNA病毒的复制相关的蛋白质的基因的上游，且所述多聚核苷酸的碱基序列为序列号1所示的碱基序列。

2.一种启动子，其特征在于，该启动子的结构如下，

构成非编码区域的多聚核苷酸，所述非编码区域位于编码与柔弱角毛藻DNA病毒的复制相关的蛋白质的基因的上游，且所述多聚核苷酸的碱基序列为序列号1中从+107至-72的碱基序列。

3.一种载体，其特征在于，该载体含有权利要求1或2所述的启动子，以及编码任意蛋白质的基因。

4.一种藻类的遗传转化方法，其特征在于，该遗传转化方法包括制备权利要求3所述的载体的工序，以及将上述载体导入藻类细胞的工序。