CN102288751A

CN102288751A - 一种快速检测迟缓爱德华氏菌胶体金免疫层析试纸条

Info

Publication number: CN102288751A
Application number: CN2011101132127A
Authority: CN
Inventors: 樊海平; 辛志明; 吴斌; 曾占壮; 张新艳
Original assignee: FUJIAN PROV INST OF FRESHWATER FISHERY
Current assignee: FUJIAN PROV INST OF FRESHWATER FISHERY
Priority date: 2011-04-25
Filing date: 2011-04-25
Publication date: 2011-12-21

Abstract

一种快速检测迟缓爱德华氏菌胶体金免疫层析试纸条，该发明涉及一种利用纳米胶体金颗粒标记抗体技术和双抗体夹心免疫层析法检测抗原模式，制备了迟缓爱德华氏菌的胶体金免疫层析检测试纸条。提供一种迟缓爱德华氏菌胶体金免疫层析检测试纸条及其制备方法与应用。该试纸条含有样品垫、金标垫、带有检测线和质控线抗体的硝酸纤维素膜、吸收垫、底板，将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次重叠相连粘贴在底板上组装而成。本试纸条检测应用操作简单、特异性好、灵敏度高、方便快速，不需要特速仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，易于推广。适合用于对迟缓爱德华氏菌的感染、污染的检测。

Description

一种快速检测迟缓爱德华氏菌胶体金免疫层析试纸条

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种快速检测迟缓爱德华氏菌胶体金免疫层析试纸条及其制备和在迟缓爱德华氏菌检测上的应用。

背景技术

迟缓爱德华菌氏病是养殖渔业中暴发性的一类细菌性疾病，流行于叉尾鲴科、鳗鲡科及牙鲆、鲤等经济养殖鱼类，主要导致鱼类的肝、肾病。该病多发于春夏之变、秋季等高水温期，夏季达到高峰，其流行面积广，死亡率较高，危害十分严重，已引起水产养殖业的高度重视。对迟缓爱德华菌氏病的检测鉴定，目前主要局限于细菌学检查或病理观察，按常规的细菌分离鉴定诊断复杂费时，易延误防治时机。另外，也有利用兔抗爱德华氏菌多克隆抗体、抗爱德华氏菌单克隆抗体建立的ELISA检测方法应用于爱德华氏菌的免疫学检测。虽然ELISA检测也能在几小时内诊断出爱德华氏菌病，具有较高的特异性和灵敏度，但存在操作技术要求高、设备比较昂贵等缺点，不便于基层生产应用。基于迟缓爱德华菌在水产动物中的流行状况以及防治要求，开发研究便捷快速、灵敏特异的检测技术已成为一种迫切的需要。本发明基于免疫学检测原理和单克隆抗体、多克隆抗体制备技术及胶体金标记技术，研制了一种迟缓爱德华氏菌的胶体金免疫层析检测试纸条。

胶体金免疫层析检测试纸条技术是20世纪90年代以来发展起来的一项新型体外诊断技术，近十多年来，胶体金标记已经发展为继同位素标记、酶标记以及荧光标记以后的一项重要的免疫标记技术。由于其快速、便捷，不需特殊设备，结果判断直观等优势，近年来该方法得到快速发展，在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用，但用于动物疾病防控检测领域的产品较少。本研究针对迟缓爱德华氏菌研制出了水产疾病检测的免疫胶体金检测试纸条，研制出相应的快速诊断试剂盒将有力的促进水产养殖业对细菌性病害的有效控制防治。研究建立的胶体金检测方法灵敏、准确、特异性强，此方法建立后，同时可与经典常规方法互补，预计将在水产动物诊疗机构、水产动物养殖企业、检验检疫部门等具有较广的应用前景，有一定的经济和社会效益。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于检测迟缓爱德华氏菌的灵敏、准确、快速的胶体金免疫层析检测试纸条及其制备方法和在迟缓爱德华菌氏检测上的应用。

本发明提供了迟缓爱德华氏菌胶体金免疫层析检测试纸条，其特征在于：该试纸条包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫、底板，在底板上以样品垫为起始端，依次重叠粘贴固定样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫。

本发明提供了迟缓爱德华氏菌胶体金免疫层析检测试纸条的制备包括以下步骤：

(1)制备抗迟缓爱德华氏菌单克隆抗体或多克隆抗体；

(2)纳米胶体金颗粒的制备；

(3)制备抗迟缓爱德华氏菌单克隆抗体或多克隆抗体的胶体金标记物，形成金标抗体；

(4)将金标抗体均匀喷涂到玻璃纤维素膜上，经干燥形成金标垫；

(5)将抗迟缓爱德华氏菌单克隆抗体或抗迟缓爱德华氏菌多克隆抗体喷涂到硝酸纤维素膜上的检测线位置作为检测线捕获抗体，抗金标抗体的二抗或葡萄球菌A蛋白喷涂到硝酸纤维素膜上的质控线位置作为质控线捕获抗体，封闭空白位点，充分干燥；

(6)将吸收垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫、底板组装成胶体金免疫层析检测试纸条。

附图说明

图1为本发明迟缓爱德华氏菌胶体金免疫层析检测试纸条的组装结构图，其中：1是样品垫；2是金标垫；3是检测线显色位置；4是质控线显色位置；5是硝酸纤维素膜；6是吸收垫；7是底板。

图2为本发明迟缓爱德华氏菌胶体金免疫层析检测试纸条的外观结构图，其中：8是塑料外壳；9是结果读取窗口；10是检测样品加样区。

具体实施方式

本发明的具体实施方式参照下面的实施例进行详细说明，但并不局限于此。

本检测试纸条的制备包括以下步骤：抗迟缓爱德华氏菌单克隆抗体细胞株的建立、兔抗迟缓爱德华氏菌多克隆抗体血清的制备、配对抗体的选择、纳米胶体金颗粒的制备、纳米胶体金标记pH值优化、纳米胶体金标记蛋白浓度优化、金标垫的制备、硝酸纤维素膜上的检测线与质控线抗体的喷涂及封闭、试纸条的组装、检测方法。

实施例1、抗迟缓爱德华氏菌单克隆抗体细胞株的建立

制备迟缓爱德华氏菌灭活抗原，免疫Balb/c小鼠，免疫之后制备脾细胞悬液；同时制备骨髓瘤细胞悬液；将脾细胞与骨髓瘤细胞经过细胞杂交融合，筛选阳性单克隆细胞孔；经进一步的阳性克隆化及其筛选，建立抗迟缓爱德华氏菌单克隆抗体杂交瘤细胞株2株，分别命名为ETMcAb3A7、ETMcAb4F11。该2株细胞株已于2010年6月6日在中国典型培养物保藏中心保藏(中国.武汉.武汉大学)，保藏编号分别为CCTCC NO：C201061和CCTCC NO：C201062。

实施例2、抗迟缓爱德华氏菌单克隆抗体腹水的制备

培养抗迟缓爱德华氏菌单克隆抗体细胞株ETMcAb3A7、ETMcAb4F11，分别收集单克隆抗体细胞，分别腹腔注射Balb/c小鼠，洁净环境饲养。约7-10d后观察小鼠腹部，有明显腹水者用12^#针头由腹腔下侧穿刺回收腹水，3000r·min^-1离心5min，沉淀红细胞及血细胞，收集上层淡黄色的腹水，保存备用。

实施例3、兔抗迟缓爱德华氏菌多克隆抗体血清的制备

制备迟缓爱德华氏菌灭活抗原，首免加等量的完全弗氏佐剂，注射新西兰兔，2-3周内进行二免，抗原加等量不完全弗氏佐剂，一个月后三免。免疫结束后，通过颈动脉割取血，经5000r·min^-1离心后收集血清，无菌分装，-80℃保存备用。

实施例4、配对抗体的选择

配对抗体的选择是选用已经制备的抗迟缓爱德华氏菌单克隆抗体、多克隆抗体，将所有相关抗体作配对实验后，选择灵敏度、特异性较好的一组抗体，分别用于胶体金标记和硝酸纤维素膜检测线捕获抗体的喷涂。

我们选择了实验室制备的抗迟缓爱德华氏菌单克隆抗体ETMcAb3A7、ETMcAb4F11与兔抗迟缓爱德华氏菌多克隆抗体，两两经过夹心法实验与金标抗体免疫层析实验，最后选择一对效果最佳抗体。实验结果表明，抗迟缓爱德华氏菌单克隆抗体ETMcAb3A7与ETMcAb4F11分别做为胶体金标记抗体、检测线抗体为最佳组合，该方案实施可降低样品检测中假阴性信号的出现，提高抗体的胶体金标记效果，并能获得可靠的结果。

实施例5、纳米胶体金颗粒的制备

取250mL三角瓶一个，制备1％氯化金100mL，加热沸腾；取1mL的1％柠檬酸钠加入上述溶液中，迅速混合均匀，再保持沸腾15min，自然冷却后蒸馏水恢复至100mL体积；胶体金溶液用硅化过的试剂瓶4℃保存，备用。

胶体金烧制之后，静置4h后观察，若胶体金溶液表面有漂浮物，则弃取，重新烧制；4℃保存的胶体金溶液表面若有漂浮物或絮状沉淀，也应弃取，重新烧制。

实施例6、纳米胶体金标记pH值优化

取若干个5mL试管，分别加入1.5mL 20nm胶体金；用0.05moL·L^-1 K₂CO₃和0.1moL·L^-1HCl将胶体金溶液的pH调为6～10；取1.5ml离心管，按pH从低到高分别将上述胶体金分别取1mL加入管中，重复三次；每孔分别加入单克隆抗体200μL，浓度为1mg·mL^-1，迅速混匀，混合，室温下放置30min；每孔分别加入5％KCl 50μL，混匀后静置4h；观察胶体金颜色变化，记录颜色变化较小的组，优选PH为8.0-9.8；在优选pH范围内调整，重复上述步骤，最适PH为8.2。

试验结果表明：维持胶体金溶液稳定的最佳pH值范围为8.2-9.0，试验最优pH值为8.2。

实施例7、纳米胶体金标记蛋白浓度优化

本发明还在于提供一种获得维持胶体金稳定的抗体最佳标记剂量的方法，包括：

取10支洁净的1.5mL离心管，分别加入最适pH值范围的胶体金溶液1mL；在1～10号管内分别依次加入稀释好的待标记抗体20μg、18μg、16μg、14μg、12μg、10μg、8μg、6μg、4μg、0μg，混匀，静置2min；在10个管内分别加入10％KCl溶液50μL，混匀后室温静置2h；观察颜色变化。

未加抗体及加入量不足以稳定胶体金的试管中的液体颜色呈现由红变蓝的变化，而加入抗体量达到或超过最低稳定剂量的试管则保持红色不变。与对照管(1号管)相比，颜色最接近、含抗体剂量最低的试管所含的抗体剂量，即为1mL胶体金所必须的抗体稳定剂量，在此基础上再加20％抗体，即为1mL胶体金所必须的抗体最佳标记剂量。

本发明经过反复试验验证和分析，得出的结果表明：维持胶体金溶液适宜的蛋白抗体浓度为10μg·mL^-1。

实施例8、金标垫的制备

取两个50mL的试管，分别加入10mL 25nm胶体金；加入适量0.05moL·L^-1K₂CO₃调整pH为最适浓度；4℃条件下，加入最佳标记浓度的抗体反应20min，4℃12000r·min^-1离心30min，弃去上清；每支离心管中加入10mL重悬液悬浮沉淀后同上离心，弃上清液，管底得到暗红色的疏松状沉淀，重悬液为0.2moL·L^-1PB缓冲液(含1％BSA、0.02％PEG、0.3％Tween-20、0.1moL·L^-1NaCl)；重复离心1次，弃去上清；0.05moL·L^-1PB(含1％BSA、0.02％PEG、0.3％Tween-20、12％蔗糖、1％Na N₃、0.1moL·L^-1NaCl)重悬沉淀，4℃冰箱储存备用；

取上述标记好的免疫胶体金溶液调整至一定浓度，均匀喷涂在玻璃纤维素膜上，37℃温箱中过夜干燥，密封包装置于4℃冰箱备用。

实施例9、硝酸纤维素膜上的检测线、质控线抗体的喷涂及封闭

将硝酸纤维素膜用1％的甲醇溶液浸泡飘洗后，迅速轻柔洗干，干燥；将抗迟缓爱德华氏菌单克隆抗体(2mg·mL^-1)、兔抗鼠I gG抗体(1mg·mL^-1)分别加入bio-dot胶体金喷点***的检测线、质控线的储存瓶中，调整划膜的位置，进行喷膜划线；将划好检测线、质控线的硝酸纤维素膜置于37℃温箱中烘干2h；取出硝酸纤维素膜置于中性蛋白中浸泡润湿后立即取出，置于37℃温箱中封闭4h后，密封保存在4℃冰箱备用。

试验结果制备了具有免疫活性的检测线和质控线，并用封闭液将空白位点封闭了的免疫硝酸纤维素膜。

实施例10、试纸条的组装

将吸收垫、金标垫、样品垫分别裁成长条形2.5cm、0.5cm、1.5cm；将免疫硝酸纤维素膜沿不干胶底板的长轴方向、距不干胶底板上边沿2.2cm、下边1.8cm位置粘贴；将吸收垫与免疫硝酸纤维素膜重叠0.3cm处粘贴在硝酸纤维素膜的上方；将金标垫与免疫硝酸纤维素膜重叠0.1cm处粘贴在免疫硝酸纤维素膜的下方；样品垫与金标垫重叠0.1cm粘贴在金标垫的下方；将从上到下依次固定有将吸收垫、免疫硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫的底板裁切成宽×长为0.35cm×6cm的长条，即成测试条，装入塑料外壳，与干燥剂一起装入铝箔袋内，密封贮存。

经过组装、剪裁、干燥、密封等步骤，即可组装成迟缓爱德华氏菌胶体金快速检测试纸条。

实施例11、检测方法

待检样品的处理：固态样本如发病动物病灶组织、水产品或细菌培养物等样本，加适量蒸馏水研磨离心或静置待沉淀取上层清液；血液、腹水等液体样本可直接抽取检测样本；含菌量较少的样品可经过培养基增菌后取菌液直接检测；将迟缓爱德华氏菌胶体金快速检测试纸条恢复室温；抽取适量检测样本80-150μL，缓慢加入检测卡上的加样孔内；20min后观察检测试纸条的显色情况，记录结果。

检测结果：若含有迟缓爱德华氏菌，则与试纸上金标抗体形成相应的复合物，上行与包被在免疫硝酸纤维膜上的单克隆抗体结合，形成红色线条，即在“T”处形成红色条带。无论检测样品是否含有迟缓爱德华氏菌，金标抗体继续向上迁移与包被在膜上的兔抗鼠IgG形成红色沉淀线，即在“C”处形成红色条带。

所以，若质控线显色，检测线不显色为阴性结果，检测样品不含有迟缓爱德华氏菌。若质控线显色，检测线显色为阳性结果，检测样品含有迟缓爱德华氏菌。若质控线不显色则检测结果判定为试纸条变质失效。

Claims

1.一种迟缓爱德华氏菌的胶体金免疫层析检测试纸条，其特征在于：该试纸条包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫、底板。

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：样品垫的材料选自玻璃纤维、滤纸纤维或聚脂膜，金标垫的金标抗体支持膜选自玻璃纤维、滤纸纤维或聚脂膜，吸收垫选用吸水滤纸，底板选用带不干胶的PVC板。

3.根据权利要求1-2任一项所述的试纸条，其特征在于：底板上以样品垫为起始端，依次重叠粘贴固定有样品垫、金标垫、带有检测线和质控线抗体的硝酸纤维素膜、吸收垫。

4.根据权利要求1-3任一项所述的试纸条，其特征在于：抗迟缓爱德华氏菌的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；质控线抗体根据金标抗体的来源可选择羊抗兔、鼠抗兔、兔抗羊、羊抗鼠、兔抗鼠等的IgG或葡萄球菌A蛋白。

5.一种迟缓爱德华氏菌的胶体金免疫层析检测试纸条的制备方法，其特征在于：该试纸条的制备步骤包括：(1)制备抗迟缓爱德华氏菌单克隆抗体或多克隆抗体；(2)制备纳米胶体金颗粒；(3)制备抗迟缓爱德华氏菌单克隆抗体或多克隆抗体的纳米胶体金标记物，形成金标抗体；(4)将金标抗体均匀喷涂到金标抗体支持膜上，经干燥制备金标垫；(5)将抗迟缓爱德华氏菌单克隆抗体或抗迟缓爱德华氏菌多克隆抗体喷涂到硝酸纤维素膜上的检测线位置作为检测线捕获抗体，抗金标抗体的二抗或葡萄球菌A蛋白喷涂到硝酸纤维素膜上的质控线位置作为质控线捕获抗体，并封闭硝酸纤维素膜上的空白位点；(6)将吸收垫、带有检测线和质控线抗体的硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫、底板组装成胶体金免疫层析检测试纸条。

6.一种迟缓爱德华氏菌胶体金免疫层析检测试纸条的应用，其特征在于：该试纸条应用于检测迟缓爱德华氏菌。

7.根据权利要求6所述的试纸条，其特征在于该检测步骤如下：

(1)取80-150μL待检样本加在检测试纸条的加样区；

(2)在20min内观察检测结果。