CN102286596B - 一种15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的制备方法，包括雷斯青霉Penicillium raistrickii(ATCC 10490)发酵、加入底物左旋乙基甾烯双酮进行生物转化，其特征在于：所述生物转化的体系由离子液体和缓冲液相构成，其中离子液体相和缓冲液相的体积比为0.25～1.25∶1。本发明方法是在离子液体/水双液相***中，利用雷斯青霉Penicillium raistrickii(ATCC 10490)菌体中所含的羟化酶，催化左旋乙基甾烯双酮的15α位发生羟基化反应，生成15α羟基左旋乙基甾烯双酮，制备过程中无需加入有机溶剂，降低了对环境具有严重破坏作用的有机溶剂的使用，反应条件温和，转化装置简单，原料来源充足，制备过程简单，生产成本低，对环境污染危害小，同时可以降低生产成本。
Description
技术领域
本发明属于生物催化领域，尤其是一种15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的制备方法。
背景技术
随着人口增长的速度越来越快，甾体避孕药的出现为有效控制人口的过度增长带来了希望，孕二烯酮是新一代避孕药的主要成分之一，它以原型与孕激素受体结合，具有高度的亲和力且几乎没有雄激素和***活性，口服吸收快速而完全，是目前最为理想的口服避孕药之一，本发明中催化制备的15α羟基化左旋乙基甾烯双酮是“孕二烯酮”合成的关键中间体。
一般甾体类物质具有很强的疏水性(溶解度范围在10-5～10-4mol/L)，而甾体转化酶属于胞内酶，底物只有扩散进入细胞才能与酶接触而进行转化反应，这就导致底物与转化酶不能很好接触，造成转化率偏低，发酵时间延长。因此，提高底物的溶解性能(即有效反应浓度)，加速底物和产物分子的传递，是提高甾体转化反应效率的关键技术之一。有报道说，可将有机溶剂应用于甾体转化作为促溶剂，以促进底物有效地溶解，达到提高转化率的目的，但是有机溶剂对细胞具有很大的毒性，并且会给环境带来污染，其危害作用不容小视。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种离子液体/水双液相***中利用雷斯青霉催化甾体化合物左旋乙基甾烯双酮生成15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的生物制备方法，该方法具有目标产物转化率高、过程简单、绿色环保的优点。
本发明实现目的的技术方案如下：
一种15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的制备方法，包括雷斯青霉Penicillium raistrickii(ATCC 10490)发酵、加入底物左旋乙基甾烯双酮进行生物转化，其特征在于：所述生物转化的体系由离子液体和缓冲液相构成，其中离子液体相和缓冲液相的体积比为0.25～1.25∶1。
而且，所述离子液体包括[BMIM][PF6]、[HMIM][PF6]、[BMIM][NTF2]、[HMIM][NTF]、[BMPL][NTF]、[HMPL][NTF]、[BMPL][FAP]、[HMIM][FAP]、[EWTMG][FAP]、[(E2OH)MIM][NTF]、[(EOE)MMO][NTF]、[(MOP)MPI][NTF]、[(P3OH)PYR][NTF]；所述缓冲液相为pH5～7.3的磷酸缓冲液；
而且，所述底物左旋乙基甾烯双酮进行生物转化的底物投料量的重量百分比为2～7‰，温度为25～30℃，摇床转速为160～200r/min，转化时间为90～100h。
而且，所述雷斯青霉Penicillium raistrickii(ATCC 10490)发酵步骤为：
(1)孢子悬液的制备：将雷斯青霉Penicillium raistrickii(ATCC 10490)接种到斜面培养基上，经培养后用无菌水，含量为质量百分比1‰的Tween-80水溶液，将斜面孢子洗下，制备出孢子悬液；
(2)菌丝培养：将已制备好的孢子悬液接入到发酵培养基中，培养温度28～32℃，接种量为108～1011个/ml，摇床转速为160～200r/min，培养时间为24～72h；培养成熟后所得球状菌丝体经抽滤获得菌饼。
而且，所述菌饼投入到离子液体/水两相***的水相中的菌球重量占水相质量的5～8％。
而且，所述斜面培养基wt％：葡萄糖1.5，麦芽糖2，蛋白胨0.1，琼脂2，pH自然；所述发酵培养基wt％：葡萄糖3，玉米浆1，NaNO30.2，KH2PO40.1，MgSO40.05，FeSO40.002，KCl 0.05，K2HPO40.2，pH 7.2～7.5。
而且，所述将抽滤得到的菌饼投入到缓冲液相中，再加入离子液体，同时以干粉投料的方式将底物投入到离子液体/缓冲液相***中进行微生物转化。
本发明的优点和积极效果如下：
1、本发明方法是在离子液体/水双液相***中，利用雷斯青霉Penicillium raistrickii(ATCC10490)菌体中所含的羟化酶，催化左旋乙基甾烯双酮的15α位发生羟基化反应，生成15α羟基左旋乙基甾烯双酮，制备过程中无需加入有机溶剂，降低了对环境具有严重破坏作用的有机溶剂的使用，反应条件温和，转化装置简单，原料来源充足，制备过程简单，生产成本低，对环境污染危害小，同时可以降低生产成本。
2、明提供了离子液体/水双液相***中15α羟基化左旋乙基甾烯双酮制备的工艺，并将离子液体/水双液相体系设计用于全细胞生物催化，解决了底物和产物在水相中溶解度低、有机溶剂对于细胞具有毒性等问题，在4‰投料量情况下，其转化率最高可达80％以上，操作工艺简便，既符合了绿色环保的时代特征，又达到了降低生产成本的目的，具有一定的工业化应用前景，对于我国制药行业以及计划生育政策的实施具有重要的意义。
3、本发明在离子液体/水双液相***中合成甾体药物“孕二烯酮”的关键中间体15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的生物催化制备方法，15α羟基化左旋乙基甾烯双酮是合成“孕二烯酮”的关键中间体，对于我国制药行业以及计划生育政策的实施具有重要的意义。
4、本发明所用的离子液体是在室温(或稍高于室温的温度)下呈液态的离子体系，通过组合大量的有机阳离子和大量无机阴离子的方法可以使离子液体的种类增加，较多可能的合成种类使得离子液体被称为“可设计的溶剂”，同时，离子液体具有导电性、不挥发、不燃烧等特点，对细胞的毒性较小甚至没有，并消除了使用挥发性的有机溶剂所带来的安全隐患和对环境的污染，从而获得了“绿色”溶剂的称呼，被广泛应用于生物催化反应中。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本申请所用的各种方法和原料如下：
1制备材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种：菌种来源：雷斯青霉(Penicillium raistrickii)ATCC 10490(购自美国典型菌种保藏中心)。
1.1.2仪器与分析条件
高效液相色谱***：色谱柱为ODS-2HPERSI1C18柱：流动相甲醇∶水＝80∶20；柱温20℃；检测波长241nm，含量用外标峰面积法计算。
1.2实施方法
1.2.1培养基
斜面培养基(M1，wt％)：葡萄糖1.5，麦芽糖2，蛋白胨0.1，琼脂2，pH自然，100g水中加入上述物质，质量百分含量。
种子培养基(M2，wt％)：葡萄糖3，玉米浆1，NaNO30.2，KH2PO40.1，MgSO40.05，FeSO40.002，KCl 0.05，K2HPO40.2，pH 7.2～7.5，100g水中加入上述物质，质量百分含量。
1.2.2培养条件
斜面：温度28～32℃，生长周期5～7d。
菌丝发酵液：温度28～32℃，接种量108～1011个/ml，转速160～200r/min，培养时间24～48h。
转化条件：温度28～32℃，转速160～200r/min。
1.2.3制备步骤
(1)孢子悬液的制备：将雷斯青霉Penicillium raistrickii(ATCC 10490)接种到斜面培养基上，经培养后用无菌水(含量为1‰的Tween-80水溶液)将斜面孢子洗下，制备出孢子悬液；
(2)菌丝培养：将已制备好的孢子悬液接入到发酵培养基中，接种量为108～1011个/ml，培养温度为28～32℃，培养时间24～48h，培养成熟后所得球状菌丝体经抽滤获得菌饼；
所用到的生物催化剂为培养时间为18～72h直径大小为0.9～3.0mm的雷斯青霉球状菌丝体；投入到离子液体/水两相***的水相中的菌球重量占水相质量的5～8％。
(3)双液相体系中的生物转化：将抽滤得到的菌饼投入到离子液体/水两相***的水相中，菌饼与水相的质量比至少为5％，再加入离子液体，同时采用干粉投料的方式将底物左旋乙基甾烯双酮(粒度为14～16μ)加入到离子液体/水双液相***中进行微生物转化，投料量为2‰～4‰，温度为25～30℃，摇床转速为160～200r/min，转化时间为48～96h；
(4)产物转化率的测定分析：底物被转化完全后，取样，并通过高效液相色谱测定其产物转化率。
1.2.4产物转化率的计算方法
底物转化完成后，将两相中的样品分别进行处理，其中水相中的液相样品制备方法为：分别取水相中的转化液500μl于离心管中，加入等体积乙酸乙酯，萃取30min，12000r/min下离心5min，取上清100μl挥干乙酸乙酯，加入1ml甲醇溶解，再通过高效液相色谱法测定目的产物在水相中的含量；离子液体相中的液相样品制备方法为：底物转化完成后，取离子液体相中的转化液100μL，加入900μL甲醇，直接稀释通过HPLC检测即可。
整个体系中的目的产物量的计算公式为：总目的产物测量值(g)＝水相中目的产物测量值(g)+离子液体相中目的产物测量值(g)。
产物15α羟基左旋乙基甾烯双酮产率的计算公式为：产率(％)＝总目的产物测量值(g)/目的产物理论值(g)×100％。
采用高效液相色谱***，色谱柱为ODS-2HPERSIL C18柱，流动相为甲醇∶水＝80∶20，柱温为20℃，检测波长为241nm，含量用外标峰面积法计算。
具体转化实施示例
本专利所用的离子液体为非水溶性离子液体，与水能形成互不相溶的两相。
实施例1
一种15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的制备方法，本实施例采用pH为5.8的磷酸缓冲液作为水相，离子液体相选取离子液体1-丁基-3甲基咪唑六氟磷酸盐，即[BMIM][PF6]，V(离子液体相)∶V(水)＝0.25∶1，双液相体系总装液量为30ml，步骤是：
(1)孢子悬液的制备：将雷斯青霉Penicillium raistrickii(ATCC 10490)接种到斜面培养基上，经培养后用无菌水(含量为质量百分比1‰的Tween-80水溶液)将斜面孢子洗下，制备出孢子悬液；
(2)菌丝培养：将已制备好的孢子悬液接入到发酵培养基中，接种量为109个/ml，培养温度为28℃，培养时间36h，培养成熟后所得球状菌丝体经抽滤获得菌饼；
(3)双液相体系中的生物转化：将抽滤得到的菌饼投入到离子液体/水两相***的水相中，投入的菌饼与水相的质量比至少为5％；再加入离子液体，同时采用干粉投料的方式将底物左旋乙基甾烯双酮(粒度为14～16μ)加入到离子液体/水双液相***中进行微生物转化，投料量的重量百分比为3‰，温度为28℃，摇床转速为180r/min，转化时间为96h；
(4)产物转化率的测定分析：底物转化完成后，将两相中的样品分别进行处理，其中水相中的液相样品制备方法为：分别取水相中的转化液500μl于离心管中，加入等体积乙酸乙酯，萃取30min，12000r/min下离心5min，取上清100μl挥干乙酸乙酯，加入1ml甲醇溶解，再通过高效液相色谱法测定目的产物在水相中的含量；离子液体相中的液相样品制备方法为：底物转化完成后，取离子液体相中的转化液100μL，加入900μL甲醇，直接稀释检测即可，并通过HPLC方法进行检测。
整个体系中的目的产物量的计算公式为：总目的产物测量值(g)＝水相中目的产物测量值(g)+离子液体相中目的产物测量值(g)。
产物15α羟基左旋乙基甾烯双酮产率的计算公式为：产率(％)＝总目的产物测量值(g)/目的产物理论值(g)×100％。
分析测定转化率，转化率为82％。
实施例2
一种15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的制备方法，本实施例采用pH为5.8的磷酸缓冲液作为水相，离子液体相选取离子液体1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，即[HMIM][PF6]，V(离子液体相)∶V(水)＝0.5∶1，双液相体系总装液量为30ml，步骤是：
(1)孢子悬液的制备：将雷斯青霉Penicillium raistrickii(ATCC 10490)接种到斜面培养基上，经培养后用无菌水(含量为1‰(m/m)的Tween-80水溶液)将斜面孢子洗下，制备出孢子悬液；
(2)菌丝培养：将已制备好的孢子悬液接入到发酵培养基中，接种量为109个/ml，培养温度为28℃，培养时间36h，培养成熟后所得球状菌丝体经抽滤获得菌饼；
(3)双液相体系中的生物转化：将抽滤得到的菌饼投入到离子液体/水两相***的水相中，再加入离子液体，同时采用干粉投料的方式将底物左旋乙基甾烯双酮(粒度为14～16μ)加入到离子液体/水双液相***中进行微生物转化，投料量为4‰(m/m)，温度为28℃，摇床转速为180r/min，转化时间为72h；
(4)产物转化率的测定分析：底物转化完成后，将两相中的样品分别进行处理，其中水相中的液相样品制备方法为：分别取水相中的转化液500μl于离心管中，加入等体积乙酸乙酯，萃取30min，12000r/min下离心5min，取上清100μl挥干乙酸乙酯，加入1ml甲醇溶解，再通过高效液相色谱法测定目的产物在水相中的含量；离子液体相中的液相样品制备方法为：底物转化完成后，取离子液体相中的转化液100μL，加入900μL甲醇，直接稀释检测即可，并通过HPLC方法进行检测。
整个体系中的目的产物量的计算公式为：总目的产物测量值(g)＝水相中目的产物测量值(g)+离子液体相中目的产物测量值(g)。
产物15α羟基左旋乙基甾烯双酮产率的计算公式为：产率(％)＝总目的产物测量值(g)/目的产物理论值(g)×100％。
分析测定转化率，转化率为84％。
实施例3
一种离子液体/水两相***中催化制备15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的方法，本实施例采用pH为5.8的磷酸缓冲液作为水相，离子液体相选取离子液体1-丁基-3-甲基咪唑双三氟甲烷磺酰亚胺盐，即[BMIM][NTF]，V(离子液体相)∶V(水)＝0.5∶1，双液相体系总装液量为50ml，步骤是：
(1)孢子悬液的制备：将雷斯青霉Penicillium raistrickii(ATCC 10490)接种到斜面培养基上，经培养后用无菌水(含量为1‰的Tween-80水溶液)将斜面孢子洗下，制备出孢子悬液；
(2)菌丝培养：将已制备好的孢子悬液接入到发酵培养基中，接种量为109个/ml，培养温度为28℃，培养时间36h，培养成熟后所得球状菌丝体经抽滤获得菌饼；
(3)双液相体系中的生物转化：将抽滤得到的菌饼投入到离子液体/水两相***的水相中，再加入离子液体，同时采用干粉投料的方式将底物左旋乙基甾烯双酮(粒度为14～16μ)加入到离子液体/水双液相***中进行微生物转化，投料量为3‰，温度为28℃，摇床转速为180r/min，转化时间为72h；
(4)产物转化率的测定分析：底物转化完成后，将两相中的样品分别进行处理，其中水相中的液相样品制备方法为：分别取水相中的转化液500μl于离心管中，加入等体积乙酸乙酯，萃取30min，12000r/min下离心5min，取上清100μl挥干乙酸乙酯，加入1ml甲醇溶解，再通过高效液相色谱法测定目的产物在水相中的含量；离子液体相中的液相样品制备方法为：底物转化完成后，取离子液体相中的转化液100μL，加入900μL甲醇，直接稀释检测即可，并通过HPLC方法进行检测。
整个体系中的目的产物量的计算公式为：总目的产物测量值(g)＝水相中目的产物测量值(g)+离子液体相中目的产物测量值(g)。
产物15α羟基左旋乙基甾烯双酮产率的计算公式为：产率(％)＝总目的产物测量值(g)/目的产物理论值(g)×100％。
分析测定转化率，转化率为92％。
Claims (3)
1.一种15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的制备方法，包括雷斯青霉PenicilliumraistrickiiATCC10490发酵、加入底物左旋乙基甾烯双酮进行生物转化，其特征在于：所述生物转化的体系由离子液体和缓冲液相构成，其中离子液体相和缓冲液相的体积比为如下：
离子液体相[BMIM][PF6]：缓冲液相=0.25:1，
离子液体相[HMIM][PF6]：缓冲液相=0.5:1，
离子液体相[BMIM][NTF]：缓冲液相=0.5:1，
所述缓冲液相为pH5.8的磷酸缓冲液；
所述底物左旋乙基甾烯双酮进行生物转化的底物投料量的重量百分比为2～7‰，温度为25～30℃，摇床转速为160～200r/min，转化时间为90～100h；
所述雷斯青霉Penicillium raistrickiiATCC10490发酵步骤为：
⑴孢子悬液的制备：将雷斯青霉Penicillium raistrickiiATCC10490接种到斜面培养基上，经培养后用无菌水，含量为质量百分比1‰的Tween-80水溶液，将斜面孢子洗下，制备出孢子悬液；
⑵菌丝培养：将已制备好的孢子悬液接入到发酵培养基中，培养温度28～32℃，接种量为108～1011个/ml，摇床转速为160～200r/min，培养时间为24～72h；培养成熟后所得球状菌丝体经抽滤获得菌饼。
2.根据权利要求1所述的15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的制备方法，其特征在于：所述斜面培养基wt%：葡萄糖1.5，麦芽糖2，蛋白胨0.1，琼脂2，pH自然；所述发酵培养基wt%：葡萄糖3，玉米浆1，NaNO30.2，KH2PO40.1，MgSO40.05，FeSO40.002，KCl0.05，K2HPO40.2，pH7.2～7.5。
3.根据权利要求1所述的15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的制备方法，其特征在于：将所述经抽滤得到的菌饼投入到缓冲液相中，再加入离子液体相，同时以干粉投料的方式将底物投入到离子液体相/缓冲液相***中进行微生物转化。
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