CN102277455A - 猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒检测用引物、探针及检测试剂盒 - Google Patents
猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒检测用引物、探针及检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒检测用引物、探针及检测试剂盒。所述检测用引物和探针为序列表SEQIDNO:1至SEQIDNO:9,本发明还提供了猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的检测试剂盒。本发明所选引物和探针特异性非常强,一次能检测三种病毒,节约成本、减少步骤,提高效率。本发明方法具有高特异性、高灵敏度,高效率、低成本的特点,适合较大量样品的分析。
Description
技术领域
本发明涉及猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒检测用引物、探针及检测试剂盒。
背景技术
猪圆环病毒2型(Porcine circocirus type2,PCV-2)、猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)和猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是目前常见的引起猪繁殖障碍病的DNA病毒。目前,很多猪场都同时存在上述三种病毒引起的疾病,给养猪业造成巨大的经济损失。以上三种病毒常呈现混合感染,在临床上以受感染母猪产死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔猪为主要特征,不容易区分。
国内外猪病现有常用诊断技术主要包括:临床诊断、病原诊断、血清学诊断,分子生物学诊断等。临床诊断主要依据流行病学、临床症状和尸体剖检来判断疾病种类,难以做到确诊。病原分离是最经典和可靠的病原诊断方法,特异性高,可直接确诊,但病毒分离所需时间较长,成本较高。血清学检测技术有血清中和试验(Neutralization test)、凝集性试验(Agglutination test)、荧光抗体技术(Fluorescent-labelled abtibody technic)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、斑点金免疫渗滤法、胶体金免疫层析法(colloidal gold immunochromatography)等。荧光抗体技术具有快速、鉴别准确、可靠、分辨率高等优点,但费用昂贵(需配备荧光显微镜)、特异性差、主观性强(需有经验的检验员),同时难区分非特异性染色。其他血清学技术主要用于检测血清抗体水平。目前最常用的血清学诊断方法是ELISA,应用很广,发展很快,是检测抗体的主要免疫学方法,也是监测猪群抗体水平的主要技术手段,常用于规模化养猪场的免疫水平监测。分子生物学检测技术包括聚合酶链式反应(PCR)、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(Real Time Quantitative PCR)、实时荧光定量RT-PCR(Real Time Quantitative RT-PCR)核酸探针技术、基因芯片检测技术等。常规单项PCR及实时定量PCR一次只能检测一种病毒,费时费力,多种病因混合感染时,难以应用常规方法进行早期快速检测。多重PCR及实时定量PCR可以同时检测多种病毒,方便快捷,省时省力。
本发明首次将实时定量PCR技术应用于同时检测猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒检测领域,提供了针对猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒检测的特异性引物、探针序列、试剂盒和检测方法。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的同时检测猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的核苷酸序列,包括引物和探针。
本发明要解决的第二个技术问题是提供快速、准确、使用方便的同时检测猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的检测试剂盒。
为解决上述技术问题,本发明采用以下技术方案:
本发明提供了检测猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的引物和探针,具体如下:
1. 通过序列比较,根据PCV ORF2 基因的序列 (GenBank:EU257513),在其保守区设计一对引物及一条探针:
1)PCV正义引物(PCV-F) 5' CCTCCCGCCATACCATAACC 3' (SEQ ID NO:1);
2)PCV反义引物(PCV-R)5' CTGATTTCTTTTGTTGTTTGGTTGG 3' (SEQ ID NO:2);
3)PCV探针(PCV-probe)5' (FAM) CCCTTCTCCTACCACTCCCGSTACTTTAC (ECLIPSE) 3' (SEQ ID NO:3),该探针的5’端标记报告荧光基团FAM,3’端标记淬灭荧光基团ECLIPSE;
其中,S代表兼并碱基G或C。
2. 通过序列比较,根据PRV gH基因的序列(GenBank:X58868),在其保守区设计一对引物及一条探针:
4)PRV 正义引物(PRV-F)5'ACATGGAGGAGCAGCTCATG 3',(SEQ ID NO:4);
5)PRV 反义引物(PRV- R)5' AAGAGCATCAGGGCCTTGAC 3',(SEQ ID NO:5);
6)PRV 探针(PRV- probe):
5’ (TAMARA )CGCCAACTCCACCATCCCCAGC(ECLIPSE) 3’, (SEQ ID NO:6)。
3. 通过序列比较,根据PPV VP2基因的序列(GenBank:DQ464345),在其保守区设计一对引物及一条探针:
7)PPV正义引物(PPV-F)5’ CAAGAAATATTCAATGTAGTRCTTAAAAC 3’ (SEQ ID NO:6);
8)PPV反义引物(PPV-R)5’ GTGTGTATGGAAGTGTGTTATTGG 3’ (SEQ ID NO:7);
9)PPV 探针(PPV-probe)
5’ (JOE) CAGAATCAGCAACCTCACCACCAACCAA (ECLIPSE) 3’ (SEQ ID NO:9),该探针的5’端标记报告荧光基团JOE,3’端标记淬灭荧光基团ECLIPSE;
其中,R代表兼并碱基A或T。
本发明还提供了一种猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的检测试剂盒,由以下组分组成:
1)DNA提取试剂;通常可以使用商业购买的DNA提取试剂盒或使用常规SDS裂解法中通常使用的各种试剂,DNA提取试剂盒可以选择例如上海***生物科技有限公司的DNA提取试剂盒(Genomic DNA Purification kit,cat.no K201);
2)DNA标准品:含猪圆环病毒靶基因的T载体质粒,含猪伪狂犬病毒靶基因的T载体质粒和含猪细小病毒靶基因的T载体质粒;
3)实时定量PCR反应液,其包括:含有TaqDNA聚合酶、dNTP的PCR缓冲液,检测猪圆环病毒的正义引物、反义引物和荧光探针,检测猪伪狂犬病毒的正义引物、反义引物和荧光探针,检测猪细小病毒的正义引物、反义引物和荧光探针,荧光定量PCR参比染料;
优选使用:1×含有TaqDNA聚合酶、dNTP PCR缓冲液,检测猪圆环病毒的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM,检测猪伪狂犬病毒的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM,检测猪细小病毒的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM, 1×荧光定量PCR参比染料;
进一步地,所述含有Taq DNA聚合酶、dNTP的PCR缓冲液为premix Ex TaqTM,购自Takra,货号(DRR039),所述荧光定量PCR参比染料为ROX Reference Dye购自大连宝生物公司,货号(DR0X01),所述引物和探针均委托大连宝生物公司合成。
所述premix Ex TaqTM为2×实时定量PCR缓冲液,包含有以下成分:Taq DNA聚合酶,200U;dNTP,5mM;MgCL2,5mM;KCl , 100 mM; Tris-HCl,20 mM;0.2% Triton X-100。
4)阴性对照:DEPC水;
5)DEPC水;1mL x2管,自来水两次蒸馏,经过Millipore 纯水仪纯化,电阻率大于18.0MΩ.CM。
其中,检测猪圆环病毒的正义引物为序列表SEQ ID No:1所示的核苷酸序列,反义引物为序列表SEQ ID No:2所示的核苷酸序列,荧光探针为序列表SEQ ID No:3所示的核苷酸序列,其5’端标记报告荧光基团FAM,3’端标记淬灭荧光基团ECLIPSE;检测猪伪狂犬病毒的正义引物为序列表SEQ ID No:4所示的核苷酸序列,反义引物为序列表SEQ ID No:5所示的核苷酸序列,荧光探针为序列表SEQ ID No:6所示的核苷酸序列,其5’端标记报告荧光基团TAMARA,3’端标记淬灭荧光基团ECLIPSE;检测猪细小病毒的正义引物为序列表SEQ ID No:7所示的核苷酸序列,反义引物为序列表SEQ ID No:8所示的核苷酸序列,荧光探针为序列表SEQ ID No:9所示的核苷酸序列,其5’端标记报告荧光基团JOE,3’端标记淬灭荧光基团ECLIPSE。
本发明还提供了上述猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的检测试剂盒的使用方法:
1.样品采集、运送及制备
临床发病的猪场,采集病死猪的肾、脾和***,用50mL离心管收集,置于4℃保鲜盒中,运送回实验室。取100mg肾、脾和***,加入500μL的0.01M PBS液,用组织捣碎机捣碎,4000rpm离心20 min,取上清200μL。-70℃冻存备用。
2.DNA提取
有两种方法:试剂盒法和SDS裂解法
试剂盒法:
按照上海***生物科技有限公司的DNA提取试剂盒(Genomic DNA Purification kit,cat.no K201)提供的方法提取病毒DNA,具体方法如下:
1)取400μL 裂解液移入到1.5ml 离心管中。
2)加入200μL病料上清液,在漩涡振荡器上混匀(15s),加入3μL(120μg)蛋白酶K;混匀,55℃保温10-60分钟。
3)高速室温12000转、分离心5分钟,将上清转移到1.5ml无菌离心管中,加入300μl SolutionB,混匀。
4)将样品全部转移到3S柱,柱子放入2ml收集管中,盖上离心管盖子,12000转,室温离心1分钟。
5)取下3S柱,弃去离心管中的废液。将柱子放回同一根离心管中,加入500μL Wash Solution,12000转室温离心1分钟。
6)重复步骤5);
7)取下3S柱,弃去离心管中的全部废液。将柱子放回同一根离心管中, 10000转室温离心2分钟,以出去残余的Wash Solution。
8)把柱子放进1.5ml 无菌离心管中,弃去收集管,小心打开盖子,加入80μL TE,盖上盖子,室温或37-55℃放置2分钟,12000转室温离心1分钟,弃去柱子,1.5ml 离心管中即为病毒DNA。
SDS裂解法:
1)取病料200μL,加入等体积样品裂解缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.4, 20mMEDTA,1% SDS)及10μL 200μg/mL的蛋白酶K, 56℃水浴30分钟,
2)5000转/分钟, 离心15分钟。
3)酚∶氯仿、氯仿各抽提一次,吸取水相。
4)用2.5倍样品体积的异丙醇-70℃沉淀 DNA 30分钟,10000转/分钟离心10分钟。
5)70%预冷乙醇洗涤2次,自然干燥后用200μL TE(10 mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH8.0)溶解,加入50μg/mL 的RNase A,37℃作用1小时。
3. 实时定量RT-PCR反应:
96孔PCR板,第一排12孔作为标准曲线和阴性对照孔,其余为样品检测孔。
反应体系为20μL,见表1:
表1
其中,含有TaqDNA聚合酶、dNTP的PCR缓冲液为premix Ex Taq TM ,荧光定量PCR参比染料为ROX Reference Dye。
所述的模板DNA ,如果是制作标准曲线,用体外转录的DNA标准品作为模板,浓度为101~108,如果是样品检测,用腹泻物提取的DNA为模板,阴性对照模板为DEPC水,
检测条件为:在ABI7300荧光定量PCR仪上进行反应,反应条件为95℃10秒钟,然后经过95℃5秒钟,60℃30秒钟40个循环。
本发明的优点是:
本发明试剂盒在一个PCR管中同时检测三种病毒,大大提高了检测效率,并能做到鉴别诊断三种病毒。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法,所用的试验材料,如无特殊说明,均为常规生化试剂供应商购买得到。
实施例1、试剂盒的组成
一、试剂盒的组成
1)DNA提取试剂;上海***生物科技有限公司的DNA提取试剂盒(Genomic DNA Purification kit,cat.no K201);
2)DNA标准品:含猪圆环病毒靶基因的T载体质粒,含猪伪狂犬病毒靶基因的T载体质粒和含猪细小病毒靶基因的T载体质粒;
3)实时定量PCR反应液,其包括:1×含有Taq DNA聚合酶、dNTP的PCR缓冲液,检测猪圆环病毒的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM,检测猪伪狂犬病毒的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM,检测猪细小病毒的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM, 1×荧光定量PCR参比染料;
进一步地,所述含有Taq DNA聚合酶、dNTP的PCR缓冲液为premix Ex TaqTM,购自Takra,货号(DRR039),所述荧光定量PCR参比染料为ROX Reference Dye购自大连宝生物公司,货号(DR0X01),所述引物和探针均委托大连宝生物公司合成。
4)阴性对照:DEPC水;
5)DEPC水;1mL x2管,自来水两次蒸馏,经过Millipore 纯水仪纯化,电阻率大于18.0MΩ.CM。
其中,检测猪圆环病毒的正义引物为序列表SEQ ID No:1所示的核苷酸序列,反义引物为序列表SEQ ID No:2所示的核苷酸序列,荧光探针为序列表SEQ ID No:3所示的核苷酸序列,其5’端标记报告荧光基团FAM,3’端标记淬灭荧光基团ECLIPSE;检测猪伪狂犬病毒的正义引物为序列表SEQ ID No:4所示的核苷酸序列,反义引物为序列表SEQ ID No:5所示的核苷酸序列,荧光探针为序列表SEQ ID No:6所示的核苷酸序列,其5’端标记报告荧光基团TAMARA,3’端标记淬灭荧光基团ECLIPSE;检测猪细小病毒的正义引物为序列表SEQ ID No:7所示的核苷酸序列,反义引物为序列表SEQ ID No:8所示的核苷酸序列,荧光探针为序列表SEQ ID No:9所示的核苷酸序列,其5’端标记报告荧光基团JOE,3’端标记淬灭荧光基团ECLIPSE。
二、DNA标准品的制备
(1)猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒基因的PCR扩增
利用上海***公司的DNA提取试剂盒(上海***生物科技有限公司的DNA提取试剂盒(Genomic DNA Purification kit,cat.no K201)),从冻存的PPV和PRV细胞毒以及PCV病料(PPV购于中国兽药监查所,PRV购自武汉科前动物生物制品有限责任公司,PCV为浙江省农业科学院分离鉴定保存)中提取病毒DNA,并以此为模板,分别以PCV(F) 和PCV(R)、PRV(F)和PRV(R)、PPV(F)和PPV(R)为上下游引物扩增目的基因,得到113bp、94bp和133bp大小的DNA片段,与预期大小相符。
(2)猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒基因的T载体克隆
将猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒基因的PCR产物经DNA纯化试剂盒纯化后连接到大连宝生物公司购买的pMD18-T载体中,转化Top10感受态细胞,筛选出阳性克隆,送Invitrogen公司测序验证。
(3)猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒实时定量PCR标准品的制备
验证序列正确后大量提取阳性质粒,并纯化,测其浓度和纯度,-20℃保存,做标准品备用。
实施例2利用DNA标准品建立标准曲线
将上述已经测出的质粒DNA(PCV-T、PRV-T、PPV-T)的浓度,利用公式:(6.02 x 1023拷贝数/摩尔) x (浓度g/ml) x10-3 / (MW g/mol) = 拷贝/μl,分别计算出PCV-T、PRV-T和PPV-T拷贝数,共同十倍稀释,以103~107拷贝/μl的RNA为模板,在ABI7300荧光定量PCR仪上进行反应,反应体系为20μl,其中2 x premix Ex TaqTM 10μl,PCV(F) 和PCV(R)、PPV(F)和PPV(R)、PRV(F)和PRV(R) (20μM)各0.2μl, PCV-Probe、PPV- Probe 和PRV- Probe (20μM) 各0.4μl,ROX Reference Dye (50x) 0.4μl,模板DNA 2μl,DDW至20μl。反应条件为95℃10秒钟,然后经过95℃ 5秒钟,60℃30秒钟40个循环。利用软件对数据进行分析,得到标准曲线。其R值分别为0.994587(PCV)、0.997931(PRV)、0.997765(PPV)。
实施例3、试剂盒的特异性试验
1材料,见表2:
病毒 | 来源 |
猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒 | 上海海利生物药品有限公司 |
猪圆环病毒 | 浙江省农科院畜牧兽医研究所猪病组分离鉴定保存 |
猪伪狂犬病毒 | 武汉科前动物生物制品有限责任公司 |
猪细小病毒 | 购于中国兽药监察所 |
猪瘟病毒 | 南京天邦猪瘟细胞苗 |
猪乙型脑炎病毒 | 湖南亚华种业股份有限公司生物药厂 |
猪轮状病毒 | 浙江省农科院畜牧兽医研究所猪病组分离鉴定保存 |
猪大肠杆菌 | 浙江省农科院畜牧兽医研究所猪病组分离鉴定保存 |
副猪嗜血杆菌 | 浙江省农科院畜牧兽医研究所猪病组分离鉴定保存 |
猪链球菌 | 浙江省农科院畜牧兽医研究所猪病组分离鉴定保存 |
2 方法:
利用本发明所述的试剂盒使用方法对猪常见病毒病进行检测,同时以105浓度的质粒DNA为阳性控制,验证其特异性。
3 结果
本发明试剂盒对7种猪常见病毒病和3种细菌病进行检测,只有阳性控制出现扩增曲线,结果表明,所建立的方法特异性良好。
实施例4 试剂盒的敏感性检测
1材料:
猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒T载体质粒标准品。
2 方法:
为了验证本发明试剂盒的敏感性,以10倍稀释的猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒T载体质粒标准品(2×100~2×107拷贝/μL)为模板,每个稀释度的模板分别加2μl,同时设阴性对照,每个样品平行做3个孔。按照所建立的方法,在定量PCR仪上进行扩增反应。
3 结果:
经过定量PCR仪上扩增,得出动力学曲线和标准曲线,当模板为2×10拷贝/μl 时,其CT值仍在可检测范围内(CT<40),表明本实验所建立的方法最低能检测到2×10拷贝/μl的D NA。
实施例5 批间重复和批内重复
(1)材料
猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒T载体质粒标准品
(2)方法
批内重复试验
同一时间提取的猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒T载体质粒标准品,每组进行四个平行,均设阴性空白对照,按照建立的方法进行实时定量PCR。
批间重复试验
在3个不同时间提取猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒T载体质粒标准品,每组进行四个平行,均设阴性空白对照,按照建立的方法进行实时定量PCR。
(3)结果
按照进行了批间重复实验和批内重复实验,最后利用统计学方法对所得数据进行分析处理,结果显示猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒 Ct值变异系数CV%均不超过2%(表1,2),从而表明该检测方法具有很好的稳定性。
表3检测4份不同批次试剂盒批间重复检测结果
1 | 2 | 3 | 4 | |
PCV Mean Ct±S.D | 12.61±0.13 | 16.58±0.07 | 21.01±0.25 | 25.20±0.10 |
变异系数CV(%) | 0.27 | 0.08 | 0.64 | 0.17 |
PRV Mean Ct±S.D | 12.59±0.13 | 17.91±0.04 | 22.69±0.14 | 26.35±0.16 |
变异系数CV(%) | 0.27 | 0.22 | 0.04 | 0.23 |
PPV Mean Ct±S.D | 12.59±0.13 | 17.91±0.04 | 22.69±0.14 | 26.35±0.16 |
变异系数CV(%) | 0.27 | 0.22 | 0.04 | 0.23 |
表4检测4份不同批次试剂盒批内重复检测结果
1 | 2 | 3 | 4 | |
PCV Mean Ct±S.D | 10.09±0.10 | 14.22±0.04 | 18.19±0.08 | 22.34±0.26 |
变异系数CV(%) | 0.14 | 0.05 | 0.09 | 0.11 |
PRV Mean Ct±S.D | 16.58±0.07 | 19.00±0.01 | 26.56±0.05 | 33.26±0.06 |
变异系数CV(%) | 0.08 | 0.03 | 0.16 | 0.17 |
PPV Mean Ct±S.D | 14.09±0.07 | 18.30±0.17 | 22.69±0.11 | 26.83±0.04 |
变异系数CV(%) | 0.08 | 0.13 | 0.03 | 0.19 |
实施例6 临床验证
利用本实验建立的TaqMan三重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒,对从浙江7个县市采集到的30份猪病料样品进行猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的检测,同时设阴阳性对照。检测结果为:30份腹泻粪样品中PCV阳性19份,阳性率为63.3%;PPV阳性4份,阳性率为13.4%;PRV阳性2份,阳性率为6.7%。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒检测用引物、探针及检测试剂盒
<130>
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成PCV正义引物(PCV-F)
<400> 1
cctcccgcca taccataacc 20
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成PCV反义引物(PCV-R)
<400> 2
ctgatttctt ttgttgtttg gttgg 25
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成PCV探针(PCV-probe)
<400> 3
cccttctcct accactcccg stactttac 29
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成PRV 正义引物(PRV-F)
<400> 4
acatggagga gcagctcatg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成PRV 反义引物(PRV- R)
<400> 5
aagagcatca gggccttgac 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成PRV 探针(PRV- probe)
<400> 6
cgccaactcc accatcccca gc 22
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成PPV正义引物(PPV-F)
<400> 7
caagaaatat tcaatgtagt rcttaaaac 29
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成PPV反义引物(PPV-R
<400> 8
gtgtgtatgg aagtgtgtta ttgg 24
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成PPV 探针(PPV-probe)
<400> 9
cagaatcagc aacctcacca ccaaccaa 28
Claims (8)
1.一组检测猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的核苷酸引物和探针,其特征在于,所述核苷酸引物和探针为序列表SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:9,其中序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2分别为检测猪圆环病毒的正义引物和反义引物,序列SEQ ID NO:3为检测猪圆环病毒的荧光探针,序列SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5分别为检测猪伪狂犬病毒的正义引物和反义引物,序列SEQ ID NO:6为检测猪伪狂犬病毒的荧光探针,序列SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8分别为检测猪细小病的正义引物和反义引物,序列SEQ ID NO:9为检测猪细小病的荧光探针。
2.根据权利要求1所述的检测猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的核苷酸引物和探针,其特征在于:所述探针SEQ ID NO:3的5’端标记报告荧光基团FAM,3’端标记淬灭荧光基团ECLIPSE。
3.根据权利要求1所述的检测猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的核苷酸引物和探针,其特征在于:所述探针SEQ ID NO:6的5’端标记报告荧光基团TAMARA,3’端标记淬灭荧光基团ECLIPSE。
4.根据权利要求1所述的检测猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的核苷酸引物和探针,其特征在于:所述探针SEQ ID NO:9的5’端标记报告荧光基团JOE,3’端标记淬灭荧光基团ECLIPSE。
5.一种猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的检测试剂盒,其特征在于,由以下组分组成:
1)DNA提取试剂;
2)DNA标准品:含猪圆环病毒靶基因的T载体质粒,含猪伪狂犬病毒靶基因的T载体质粒和含猪细小病毒靶基因的T载体质粒;
3)实时定量PCR反应液,其包括:含有TaqDNA聚合酶、dNTP的PCR缓冲液,检测猪圆环病毒的正义引物、反义引物和荧光探针,检测猪伪狂犬病毒的正义引物、反义引物和荧光探针,检测猪细小病毒的正义引物、反义引物和荧光探针,荧光定量PCR参比染料;
4)阴性对照:DEPC水;
5)DEPT水;
其中,检测猪圆环病毒的正义引物为序列表SEQ ID No:1所示的核苷酸序列,反义引物为序列表SEQ ID No:2所示的核苷酸序列,荧光探针为序列表SEQ ID No:3所示的核苷酸序列,其5’端标记报告荧光基团FAM,3’端标记淬灭荧光基团ECLIPSE;检测猪伪狂犬病毒的正义引物为序列表SEQ ID No:4所示的核苷酸序列,反义引物为序列表SEQ ID No:5所示的核苷酸序列,荧光探针为序列表SEQ ID No:6所示的核苷酸序列,其5’端标记报告荧光基团TAMARA,3’端标记淬灭荧光基团ECLIPSE;检测猪细小病毒的正义引物为序列表SEQ ID No:7所示的核苷酸序列,反义引物为序列表SEQ ID No:8所示的核苷酸序列,荧光探针为序列表SEQ ID No:9所示的核苷酸序列,其5’端标记报告荧光基团JOE,3’端标记淬灭荧光基团ECLIPSE。
6.根据权利要求5所述的猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的检测试剂盒,其特征在于,所述DNA提取试剂为DNA提取试剂盒。
7.根据权利要求5所述的猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的检测试剂盒,其特征在于,所述实时定量PCR反应液包括:1×含有TaqDNA聚合酶、dNTP的PCR缓冲液,检测猪圆环病毒的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM,检测猪伪狂犬病毒的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM,检测猪细小病毒的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM, 1×荧光定量PCR参比染料。
8.根据权利要求7所述的猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的检测试剂盒,其特征在于,所述含有TaqDNA聚合酶、dNTP的PCR缓冲液为premix Ex Taq TM,所述荧光定量PCR参比染料为ROX Reference Dye。
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