CN102277411B

CN102277411B - IspD抑制剂筛选模型及IspD抑制剂杜米芬的新用途

Info

Publication number: CN102277411B
Application number: CN 201010196922
Authority: CN
Inventors: 肖春玲; 高鹏; 杨延辉; 熊小椒; 关艳; 甘茂罗; 郝雪秦; 刘忆霜
Original assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Current assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Priority date: 2010-06-10
Filing date: 2010-06-10
Publication date: 2013-11-06
Anticipated expiration: 2030-06-10
Also published as: CN102277411A

Abstract

本发明涉及用于IspD抑制剂筛选的试剂组，包括MEP、CTP和IspD，还包括酶反应缓冲液、离子试剂以及用于测定PPi的试剂。本发明还涉及筛选IspD抑制剂的方法。通过此方法从3000多个化合物中筛选出具有抗结核活性的杜米芬。本发明还涉及杜米芬在体内/体外抑制结核分枝杆菌的用途以及杜米芬用于制备抗结核药物的用途。

Description

IspD抑制剂筛选模型及IspD抑制剂杜米芬的新用途

技术领域

本发明涉及化学药物和药物筛选领域，具体地，本发明涉及一种结核杆菌酶IspD抑制剂的筛选模型，以及IspD抑制剂杜米芬用于制备抗结核治疗药物的用途。

背景技术

结核病(Tuberculosis，以下简称为“TB”)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染引起的慢性传染性疾病，严重危害着人类生命健康。现在全球三分之一的人口已经感染了结核分枝杆菌，并且每年新增结核病病例927万例，死亡300万，成为与AIDS、疟疾并称的三大传染病。我国是全球22个结核高负担国家之一，有5.5亿人口感染了TB，患者人数高达550万，居世界第二位，每天新增结核病患者4000多例。

结核分枝杆菌，属于分枝杆菌属，为结核病的病原菌。结核分枝杆菌的耐药已成为当前结核病治疗中所面临的最严重的问题之一，单药耐药、多药耐药甚至严重耐药(极端耐药)的结核分枝杆菌不断出现和传播，使传统的抗TB药物失去了原有的疗效。在过去的三、四十年中，未能开发出真正有效的新型抗TB药物。而且卡介苗的保护率在发达国家也已经低于50％，在中国则更低。为了应对结核病威胁，迫切需要研制新的抗TB药物。

一直以来，细胞壁是筛选抗细菌药物的首选靶点。结核杆菌的细胞壁对于其生长繁殖至关重要，在细胞壁各成分的合成与组装过程中有众多的酶系参与，潜在着多个抗结核药物的新靶点。而且其中多数的酶是人体内所不存在的，因此靶向细胞壁的药物具有较好的选择毒性。

近几年的研究结果表明：在某些细菌、原虫和植物体内存在一条2- 甲基-赤藓糖醇磷酸(methylerythritol phosphate，MEP)途径用于合成类异戊二烯的前体物质异戊酰焦磷酸(isopentenyl diphosphate，IPP)或二甲烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate，DMAPP)。该途径完全不同于哺乳动物和植物胞浆中的甲羟戊酸(MVA)途径。MEP途径合成的类异戊二烯及其衍生物在生物代谢和细胞壁合成中至关重要，因此MEP途径已成为药靶研究的热点。将大肠埃希菌或肠沙门菌MEP途径的某一基因突变或缺失，可引起致死性突变，证实MEP途径对细菌的生存是必需的。由于MEP途径在病原体广泛存在，而不存在于人、动物和植物胞浆中，使得催化该途径的酶成为潜在的、同时又具有选择性的分子靶位。

MEP途径共包含8个酶参与其中，分别为DXS，IspC，IspD，IspE，IspF，IspG，IspH，Idi。其中ispD(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphateCytidyltransferase，2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸胞嘧啶转移酶)为这一途径中的关键基因，负责将MEP和CTP(三磷酸胞苷)催化反应生成CDP-ME(如图1所示)。Dean Crick对该基因进行了温度敏感性突变，证明确实该基因突变结核杆菌无法存活(Hyungjin Eoh，Amanda C.Brown，Lori Buetow，et al.Brennan，and Dean C.Crick.Characterization of the Mycobacterium tuberculosis4-Diphosphocytidyl-2-C-Methyl-d-Erythritol Synthase：Potential for Drug Development.J Bacteriol.2007，189(24)：8922-8927)。但目前尚没有IspD抑制剂的报道，通过筛选结核杆菌的IspD抑制剂有可能发现全新作用机制的抗结核药物。

杜米芬(Domiphen Bromide，DMB)系阳离子型表面活性广谱杀菌剂。其适用于口腔、咽喉感染的辅助治疗和皮肤、器械消毒等。目前尚没有杜米芬作为抗结核药物的报道。

发明内容

为了筛选IspD抑制剂，本发明以IspD为靶标，利用其酶学活性建立IspD抑制剂筛选模型，并评价筛选产物的抗结核活性，最终发现杜米芬具有抗结核杆菌活性。具体地，

本发明的一个方面涉及一种筛选IspD抑制剂的组合试剂，其包括MEP、CTP、IspD和待筛选化合物；还包括酶反应缓冲液和离子试剂，其中所述离子试剂包括MgCl₂、NaF及DTT(二硫苏糖醇)；此外还包括测定MEP、CTP和IspD反应所生成的PPi的试剂，所述试剂优选为β-巯基乙醇和钼酸铵。

其中所述IspD是从能够产生IspD的生物中提取获得或者根据上述生物的基因组序列利用分子生物学方法获得。

优选地，IspD是从结核分枝杆菌中提取获得或者根据结核分枝杆菌基因组序列利用分子生物学方法获得。

在本发明的一个实施方案中，以结核杆菌H37Rv基因组为模版，分别以5’-GTTCATCCATATGGTCAGGGAAGCGGGCGAAGTAGTTGCG-3’(SEQ IDNO：1)和5’-GTCTTATCTCGAGCCCGCGCACTATAGCTTGGGCCAGC-3’(SEQID NO：2)为引物，通过PCR扩增得到ispD基因序列，克隆并转化，得到可高效表达结核杆菌IspD蛋白的大肠杆菌B121(DE3)，IPTG诱导蛋白表达，取表达产物纯化，用于筛选。

本发明的另一方面涉及筛选IspD抑制剂的方法。

该方法的基本原理为：IspD催化结核杆菌细胞壁合成前体CDP-ME的合成(图1)，反应过程中，在生成1mol的产物CDP-ME的同时释放出1mol的焦磷酸(PPi)，PPi生成量直接反映出该酶促反应进行的情况，因而可间接地反映IspD的活性。

PPi生成量的测定可采用放射性方法，将CTP最后一个单磷酸进行放射性标记，通过反应生成的PPi的放射性强度检测反应进程，但该方法有放射性污染，不适于大规模使用；也可采用无机磷酸酶将PPi分解为单磷酸，然后利用显色反应检测，此方法的缺点是该过程中引入了另外的酶，需要反向筛选排除假阳性，增加了筛选步骤。

在本发明中，PPi的测定优选采用吸光度法，反应依据为：在酸性条件下，焦磷酸根与钼酸铵在巯基乙醇存在时形成蓝色产物，该蓝色产物的吸收值与本底(黄色)吸收值的差值在一定范围内与产物生成量呈线性关系，此法可简便可信的检测PPi的生成量(Yu Kuang，NicolasSalem，Fangjing Wang，et al.A Colorimetric Assay Method toMeasure Acetyl-CoA Synthetase Activity：Application toWoodchuck Model of Hepatitis Virusinduced HepatocellularCarcinoma.J Biochem Biophys Methods.2007，70(4)：649-655.)。

该方法包括以下步骤：

a.将CTP、MEP、IspD、待筛选化合物、酶反应缓冲液和离子试剂混合，组成反应体系，孵育，同时设立阳性对照和阴性对照组；

b.进一步加入β-巯基乙醇和钼酸铵，孵育，检测反应体系的光吸收值，得出IspD酶活性；

c.根据光吸收值计算待筛选化合物对IspD活性的抑制率，进而得到对IspD活性有抑制作用的阳性化合物。

其中各化合物的反应终浓度分别为MEP 100μM-1mM，CTP 100μM-1mM，IspD 3.85pmol-385pmol，待筛选化合物1-100μg/ml；在本发明的一个实施方案中，各化合物的反应终浓度分别为MEP 250μM，CTP 500μM，IspD 38.5pmol，待筛选化合物10μg/ml。

其中所述酶反应缓冲液的成份为50mM pH8.0的Tris-HCl，其中所述离子试剂的成份为溶于酶反应缓冲液中的10mM的MgCl₂、20mM NaF及1mM DTT。

其中β-巯基乙醇浓度为1M，其用量为0.1个反应体系体积；其中钼酸胺浓度为2.5％，溶解于2.5M的H₂SO₄中，其用量为0.4个反应体系体积。

在本发明的一个实施方案中，反应体系总体积为100μl，其中CTP和MEP的终浓度分别为500μM和250μM，离子试剂10μl，IspD38.5pmol，待筛选化合物10μg/ml。将上述体系在37℃孵育40min，加入10μl颜色试剂A(1Mβ-巯基乙醇)和40μl颜色试剂B(2.5％钼酸铵溶解至2.5M H₂SO4)后，37℃继续孵育10min，酶标仪在590nm波长下检测反应体系的光吸收值。

其中所述阳性对照组是指反应体系中加入失活的IspD，不加待筛选化合物；其中所述阴性对照组是指反应体系中不加入待筛选化合物。

其中所述根据光吸收值计算抑制率的方法如式(I)所示：

抑制率大于20％视为阳性结果。

利用以上筛选方法，本发明从3000多个化合物中筛选得到5个阳性化合物，阳性率为0.17％，其中10μg/ml的杜米芬对IspD的抑制率为44％。

本发明的再一方面还涉及IspD抑制剂杜米芬在体内/体外抑制分枝杆菌的用途；优选地，所述分枝杆菌为结核分枝杆菌；在本发明的一个实施方案中，所述结核分枝杆菌为结核分枝杆菌H₃₇Rv。因为H₃₇Rv是结核病的代表菌株，因此对H₃₇Rv具有抑制作用的药物通常被视为具有结核病治疗前景的药物。

本发明还涉及杜米芬用于制备抗结核药物的用途。

本发明还涉及IspD在制备用于筛选结核抑制剂的组合物中的用途。

发明的有益效果

本发明利用IspD的酶学活性建立了IspD抑制剂的筛选方法，从3000多个化合物中筛选得到5个阳性化合物，其中10μg/ml的杜米芬对IspD的抑制率达到44％。实验证明杜米芬在体内和体外都具有抗结核活性，是有希望的新的抗结核药物。

附图说明

图1：MEP通路示意图

图2：IspD蛋白催化的反应式

2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)在CTP存在的条件下，由IspD催化生成4-二磷酸胞苷2-C-甲基-D-赤藓糖醇(CDP-ME)，同时释放出PPi。

图3：ispD基因克隆验证电泳图谱

表达质粒pET-28a/ispD经Nde I和Xho I双酶切，获得了720bp的目的片段ispD。泳道1：DNA marker；泳道2：表达质粒经双酶切后获得的720bp的目的片段ispD

图4：ispD基因测序结果

图5：IspD蛋白纯化后SDS-PAGE及western blot验证结果

目的蛋白IspD大小约为26KD。左图为SDS-PAGE图，右图为westernblot图。泳道1：蛋白定量Marker，从上至下分别为80kd，60kd，40kd，30kd，20kd，12kd；泳道2和泳道3：16℃纯化的蛋白IspD；泳道4：蛋白定量Marker，从上至下分别为94kd，62kd，47kd，30kd，24kd，16kd；泳道5和泳道6：纯化蛋白IspD的western检测。

图6：焦磷酸(ppi)浓度标准曲线

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：ispD的克隆

以结核杆菌H₃₇Rv(结核病研究所张建元教授惠赠)基因组为模板，分别以F1：5’-GTTCATCCATATGGTCAGGGAAGCGGGCGAAGTAGTTGCG-3’(SEQID NO：1)和R1：5’-GTCTTATCTCGAGCCCGCGCACTATAGCTTGGGCCAGC-3’(SEQ ID NO：2)为引物，通过PCR扩增ispD基因序列；采用DNA琼脂糖凝胶电泳检测目的基因的扩增结果，然后回收720bp大小的目的片段ispD(图3)。

PCR反应体系：

PCR扩增条件：95℃预变性5min，然后以95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸2min，进行32个反应循环，最后72℃延伸10min。

获得的目的基因ispD与质粒pET28a连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞。通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，对阳性克隆进行PCR和质粒双酶切鉴定，并提取PCR检测及双酶切检测皆为阳性菌株的质粒(pET-28a/ispD)，进行序列测定，结果如SEQ ID NO：3所示(图4)，其中第47位至第744位为ispD序列。

提取阳性菌株中的质粒pET-28a/ispD，转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS菌株，构建高效表达结核杆菌IspD的BL21(DE3)plysS，经过PCR检测和双酶切检测均为阳性、且测序结果正确的工程菌用20％甘油进行菌种保存，冻存于-80℃。

实施例2：IspD蛋白的表达

将冻存的实施例1制备的可高效表达结核杆菌IspD蛋白的大肠杆菌B121(DE3)划线接种于含有100μg/ml卡那霉素(Kan)和37μg/ml氯霉素(Ch1)的LB平板，37℃，过夜培养，挑取单菌落接种于含有100μg/ml Kan和37μg/ml Ch1的LB液体培养基，200r.p.m.，37℃，过夜培养；将过夜培养物按1∶50接种于含有100μg/ml Kan和37μg/mlCh1的新鲜LB液体培养基中，200r.p.m.，37℃，培养至菌体OD₆₀₀≈0.5；培养物中加入IPTG至终浓度为1mmol/L，加入50％酵母浸出物至终浓度0.5％。16℃，200r.p.m.，培养12h，诱导IspD蛋白的表达。

实施例3：IsDD蛋白的纯化及检测

按实施例2的条件培养可高效表达结核杆菌IspD蛋白的大肠杆菌BL21(DE3)plysS，并诱导表达IspD蛋白；10000×g离心10min收集菌体；裂解缓冲液悬浮菌体细胞，冰浴、400W、3s/8s、99次超声破碎菌体细胞，4℃下14000×g离心1h收集上清液；使用

prime***，在pH8.0的条件下，上清液上Hi-trap亲和柱(GE公司，17-5247-01)，用缓冲液进行梯度洗脱，收集洗脱液；收集到的样品加入15ml超滤离心管(10kDa，MilliPore公司)，4℃下5000g离心15min，至样品量小于2.5ml；使用PD-10脱盐柱和脱盐缓冲液将超滤后的样品脱盐。-80℃保存。

通过SDS-PAGE和Western Blot电泳检测纯化后的蛋白IspD(如图5所示)。

实施例4：酶活性分析

反应体系：

10μl离子试剂(含终浓度10mM的MgCl₂、20mM NaF及1mM DTT)；1μg的实施例3获得的纯化的IspD；CTP和MEP(其终浓度分别为500μM和250μM)。

酶反应缓冲液为50mM Tris-HCl(pH8.0)，反应体系总体积为100μl。

设不加IspD或加入热失活的IspD作为对照。

同时设加入8个不同浓度(0μM，25μM，50μM，75μM，100μM，150μM，200μM，250μM)的100μl PPi，在活性测定中绘制吸收值与PPi浓度的标准曲线，通过Excel拟合出相关线形曲线的公式(参见图6)，从而根据公式计算酶的反应进程(如图6)。

活性测定：

将上述体系在37℃孵育40min，加入10μl颜色试剂A(1Mβ-巯基乙醇)和40μl颜色试剂B(2.5％钼酸铵溶解至2.5M H₂SO4)后，37℃ 继续孵育10min，酶标仪在590nm波长下检测反应体系的光吸收值。

结果：

将样品的吸收值参照标准曲线，计算出反应生成的PPi的浓度。将生成的PPi的浓度除以完全反应可能生成的PPi的浓度，作为反应进程。代入公式：

反应进程＝生成的PPi的浓度/完全反应生成的PPi的浓度×100％

当反应进程大于40％，酶的活性即被认为是正常。

实施例5：IspD抑制剂的筛选

筛选所用方法的原理、反应体系和活性测定方法同实施例4，具体筛选分组见表1。

表1

注：括号内为反应终浓度。

在上述筛选体系中对不同来源的化合物(包括天然产物734个和化学合成化合物2458个)进行筛选，酶抑制率的计算方法如下：

在本筛选***中，由于尚无IspD抑制剂问世，以失活的IspD作为阳性对照组，其给出的吸收值最小，酶抑制率为最大；以完全正常的酶促反应体系为阴性对照，该组给出的吸收值最大，抑制率最小。通过计算得出待筛样品的酶抑制率，当抑制率大于20％即被认为是阳性结果。

筛选结果：

从3192个化合物(包括天然产物734个和化学合成化合物2458个，其中2050个为本所合成，258个由中国药科大学提供，150由中山大学提供)中筛选得到5个阳性化合物，阳性率为0.17％。其中10μg/ml的杜米芬对IspD的抑制率为44％。

实施例6本筛选模型的评价

目前广泛用于评价筛选模型质量的定量技术参数有四个：信号/背景比值(S/B)、信号/噪音比值(S/N)、信号本底变异系数(CV)和Z’-因子，各参数计算公式如下：

本筛选模型各参数值见表2。

表2

从表2可以看出，本筛选方法背景低、噪音小、重复性好，结果可靠。

实施例7：杜米芬的体外抗结核活性测定

抗结核活性测定方法是：采用无菌48孔板进行杜米芬的抗结核活性测定。各孔分别加入用2倍浓度培养基(Middlebrook，BD Difco)稀释的药物。实施例5筛选得到的各阳性化合物制成适当浓度的初溶液，用培养基(2×)稀释成各所用化合物的二倍浓度，每种阳性化合物各10个梯度，48孔板每孔加入100μl，各阳性化合物终浓度为：50.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.25、0.625、0.315和0.156μg/ml。对照药异烟肼(INH，Sigma公司)终浓度为：40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078、0.039和0.019μg/ml。接着加入结核分枝杆菌H37Rv，每孔接种100μl，每孔菌量为4×10^-3mg。每板均设2个不含抗菌药的生长阳性对照孔和两个以蒸馏水替代培养基的生长阴性对照孔，将48孔板加盖后周围用透明胶带密封，置于湿盒37℃孵育。第3天后观察阳性生长对照孔和阴性生长对照孔。观察到两者有明确差别时，对各个试验孔细菌生长的数量和形态进行观察，判定抑制或耐药并记录结果，第7天后再观察记录一次进行确认。

测定结果见表3。

表3

结论：杜米芬对结核杆菌H₃₇Rv的最小抑制浓度(MIC)为5.0-10μg/ml；阳性对照异烟肼对结核杆菌H₃₇Rv的MIC为0.1μg/ml；

实施例8：体内抗结核活性评价

采用小鼠急性气溶胶感染结核病模型评价实施例5筛选得到的阳性化合物的抗结核活性。方法是按照气溶胶感染装置(099C A4224Inhalation Exposure System)的标准操作规程(Lisa A.Collins，ScottG.Franzblau.Microplate Alamar Blue Assay versus BACTEC 460System for High-Throughput Screening of Compounds againstMycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium.Antimicrobial Agents And Chemotherapy.1997，41(5)：1004-5)感染小鼠，感染剂量50-100CFU/只。感染后3天、10天分别处死3只小鼠，做肺组织活菌计数。感染第10天开始给予药物治疗，受试药物DMB4mg/kg，阳性对照药利福平10mg/kg，异烟肼25mg/kg，同时设CMC无药对照组，每组6只，均口服灌胃给药，每周中的周一至周五每天给药一次，每周共5次，共15个剂量。感染后第30天处死各组小鼠，称重，无菌操作下解剖，做肺组织活菌计数。

测定结果见表4。

表4

结论：在4mg/kg的剂量下，DMB实验组已表现出小鼠体内的结核杆菌滴度下降，经过双样本t检验，DMB组与对照组相比，p＜0.001，存在统计学上的显著性差异，即DMB已经表现出抗结核活性。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对哪些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110>中国医学科学院医药生物技术研究所

<120>IspD抑制剂筛选模型及IspD抑制剂杜米芬的新用途

<130>IDC100011

<160>3

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gttcatccat atggtcaggg aagcgggcga agtagttgcg 40

<210>2

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gtcttatctc gagcccgcgc actatagctt gggccagc 38

<210>3

<211>991

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gggctttgtt agcagccgga tctcagtggt ggtggtggtg gtgctcgagt cacccgcgca 60

ctatagcttg ggccagcaac agatccagtt tggtggtgat cttgaacgcc agcggatcgc 120

cgtcgaccac ctgcacctgg ccgccgatat gctcgaccag cgacgcgtca tcggtgtact 180

cggcggctgg aaggtctagg gagccgcgct gatatgaccg cagcagcagg tcggtagtga 240

acccttgtgg ggtctgcacg gcccgcagcc cggctcgttc cggcgtgccc aggaccaccc 300

cgttggcatc cacggccttg atggtgtcag aaagcggcag tacgggaacg acggcggcat 360

aaccgtcccg caacgcctcg accacccggg cgaccagggc cggtggtgtc agtgcccgcg 420

cggcatcatg cacaagcaca aactccggct ccgcggtccc ggacagcact gtcagcgcca 480

ggttcacggt gtcagtgcga ttcgacccac ccgccacaat catcgccctg tggccgagga 540

tctgcctcgc ctcgtccgta cggtcggcgg gcacggccac aacaacggtg tcaactaccc 600

ccgaatccag caggccatcg acggcccgct caatgagagt ctgcccgtcg agctggtaaa 660

acgccttggg cacaccgacg gccaaccgct cccccgaccc cgcagccggg acgatcgcaa 720

ctacttcgcc cgcttccctg accatatggc tgccgcgcgg caccaggccg ctgctgtgat 780

gatgatgatg atggctgctg cccatggtat atctccttct taaagttaaa caaaattatt 840

tctagagggg gaattgttat ccgctcacaa ttcccctata gtgaagtcgt attaaatttc 900

gcgggatcga gatctcgatc cccaccccgg aagcaacgtt gggcgggatc acccgggccc 960

cagggggggg tggttggggc catattatcc a 991

Claims

1.杜米芬在体外抑制分枝杆菌的用途，所述分枝杆菌为结核分枝杆菌。

2.权利要求1的用途，其中所述分枝杆菌为结核分枝杆菌H₃₇Rv。

3.杜米芬用于制备抗结核药物的用途。