CN102272287B - 冷冻干燥粉末状菌体及其制造方法 - Google Patents

冷冻干燥粉末状菌体及其制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供适于长期保存、通过简便且有效的冷冻干燥而得到的冷冻干燥粉末状菌体。本发明的冷冻干燥粉末状菌体的制造方法为对将乳酸菌和/或双叉乳杆菌悬浮在糖质溶液中所得到的悬浮液进行冷冻干燥来得到冷冻干燥粉末状菌体的冷冻干燥粉末状菌体的制造方法，其中，所述糖质为海藻糖和蔗糖、且冷冻干燥前的上述悬浮液中的海藻糖和蔗糖各自的浓度为4.5重量％以上。海藻糖与蔗糖的重量比优选为5∶1～1∶5。

Description

冷冻干燥粉末状菌体及其制造方法
技术领域
本发明涉及冷冻干燥粉末状菌体及其制造方法，特别是涉及即使在特定的高温条件下也能够长期保存的冷冻干燥粉末状菌体及其制造方法。
背景技术
近年来，具有益生功能的菌株引起了人们的关注。并且，基于通过摄取这些菌而进行消化道内的改善/正常化以及与此相伴的免疫调整作用的预防医学盛行。其中，特别是乳酸菌、双叉乳杆菌等也被称为益生菌，自古以来就以各种食品的形式进行摄取。最近，其功能开发比以前更为繁盛，并且还进行了组合有新颖的功能性的商品形式的开发。
出于上述的进行消化道内的改善/正常化等目的，开发出了大量的含有这些菌类的加工食品组。并且在用于简便且有效地摄取这些菌类的工作方面仍在研究中。例如，作为这些食品组的通常的一例可以举出酸奶，但为了进一步易于摄取，也将这些菌类制成粉末状。该粉末状菌体也可用作用于简便地制造应用加工食品的新颖原料，其利用价值高。
但是，在将这些菌类制成粉末状的情况下，如果在摄取时或食品制造时这些菌类未能残存有必要量以上的活菌，则无法得到这些菌类的效果。因而，希望开发出有效的菌类保存方法、以及用于简便地制成粉末状的方法。例如，希望开发出在进行冷冻干燥的情况下提高其存活性的方法。
为了达成上述目的，迄今已进行了各种研究。
例如，专利文献1的目的在于，通过对在酸性下或高温下会被杀灭的乳酸菌、双叉乳杆菌等有用菌进行被覆造粒来进行保存这样的意图而使其不会在胃液中发生溶解而在肠内的可溶性得到提高。具体地说，将生理活性物质通过3层被覆制成造粒物，在其中一层中使用糖类。
另外，在专利文献2中提出了向培养基中添加含有糖类的存活性改善剂以改善双歧杆菌属细菌的存活性的方法，所述糖类选自甘油、木糖醇、核糖醇、***糖醇、甘露醇。该方法的目的在于，在好气条件下或低pH条件下进行保存时，维持存活性和菌数。特别是该技术的主要目的在于提高在培养基***中的存活率。
另外，在专利文献3中，提供了一种在乳酸菌体粉末中混入有聚甘油脂肪酸酯的长期稳定性优异且耐酸性、肠溶性优异的肠溶性乳酸菌组合物。上述技术主要着眼于在特定条件下的保存性及耐性。
另一方面，关于改良菌类的冷冻保存、冷冻干燥保存时的存活性的方面，也开发出了各种技术。
例如，在专利文献4中，为了提供一种在冷冻或冷冻干燥工序中菌体的损伤或死亡少且存活率高的制造方法，公开了一种这样的冷冻干燥的方法：向乳酸菌类的菌体分散液中添加来自魔芋粉的多糖类部分水解物进行冷冻干燥。多糖类部分水解物是通过酶分解而得到的具有特定分子量的物质，制造该水解物需要繁杂的工序。另外，该技术以提高冰冻熔化时的存活率为主要目的，其中对于利用该技术所制造的冷冻干燥粉末状菌体在保存后的存活率完全没有暗示或提及。
在专利文献5中，提出了在将冷冻菌解冻后细菌存活率和活性仍良好的保存液。该细菌用冷冻保存液含有海藻糖和/或聚乙二醇作为有效成分。由此该保存液的特征在于，抑制冷冻时的损害、在解冻后立即可以使用。该技术为含有水分的***，特别是对于从冷冻到解冻这一过程中的问题进行解决的技术。
另外，在专利文献6中，利用具有淀粉质、糖质的保护膜对发酵乳杆菌进行被覆制成喷雾干燥粉体。该技术是把重点放于提高喷雾干燥时细菌的存活性的技术。
进一步地，在专利文献7中，通过使干燥乳酸菌等干燥微生物与L-精氨酸酸性氨基酸盐共存来提高干燥状态下的保存稳定性。该技术的主要目的在于，在将微生物(菌)制剂化时提高微生物的保存稳定性。另外，其中示出了将用该技术制造的双叉乳杆菌制剂在40℃保存2周的结果，但其存活率仅为25％左右，并非为可耐受延长至数个月的长期保存的技术。
另外，在非专利文献1中示出了下述研究结果：根据该冷冻干燥中的机理分析，已经查明微生物冷冻干燥时的损伤是主要由构成细胞膜的磷脂质的物理状态的变化以及蛋白质的结构变化造成；基于该发现，在海藻糖或蔗糖存在下对于大肠杆菌等进行冷冻干燥。但是，其中对于将海藻糖与蔗糖混合使用完全没有暗示或提及。进一步地，对于具体冷冻干燥物的长期保存以及在特定高温条件的保存也没有进行任何相应的研究。
进一步地，在非专利文献2中，出于与上述同样的目的，进行了关于唾液乳杆菌(lactobacillus salivarius)的冷冻干燥和保存的研究。在该文献中，将4％海藻糖；4％蔗糖；18％脱脂奶粉；4％海藻糖和18％脱脂奶粉；4％蔗糖和18％脱脂奶粉；4％海藻糖和4％蔗糖；以及4％海藻糖和4％蔗糖及18％脱脂奶粉用作冷冻干燥保护剂，将冷冻干燥粉末状菌体保存在-85℃，对其存活率进行研究。另外，在冷冻干燥时菌体悬浮液中的糖浓度为约3.2％、脱脂奶粉浓度为14.4％。根据该文献所公开的结果，记述了利用4％蔗糖不能充分提高冷冻干燥粉末状菌体在-85℃的保存性，但利用4％蔗糖与18％脱脂奶粉却能够提高冷冻干燥粉末状菌体在-85℃的保存性。进一步记述了单独利用4％海藻糖提高了冷冻干燥粉末状菌体在-85℃的保存性的结果。此外示出了将利用4％海藻糖、4％蔗糖以及18％脱脂奶粉的混合溶液进行冷冻干燥所得到的粉末状菌体于室温(温度未记载)下保存7周的结果。在此提到，当保存在特定的湿度条件(湿度2.8～5.6％、以水分活性计0.028～0.056)的环境下时，能够维持高保存性。但是，在湿度0％和湿度8.8％的环境下不能维持高保存性(存活率分别为约40％和10％)，将可室温保存的条件限制在极低的湿度并且湿度范围非常狭窄，不具有实用性。如此，非专利文献2的技术示出的是偏离通常生活环境的环境条件下的保存试验结果，进一步地，对高温条件下的保存完全没有暗示或提及，还难以将该技术应用于通常的食品中。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平5-186337号公报
专利文献2：日本特开平11-137172号公报
专利文献3：日本特开2001-64189号公报
专利文献4：日本特开平7-313140号公报
专利文献5：日本特开2001-327280号公报
专利文献6：日本特开2005-52100号公报
专利文献7：国际公开WO2006/106806号公报
非专利文献
非专利文献1：Samuel B.Leslie等，“干燥时利用海藻糖和蔗糖对非损伤细菌的细胞膜和蛋白质二者的保护(Trehalose and Sucrose Protect Both Membranes andProteins in IntactBacteria during Drying)”、应用与环境微生物(Applied andEnvironmental Microbiology)，美国，1995年10月，第3592-3597页
非专利文献2：Gaber Zayed等，“海藻糖和水分含量对于冷冻干燥和保存时的唾液乳杆菌的存活性的影响(Influence of trehalose and moisture content on survival ofLactobacillus salivarius subjected to freeze-drying and storage)”，Process Biochemistry，2004年，第39卷，第1081-1086页
发明内容
发明所要解决的问题
如上所述，迄今为止，关于有用菌类的保存以及有效形态已经进行了各种研究。特别是对于粉末状的冷冻干燥菌体或者干燥菌体等，出于其制品形态的简便性已经进行了各种尝试，但在菌类的功能维持、长期保存后的存活率方面尚有很大的研究余地。例如，在特定的尝试中，存在例如仅对特定的菌类有效、或者即使对多种菌类有效但保存条件具有需要超低温且低湿等显著限制，因而可以说尚未开发出工业上有效的手段。特别是为了用作可应用于常温下可长期保存的食品中的粉末状菌体，需要在假设为通常的生活环境温度的范围内的高温(30～40℃)条件下、而并不限于特殊的保存条件下具有高存活性。不具有这样的性质的粉末状菌体其品质无法得到保证，不能确信可将其用作食品的材料。
因而，本发明的目的在于提供一种适于长期保存、通过简便且有效的冷冻干燥而得到的冷冻干燥粉末状菌体及其制造方法。特别是提供即使在冷冻干燥后进行长期保存，并且该长期保存即使在并非为超低温的、据认为对于保存性有很大影响的生活温度带(特别是夏期)来进行，也能够在乳酸菌及双叉乳杆菌等有用菌的存活率高的状态下进行保存，在保存后也可以简便地以粉末的形式直接摄取、或者可有效地用作食品制造中的原料的冷冻干燥粉末状菌体及其制造方法。进一步地还提供含有所得到的冷冻干燥粉末状菌体的食品组合物。
解决问题所采用的手段
鉴于上述现有的问题，本发明人进行了深入研究，结果发现，通过对将乳酸菌和/或双叉乳杆菌悬浮在糖质溶液中的悬浮液进行冷冻干燥，有用菌(乳酸菌和/或双叉乳杆菌)的粉末状菌体的存活性、特别是高温保存时的存活率得以显著提高，以至于完成了本发明。
根据本发明，提供了适于长期保存、通过简便且有效的冷冻干燥而得到的冷冻干燥粉末状菌体。
即，本发明的一个方面为冷冻干燥粉末状菌体的制造方法，其为对将乳酸菌和/或双叉乳杆菌悬浮在糖质溶液中的悬浮液进行冷冻干燥来得到冷冻干燥粉末状菌体的冷冻干燥粉末状菌体的制造方法，其中，上述糖质为海藻糖和蔗糖，且冷冻干燥前的上述悬浮液中的海藻糖和蔗糖各自的浓度为4.5重量％以上。
在本发明中，海藻糖和蔗糖各自的浓度优选为4.5重量％～15重量％、更优选为8重量％～12重量％。
在本发明中，海藻糖与蔗糖的重量比优选为5∶1～1∶5。
在本发明中，作为上述乳酸菌和/或双叉乳杆菌的优选例，可以举出属于双歧杆菌(Bifidobacterium)属的菌类等。
作为属于双歧杆菌(Bifidobacterium)属的菌类的优选例，可以举出两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)株、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)株等。
作为两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)株的优选例，可以举出两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)OLB6378株等。
作为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)株的优选例，可以举出长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)OLB6001株等。
此外，本发明的其它方面涉及利用上述任意记载的冷冻干燥粉末状菌体的制造方法制造出的冷冻干燥粉末状菌体。
本发明进一步的其它方面涉及含有有效量的上述冷冻干燥粉末状菌体的食品组合物。
发明效果
基于本发明的可长期保存的冷冻干燥粉末状菌体的制造方法特别是在固体物质/粉末状食品等需要保证长期保存等的情况下特别能够显示出其效果。即，由于利用本发明的制造方法制造出的粉冷冻干燥末状菌体在高温保存时的存活率得以显著提高，因而即使在保存后进行使用也能够获得有用的乳酸菌和/或双叉乳杆菌的效果。
此外，由于本发明的制造方法为简便的方法，因而不需要特别的装置及复杂的工序，也不会导致与此相伴的成本增加。
另外，由于利用本发明的制造方法制造出的冷冻干燥粉末状菌体可以直接使用，因而在保存后也可以简便地以粉末的形式直接进行摄取、或者可以有效地用作食品制造中的原料。
附图说明
图1是示出了在冷冻干燥前的悬浮液中的海藻糖浓度与蔗糖浓度分别为6.6重量％(作为与菌体混合前的糖溶液，使用分别含有20重量％的海藻糖和蔗糖的糖溶液。)的条件下所制备出的两歧双歧杆菌的冷冻干燥粉末状菌体在20℃、30℃、40℃的各温度下的保存试验结果的曲线图。
图2是示出了在冷冻干燥前的悬浮液中的海藻糖浓度与蔗糖浓度分别为10重量％(作为与菌体混合前的糖溶液，使用分别含有30重量％的海藻糖和蔗糖的糖溶液。)的条件下所制备出的两歧双歧杆菌的冷冻干燥粉末状菌体在20℃、30℃、40℃的各温度下的保存试验结果的曲线图。
图3是示出了在冷冻干燥前的悬浮液中的海藻糖浓度与蔗糖浓度分别为6.7重量％(作为与菌体混合前的糖溶液，使用分别含有20重量％的海藻糖和蔗糖的糖溶液。)的条件下所制备出的长双歧杆菌的冷冻干燥粉末状菌体(图中的圆圈数字2)以及比较用的冷冻干燥粉末状菌体(图中的圆圈数字1)在40℃的温度下的保存试验结果的曲线图。
具体实施方式
下面对本发明进行详细说明，但本发明并不限于下面叙述的各种方式。
作为本发明中使用的乳酸菌及双叉乳杆菌，可以示例出属于双歧杆菌(Bifidobacterium)属的菌类，具体可以举出例如长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)株、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)株、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)株、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)株、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)株等。此外还可以示例出属于乳酸杆菌(Lactobacillus)属、链球菌(Streptococcus)属的菌类，具体可以举出例如加氏乳酸杆菌(Lactobacillus gasseri)株、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)株、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)株等。但是，本发明并不限于这些菌株，并且对于这些菌株，可以单独使用或者2种以上组合使用。
作为上述菌株中的优选例，可以举出两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)株、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)株等。
作为这些优选例的保藏菌株的例子，可以举出两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)OLB6378株、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)OLB6001株等。
(A)两歧双歧杆菌OLB6378株的保藏
本发明中所用的两歧双歧杆菌OLB6378株以下述条件进行保藏。
(1)保藏机构名称：独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心
(2)联系方式：邮编292-0818千叶县木更津市上总镰足2-5-8
电话号码0438-20-5580
(3)保藏编号：NITE BP-31
(4)用于识别的表示：Bifidobacterium bifidum OLB6378
(5)原保藏日期：平成16年(2004年)10月26日
(6)基于布达佩斯条约的保藏转移日期：2006年1月18日
(B)长双歧杆菌OLB6001株的保藏
本发明中所用的长双歧杆菌OLB6001株以下述条件进行保藏。
(1)保藏机构名称：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心
(2)联系方式：邮编305-8566茨城县筑波市东1-1-1中央第6
电话号码029-861-6029
(3)保藏编号：FERM P-13610
(4)用于识别的表示：Bifidobacterium longum No.7
(5)保藏日期：平成5年(1993年)4月20日
(6)基于布达佩斯条约的保藏转移
接受日：平成22年(2010年)3月2日
接受编号：FERM ABP-11242
本发明中所用的两歧双歧杆菌OLB6378株以及长双歧杆菌OLB6001株具有下述细菌学性质。
两歧双歧杆菌OLB6378株为来自人婴儿粪便的革兰氏阳性专性厌氧杆菌。若将该菌接种至乳酸菌MRS肉汤(BD)中并在采用AnaeroPack·KENKI(三菱瓦斯化学社制造)的厌氧状态下于37℃培养18小时，则观察到Y字型的细菌形态。另外，采用两歧双歧杆菌(Bifidobacteirum bifidum)的特异性引物(腸内フロ一ラシンポジウム8(肠内菌丛论文集8)，肠内菌丛的分子生物学检测·鉴定；光冈知足、松本隆广)、具体采用16S rDNA的种特异性引物BiBIF-1：CCA CAT GAT CGC ATG TGA TT和BiBIF-2：CCG AAG GCT TGC TCC CAAA通过PCR观察到PCR产物。
长双歧杆菌OLB6001株为来自成人粪便的革兰氏阳性专性厌氧杆菌，其细菌形状为杆菌或支链状的多形形状，无芽胞形成、无运动性。若将该菌株涂布在BL琼脂培养基(荣研)平板上并利用不锈钢棉法在37℃培养48小时，则形成不透明的圆形半球状的具有光泽的菌落。该菌株对于***糖、木糖、核糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、棉子糖、松三糖具有发酵性。
作为本发明所用的保护剂的糖质为海藻糖与蔗糖的混合物。从可获得适于在高温下长期保存的冷冻干燥粉末状菌体的方面考虑，冷冻干燥前的悬浮液中的海藻糖与蔗糖各自的浓度为4.5重量％以上、优选为8重量％以上。从即使过度增大浓度高温下的长期保存性的效果也相同的方面考虑，该浓度的上限优选为15重量％、更优选为12重量％。对海藻糖与蔗糖的重量比没有特别限定，但从可获得适于在高温下长期保存的冷冻干燥粉末状菌体的方面考虑，优选为5∶1～1∶5、更优选为3∶1～1∶3、特别优选为1∶1～1∶1。
优选的是，将这些糖质以含有糖质的水溶液的形态与培养菌混合，使该菌再悬浮。通过对如此得到的悬浮液进行冷冻干燥，可得到本发明的冷冻干燥粉末状菌体。
另外，在含有糖质的水溶液中，除了水和糖质外，还可以含有例如乳蛋白质、氨基酸、抗坏血酸等。
本发明的冷冻干燥粉末状菌体的制造方法没有特别限定，例如由下述步骤构成。
1)按照常规方法培养所期望的菌类。
2)将含有所培养的菌的培养液直接用于下述3)中，或者将含有所培养的菌的培养液通过离心分离等进行浓缩或者固液分离，得到浓缩的培养液(菌体液)或者以固体成分的形式分离出的菌体，将其用于下述3)中。
3)将所得到的菌体液或菌体与含有规定浓度糖质(保护剂)的溶液混合，得到悬浮液后，将该悬浮液冷冻干燥，得到本发明的冷冻干燥粉末状菌体。
作为冷冻干燥的方法，可以举出使用冷冻干燥机的方法等，例如，可以在低温(例如-30～-90℃)下急速预冷冻后，在室温(例如0～20℃)且减压下(优选为1000Pa以下、更优选为100Pa以下的真空度)进行干燥，在维持该真空度的条件下，将冷冻干燥机的温度上升至例如30～70℃，进一步进行干燥。
对于本发明的冷冻干燥粉末状菌体，由于使用了亦可用作食品添加物的海藻糖与蔗糖，因而可直接摄取；并且也可以将其添加至各种食品组合物中来使用。另外，本发明的冷冻干燥粉末状菌体即使在长期保存后也显示出特定的菌存活率，因而也可将其用作发酵牛奶等的种菌等原料。
作为食品组合物可以举出各种饮食品(冷饮、发酵牛奶、酸奶、调整奶粉等)。食品组合物可以直接使用，或者可以按照通常的食品组合物中的常规方法与其他食品或食品成分混合等来使用。并且，食品组合物的性状可以为通常使用的饮食品的状态，例如可以为固体状(粉末、颗粒状等)、糊状、液态或悬浮状的任意状态。
对食品组合物中的其他成分没有特别限定，可以举出水、蛋白质、糖质、脂质、维生素类、矿物质类、有机酸、有机碱、果汁、调味料类等。这些成分可以单独使用1种，或者也可以2种以上组合使用。另外，作为食品组合物中的其他成分，也可以使用合成品和/或含有大量合成品的食品。
实施例
下面，基于使用了通常难以保存的厌氧菌(双叉乳杆菌)的实施例对本发明进行说明，但本发明并不限定于此。另外，在本说明书中，对于％的表达，在没有明示的情况下表示的是重量％。
[实验例1]
按照下面所示的步骤，基于本发明的制造方法来制造冷冻干燥粉末状菌体。
1)在酪蛋白分解培养基(以经酶分解的酪蛋白作为蛋白的培养基)中对两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)OLB6378株进行中和培养。
2)对320ml培养液进行离心分离(在4℃、以10000G进行20分钟)去除307.2ml上清液，得到菌体沉淀物部分(12.8ml)。
3)向菌体沉淀物部分(4ml)中添加含有特定浓度糖质的保护剂液(2ml)，使菌体悬浮，在-80℃冷冻以进行冷冻干燥。
4)冷冻干燥终止后，立即向0.5g冷冻干燥粉末状菌体中添加生理食盐水进行复水，利用BL琼脂平板培养基测定复水液中的活菌数。
5)进一步地，将0.5g冷冻干燥粉末状菌体加入至Lami-Zip(注册商标；塑料袋的商品名)中，对于在20℃或30℃保存53天后的冷冻干燥粉末状菌体，也同样地利用BL琼脂平板培养基来测定活菌数。
本实验例中所用的保护剂液如下述表1所示。
[表1]
将上述的基于本发明的试样1、2以及比较试样1、2、3中两歧双歧杆菌的保存试验结果列于表2。另外，由于比较试样1、2中的存活率低，因而仅参考性地示出了在20℃保存7天的情况下的结果。
[表2]
*1：保存天数：7天
如表2所示，在基于本发明方法的实施例1～4中，即使将冷冻干燥粉末状菌体在规定的高温条件下保存53天，也未见活菌数的减少。特别可知，即使在如实施例2、4那样的相当接近于生活环境温度的高温下，其存活率也可得到飞跃性的提高。
由此可知，本发明的制造方法为充分适用于保质期比较长的固体状/粉末状食品中的技术。
另外，比较例1、2是关于以非专利文献2为代表的仅用海藻糖的体系的试验，但可知仅用海藻糖并不能充分地达成目的。特别是在非专利文献2中叙述了在超低温下、在湿度条件下进行保存时的效果，但可知在如本实验那样的生活环境温度下是不能得到所期望的效果的。
另外，在比较例3、4中针对与非专利文献2中同样浓度的海藻糖/蔗糖合用体系进行了研究，但可知在假定为生活环境的温度条件下活菌数减半。
由此可知，利用这些比较例的方法所得到的冷冻干燥粉末状菌体难以适用于保质期长的固形/粉末状食品中，并非为适于对这些食品实用的技术。
[实验例2]
对于利用本发明的制造方法来得到的冷冻干燥粉末状菌体，进一步对在高温条件下(20℃、30℃、40℃)进行长期保存(～6个月)的情况下的效果进行实验。
另外，对于所使用的冷冻干燥粉末状菌体，将投料量增加到约30倍，除此以外，按照与试样1和2同样的制造方法进行制造。因而，下面以试样1、2的形式来说明。
通过上述实验所得到的结果示于图1和图2。
由图中明显可知，即使将试样1(参照图1。将含有20重量％海藻糖的溶液与含有20重量％蔗糖的溶液进行混合而得到的分别含有6.6重量％的海藻糖和蔗糖的保护剂溶液)以及试样2(参照图2。将含有30重量％海藻糖的溶液与含有30重量％蔗糖的溶液进行混合而得到的分别含有10重量％的海藻糖和蔗糖的保护剂溶液)均置于20℃和30℃的保存温度条件下，在6个月后也能够维持充分的活菌数，显示出非常高的存活性。
对于在40℃的保存，尽管为相当极端的生活环境温度条件的保存，但试样1在保存1个月后仍显示出93.9％的存活性。因而可知，在该条件下，作为保护剂溶液的浓度，更优选试样1中所用的浓度。
[实验例3]
使用下述表3所示的试样并在40℃保存3个月，除此以外，与实施例1同样地进行实验。结果列于表4。由表4可知，在海藻糖与蔗糖的质量比为3∶1～1∶3之间时，存活性为11～17％，彼此未见差异，具有同等的效果。
[表3]
[表4]
[实验例4]
按照下面所示的步骤，基于本发明的制造方法来制造冷冻干燥粉末状菌体。
1)在酪蛋白分解培养基(以经酶分解的酪蛋白作为蛋白的培养基)中对长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)OLB6001株进行中和培养。
2)对5400ml培养液进行离心分离(在4℃、以10000G进行20分钟)去除5200ml上清液，得到菌体沉淀物部分(200ml)。
3)向菌体沉淀物部分(200ml)中添加含有规定浓度糖质的保护剂液100ml，使菌体悬浮，在-80℃冷冻以进行冷冻干燥。
4)冷冻干燥终止后，立即向1g冷冻干燥粉末状菌体中添加生理食盐水进行复水，利用BL琼脂平板培养基测定复水液中的活菌数。
5)进一步地，将2g冷冻干燥粉末状菌体加入至Lami-Zip(注册商标；塑料袋的商品名)中，对于在40℃进行8天、30天、82天、124天的各期间的保存后的冷冻干燥粉末状菌体，也同样地利用BL琼脂平板培养基来测定活菌数。
本实验例中所用的保护剂液如下。
(1)实施例8
使用分别含有20重量％的海藻糖和蔗糖的糖溶液(下面称为试样6。)。将该糖溶液与菌体沉淀物部分进行混合而成的冷冻干燥前的悬浮液中的海藻糖和蔗糖的含量分别为6.7重量％。
(2)比较例5
使用含有6重量％脱脂奶粉、1.7重量％乳糖、0.4重量％氨基酸(赖氨酸等)、4重量％其他成分(糊精等)的溶液(下面称为比较试样4。)。
结果如表5和图3所示。由表5可知，在将比较例5的冷冻干燥粉末状菌体(图3中的圆圈数字1)于40℃保存约4个月的情况下，仅显示出了0.002％的存活性；与此相对，在将实施例8的冷冻干燥粉末状菌体(图3中的圆圈数字2)于40℃保存约4个月的情况下，显示出了40.0％的高存活性。
[表5]
工业实用性
利用基于本发明的可长期保存的冷冻干燥粉末状菌体的制造方法，特别是在固体物质/粉末状食品等需要保证长期保存的情况下等，即使在保存后也能获得有用的乳酸菌和/或双叉乳杆菌的效果。另外，其不需要特别装置及复杂工序，也不存在与此相伴的成本增加，在经济上也是有利的。进一步地，由于本发明的冷冻干燥粉末状菌体可以直接使用，因而可以在保存后也简便地以粉末形式直接摄取、可以有效地用作食品制造中的原料，其利用价值高。

Claims (8)

1.一种冷冻干燥粉末状菌体的制造方法，该制造方法是对将乳酸菌和/或双叉乳杆菌悬浮在糖质溶液中所得到的悬浮液进行冷冻干燥来得到冷冻干燥粉末状菌体的冷冻干燥粉末状菌体的制造方法，其中，所述糖质为海藻糖和蔗糖，且冷冻干燥前的上述悬浮液中的海藻糖和蔗糖各自的浓度为6.6重量％～12重量％。
2.如权利要求1所述的冷冻干燥粉末状菌体的制造方法，其中，冷冻干燥前的上述悬浮液中的海藻糖和蔗糖各自的浓度为6.6重量％～10重量％。
3.如权利要求1或2所述的冷冻干燥粉末状菌体的制造方法，其中，冷冻干燥前的上述悬浮液中的海藻糖和蔗糖各自的浓度为8重量％～10重量％。
4.如权利要求1或2所述的冷冻干燥粉末状菌体的制造方法，其中，所述乳酸菌和/或双叉乳杆菌为属于双歧杆菌(Bifidobacterium)属的菌类。
5.如权利要求4所述的冷冻干燥粉末状菌体的制造方法，其中，所述乳酸菌和/或双叉乳杆菌为两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)株。
6.如权利要求5所述的冷冻干燥粉末状菌体的制造方法，其中，所述乳酸菌和/或双叉乳杆菌为两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)OLB6378株。
7.如权利要求4所述的冷冻干燥粉末状菌体的制造方法，其中，所述乳酸菌和/或双叉乳杆菌为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)株。
8.如权利要求7所述的冷冻干燥粉末状菌体的制造方法，其中，所述乳酸菌和/或双叉乳杆菌为长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)OLB6001株。
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