CN102272108A

CN102272108A - 用于分析波生坦及相关物质的hplc方法以及这些物质作为参比标准和标记的用途

Info

Publication number: CN102272108A
Application number: CN2009801534338A
Authority: CN
Inventors: 埃拉·科特斯瓦拉·萨蒂亚·维贾雅库马; 阿维纳什·普拉巴卡·尼卡姆
Original assignee: Generics UK Ltd
Current assignee: Generics UK Ltd
Priority date: 2008-11-03
Filing date: 2009-11-02
Publication date: 2011-12-07
Also published as: JP2012507497A; US20110263853A1; NZ593117A; WO2010061210A1; CA2741928A1; EP2350028A1; AU2009321375A1; US8975402B2

Abstract

本发明涉及一种用于分析药品物质波生坦和相关物质的新型HPLC方法，本发明还涉及所述物质作为参比标准和标记的用途。

Description

用于分析波生坦及相关物质的HPLC方法以及这些物质作为参比标准和标记的用途

技术领域

本发明涉及一种用于分析药品物质波生坦和相关物质的新型HPLC方法、以及所述物质作为参比标准和标记的用途。

背景技术

为确保医药产品的上市许可，制造商必须向合适的注册机构提交详细证明，以证实该产品适合向市场发放。因此必须使注册机构相信该产品对于人类给药是可接受的，且待上市的特定药物组合物在发放之时没有杂质并具有可接受的储存稳定性。

向注册机构提交的文件必须包括分析数据，该分析数据表明在制造时活性药物成分(API)中没有杂质、或存在可接受水平的杂质，并表明药物组合物的储存稳定性是可接受的。

API及药物组合物中的可能杂质包括残留量的合成前体(中间体)、合成API过程中产生的副产品、残留溶剂、API的异构体(如几何异构体、非对映异构体或对映异构体)、合成API或制备药物组合物所使用的材料中存在的污染物、以及未识别的不定物质(adventitious substances)。在储存期间可能出现的其它杂质包括API的降解物(degradants)，如水解或氧化形成的那些降解物。

***门具有非常严格的标准，生产商必须证明他们的产品相对无杂质或杂质在可接受的限度内，这些标准对于生产的每批药物产品是可再现的(可重复使用的)。

为证明API或药物组合物安全有效所需的测试包括：纯度化验、相关物质测试、含量均匀度测试和溶出度测试。化验测试确定与已知纯度的标准相比时测试产品的纯度，而相关物质测试则用来对产品中存在的所有杂质进行定量。含量均匀度测试确保批量产品如片剂含有均匀含量的API，而溶出度测试则确保每批产品具有一致的API溶出度和释放。

选择用于分析API或药物组合物(如片剂和胶囊剂)的技术通常为连接检测器的高效液相色谱(HPLC)。检测器包括UV-可见检测器或质谱(MS)检测器。API和存在的杂质(如果有的话)在HPLC固定相上得以分离，并通过所述检测器进行检测和定量。

HPLC是一种色谱分离技术，其中，高压泵迫使所分析的物质或混合物连同液体溶剂--流动相(也称为洗脱剂)--通过含有固定相的分离柱。

HPLC分析可在等度(isocratic)或梯度模式下进行。在等度模式下，流动相组分始终恒定。梯度HPLC分离是伴随一段时间内组成流动相的两种或多种溶剂的百分比逐渐改变而进行的。溶剂的改变由混合器控制，在溶剂通过柱之前，混合器将其混合以产生流动相。

如果物质与固定相强烈地相互作用，那么其在柱中保留相对较长的时间，而与固定相不那么强烈地相互作用的物质则更快地从柱中洗脱出来。取决于相互作用的强度，分析物的各种成分在不同时间(称为保留时间)出现在分离柱的末端，在那里借助于合适的检测器如UV检测器对它们进行检测和定量。

波生坦(bosentan)属于一类高度取代的嘧啶，其用于通过阻断内皮素(endothelin)的作用来治疗肺动脉高血压。

波生坦，具有式(I)所示的化学结构，分子量为551.615，其分子式为C₂₇H₂₉N₅O₆S。波生坦是一种白色至淡黄白色(yellowish white)粉末，易溶于乙腈。

现有技术披露了三种工艺杂质(process impurities)，Ro 47-0005、Ro47-4056和Ro 47-9931，它们在合成波生坦过程中获得(EMEA2005)。然而，这些杂质的结构未被描述。此外，还有报道描述了三种代谢物的形成：Ro 48-5033(叔丁基的羟基化产物)、Ro 47-8634(游离的酚代谢物)和Ro 64-1056(次级代谢物，其为游离的酚，并具有羟基化的叔丁基)。

文献中报道了多种用于检测这些杂质的HPLC方法，例如：(1)“Evolving Bioanalytical Methods for the Cardiovascular Drug Bosentan”，Chromatographia，vol.55，pages S115-S119，2002；以及(2)“Determinationof an endothelin receptor antagonist in human plasma by narrow-bore liquidchromatography and ionspray tandem mass spectrometry”，J.ChromatographyA，vol.712，pages 75-83，1995。这些出版物描述了利用醋酸铵和乙腈的混合物和反相色谱(RP-18或RP-8)的等度HPLC方法。

然而，现有的HPLC方法均不适用于检测和定量波生坦样品(尤其是通过可替换的新途径如WO 2009/004374及其优先权申请IN1245/MUM/2007所披露的途径而合成的样品)中存在的所有合成中间体及其它相关物质。现有方法在评估波生坦及其盐中的总杂质方面也存在缺陷。

因此，现有技术所报道的HPLC方法不能方便地用于、或者不适合用于分析作为API的波生坦及其盐，尤其是对于通过WO 2009/004374及其优先权申请IN 1245/MUM/2007所披露的途径合成的样品中存在的相关物质。

因此，尽管文献中已报道了多种用于分析波生坦和/或其盐及其杂质的HPLC方法，仍然需要一种可替换的方法，该方法避免与以上讨论的已知方法相关的问题。

本发明人所从事的研究开发并验证了一种用于分析波生坦、尤其是对于合成过程中形成的相关物质的新型、高效、可重现且简单的HPLC方法。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供一种新的可替换方法，用于分析波生坦、其杂质及相关物质，同时避免与现有技术方法相关的典型问题。

本发明的一个具体目的是提供一种新型、准确且灵敏的HPLC方法，用于检测及定量中间体和相关物质，这些中间体和相关物质形成并可能残留在通过WO 2009/004374及其优先权申请IN 1245/MUM/2007披露的途径所合成的批量波生坦和/或其盐中。

另一个目的是提供参比标记(reference markers)和参比标准(referencestandards)，用于检测在制备波生坦(尤其是通过WO 2009/004374及其优先权申请IN 1245/MUM/2007披露的途径制备波生坦)的过程中形成的称为A-E的杂质。

本发明提供了一种用于分析波生坦的HPLC方法，其中，流动相包括两种或更多种液体，且液体的相对浓度随预定梯度而变化。

发明人还注意到可利用五种杂质(称为化合物A-E)作为用于分析波生坦或含有波生坦的药物剂型的参比标记或参比标准。现有技术中尚未披露杂质A-E。

因此，本发明的第一个方面提供化合物A，其具有化学名N-[6-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)-5-羟基-2-(嘧啶-2-基)-嘧啶-4-基]-4-叔丁基苯磺酰胺，并具有以下结构：

第二个方面提供化合物B，其具有化学名N-[6-(乙烯-1-氧基)-5-羟基-2-(嘧啶-2-基)-嘧啶-4-基]-4-叔丁基苯磺酰胺，并具有以下结构：

第三个方面提供化合物C，其具有化学名N-[6-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(嘧啶-2-基)-嘧啶-4-基]-4-叔丁基苯磺酰胺，并具有以下结构：

第四个方面提供化合物D，其具有化学名N-[6-羟基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(嘧啶-2-基)-嘧啶-4-基]-4-叔丁基苯磺酰胺，并具有以下结构：

第五个方面提供化合物E，其具有化学名N-[6-(乙烯-1-氧基)-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(嘧啶-2-基)-嘧啶-4-基]-4-叔丁基苯磺酰胺，并具有以下结构：

化合物A-E为波生坦合成过程中的副产品，适于用作参比标记或参比标准。在一个特别优选的实施方式中，根据本发明的化合物A-E为分离形式(isolated form)。最优选该分离形式为基本上纯的形式，优选纯度高于约90％、优选高于约95％、优选高于约98％、最优选高于约99％，优选通过HPLC测量。

根据本发明的第六个方面提供一种测试波生坦或含有波生坦的药物剂型的样品纯度的方法，该方法包括测定样品中根据本发明的化合物A-E中的一种或多种的存在。在本发明的方法中，所述化合物用作参比标记或参比标准。

根据本发明的第七个方面，提供一种用于表征化合物A-E的方法，该方法利用HPLC方法来分析波生坦中的所述工艺杂质A-E。优选该HPLC方法为LC-MS相容性方法。

因此，提供了根据本发明的化合物A-E在测试波生坦或含有波生坦的药物剂型的样品纯度中作为参比标记(一种或多种)或参比标准(一种或多种)的用途。

另一个方面提供一种用于测试波生坦样品纯度的色谱方法，所述方法包括：通过利用根据本发明的参比标记或在替换实施方式中利用根据本发明的参比标准，来测定样品中化合物A-E中的一种或多种的存在。

又一个方面提供一种通过测定含有波生坦的样品中化合物A-E中任何一种或多种的存在来测试波生坦样品的纯度的色谱方法，所述方法包括：

(a)将波生坦或含有波生坦的剂型的样品溶解在溶剂中以制备样品溶液；

(b)将化合物A-E中任何一种或多种的样品溶解在溶剂中以制备参比标记溶液；

(c)对样品溶液和参比溶液实施色谱技术；以及

(d)通过参照该参比溶液中存在的已知化合物(一种或多种)的存在，测定样品中化合物A-E中的任何一种或多种的存在。

在一种实施方式中，该色谱法为液相色谱法，如HPLC、LC-MS或LC-MS/MS法；优选该色谱法为HPLC法，优选梯度HPLC法。可替换地，该色谱法可以是气相色谱法，如GC-MS。

优选地，本发明中使用的固定相为反相。合适的固定相包括十八烷基硅烷硅胶(octadecylsilyl silica gel)或辛基硅烷硅胶(octylsilyl silica gel)。

在本发明的优选实施方式中，提供一种梯度HPLC方法，其中，流动相包含缓冲液(A)和有机溶剂(B)的组合。优选地，缓冲液(A)为含水缓冲液，优选为磷酸盐、醋酸盐、甲酸盐或三氟乙酸或它们的混合物的水溶液。更优选缓冲液(A)为醋酸盐(最优选为醋酸铵或可替换的甲酸铵)的水溶液，在特别优选的实施方式中其存在的浓度为约0.01M至1.0M。

根据本发明的进一步优选的实施方式提供一种流动相，其中，有机溶剂(B)为极性质子溶剂，如甲醇、丙醇或异丙醇；或偶极非质子溶剂，如乙腈。优选有机溶剂(B)选自包括甲醇、乙腈、丙醇或异丙醇或它们的混合物的组中，最优选为乙腈或可替换的甲醇或它们的混合物。

特别优选的流动相包含醋酸铵(A)和乙腈(B)的组合。

进一步提供根据本发明的梯度HPLC方法，其中，流动相包含如下的梯度设计：

时间(min)	％A	％B
			0	90	10
40	10	90
			41	90	10
50	90	10

还提供一种特别优选的梯度HPLC方法，其中，流动相包含醋酸铵作为缓冲液(A)。在另一种特别优选的实施方式中，流动相包含乙腈作为有机溶剂(B)。

进一步优选的实施方式包括一种HPLC方法，其中，缓冲液(A)的pH为约2至7，优选为约2至6。

在其它实施方式中，色谱法在约15-40℃的温度下进行。

根据本发明的HPLC方法以单次操作(single run)有效地检测并定量包括那些选自以下化合物中的化合物的所有杂质。

化合物A：N-[6-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)-5-羟基-2-(嘧啶-2-基)-嘧啶-4-基]-4-叔丁基苯磺酰胺。

化合物B：N-[6-(乙烯-1-氧基)-5-羟基-2-(嘧啶-2-基)-嘧啶-4-基]-4-叔丁基苯磺酰胺。

化合物C：N-[6-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(嘧啶-2-基)-嘧啶-4-基]-4-叔丁基苯磺酰胺

化合物D：N-[6-羟基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(嘧啶-2-基)-嘧啶-4-基]-4-叔丁基苯磺酰胺。

化合物E：N-[6-(乙烯-1-氧基)-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(嘧啶-2-基)-嘧啶-4-基]-4-叔丁基苯磺酰胺。

待通过根据本发明的测试波生坦纯度的方法进行测试的波生坦样品，可以是：

(a)波生坦API；或

(b)含有波生坦的剂型；或

(c)波生坦盐和/或溶剂化物(如水合物)；或

(d)含有波生坦盐和/或溶剂化物(如水合物)的剂型。

优选地，通过根据本发明的测试波生坦纯度的方法而测试的波生坦，适用于药物组合物中。

本发明的另一方面提供波生坦，该波生坦已被实施根据本发明的测试波生坦纯度的方法。优选该波生坦基本上没有化合物A-E中的一种、两种、三种、四种或全部五种。

本发明的又一个方面提供波生坦，该波生坦基本上没有化合物A-E中的一种、两种、三种、四种或全部五种。

如果波生坦含有少于约5％、优选少于约3％、优选少于约2％、优选少于约1％、优选少于约0.5％、优选少于约0.1％、优选少于约0.05％(优选通过HPLC测定)的一种化合物，则该波生坦为“基本上没有”该化合物。

本发明的还有一个方面提供一种含有根据本发明的波生坦的药物组合物。

附图说明

图1示出样品A的分析HPLC色谱图，其是在Waters仪器上进行分析并绘制为吸光度(吸光度单位)对时间(分钟)的曲线。

图2示出样品B的分析HPLC色谱图，其是在Merck Hitachi仪器上进行分析并绘制为电压(伏特)对时间(分钟)的曲线。

图3示出杂质A-E的结构。

图4示出杂质A的MS/MS碎片。

图5示出杂质B的MS/MS碎片。

图6示出杂质D的MS/MS碎片。

图7示出杂质E的MS/MS碎片。

具体实施方式

本发明可用于分析作为API的波生坦和/或其盐、或配制在药物组合物中的波生坦和/或其盐。

本发明所能够分析的药物组合物包括固体和液体组合物，并可选地包括一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。固体形式的组合物包括粉剂、片剂、丸剂、胶囊剂、扁囊剂、栓剂和可分散的颗粒剂。液体组合物包括溶液或悬浮液，其可通过口服、注射或输注途径给予。

说明书与权利要求书通篇所使用的术语“波生坦”是指波生坦和/或其任何盐或溶剂化物(包括水合物)。本发明尤其可用于分析波生坦游离碱。

说明书通篇所使用的术语“杂质”或“相关物质”可意指在制造API或药物组合物中形成的杂质、以及/或者API降解形成的杂质或在储存中的药物组合物中形成的杂质。

如上所述，现有技术中所报道的HPLC方法不适合用于分析波生坦，尤其是对于通过WO 2009/004374及其优先权申请IN 1245/MUM/2007披露的途径所制备的波生坦和/或其盐的合成中所形成的相关物质(本文将上述两篇文献的全部内容引入，以供参考)。

然而，本发明一种特别优选的实施方式解决了这一问题，并且以单次操作有效地检测并定量这种特定合成过程中形成的所有杂质和中间体。本发明的优势在于：梯度法允许所有极性至非极性杂质的洗脱。

本发明特别适合用于测定和定量样品中化合物A-E中的一种或多种的存在。除非另有描述，否则本文中的术语“杂质”和“化合物”在与化合物A-E相关的范围下，可以互换使用。

本发明的优势还在于，该方法对于波生坦和/或其盐中相关物质的分析是具选择性、灵敏性、线性、精密性、准确性和耐用性的。此外，本发明具高度灵敏性，且允许检测和定量波生坦和/或其盐中水平(量)显著低于***门和ICH指南中规定的可接受限值的相关物质。

此外，本发明的方法可用于容易地检测和定量波生坦样品储存中形成的所有降解杂质。通过按照ICH Q1A指南进行强制降解研究来确立该方法，并按照ICH Q2A指南进行验证，该验证覆盖以下参数：专属性、线性与范围、精密度(重复性、重现性和中间精密度)、准确度、检测限(LOD)、定量限(LOQ)、耐用性及***适应性。

本发明人开发出一种新型梯度HPLC方法以通过LC-MS和LC-MS/MS来表征五种工艺杂质A-E。所述方法足够耐用从而可用于分析其它已知的相关物质，如波生坦(尤其是通过WO 2009/004374及其优先权申请IN 1245/MUM/2007描述的途径所合成的波生坦)合成中的前体。由于杂质、前体和波生坦之间极性差异较大，本发明人考虑到梯度设计最为合适。

本发明的发明人进一步使用LC-MS和LC-MS/MS技术来表征新的工艺杂质A-E的结构。

在实施本发明中，本发明的发明人发现含有十八烷基硅烷硅胶(RP-18)或辛基硅烷硅胶(RP-8)的固定相最为有利。特别优选的固定相含有Waters XTerra RP18(250mm x 4.6mm)，5μ，柱。

本发明方法优选包括梯度设计，使得液体A和B的相对浓度经10至180分钟时间典型地变化为100％A∶0％B至0％A∶100％B的梯度。优选地，经25至120分钟时间，梯度为100％A∶0％B至0％A∶100％B，更优选地，经25至60分钟时间，梯度为100％A∶0％B至0％A∶100％B，最优选地，经约40分钟，梯度为90％A∶10％B至10％A∶90％B。这种梯度法的优势在于，其允许所有极性至非极性杂质的洗脱。

使用的流动相优先选自一种或多种缓冲液(A)和一种或多种有机溶剂(B)的组合。

缓冲液优先选自包括磷酸盐、醋酸盐、甲酸盐或三氟乙酸或它们的混合物的水溶液的组中。

存在的缓冲液的浓度可以为0.001至0.1M，优选浓度为0.001至0.05M，更优选浓度为0.005至0.05M。

特别优选的流动相包含醋酸铵(A)和乙腈(B)的组合。

在根据本发明的一种特别优选的实施方式中，进一步提供一种梯度HPLC方法，其中，流动相包括如下的梯度设计：

时间(min)	％A	％B
			0	90	10
40	10	90
			41	90	10
50	90	10

还提供一种特别优选的梯度HPLC方法，其中，流动相包含醋酸铵作为缓冲液(A)。在另一种特别优选的实施方式中，流动相包含乙腈作为有机溶剂(B)。发明人发现当流动相包含醋酸铵(A)和乙腈(B)时梯度设计尤其有效。

缓冲液(A)可含有一种或多种附加溶剂(additional solvent)，其为选自甲醇、乙腈、丙醇或异丙醇或它们的混合物中的有机溶剂。缓冲液(A)中的附加溶剂可以是或不是与有机溶剂(B)相同的溶剂。缓冲液(A)中的附加溶剂优选为乙腈。

缓冲液的pH选择为约2至7。

典型地，本发明的方法在约15-40℃的柱温下进行。

本发明的另一方面提供一种内部参比溶液(internal referencesolution)。该参比溶液包含溶解于合适溶剂中的一种或多种化合物A-E。所述参比溶液可用于测定在利用根据本发明的色谱技术进行分析的样品中作为杂质的任何化合物A-E的存在。所述分析的方法对于技术人员是显而易见的。

根据本发明的另一个方面，提供一种参比标准溶液，其中，已知量的一种或多种化合物A-E溶解于合适的溶剂中。所述参比溶液可用于测定在利用根据本发明的色谱技术进行分析的样品中作为杂质的任何化合物A-E的存在和量。所述分析的方法对于技术人员是显而易见的。

本发明人已广泛测试本发明的方法，从而表明其具重现性、准确度、精密度和相对于浓度的线性以及耐用性。

虽然本发明以其具体实施方式进行描述，然而某些修改和等同物对于本领域技术人员是显而易见的，并且旨在包括在本发明的范围之内。

通过以下实施例对本发明进行阐述，以下实施例不以任何方式限制本发明。

实施例

HPLC方法和分析：

利用面积归一化法，发现HPLC分析过程中所观察到的波生坦中的五种工艺杂质A-E高于0.1％，因此需要根据ICH Q3A指南对其进行鉴定。用于进行所述分析的方法为根据本发明的梯度HPLC方法。使用的实验条件如下。

实验条件：

柱：Waters XTerra RP18(250mm x 4.6mm)，5μ；

流速：1ml/min；

检测(波长)：225nm；

样品浓度：1000ppm；

稀释液：乙腈；

流动相：0.03M含水醋酸铵(A)--乙腈(B)梯度；

梯度设计如下所述。

时间(min)	％A	％B
			0	90	10
40	10	90
			41	90	10
50	90	10

质(谱)：API 2000三重四极杆

电离模式：正(离子)和负(离子)模式。

使用上述HPLC方法，通过LC-MS分析波生坦样品A和B中的工艺杂质。图1和2分别示出所述样品的分析HPLC色谱图。

将保留时间(RT)、相对保留时间(RRT)和通过面积归一化法得到的每种杂质的％面积、每种杂质由相关质谱(MS)测定的分子离子和二次质谱(MS/MS)的碎片总结在表1和2中。

表1--样品A的HPLC分析

表2--样品B的HPLC分析

*由于分子的性质，碎片如此广泛以至于没有峰可提供信息。

表征

样品的HPLC分析显示杂质A-E可在质谱分析中检测。基于在杂质的质谱中获得的分子离子及工艺条件，鉴定了杂质A-E的结构，如图3绘出的。

此外，基于文献报道的波生坦碎片模式(J.Am.Soc.Mass Spectrom.，vol.10(12)，pages 1305-1314，1999)，通过解析在MS/MS谱中观察到的碎片离子，证实了杂质A、B、D和E的结构。杂质A、B、D和E的碎片模式分别示于图4至7中。在杂质C的情况下，通过MS在m/z 594.3(M-H)⁺处观察到的分子离子峰碎裂过多以至于在MS/MS研究中没有峰可提供有关杂质C性质的信息。因此，由于在MS/MS谱中缺乏杂质C的特征碎片，结构确认无法进行。

杂质A-E的化学名为：

杂质A：N-[6-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)-5-羟基-2-(嘧啶-2-基)-嘧啶-4-基]-4-叔丁基苯磺酰胺。

杂质B：N-[6-(乙烯-1-氧基)-5-羟基-2-(嘧啶-2-基)-嘧啶-4-基]-4-叔丁基苯磺酰胺。

杂质C：N-[6-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(嘧啶-2-基)-嘧啶-4-基]-4-叔丁基苯磺酰胺。

杂质D：N-[6-羟基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(嘧啶-2-基)-嘧啶-4-基]-4-叔丁基苯磺酰胺。

杂质E：N-[6-(乙烯-1-氧基)-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(嘧啶-2-基)-嘧啶-4-基]-4-叔丁基苯磺酰胺。

应理解以上仅通过实施例对本发明进行描述。这些实施例不旨在限制本发明的范围。在不违背本发明的范围和构思的前提下，可进行各种修改和实施方式，且本发明仅由所附权利要求限定。

Claims

1.化合物A，具有化学名N-[6-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)-5-羟基-2-(嘧啶-2-基)-嘧啶-4-基]-4-叔丁基苯磺酰胺，并具有以下结构：

2.化合物B，具有化学名N-[6-(乙烯-1-氧基)-5-羟基-2-(嘧啶-2-基)-嘧啶-4-基]-4-叔丁基苯磺酰胺，并具有以下结构：

3.化合物C，具有化学名N-[6-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(嘧啶-2-基)-嘧啶-4-基]-4-叔丁基苯磺酰胺，并具有以下结构：

4.化合物D，具有化学名N-[6-羟基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(嘧啶-2-基)-嘧啶-4-基]-4-叔丁基苯磺酰胺，并具有以下结构：

5.化合物E，具有化学名N-[6-(乙烯-1-氧基)-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(嘧啶-2-基)-嘧啶-4-基]-4-叔丁基苯磺酰胺，并具有以下结构：

6.根据权利要求1-5中任一项所述的化合物，为分离形式。

7.根据权利要求6所述的化合物，其为基本上纯的形式。

8.根据权利要求6或7所述的化合物，其具有高于约90％的纯度。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的化合物，用于在测试波生坦或含有波生坦的药物剂型的样品纯度中作为参比标记或作为参比标准而使用。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的化合物在测试波生坦或含有波生坦的药物剂型的样品纯度中作为参比标记或作为参比标准的用途。

11.一种用于测试波生坦样品纯度的色谱方法，所述方法包括：通过利用根据权利要求9或10所述的参比标记或参比标准来测定所述样品中化合物A-E中任何一种或多种的存在。

12.一种色谱方法，包含流动相和固定相，用于在含有波生坦的样品中通过测定化合物A-E中任何一种或多种的存在来测试波生坦样品的纯度，所述方法包括：

(b)将根据权利要求1-9中任一项所述的化合物A-E中的任何一种或多种的样品溶解在溶剂中以制备参比标记溶液；

(c)对所述样品溶液和所述参比溶液实施色谱技术；以及

(d)通过参照所述参比溶液中存在的已知化合物的存在，测定所述样品中化合物A-E中任何一种或多种的存在。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其中，所述方法为HPLC方法或梯度HPLC方法。

14.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，其中，使用的所述固定相为：

(a)反相；和/或

(b)辛基硅烷硅胶或十八烷基硅烷硅胶

15.根据权利要求11-14中任一项所述的方法，其中，所述流动相包含缓冲液(A)和有机溶剂(B)的组合。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述缓冲液(A)：

(a)为含水缓冲液；和/或

(b)为磷酸盐、醋酸盐、甲酸盐或三氟乙酸或它们的混合物的水溶液；和/或

(c)为醋酸盐水溶液；和/或

(d)为醋酸铵水溶液；和/或

(e)为醋酸铵水溶液，其中，醋酸铵的浓度为0.01M至1.0M。

17.根据权利要求15或16所述的方法，其中，所述有机溶剂(B)：

(a)为极性质子溶剂或偶极非质子溶剂；和/或

(b)选自包括甲醇、乙腈、丙醇或异丙醇或它们的混合物的组中；和/或

(c)包含乙腈或甲醇或它们的混合物。

18.根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其中，所述流动相包含醋酸铵(A)和乙腈(B)的组合。

19.根据权利要求15-18中任一项所述的方法，其中，所述流动相包含以下梯度设计：

时间(min) ％A ％B 0 90 10 40 10 90 41 90 10 50 90 10

20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述流动相包含：

(a)醋酸铵，作为所述缓冲液(A)；和/或

(b)乙腈，作为所述有机溶剂(B)。

21.根据权利要求15-20中任一项所述的方法，其中，所述缓冲液(A)的pH为约2至6。

22.根据权利要求11-21中任一项所述的方法，其中，所述色谱法在约15-40℃的温度下进行。

23.根据权利要求11-22中任一项所述的方法，用于：

(a)检测化合物A-E中的一种或多种；和/或

(b)检测并定量化合物A-E中的一种或多种；和/或

(c)以单次操作检测并定量化合物A-E中的一种或多种。

24.根据权利要求11-23中任一项所述的方法，其中，待测试的波生坦样品为：

(a)波生坦API；或

(b)含有波生坦的剂型；或

(c)波生坦盐和/或溶剂化物；或

(d)含有波生坦盐和/或溶剂化物的剂型。

25.根据权利要求11-24中任一项所述的方法，其中，被测试的所述波生坦用于药物组合物中。

26.波生坦，其已被实施根据权利要求11-25中任一项所述的方法。

27.根据权利要求26所述的波生坦，其基本上没有如权利要求1-5中所限定的化合物A-E中的一种、两种、三种、四种或全部五种。

28.波生坦，其基本上没有如权利要求1-5中所限定的化合物A-E中的一种、两种、三种、四种或全部五种。

29.一种药物组合物，含有根据权利要求26-28中任一项所述的波生坦。