CN102271668B - 表观遗传调控的小分子调节剂和其治疗应用 - Google Patents

表观遗传调控的小分子调节剂和其治疗应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于调节转录因子、特别是将表观遗传调控剂(组蛋白修饰酶)募集至特定的DNA启动子的转录因子的功能的方法和组合物。靶向的转录因子包括但不限于肌细胞增强因子(MEF2)、叉状头/翼状螺旋转录因子FOXP3和转录因子GATA3。本发明还公开了MEF2和其相关因子的小分子调节剂以及它们的治疗应用，所述相关因子包括但不限于组蛋白脱乙酰酶(HDAC)、p300/CBP和Cabin1。

Description

表观遗传调控的小分子调节剂和其治疗应用
相关申请的交叉引用
本申请要求2008年11月5日提交的美国临时申请第61/111,689号和2009年9月29日提交的临时申请第61/246,934号的权益。本文在此通过参考并入以上临时申请。
关于联邦赞助的研发的声明
本发明得到以下来自NIHR21AI49905、RO1HL076334和RC1DA028790的资助的部分支持。因此，美国政府享有一定的权利。
技术领域
本发明大体上涉及分子医学的领域。特别地，本发明涉及用于调节转录因子、特别是将表观遗传调控剂(组蛋白修饰酶)募集至特定的DNA启动子的转录因子的功能的方法和组合物。靶向的转录因子包括但不限于肌细胞增强因子(MEF2)、叉状头/翼状螺旋转录因子FOXP3和转录因子GATA3。更特别地，本发明涉及MEF2和其相关因子的小分子调节剂以及它们的治疗应用，所述相关因子包括但不限于组蛋白脱乙酰酶(HDAC)、p300/CBP和Cabin1。
背景技术
本发明涉及用于调节与特定疾病相关的转录因子的功能的小分子的用途。转录因子是与特定DNA序列结合的蛋白，其直接调控基因表达或通过诸如辅激活子和辅阻遏子等相关蛋白调控基因表达，或者通过募集诸如组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)等组蛋白修饰酶而调控基因表达。转录因子通过确保合适的基因表达水平而在许多生物过程中起关键作用。如果它们调控转录的能力受到异常修饰，则它们还可以与特定的疾病状态相关。因此，可以选择性调节特定转录因子的功能的小分子的鉴定和开发，可以引起潜在的新治疗应用。本发明基于两个基本想法。一个想法是开发结合诸如MEF2、FOXP3和GATA3等特定转录因子并且调节其与转录辅激活子和辅阻遏子的相互作用的小分子。另一个想法是开发阻断HAT(例如p300和CBP)和HDAC以及其它组蛋白修饰酶(诸如组蛋白甲基转移酶、和脱甲基酶、DNA甲基转移酶)的募集以及阻断向特定的染色质区域的染色质重塑机制的小分子。
特别地，本发明涉及肌细胞增强因子-2(MEF2)，其在肌肉***、免疫***和神经***的发育和适应性响应中起关键作用(Flavell等，2006；Kim等，2008；Mao等，1999；McKinsey等，2002；Pan等，2004；Potthoff和Olson，2007；Youn和Liu，2000；Youn等，1999)。已经表明MEF2是心肌细胞中肥大性响应的关键调控子。由病理刺激诱导的心脏肥大可以在许多形式的心血管疾病中引起心力衰竭。
MEF2通常定义了具有4个成员的转录因子家族：MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D。通过使用鼠类和果蝇遗传学已经详细地证明了它们功能的重要性(Potthoff和Olson，2007)。最初在骨骼肌中鉴定出的MEF2，与诸如MyoD等肌原性碱性螺旋-环-螺旋转录因子一起，促进和维持肌生成(Molkentin和Olson，1996)。MEF2家族的一个成员MEF2A最近已经被表述为“心脏病发作基因”，这是因为该蛋白的突变与冠心病(CAD)和心肌梗死(MI)有关(Wang等，2003)。这些发现成为MEF2在人类心脏病中起关键作用的基础(Kim等，2008；Wei等，2008；Zhang等，2002)。
现在已知MEF2在许多其它细胞类型中是通用的转录因子。例如，MEF2是用于在淋巴***发育中介导钙信号传导的重要转录因子之一(Pan等，2004；Youn和Liu，2000；Youn等，1999)。MEF2调控细胞因子表达和免疫响应。MEF2还调控作为神经元存活和突触重塑的基础的转录程序(Chen和Cepko，2009；Flavell等，2006；Flavell和Greenberg，2008；Flavell等，2008；Mao等，1999；Morrow等，2008；Shalizi等，2006；Shalizi和Bonni，2005；Yang等，2009)。这些观察表明，调节MEF2功能的小分子可以在心脏肥大和心力衰竭、自体免疫疾病和移植排斥、神经退行性疾病以及学习力和记忆力的病理性损伤中具有治疗效果(Fischer等，2007；Stefanko等，2009)。
在细胞内部，MEF2的作用包括三个不同步骤：(i)转录阻遏；(ii)钙依赖性去阻遏；和(iii)转录激活。MEF2的转录阻遏作用取决于其与各种转录辅阻遏子的相关性，所述转录辅阻遏子具有固有的或相关的组蛋白脱乙酰酶(HDAC)活性。在T细胞中，MEF2结合Cabin I，Cabin I接着与诸如HDAC1、HADC2和HDAC3等I类HDAC相连(Youn和Liu，2000)。在肌肉细胞中，MEF2与诸如HDAC4、HDAC5和HDAC9等II类HDAC直接结合，并抑制参与肌肉的发育和适应性响应的特定基因的表达(Chan等，2003；Gregoire等，2006；Gregoire和Yang，2005；McKinsey等，2001，2002；Miska等，1999；Sparrow等，1999)。其HDAC5或HDAC9已经被敲除的小鼠显示出对肥大刺激的敏感性增加，表明了II类HDAC在心脏肥大中的重要作用(Potthoff和Olson，2007)。这些数据和其它数据表明，MEF2和II类组蛋白脱乙酰酶(HDAC)、特别是HDAC5和HDAC9，在心肌细胞中是肥大信号的关键介导物。大量的数据表明，MEF2/II类HDAC途径是心脏肥大的潜在治疗靶标。
响应于特定的钙信号，Cabin1和HDAC被从MEF2中除去(Potthoff和Olson，2007)。然后MEF2募集诸如p300和CBP等辅激活子以通过与各种转录激活子和辅激活子结合而启动不同的程序(McKinsey等，2001；Sartorelli等，1997；Slepak等，2001；Wei等，2008)。已经显示p300的少量增加对于诱导MEF2依赖性心脏肥大是充分必要的。MEF2具有由已被良好表征的MADS盒和MEF2特异性结构域组成的高度保守的N末端区(第2位～第93位残基)(Shore和Sharrocks，1995)。MADS盒/MEF2结构域的功能非常丰富，介导DNA结合、二聚化和与包括Cabin1、IIa类HDAC和p300/CBP在内的大量MEF2转录伴侣的蛋白-蛋白相互作用(McKinsey等，2001，2002)。已经显示MEF2中的MADS盒/MEF2结构域对于与在II类HDAC和Cabin1中保守的小基序结合是充分必要的。p300和CBP的CH3结构域也据显示会结合MADS盒/MEF2结构域。
虽然本领域可获得MEF2参与各种细胞过程的广泛知识，但是迄今为止由于缺乏合适的分子工具而无法利用该知识。特别地，如何通过小分子调节MEF2的活性一直是个长期存在的挑战。这是因为MEF2是相对较小的转录因子，没有任何明显的酶活性；其主要功能在于结合特定的DNA并且将诸如Cabin1、II类HDAC和p300/CBP等转录辅调控子(co-regulator)募集至特异性启动子。通常认为该功能模式不具有可药性，或至少非常难以被小分子靶向。所述分子的发现或创造会促进该领域的进展，并且会产生用于MEF2相关疾病的基于机制或基于结构的新治疗应用，所述MEF2相关疾病包括炎症、自体免疫疾病、神经退行性疾病、癌和心血管疾病。
本申请描述的发明还可扩展至调节诸如叉状头/翼状螺旋转录因子FOXP3等其它转录因子的活性(Bennett等，2001；Fontenot等，2003；Hori等，2003；Wu等，2006；Zheng和Rudensky，2007)。FOXP3是对于调控性T细胞(Treg)的发育和功能而言至关重要的关键转录因子。Treg是抑制免疫***的过度激活所需的特别的T细胞群。通过突变和其它机制造成FOXP3功能的丧失会引起诸如IPEX等致命性自体免疫疾病，而FOXP3或其活性的表达增强可以造成功能受到抑制。FOXP3功能增强在治疗自体免疫疾病和移植排斥时可能是有益的，而FOXP3活性的策略性下调可用于开发基于免疫的抗肿瘤治疗(Zuo等，2007a；Zuo等，2007b)。因此，结合FOXP3并且调节其与辅阻遏子和辅激活子的相互作用的小分子可能在自体免疫疾病、移植排斥和癌治疗中具有治疗应用。
与MEF2类似，FOXP3的功能受包括HAT(例如TIP60)和HDAC(包括I类和II类HDAC)在内的转录辅调控子的严格调控(Li等，2007)。因此，可以通过本发明所述的方法开发结合FOXP3并且阻断其与辅调控子的相互作用的小分子，所述辅调控子包括诸如组蛋白修饰酶和染色质重塑机制等表观遗传调控子。
类似地，靶向转录辅调控子还满足了其挑战的作用。
在诸如MEF2等转录因子的转录辅调控子中，II类HDAC是研究最透彻的组。
组蛋白脱乙酰酶(HDAC)(EC号3.5.1)是一类从位于组蛋白上的ε-N-乙酰基赖氨酸氨基酸除去乙酰基的酶。其作用与组蛋白乙酰转移酶(HAT)的作用相反。现在还将HDAC蛋白称为赖氨酸脱乙酰酶(KDAC)，以更准确地描述其活性而不是其靶标，其靶标还包括许多非组蛋白。
如其名称所表明，HDAC的主要功能之一是从组蛋白除去乙酰基。组蛋白是染色质的主要蛋白成分。它们充当DNA绕其缠绕的轴，并且在基因调控和DNA包装中起重要作用。组蛋白具有由存在于其赖氨酸和精氨酸氨基酸上的氨基引起的正常带正电的尾部。这些正电荷帮助组蛋白尾部与位于DNA主链上的带负电的磷酸基相互作用并与其结合。
DNA和组蛋白之间的连接在调控转录因子接近DNA的能力上充当至关重要的控制机制。DNA和组蛋白之间的强连接限制了被转录因子接近，因此抑制基因转录(Morrison等，2007)。对组蛋白或DNA进行修饰改变了其连接强度，并进而调节转录活性(Morrison等，2007)。已经显示共价添加甲基、磷酸基或乙酰基部分改变了核小体状态并由此影响转录。乙酰基向组蛋白上的保守性N-末端赖氨酸残基的ε-氨基的添加引起乙酰化。向组蛋白添加乙酰基减少了带正电的组蛋白和带负电的DNA磷酸主链之间的吸引力，产生更加松弛的和可接近的染色质结构。HAT促进了组蛋白乙酰化，因此据认为是转录激活子。反之，HDAC用于从组蛋白除去乙酰基，由此抑制转录。因此，正是HAT和HDAC活性之间的相互作用主要管理局部染色质结构和基因表达。HDAC通过染色质的脱乙酰化改变全局基因转录。应该注意，HDAC不直接结合DNA序列，而是需要额外的靶基因识别用因子(Morrison等，2007)。
基于功能和DNA序列相似性，存在4种已得到认识的HDAC蛋白亚型(I类～IV类)。将前两种亚型称为“经典”HDAC，其活性受曲古抑菌素A(TSA)抑制。I类HDAC包括普遍表达的HDAC1、2、3和8(Zhang和Olsen，2000)。II类HDAC有两个亚类IIa和IIb，IIa包括4、5、7和9，而IIb包括HDAC6和HDAC10。IIa类享有共同的结构组织，具有羧基端催化域和介导与转录因子的肌细胞增强因子2(MEF2)家族成员的相互作用的氨基端延伸。HDAC与通常在细胞核中发现的I类的不同之处还在于其亚细胞定位，IIb类主要定位于细胞质中，而IIa类在细胞核和细胞质之间穿梭。与I类HDAC不同，IIa类HDAC是受组织限制的，在心脏、骨骼肌和脑中具有特别高水平的表达(Zhang等，2002)。III类是不受TSA影响的NAD+依赖性蛋白家族，并且认为IV类是其自身的非典型类别。HDAC11归类于V类。
考虑到HDAC在细胞过程中所起的重要作用，HDAC抑制剂(HDACi)的医学应用是研究的活跃区域。但是，HDACi的许多用途是在不了解其基础机制时发现的。例如，在精神病学和神经学中，使用丙戊酸作为情绪稳定剂和抗癫痫药有很长的历史。当将丙戊酸用作许多其它作为抗惊厥药而被研究的化合物的载剂时，偶然发现了丙戊酸的抗惊厥性。不久以后将丙戊酸鉴定为HDACi。近年来，HDACi作为缓和剂或用于神经退行性疾病的治疗而被活跃地研究。还付出了大量精力来开发癌治疗用HDACi。例如，最近已经批准伏立诺他(Vorinostat)(SAHA)用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)。用于CTCL的处于临床评价的替代试剂是环状缩酚肽天然产物FK228(Romidepsin)，其是I类HDAC的强效抑制剂。另外，临床实验正在研究丙戊酸对受感染人中的HIV潜伏库的影响。虽然对于HDACi的医学应用的兴趣不断增长，这些化合物工作的确切机制仍未被良好地理解。因此，这些努力很大程度上由猜测和试错实验指导。
使用HDACi的一个特别的问题在于大多数已知的抑制HDAC活性的小分子被设计成通过靶向HDAC的催化活性而起作用。但是，由于该活性位点是大量不同的HDAC同种型共有的保守性特征，其天生难以鉴定具有同种型选择性的HDACi。因此，大多数HDACi具有较低的特异性，不能特异性靶向任何特定种类的HDAC。例如，曲古抑菌素A(TSA)是目前已知的最强效的可逆HDACi中的一种，其IC50在较低的纳摩尔范围内。具有羟肟酸基团和与苯基连接的五碳原子连接子的TSA具有可适配至HDAC的活性位点内的最佳构象(de Ruijter等，2003；Somoza等，2004)。据认为所有HDAC对于受TSA的抑制具有大致相等的敏感性。
因此，发现抑制HDAC的功能并由此调节相关转录因子的活性的小分子的主要障碍，在于目前的现有技术致力于发现和优化已经通过HDACi与HDAC酶的活性位点结合的能力而得到鉴定和评价的HDACi。通常，这些HDACi具有通用结构R-L-Z，其中R是经由较短的脂肪族连接子L连接至Zn2+螯合基团Z的蛋白表面识别基团，Z与活性位点锌原子结合。在已知HDACi中出现的最常见螯合基团(Z)是：羟肟酸(TSA、伏立诺他、LAQ824、belinostat)、硫醇衍生物(FK228、拉格唑拉(largazole))或亲电子性酮(trapoxin A)。此类与如Zn2+等金属阳离子紧密结合的基团的潜在缺点在于它们对特定的蛋白可能缺乏足够的选择性，从而引起各种副作用。
另一类已知的HDACi是特征在于邻氨基酰基苯胺(2-氨基酰基苯胺)部分的苯甲酰胺类，包括MS-725、MGCD0103、庚二酰基苯胺邻氨基酰基苯胺(PAOA)和化合物106(N1-(2-氨基苯基)-N7-对甲苯基庚烷二酰胺)，化合物106经研究认为是包括弗里德赖希氏共济失调和亨廷顿病在内的神经退行性疾病的潜在治疗物(Chou等，2008；Herman等，2006；Paris等，2008；Rai等，2008；Thomas等，2008；Wong等，2003)。虽然该类HDACi作用的详细分子机制尚未知，但是据推测这些分子涉及邻氨基酰基苯氨基与HDAC活性位点的锌原子的结合，但是缺乏所述结合基序的任何直接证据。另外，发现所述分子显示的生物活性涉及HDAC功能的抑制，尽管其它非选择性HDACi并未显示出类似的活性。例如，化合物106虽然具有较弱的HDAC抑制，但据显示其非常活跃地诱导frataxin，而诸如SAHA等紧密相关的HDACi不具有这类活性。因此，考虑到该类化合物作用的分子机制的缺乏，妨碍了对其治疗潜能进行优化。
由各种HDAC同种型的良好调控生物作用所产生的数种其他因子，对于设计HDACi的常规方法造成了进一步的挑战。实验显示，在存在HDACi时乙酰化组蛋白的量增加。但是，通过经DNA结合的转录因子进行的HAT和HDAC的募集引起多蛋白转录调控复合物的形成，该多蛋白转录调控复合物赋予细胞类型特异性和对从属基因(subordinate gene)阵列的信号依赖性调控。使用不加区别地抑制HDAC的HDACi类似于将猴子农场(monkey ranch)掷入复杂且经过精巧平衡的机器中。这解释了在许多涉及HDACi的实验中所观察到的众多不期望的副作用。
对HDACi的医学用途进行研究时遇到的问题也是研究表观遗传调控的研究中所共有的。表观遗传调控是不永久性地改变DNA序列而建立可遗传基因表达模式。其已经表现为调控细胞功能的关键机制。
表观遗传调控的变化是许多疾病，特别是癌的标志。正在开发的作为治疗这些疾病的药物的小分子通常经由表型筛选发现，其通过调节细胞过程的表观遗传控制起作用。同样，表观遗传调控的基础机制是令人极为关注的领域。同时，对小分子表观遗传调控剂的搜索正在成为非常有前景的药物发现领域。
由于表观遗传调控很大程度上经由通过酶对染色质结构进行的化学修饰而实现，所述酶作用于DNA(例如DNA胞嘧啶甲基转移酶)或蛋白(例如，HAT、HDAC、组蛋白甲基化酶和组蛋白脱甲基酶)，在该背景下，HDAC调控DNA转录的作用可以视为表观遗传调控的组成部分。与HDACi类似，表观遗传调控剂的大多数现有化学调节剂通过与酶的催化位点结合而抑制这些酶，所述催化位点经常是具有不同细胞作用的多种酶所共有的。
虽然关于诸如MEF2等转录因子的作用取得最新进展，并且其涉及数种主要疾病，但是无法鉴定能够调节MEF2的功能的小分子。所述分子会促进该领域的进展，并且会产生用于MEF2相关疾病的基于机制或基于结构的新型治疗应用，所述MEF2-相关疾病包括炎症、自体免疫疾病、神经退行性疾病、癌和心血管疾病。
因此，该研究领域的通常问题是缺乏能够靶向特定的表观遗传调控酶或蛋白的小分子。另一问题还在于缺乏设计、评价和优化所述小分子的方法，其方式在于给予所需选择性而没有由横跨整个酶或蛋白类型的广谱活性引起的相关缺点。所述分子作为研究表观遗传调控的基础机制的分子工具以及作为用于靶向治疗干预的治疗剂会具有重要应用。
发明内容
通过深入的生化和结构研究(Guo等，2007；Han等，2005；Han等，2003)，本发明人意外地发现了使得可以使用小分子调节MEF2的活性的独特MEF2结构特征。该发现是本发明的核心，因为其违反了常规观点并且开放了各种可能性。基于该意外发现，发明人设计了一种通过经由界面抑制剂阻断转录因子与其辅因子之间的相互作用而调节细胞过程的通用策略。因此，本发明还提供了用于鉴定、筛选、检验和合成能够与位于所述因子-辅因子复合物的界面表面中的位点结合并由此干扰所述复合物的形成的小分子调节剂。
因此，本发明已经解决了靶向诸如MEF2等迄今为止“不可药用(undrugable)”的转录因子的长期存在的问题。
关于HDACi所面临的特异性问题，本发明提供了开发具有HDAC功能的小分子调节剂的替代方法。本发明靶向HDAC与调节转录所需的相关转录因子的结合位点，而不是靶向特定HDAC的活性位点。由于不同的HDAC亚型会具有与不同转录因子结合的不同表面，通过靶向这些蛋白-蛋白相互作用的界面，由保守性活性位点造成的特异性问题得以解决。
具体而言，本发明针对转录因子MEF2和IIa类HDAC之间的相互作用。MEF2的活性受IIa类HDAC控制，所述IIa类HDAC结合特定启动子上的MEF2，从而抑制靶基因表达(Potthoff和Olson，2007)。正在开发的用于治疗各种癌的HDAC的一些小分子抑制剂(HDACi)，也在涉及MEF2和HDAC活性的失调的疾病中显示出治疗潜能，所述疾病包括心脏肥大、神经退行性疾病和免疫功能障碍(Morrison等，2007；Paris等，2008)。这些观察表明，阻断IIa类HDAC:MEF2相互作用的小分子可能作为成员特异性HDACi提供类似的治疗益处(Guo等，2007；Han等，2005；Han等，2003)。
IIa类HDAC在肌肉细胞、神经元细胞和T细胞中与MEF2密切地起作用。IIa类HDAC不结合DNA，但依赖于其与经DNA结合的MEF2的相互作用以用于启动子靶向。该相互作用受较短的两亲性螺旋结构介导，该螺旋结构在IIa类HDAC而非其它HDAC中是保守的，且与MEF2的MADS盒/MEF2结构域上的疏水沟结合(Guo等，2007；Han等，2005；Han等，2003)。所述配体/受体样结合机制表明，可以使用小分子来阻断IIa类HDAC向MEF2-特异性启动子的募集(Guo等，2007；Han等，2005；Han等，2003)。
本发明基于以下***结构和生化研究(Guo等，2007；Han等，2005；Han等，2003)，该***结构和生化研究表明与MEF2结合的小分子能够调节其在募集诸如Cabin1、IIa类HDAC和p300/CBP等转录辅调控子方面的活性。大多数这些辅调控子具有修饰染色质的固有功能(例如HDAC、p300和CBP)或募集染色质修饰酶和机构的能力(例如结合Cabin1、HP1、CtBP的mSin3A，结合IIa类HDAC的14-3-3)。因此，结合MEF2并调节其与其它转录辅调控子的相互作用的小分子，可以充当其中MEF2起关键调控作用的组织中的表观遗传调节子。所以这些小分子可用于治疗其中MEF2依赖性基因表达的活性失调的疾病。失调可由以下引起：MEF2和其相关因子的遗传突变、引起MEF2功能的激活不足或激活过度的信号减少或过量、结合并与MEF2相互作用的辅因子的异常表达不足或表达过量。MEF2结合性小分子的潜在临床应用包括但不限于肌肉***、免疫***和神经***的疾病。肌肉***中的疾病有由MEF2功能不平衡引起的心脏肥大、肌纤维类型重塑和其它肌肉相关疾病。免疫***中的疾病有各种由MEF2依赖性基因表达过多或过少引起的自体免疫疾病或免疫缺陷。MEF2结合性小分子还可用于操作调控性T细胞的功能和总体免疫应答以避免移植排斥。由于MEF2依赖性基因表达与突触重塑和神经元存活密切相关，MEF2结合性小分子还可用于治疗由MEF2功能失调引起的各种神经退行性疾病(例如阿尔茨海默氏病和亨廷顿病等)、孤独症、精神病以及学习力和记忆力受损。
因为本发明的小分子调节剂通过靶向位于转录因子和其辅因子的蛋白-蛋白相互作用界面处的结合位点起作用，本文还将它们称为界面抑制剂。
已经解释了本发明的基本原理，现在总结本发明的各方面和实施方式如下：
在第一方面，本发明提供了用于筛选、鉴定或优化候选界面抑制剂的检验。本发明该方面的检验通常会包括：使候选界面抑制剂与评价元件(evaluating element)接触的步骤，所述评价元件包括由蛋白-蛋白界面限定的分子表面，该分子表面包括各MEF2单体的β链S1、S2和S3以及螺旋H2，和来自Cabin1、HDAC4以及HDAC9的较短螺旋基序。在一些优选实施方式中，评价元件与提供关于候选抑制剂的信息的报道元件可操作地结合。在优选实施方式中，所述检验为基于细胞的荧光素酶检验，该荧光素酶检验允许对结合MEF2并调节其与转录辅调控子结合的小分子进行快速且高通量的筛选和优化。该检验由发明人实验室基于对MEF2复合物进行的长达10年的结构和生化研究而开发。本发明声明，通过晶体学研究首次鉴定、并通过本发明中的结构指导的突变研究进一步证明的蛋白-蛋白界面，可充当对MEF2结合性小分子进行高度特异性和灵敏性筛选的分子基础。其它实施方式中，所述检验的评价元件可以与物理检验或任何体外结合检验和基于细胞荧光素酶报道子检验、基于通过本发明鉴定的蛋白-蛋白界面的转基因报道子检验一起实施，所述物理检验包括但不限于牵出、共免疫沉淀或荧光猝灭和各向异性。
在第二方面，本发明还提供在各种哺乳动物组织中可用作MEF2依赖性转录的表观遗传调节剂的化合物，所述哺乳动物组织包括但不限于肌肉***、免疫***和神经***。在一些优选实施方式中，本发明该方面的化合物可以包括但不限于之前公开的化合物(Chou等，2008；Herman等，2006；Paris等，2008；Rai等，2008；Thomas等，2008；Wong等，2003)，庚二酰基苯胺邻氨基酰基苯胺PAOA，和市售同系物辛二酰基苯胺邻氨基酰基苯胺(或BML-210)以及它们的结构相关衍生物。
在第三方面，本发明还提供了由位于MEF2上的BML-210结合位点限定的分子框架，该分子框架源自由与MEF2结合的BML-210的晶体结构建立的结构框架，如表1中的晶体结构坐标所示。将BML-210与结合至DNA的MEF2A(1-78)二聚体共结晶。晶体衍射分辨率为，并且所述结构通过使用MEF2A(1-78):DNA复合物作为搜索模型的分子置换来解析(Santelli和Richmond，2000)。BML-210采取延伸构象来结合到MEF2的疏水口袋中(图1d)。所述分子的一端(苯基酰胺基)被许多疏水残基围绕，所述疏水残基包括Leu66、Leu67、Thr70、Leu66′(撇号表示来自其它单体的残基)和Thr70′。位于该末端的酰胺基还处在能够参与分别与Thr70和Thr70′的氢键相互作用的位置。在BML-210的另一端，环-链(ring-link)电子密度处于被Asn73、Gln56′、Asp61′和Asp63′围绕的较为亲水的环境中。该区域对应于邻氨基酰基苯氨基。此处邻氨基酰基苯氨基及其酰胺基与MEF2的残基形成密切的范德华力接触和可能的氢键相互作用(图1d)。辛二酰胺的亚甲基紧贴配合在两个MEF2分子的螺旋H2之间，形成与MEF2残基的主链和侧链的许多接触，所述MEF2残基大多数具有疏水性(图1d)。基于与MEF2结合的BML-210的晶体结构，本发明人声明，接触BML-210和PAOA或非常接近接触BML-210和PAOA的表面残基可用于通过基于实验和计算的方法指导MEF2小分子的设计和筛选。这些残基包括所有暴露的位于MEF2的S1、S2和S3链和螺旋H2上的残基。该结构框，连同与本发明所述的高通量、特异性、灵敏性检验，使得能够快速设计和优化MEF2结合性小分子，所述MEF2结合性小分子包括BML210和PAOA衍生物以及基于新型分子支架的分子。与本发明所述的MEF2结合的BML-210的晶体结构，除了限定本文所述的小分子MEF2结合位点之外，还首次披露了可能的对于邻氨基酰基苯胺部分的结合位点，所述邻氨基酰基苯胺部分存在于BML-210和其它含苯甲酰胺HDAC抑制剂中。特别地，该结合位点不同于之前对于该类HDAC抑制剂假定的HDAC酶活性位点。
在第四方面，本发明提供了用于与由以上第三方面中的分子框架限定的界面结合位点结合的MEF2结合性小分子。在一个实施方式中，所提供的分子是具有以下结构通式的MEF2结合性小分子，所述结构通式源自从与MEF2结合的BML-210的晶体结构衍生的经鉴定的结合位点。将所提供的小分子设计成与所述结构折叠体结合，并且有可能会以较高的亲和性和选择性结合MEF2。本发明的该实施方式提供的化合物包括与MEF2结合位点结合的具有通式Ra-L-Rb的化合物，其中：
Ra是与MEF2结合位点的疏水区结合的识别基团，其选自包括以下基团的组：低级烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基；烷硫基、芳硫基、或RcRdNC(＝O)-、RcRdN(SO2)-，其中：
Rc和Rd独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、烷氨基、二烷基氨基、芳氨基或杂芳基氨基组成的组。
L是由至多20个碳原子的链组成的连接子，条件是至多3个碳原子可以被氧、氮或硫原子置换，并且另一条件是其可以包括选自由以下基团组成的组的取代基：
烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、苯并基(benzo)、羟基、烷氧基、芳氧基、氧杂基(oxa)、酮基、酰氨基、磺酰氨基或氟。
Rb是与MEF2结合位点的亲水区结合的识别基团，其选自包括以下基团的组：低级烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、或RcRdNC(＝O)-、RcRdN(SO2)，其中：
Rc和Rd独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、烷氨基、二烷基氨基、芳氨基或杂芳基氨基组成的组。
在优选的实施方式中，所提供的化合物具有通式结构Ar1-L1-L2-L3-Ar2，其中Ar1和Ar2独立选自由以下芳香环组成的组的芳香环：苯、萘、吡啶、嘧啶、吡嗪、喹啉、异喹啉、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、唑、噻唑、异唑、吲哚、苯并咪唑、苯并噻唑、苯并唑，条件是所述芳香环可以含有至多7个选自由以下基团组成的组的取代基：氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、二烷基氨基、芳氨基、杂芳基氨基、羟基或卤素。所述取代基还能够连接在一起形成至多12个原子的环；
L1和L3是独立选自由以下基团组成的组中的连接基团：氨基、烷氨基、芳氨基、氧杂基、酮基、NHC(＝O)、NR(C＝O)、S(＝O)或-S(＝O)2-；
L2是选自由至多10个碳原子的链组成的组中的连接基团，条件是至多3个碳原子可以被氧、氮或硫原子置换，并且另一条件是这些原子可以含有选自由以下基团组成的组的取代基：
烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、苯并基、羟基、烷氧基、芳氧基、氧杂基、酮基、酰氨基、磺酰氨基或氟。
在另一优选实施方式中，所提供的化合物具有通式：
其中：
R1～R10独立选自由以下基团组成的组：
L1和L3是独立选自由以下基团组成的组的连接基团：氨基、烷氨基、芳氨基、氧杂基、酮基、NHC(＝O)、NR(C＝O)、S(＝O)或-S(＝O)2-；
L2是选自由至多10个碳原子的链组成的组中的连接基团，条件是至多3个碳原子可以被氧、氮或硫原子置换，并且另一条件是这些原子可以含有选自由以下基团组成的组的取代基：烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、苯并基、羟基、烷氧基、芳氧基、氧杂基、酮基、酰氨基、磺酰氨基或氟。
在另一优选实施方式中，所提供的化合物选自以下化合物的列表(图2)。
这些化合物显示出对于在体外和体内与MEF2结合的广泛亲和性，并且可如上所述用作开发肌肉***、免疫***和神经***中的基于MEF2的治疗的先导物。所述化合物确实在体外和在小鼠模型中显示出促进调控性T细胞功能的作用，因此是用于自体免疫疾病和预防移植排斥的潜在的药物先导物。
本发明中还提供了所提供的MEF2结合性分子的制备方法。
在第五方面，本发明还提供了用于治疗由MEF2依赖性转录的失调引起的疾病的化合物和组合物。本发明该方面的组合物包括一种或多种能够阻断MEF2和其辅因子的结合的化合物。所提供的化合物和组合物可用于涉及与转录因子和其募集的组蛋白修饰酶的相互作用有关的表观遗传调控的调节的治疗应用。特别地，所提供的MEF2结合性小分子可用于治疗各种由MEF2依赖性转录的失调引起的疾病，所述疾病包括但不限于心脏肥大、肌纤维类型重塑和由MEF2功能失衡引起的其它肌肉相关疾病；移植排斥、以及由MEF2依赖性基因表达过多或过少引起的自体免疫疾病或免疫缺陷；由MEF2功能失调引起的各种神经退行性疾病(例如阿尔茨海默氏病和亨廷顿病等)、孤独症、精神病以及学习力和记忆力受损。本发明该实施方式的另一应用包括调节FOXP3转录因子的功能的小分子，所述FOXP3转录因子可用于治疗各种由FOXP3依赖性转录的失调引起的疾病。这些疾病包括但不限于自体免疫疾病、移植排斥和癌。
本发明的第六实施方式涉及药物：MEF2复合物的制备和其用于结构确定的其结晶化。该草案定义了MEF2A(2-78)的特异性蛋白片段和用于获得高品质的结合MEF2的化合物的晶体的缓冲条件范围。复合物制备和结晶的该方法对于与MEF2结合的现有及未来的小分子的结构表征和使用该结构来指导先导化合物的优化是必需的。
连同附图参照以下描述，本发明的上述特征和其它特征以及其获得和使用方式会变得更加明显，并且会被最好地理解。附图只是描述了本发明的典型实施方式，因此不限制其范围。
从以下描述和所附权利要求，本发明的其它方面和优点会变得明显。
附图说明
图1显示MEF2的晶体结构和所鉴定的配体结合位点的三种不同图示(a-c)；所示的(d)是分辨率下的与MEF2A(1-78)结合的BML-210，所述MEF2A(1-78)包括参与与BML-210的结合相互作用的氨基酸。
图2显示BML-210、PAOA和相关的示例性MEF2结合性分子的结构。
图3显示用于HDACi的MEF2-HDAC荧光素酶报道子检验的示意图。
图4显示用BML-210处理24小时后在MEF2-HDAC荧光素酶报道子检验中对于荧光素酶活性的标准化响应。荧光素酶活性以剂量依赖性方式减少。
图5(a)显示在Biacore检验中与BML-210一起温育后MEF2与HDAC结合的竞争性抑制；(b)显示BML-210和HDAC在MEF2上的重叠区结合的结构分析。
具体实施方式
已经总结了本发明的各个方面，我们现在详细地描述各种示例性实施方式以进一步说明本发明。
HDAC的特异性界面抑制剂及其用途
如上所述，大量酶同种型的存在使得表观遗传调控剂的研究具有挑战性，许多所述酶同种型具有不同的功能。例如，在四个HDAC酶超家族中，I类(HDAC 1、2、3和8)和II类(HDAC 4、5、6、7、9和10)是涉及癌的两种主要类别。虽然各个个体成员的独特功能可以利用诸如敲除或敲弱等分子生物学方法进行研究，但是不能评估其在基于药物的治疗中的作用，因为大多数目前的HDAC抑制剂靶向大多数HDAC(I类和II类)共有的催化域。事实上，经常观察到的是给定的HDAC抑制剂可能通过影响不同的HDAC同种型的活性诱导在不同细胞条件下似乎相反的作用。因此，目前HDACi的同种型特异性的缺乏为特异性HDAC的药物效果和个体功能的合理机制研究造成了主要的障碍。同样，尚未清楚抑制大量HDAC或小的亚类、甚至是特定数量的HDAC是否具有更多的药理学益处。可能的是某些临床应用(例如癌治疗)可能需要前者，而其它应用(例如神经退行性变和炎症)可能受益于后者。
目前可获得的I类和II类HDAC抑制剂可以基于其化学结构的关键特征分成六个类别：(1)羟肟酸；(2)含硫醇分子；(3)亲电子性酮；(4)短链脂肪酸；(5)苯甲酰胺类(邻氨基酰基苯胺类)；和(6)环状缩酚肽。虽然已经良好地确定包括羟肟酸、硫醇类和亲电子性酮在内的这些分子中的一些通过与HDAC活性位点的锌离子结合而起作用，但是其它类别的抑制机制尚未得到良好地定义。不同的HDAC抑制剂已经显示出对不同类别的HDAC的不同活性。例如，虽然诸如TSA和SAHA等羟肟酸类别中的成员是整个I类和II类HDAC中的强效抑制剂，但是苯甲酰胺家族的一些成员(例如庚二酰基苯胺邻氨基酰基苯胺(PAOA)、MS-275、CI-994、MGCD-0103)，以及环状肽家族(例如FK228)显示出对于某些HDAC家族或亚类的中等选择性。但是，由于通常缺乏对HDAC抑制剂的分子机制的了解，如何达到该选择性尚未清楚。因此，某些HDAC抑制剂中对选择性的经验观察不能指导亚型-特异性HDAC抑制剂的合理设计。虽然数种I类(HDAC8)和II类(HDAC4和HDAC7)成员及其与不同抑制剂的复合物的晶体结构已经得到解析，I类和II类HDAC的这些结构和基于结构的序列比对表明活性位点是高度保守的，并且在周围区域仅显示出微小的差异。因此，它们也未能提供关于选择性的潜在机制的任何认识。考虑到此背景，广泛认为针对高度保守的催化域的亚型-特异性抑制剂的合理设计是具有高度挑战性的。
观察到HDAC通常与特异性辅调控子和其它染色质修饰酶存在于较大的多蛋白复合物中，本发明的发明人假设基于机理的方法可以提供较佳的途径来鉴定和优化新型HDAC类小分子表观遗传调控子。即，人们会开发靶向HDAC及其相关功能伴侣之间的蛋白-蛋白相互作用的小分子，而不是靶向如常规药物设计方法所指定的酶的活性位点。
因此，在一方面，本发明提供了通过阻断HDAC与相关转录因子的结合而调节HDAC功能的方法。通常，本发明该方面的方法会具有以下步骤：使所述转录因子与界面抑制剂接触，其中所述界面抑制剂能够与转录因子和HDAC之间的界面表面内的位点选择性地结合，由此防止该HDAC在位于所述转录因子的DNA结合位点附近的蛋白位点处执行其催化活性。
所述HDAC可以是来自经典HDAC或其亚类的任何HDAC同种型。示例性的HDAC可以包括HDAC 4、5、6、7、9和10，或其任何亚类。在优选实施方式中，HDAC是IIa类HDAC，并且在进一步优选的实施方式中，HDAC是HDAC4或HDAC9。
转录因子可以是已知会与HDAC结合的任何转录因子。示例性的转录因子可以包括但不限于MEF2、FOXP3、GATA3和Cabin1。在优选实施方式中，转录因子是MEF2。
界面抑制剂可以是小分子。
本文上述的方法可以用于为了获得关于HDAC和对应的转录因子在体内或在体外的功能和机制的信息而设定的研究。它们还可用在疾病治疗用临床设定中。
可以用本发明方法治疗的疾病通常是涉及以下疾病的那些疾病：心脏肥大、肌纤维类型重塑和由MEF2功能失衡引起的其它肌肉相关疾病；由MEF2依赖性基因表达过多或过少引起的移植排斥和自体免疫疾病或免疫缺陷；由MEF2功能失调引起的各种神经退行性疾病(例如弗里德赖希氏共济失调、阿尔茨海默氏病和亨廷顿病等)、孤独症、精神病以及学习力和记忆力受损。示例性的疾病可以包括但不限于神经退行性疾病、心脏病、自体免疫疾病、炎症和癌。
当用于临床设定时，本发明该方面的方法会包括以下一般步骤：对患者施用药物有效量的阻断剂，其中所述阻断剂能够阻断HDAC与转录因子的结合。
当用于另一不同的临床设定时，本发明该方面的方法会包括以下一般步骤：对患者施用药物有效量的阻断剂，其中所述阻断剂能够阻断Cabin1与MEF2的结合。Cabin1是钙神经蛋白依赖性转录因子的转录辅阻遏子。其在T细胞和神经元细胞中高度表达。
当用于另一不同的临床设定时，本发明该方面的方法会包括以下一般步骤：对患者施用药物有效量的阻断剂，其中所述阻断剂能够阻断p300与MEF2的结合。
当用于另一不同的临床设定时，本发明该方面的方法会包括以下一般步骤：对患者施用药物有效量的阻断剂，其中所述阻断剂能够阻断CBP与MEF2的结合。
在更一般性的设定时，本发明该方面的方法会包括以下一般步骤：对患者施用药物有效量的阻断剂，其中所述阻断剂能够阻断任何结合MEF2的转录辅调控子的结合。
如上所述，所述HDAC可以是任何经典HDAC或其亚类。阻断剂可以是小分子、螺旋状肽模拟物(peptidomimetic)或其组合，只要所述阻断剂能够与位于HDAC和转录因子之间的界面表面上的位点选择性地结合即可。在优选实施方式中，转录因子是MEF2。
用于开发界面抑制剂的方法和工具
在另一方面，本发明还提供用于鉴定能够与HDAC和转录因子之间的界面位点结合从而阻断其相互作用的界面抑制剂。
本发明该方面的检验通常具有以下步骤：将测试化合物引入评价元件，其中所述评价元件包括位于MEF2二聚体上的界面结合位点，所述界面结合位点由第二组结构元件和位于MEF2二聚体上的第一组结构元件之间的界面定义。第一组结构元件包括各个MEF2单体的β链S1、S2、S3和螺旋H2(二级结构元件和其相应的残基范围如Han等，Nature 2003所述)。第二组包括来自Cabin1、HDAC4、HDAC9、HDAC5、HDAC7、p300和CBP的短螺旋基序。评价元件还可以与报道元件可操作地连接，所述报道元件用于报道有关测试化合物的结合或未结合的信息。
在优选实施方式中，本文公开的是基于双杂交***的检验，其包括与诱饵(bait)融合的结合域、与食饵(prey)融合的激活域和报道基因；以及确定报道子信号的水平。结合域包含与GAL4DNA融合的MEF2D(GAL4-MEF2)；激活域包含与VP-16融合的HDAC4的MEF2结合基序(HDAC4-VP16)。报道基因是GAL4-驱动的报道质粒(GAL4Luc)，所有这些寄生在细胞宿主中。
本发明的该优选实施方式是基于细胞的荧光素酶检验，该检验允许快速高通量的筛选和优化如下的小分子：所述小分子与诸如MEF2等转录因子结合并且调节其与转录辅调控子的结合。该检验由本发明人实验室基于对MEF2复合物进行的超过10年的结构与生化研究而开发。该示例性实施方式的基于通过结晶学研究首次鉴定出、并通过本发明中的结构指导的突变研究进一步证明的蛋白-蛋白界面，可用作对MEF2结合性小分子进行高度特异且灵敏的筛选的分子基础。
基于包括各个MEF2单体的β链S1、S2、S3和螺旋H2的该蛋白-蛋白界面的任何检验据认为均处在本发明的范围内。其它示例性检验的实施可以包括例如但不限于牵出、共免疫沉淀的任何物理检验技术；包括但不限于萤光素酶报道子检验的基于荧光的结合检验和功能检验，和基于通过本发明所鉴定出的蛋白-蛋白界面的转基因报道检验。
特别地，为了验证所提供的化合物是否能够确实干扰细胞内IIa类HDAC的结合，可以使用数种检验，包括染色质免疫沉淀(ChIP)检验。将HDAC4质粒构建体瞬时转染到Hela细胞中。在测试化合物和缓冲控制的存在下，通过使用合适的特异性抗体和PCR引物的ChIP检测占据在MEF2介导的启动子上的HDAC4。还可以使用基于荧光成像的方法作为ChIP分析的替代途径。将融合有GFP的MEF2C和HDAC4转染到HeLa细胞或C2C12细胞中，以研究其相互作用。当单独表达时，GFP-HDAC4以分散方式定位于细胞质中，而GFP-MEF2同样也以分散模式定位于细胞核中。当共表达时，HDAC4和MEF2在细胞核内部形成斑点体(punctate bodies)。虽然这些斑点核体的性质是未知的，但是其形成明显依赖于MEF2:HDAC4相互作用，因为缺乏功能性MEF2结合基序的HDAC4突变体不能使MEF2靶向核体。最后，通过选择公知的在休眠或激活(例如用钙信号打开)状态下对MEF2依赖性阻遏或激活显示出较大响应的MEF2靶基因，通过mRNA作图(微阵列)和结合位置(芯片上ChIP)对MEF2靶基因进行的全基因组分析可以进一步有助于该方法。使用该方法，通过使用ChIP检测IIa类HDAC的启动子存在，或通过监测进行药物治疗时或在对HDAC4、5、7或9进行siRNA敲弱之后的表达变化(首先评价由siRNA引起的表达变化)，可以验证这些基因是否受II类HDAC或其它MEF2辅阻遏子(例如Cabin1)的潜在调控。总之，通过使用微阵列分析基因表达和通过在各种浓度的所提供化合物的存在下检测IIa类HDAC的全基因组结合，该方法可用于在全基因组水平上评价化合物。
为了有助于进行该检验，本发明还提供用于搜索MEF2结合性小分子的高通量、高选择性和特异性的筛选平台。该平台包含稳定转化的细胞系和作为阴性对照和阳性对照的各种化合物，所述细胞系含有GAL4-驱动的报道质粒(GAL4Luc)、与GAL4DNA结合域融合的MEF2D (GAL4-MEF2)、与VP-16融合的HDAC4的MEF2结合基序(HDAC4-VPI6)、与VP-16融合的GAL4DNA结合域(阳性对照)。可以制造由以上稳定细胞系、质粒和对照化合物组成的试剂盒，以由用户筛选以用于搜索新型MEF2结合性分子和优化现有先导化合物。通过将MEF2D转变为MEF2A、MEF2B和MEF2C，也可以使用该方法来搜索与MEF2家族的同种型选择性结合的化合物。所述化合物可用于研究特异性MEF2家族成员在疾病中的的功能和参与，并且可用于开发诊断剂和用于鉴定特异性更高的MEF2相关疾病的治疗剂。
在另一方面，本发明还提供用于通过靶向亚型特异性HDAC抑制剂/调节剂的调控性和功能性复合物来鉴定亚型特异性HDAC抑制剂/调节剂的方法。本发明该方面的方法通常包括以下步骤：(1)解析含有功能重要性界面的结构或亚结构；(2)通过对选自现有或新型的潜在HDAC抑制剂的测试分子进行计算对接而对所解析结构进行对接分析；(3)开发用于筛选可以干扰所关注HDAC复合物之间的蛋白-蛋白相互作用的化合物的检验；(4)表征步骤(3)中鉴定的化合物；(5)通过计算对所述化合物进行优化；和(6)合成经优化的化合物和使用步骤(3)的检验验证所述化合物。
对于步骤1，可以通过使用现有结构作为搜索模型进行分子替换来解析所述结构。如果需要，可以通过MAD或MIR获得实验相(experimental phase)。对于步骤2，可以使用诸如AutoDock等标准程序包进行对接。步骤3如上所述，并且主要基于哺乳动物双杂交检验。其余步骤将取决于化合物的性质而使用本领域的已知方法。
在另一方面，本发明还提供用作用于阻断HDAC和转录因子之间的结合的阻断剂的化合物。所述HDAC可以是任何经典HDAC或其亚类。所述转录因子可以是已知与HDAC结合的任何转录因子，包括但不限于MEF2、FOXP3和GATA3。
在优选实施方式中，转录因子是MEF2。
本发明该方面的化合物包括较小的有机分子和螺旋肽模拟物。
可以通过利用所公开的MEF2结合位点作为指导，使用本文提供的方法鉴定MEF2结合性小分子。所提供的小分子具有以下结构通式，所述结构通式源自由与MEF2结合的BML-210的晶体结构披露的经鉴定的结合位点。所提供的小分子被设计成与所述结构折叠体结合，并且会以较高亲和性和选择性潜在结合MEF2。为了使用该方法鉴定更强效和更有选择性的化合物，可以使用本领域已知的方法，其包括但不限于：与电子筛选(in-silico screening)结合的计算机辅助的基于结构的设计、与高通量筛选结合的组合文库设计和用于先导物鉴定以及随后的先导物优化的基于片段的药物发现。
在优选实施方式中，本发明提供的化合物包括与MEF2结合位点结合的化合物，所述化合物具有通式：
Ra-L-Rb，其中：
Ra是与MEF2结合位点的疏水区结合的识别基团，其选自包括以下基团的组：低级烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、或RcRdNC(＝O)-、RcRdN(SO2)，其中：
Rc和Rd独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、烷氨基、二烷基氨基、芳氨基或杂芳基氨基。
L是由至多20个碳原子的链组成的连接子，条件是至多3个碳原子可以被氧、氮或硫原子置换，并且另一条件是其可以包括选自由以下基团组成的组中的取代基：
烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、苯并基、羟基、烷氧基、芳氧基、氧杂基、酮基、酰氨基、磺酰氨基或氟；
Rb是与MEF2结合位点的亲水区结合的识别基团，其选自包括以下基团的组：低级烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、或RcRdNC(＝O)-、RcRdN(SO2)，其中：
Rc和Rd独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、烷氨基、二烷基氨基、芳氨基或杂芳基氨基。
在优选的实施方式中，所提供的化合物具有通式结构Ar1-L1-L2-L3-Ar2，其中Ar1和Ar2独立选自由以下芳香环组成的组的芳香环：苯、萘、吡啶、嘧啶、吡嗪、喹啉、异喹啉、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、唑、噻唑、异唑、吲哚、苯并咪唑、苯并噻唑、苯并唑，条件是所述芳香环可以含有至多7个选自由以下基团组成的组中的取代基：氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、氨基、烷氨基、二烷基氨基、芳氨基、杂芳基氨基、羟基或卤素。所述取代基还能够连接在一起形成至多12个原子的环。
L1和L3是独立选自由以下基团组成的组的连接基团：氨基、烷氨基、芳氨基、氧杂基、酮基、NHC(＝O)、NR(C＝O)、S(＝O)或-S(＝O)2-。
L2是选自由至多10个碳原子的链组成的组的连接基团，条件是至多3个碳原子可以被氧、氮或硫原子置换，并且另一条件是这些原子可以含有选自由以下基团组成的组中的取代基：
烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、苯并基、羟基、烷氧基、芳氧基、氧杂基、酮基、酰氨基、磺酰氨基或氟。
在另一优选实施方式中，所提供的化合物具有通式：
其中：
R1～R10独立选自由以下基团组成的组：
L1和L3是独立选自由以下基团组成的组的连接基团：氨基、烷氨基、芳氨基、氧杂基、酮基、NHC(＝O)、NR(C＝O)、S(＝O)或-S(＝O)2-；
L2是选自由至多10个碳原子的链组成的组的连接基团，条件是至多3个碳原子可以被氧、氮或硫原子置换，并且另一条件是这些原子可以含有选自由以下基团组成的组的取代基：烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、苯并基、羟基、烷氧基、芳氧基、氧杂基、酮基、酰氨基、磺酰氨基或氟。
另一优选实施方式中，所提供的化合物选自以下化合物的列表(图2)：
为了进一步帮助完全理解本发明的各方面和分枝，提供以下说明性的实施例。
实施例
实施例1.用于鉴定亚型特异性HDAC抑制剂/调节剂的策略
本发明提供一种用于鉴定可以充当亚型特异性HDAC抑制剂/调节剂的先导化合物的新型策略。所述策略由数个反复步骤组成：
步骤1：对于给定的所关注HDAC复合物，对与HDAC的相关调控蛋白结合的HDAC的结构或亚结构进行解析，或获得含有功能重要性界面的HDAC结构或亚结构。
步骤2：将所述结构用于对可以结合蛋白-蛋白界面的现有或新型潜在HDAC抑制剂进行对接分析。通过功能数据指导虚拟筛选，例如所述HDAC抑制剂在涉及靶HDAC复合物的细胞过程中是否显示出效果，和所述HDAC抑制剂是否似乎通过除活性位点抑制以外的机制起作用。
步骤3：还使用所述结构和相关生化信息来指导可用于筛选能够干扰预期的蛋白-蛋白界面的化合物的检验的开发。
步骤4：一旦发现所述先导物，使用步骤1中建立的结构研究***来表征其与蛋白靶标的复合物。
步骤5：将与相关化学方法组合的结构信息用于指导能够以更高亲和性和特异性结合靶蛋白的类似物的设计。所用方法与步骤2的类似。
步骤6：合成所设计的类似物并且通过步骤3中建立的检验对其进行分析。最后，将经优化的化合物用于体内研究，以测试它们是否能够模拟亲本化合物的效果但是具有更高的潜能和较少的非特异性/副作用。
利用以上基于机制的方法，发明人已经证明将此前已知的HDAC抑制剂(PAOA)鉴定为可以通过充当MEF2抑制剂(MEF2i)而特异性干扰IIa类HDAC的功能的先导化合物。此外，还设计、合成了PAOA的代表结构类似物，并用本文所述方法对其进行评价，而且鉴定出数种更强效的MEF2i(图2)，由此证明了该方法的其它方面。
实施例2.亚型特异性HDAC抑制剂在治疗应用中的用途
IIa类HDAC在神经元存活/突触形成、T细胞选择/激活和肌肉重塑中起关键作用。这些活性的失调涉及许多疾病，包括神经退行性变、炎症和心脏肥大。一些为癌治疗开发的HDACi显示出对这些疾病的有益效果。虽然这些HDAC抑制剂的非特异性阻止了它们在这些疾病中的临床应用，这些观察提出了一个令人感兴趣的问题，即所观察的治疗效果是否与IIa类HDAC有关，以及IIa类HDAC功能的选择性干扰是否是用于治疗这些疾病的可行策略。为了解决这些问题，需要能够特异性干扰IIa类HDAC的功能的小分子。
基于MEF2和IIa类HDAC的已知细胞功能和一些HDAC抑制剂在肌肉***、免疫***和神经元***中的作用，我们提出本发明的方法和化合物可用于治疗心脏肥大、肌纤维类型重塑和由MEF2功能失衡引起的其它肌肉相关疾病；移植排斥和由MEF2依赖性基因表达过多或过少引起的自体免疫疾病或免疫缺陷；由MEF2功能失调引起的各种神经退行性疾病(例如弗里德赖希氏共济失调、阿尔茨海默氏病和亨廷顿病等)、孤独症、精神病以及学习力和记忆力受损。
为治疗各种上述疾病开发的MEF2-结合分子可以口服施用、肌肉内施用、腹膜内施用、皮下施用、静脉内注射。其它递送方法也是可行的，并且确切的方案取决于正在治疗的条件。剂量也可以根据具体的临床应用而变化。但是在体外所述化合物显示出效果的标准检验为在体外约0.1μM～10μM和在动物模型研究中1mg/KG体重～10mg/KG体重。
图2中所示的本发明提供的优选化合物在体外和体内显示出对于与MEF2结合的广泛亲和性，并且可用作开发在以上所述肌肉***、免疫***和神经***中的基于MEF2的治疗的先导化合物。所述化合物确实在体外和在小鼠模型中显示出促进调控性T细胞功能的作用，因此是用于自体免疫疾病和预防移植排斥的潜在先导药物。例如，如体内抑制活性增强所证实，0.15μM的MEF2结合性分子NKL30极大地增强了调控性T细胞功能。在稳态增殖检验的小鼠模型中，通过静脉内注射施用1mg/KG体重的所述化合物也可以在体内极大地增强Treg功能。这些数据有力地表明，本发明提供的MEF2结合性分子可用于治疗自体免疫疾病和用于预防移植排斥。
实施例3.用于功能调节的向IIa类HDAC的靶向
与其它HDAC相比，IIa类家族在功能和调控的几个方面上是独特的。首先，IIa类HDAC在肌肉、脑和T细胞中选择性表达，与其在这些组织中的功能一致。第二，IIa类HDAC的活性受钙信号紧密调控，钙信号是表达IIa类HDAC的组织中的主要第二信使。第三，II类HDAC含有与催化域相连的较大调控性结构域N末端，这赋予该HDAC亚类独特的性质。所述N末端调控区含有与各种蛋白相互作用的结构域和基序，所述各种蛋白包括诸如CaM、CaMK和14-3-3等调控II类HDAC的钙响应性的蛋白，和诸如MEF2和BCL-6等使II类HDAC靶向特异性启动子的蛋白，以及与IIa类HDAC协同起作用的其它表观遗传调控子和效应子(诸如I类HDAC、CtBP和HP-1)。作为用于特异性干扰的潜在靶标，对许多这些复合物的结构进行了研究。
在许多参与IIa类HDAC的调控和功能的复合物中，在生化和结构方面得到最好表征的是MEF2复合物。MEF2是序列特异性转录因子家族(MEF2A-D)，该家族与IIa类HDAC具有相同的表达模式，并且也参与神经退行性变、炎症和心脏病。转录因子的MEF2家族共有高度保守的称为MADS盒/MEF2S结构域的N末端区，其介导DNA结合、二聚化和与各种转录因子和辅调控子的蛋白-蛋白相互作用。IIa类HDAC不结合DNA，但是根据与MEF2的相互作用而靶向特定的染色质区以用于脱乙酰化。选择阻断该相互作用作为干扰IIa类HDAC的功能的潜在途径。
IIa类HDAC和MEF2之间的相互作用可以是深入的功能和生化分析的对象，其揭示了IIa类HDAC中保守的较短的序列基序(MEF2结合基序)和MEF2的MADS盒/MEF2S结构域对于其结合而言是必要且充分的。对于MEF2和IIa类HDAC以及含有类似的MEF2结合基序的相关转录阻遏物(Cabin1)之间的相互作用进行了***结构和生物物理研究。晶体结构揭示，MEF2结合基序采取较短的两性螺旋结构来结合位于MEF2的MADS盒/MEF2结构域上的疏水沟。所述配体/受体样结合机制表明，可以使用小分子来阻断IIa类HDAC至MEF2特异性启动子的募集(参见Han Nature and2005)。
实施例4.亚类特异性HDAC抑制检验的开发
最初使用一系列使用瞬时转染的MEF2D、HDAC4和辅激活子p300来筛选各种化合物。但是这些检验给出较弱的信号和较高频率的假阳性，这可能由MEF2的复杂的转录激活机制和来自内源性因子的干扰引起。通过这些观察，发现能够重演细胞内HDAC4和MEF2之间的分子相互作用的高灵敏性和特异性的检验是必需的。为了解决该问题，发明人设计了能够检测HDAC4和MEF2D之间的相互作用的哺乳动物双杂交***，其具有来自内源性因子的最小干扰(图3)。
在该检验***中，MEF2D与GAL4DNA结合域融合(GAL4-MEF2D)，并且HDAC4(第155位～220位氨基酸)的MEF2结合基序与VP-16融合(HDAC4-VP16)。初步分析显示，用构建体和受GAL4驱动的报道质粒(GAL4Luc)瞬时转染的Hela细胞产生较强的信号，该信号与GAL4-VP16的阳性对照产生的信号相当，而之前在与HDAC4结合方面显示缺陷性的MEF2D突变Leu67Asp(L67D)不能激活报道子(数据未示出)。所有荧光素酶报道检验中的蛋白表达通过蛋白质印迹确认。
除了上述MEF2D L67D突变体之外，利用所述结构知识，引入了许多之前已知在体外干扰HDAC4:MEF2相互作用的HDAC4中的大量突变。这些突变还在基于细胞的检验中减少了荧光素酶信号(图3b)。最令人感兴趣的是，HDCA4上的Val180Lys突变在体外使MEF2的结合减弱约60％(野生型和突变体HDAC4的MEF2结合Kd分别为0.47μM和0.81μM)的在，该突变在基于细胞的检验中使荧光素酶信号部分减少(图3b)。这些观察证明来自哺乳动物双杂交检验的信号与HDAC4和MEF2之间的分子相互作用非常良好地相关。这些结果不仅为HDAC4:MEF2相互作用的结构模型提供了进一步支持，还建立了用于检测细胞内HADC4:MEF2相互作用的灵敏且特异的方法。
实施例5.鉴定MEF2/HDAC相互作用的选择性抑制剂
为了减少筛选的复杂性，使用大量的关于现有HDAC抑制剂的功能数据。虽然大多数这些抑制剂靶向催化域，通过基于细胞的组蛋白乙酰化检验发现的化合物中的某些可以影响HDAC功能的其它方面，包括IIa类HDAC与MEF2的结合。考虑到这一点，我们使用源自HDAC9:MEF2复合物的晶体结构的药效团模型进行针对小分子数据库的虚拟筛选(3D对接)。虽然该搜索未产生新型靶标，其确实显示MEF2的疏水口袋更偏好具有通过特定长度的连接子连接的两个芳香环的化合物。该结果与晶体学分析一致，表明MEF2二聚体含有两个能够结合来自HDAC9的苯丙氨酸的对称相关位点(参见Han等，Nature和JMB)。因此，搜索具有所述结构特征的已知HDAC抑制剂，并且使用哺乳动物双杂交检验测试其对HDAC4:MEF2相互作用的影响。
使用哺乳动物双杂交检验对所选择的HDAC抑制剂的库进行筛选揭示，此前所研究的化合物PAOA(图2)以剂量依赖性方式抑制报道信号(图4)。PAOA不影响HDAC4-VP16的表达，但是在10μM时将GAL4-VP16驱动的报道信号减少5.6倍(数据未示出)，表明在本发明的实验条件下，该化合物对荧光素酶活性表达的非特异性抑制。但是，相同浓度的PAOA将GAL4-MEF2D和HDAC4-VP16驱动的报道信号减少约26倍，表明PAOA具有的对干扰HDAC4:MEF2相互作用的特异性效果超过其普通抑制性效果。相反，曲古抑菌素A(TSA)作为靶向锌活性位点的强效HDAC抑制剂，对GAL4-VP16和GAL4-MEF2D/HDAC4-VP16驱动的报道信号显示出类似的抑制效果(数据未示出)。这些结果表明，能够干扰HDAC4和MEF2D之间的相互作用的是PAOA而不是TSA。
基于哺乳动物双杂交检验，PAOA对HDAC4:MEF2相互作用的IC50为约5μM，与使用组蛋白乙酰化抑制检验确定的类似。之前确定HDAC4与MEF2的结合Kd为0.47μM。如果我们假定在本发明的检验条件下HDAC4的平衡浓度为约0.5μM，则据估计PAOA与MEF2的结合Kd为5μM。但是，如果在基于细胞的检验中游离HDAC4的浓度较低，则估计的Kd可能较大。
还在Biacore T-100上使用表面等离子共振(SPR)于体外评估PAOA是否与HDAC4竞争性地结合MEF2。此处将HDAC4(第155位～220位氨基酸)固定在CM5传感器芯片上，并且使用经纯化的MEF2A(1-95)作为分析物。在各种浓度下MEF2A与HDAC4的结合产生了一系列轮廓清晰的传感图(数据未示出)。MEF2A与浓度递增的PAOA一起温育显示出与所固定HDAC4的结合的剂量依赖性减少(图5)。Biacore数据的分析表明，竞争性结合反应是复杂的，而BML-210与MEF2的直接结合超出了仪器的检出限。这些技术限制使得难以获得定量的结合常数。但是，初步数据表明BML-210确实在体外与HDAC4竞争性地结合MEF2。
PAOA最初作为可能通过抑制除HDAC6(微管蛋白特异性HDAC)之外的HDAC而选择性诱导组蛋白而不是微管蛋白的乙酰化的一组化合物的一部分发现。PAOA在体外与HDAC4竞争性地结合MEF2。右边的插图说明了通过Biacore进行的检验。HDAC4：红色螺旋；MEF2：绿色十字，脱乙酰酶。虽然该选择性的分子基础是未知的，但值得注意的是属于IIb类亚家族的HDAC6，不具有在IIa类中保守的MEF2结合基序，并且确实似乎需要MEF2来发挥功能。近来显示MEF2及其衍生物增强弗里德赖希氏共济失调中frataxin的表达。虽然该机制似乎涉及所诱导的组蛋白乙酰化，诸如TSA和SAHA等更强效但是特异性较低的HDAC抑制剂对于frataxin表达显示无影响，虽然其能够比PAOA在细胞中诱导更高水平的总组蛋白乙酰化。这些观察表明，PAOA和其衍生物拥有抑制参与frataxin沉默的特异性HDAC或HDAC复合物的独特功能。另外，可以使用本发明中所公开的与MEF2结合的BML-210的晶体结构来进一步阐明PAOA作用的分子基础。除了如本文所述来限定小分子MEF2结合性位点之外，该结构还首次揭示存在于BML-210以及PAOA中的邻氨基酰基苯胺部分的可能结合位点和存在于其它含苯甲酰胺的HDAC抑制剂中的可能结合位点。注意，该结合位点不同于之前对于该类HDAC抑制剂假定的HDAC酶活性位点。
实施例5.与位于DNA上的MEF2结合的BML-210的复合物的制备和BML-210:MEF2:DNA复合物的晶体以及所述复合物结构的原子细节
为了表征BML-210与MEF2结合的详细相互作用和使用所述结构信息来指导更强效MEF2结合分子的设计，我们已经确定了与DNA上的MEF2结合的BML-210的晶体结构。通过PCR扩增从MEF2AFL创建基因编码MEF2A1-78，并且将其克隆到pET30b表达载体中。在大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysS中于25℃过夜表达蛋白，并在Sp-Sepharose上通过连续的色谱步骤对其进行纯化，在4℃于250mM NaCl、10mM Hepes(pH7.6)、1mM EDTA、l mM DTT中进行凝胶过滤以产生0.6mg/l的最终收率。寡核苷酸(Santelli和Richmond，2000)购自IDT DNA technologies，使用MonoQFPLC柱和随后的透析、冻干和使用热循环仪退火来进行纯化。
将10mM BML 210的1/10蛋白样品量添加至0.5mg/ml的蛋白样品中，并浓缩至约17mg/ml(0.9mM)，在设定托盘之前以1∶1的比例添加DNA双链体(10％DMSO终浓度)。使用24％PEG4000、140mM NaCl、5mM MgCl2、10mM CaCl2、0.004％NaN3、3.3％甘油、50mMTrisHCl(pH5.8～pH8.18)在18摄氏度通过悬滴汽相扩散条件获得片状晶体。在pH 8.18获得具有药物密度的晶体。使晶体在分辨率进行衍射并且其属于空间组P1(α＝114.12°，β＝89.99°，γ＝89.95°)。使用ITQE.pdb作为搜索模型通过分子置换来解析所述结构(参见Richmond 2000)。最终模型具有26％的Rfree和23％的Rw。附上坐标(11.1_001_nr_nh_bml.pdb)。
实施例6.使用结构指导的设计和化学方法进行的先导物优化
通过功能筛选发现的大多数HDAC抑制剂具有中等效力，其IC50在微摩尔甚至毫摩尔范围内。通常通过对化学结构进行***改性和构效关系(SAR)研究来完成先导物优化。但是，在不知道靶标和不知道所述化合物与其靶标之间的详细结合相互作用的情况下，所述经验方法经常耗费大量劳动并且功效有限。事实上这正是PAOA的情况，其中合成了一系列的类似物以搜索更强效的可用于治疗弗里德赖希氏共济失调化合物。虽然一些PAOA类似物确实比亲本化合物显示出更高的活性，但是效果非常中庸并且改善机制也不清楚。
显著的是，这些PAOA衍生物激活frataxin表达的能力与其HDAC抑制活性不相关。例如，所述衍生物中的一些在组蛋白脱乙酰抑制检验中非常弱，而在frataxin诱导中活性很高。对于PAOA结合MEF2并且阻断IIa类HDAC的募集的初步发现，为这些令人感兴趣的结果提供了潜在的分子机制。IIa类HDAC能够不依赖于脱乙酰酶活性而阻遏转录。例如，缺乏C末端催化域的天然存在的HDAC9剪接变体(也称为MITR)是MEF2依赖性基因表达的强效转录阻遏子，这可能通过募集诸如HPI和CtBP等其它表观遗传效应子实现。在这种意义上，靶向IIa类HDAC的催化域的小分子抑制剂不能消除这些蛋白的全部表观遗传沉默潜能，这就可以解释TSA和SAHA在重新激活frataxin表达中的失效。另一方面，PAOA可以阻断HDAC活性以及其它转录阻遏子的募集。虽然MEF2也通过募集诸如CBP/p300等转录激活子参与基因激活，目前的数据表明，PAOA对MEF2依赖性基因表达的主要影响是减轻IIa类HDAC和其它转录阻遏子的沉默效果。
通过依靠以上分析和公开的BML-210:MEF2:DNA结构，以及通过使用PAOA至MEF2A的对接方案，据显示该药物分子能够更好地匹配实验观察到的电子密度，证明了ICM对接策略(MolsoftL.L.C)对于设计用于MEF2结合的新型PAOA样化合物的相关功效。该对接途径还可用于设计和分析潜在的具有更高亲和性和选择性的新型PAOA类似物。以下对所述结构中的一些特征进行简要描述以说明用于设计可以以更高亲和性结合MEF2的新型分子的原理。
BML-210采取延伸构象来结合到MEF2的疏水口袋中(图1)。这也是在IIa类HDAC和Cabin1中保守的MEF2结合基序的结合位点。由于电子密度的一端类似简单的芳香环，并且被包括Leu66、Leu67、Thr70、Leu66′、Leu67′和Thr70′在内的许多疏水性残基包围(撇号表示来自其它单体的残基)，我们将该密度指认为苯基。该末端处的羰基还处于参与和Thr70′的氢键相互作用的位置(图1)。
可以使用数种已知MEF2结构实现对新型的经优化的MEF2结合性小分子进行基于结构的设计。现在已经解析了三种MEF2复合物的晶体结构。其中两种含有分别源自Cabin 1和HDAC9的MEF2结合基序的肽(Guo等，2007；Han等，2005；Han等，2003)，而第三种是本文所述的BML-210复合物，其是首个显示小分子如何能够与MEF2结合的结构。在所有三种复合物中，小分子配体无论其是天然存在的肽还是合成分子均与位于MEF2二聚体表面上的深沟结合(图1)。此前研究表明，Cabin 1和HDAC9通过类似但独特的蛋白-蛋白相互作用结合MEF2(图1)。令人感兴趣的是，BML-210在与MEF2结合上似乎模拟天然配体的某些方面。例如，PAOA的苯环与由Leu66、Leu67、Thr70、Leu66′、Leu67′和Thr70′形成中央疏水口袋的结合类似于HDAC9中的Leu147(图1)。通过对三种结构进行的详细分析，已经鉴定出关于MEF2沟的各种结构特征，这种结构特征可以针对小分子结合进行探索，并且其包括许多离散的疏水口袋、氢键供体和受体以及数个带电残基。我们计划利用该结构信息来设计和优化新的能够与MEF2选择性结合的小分子系列。
实施例7.MEF2/HDAC相互作用的小分子抑制剂的结构指导的设计
使用晶体结构作为指导，设计了大量可以为鉴定新型MEF2活性小分子提供基础的PAOA类似物。将第一组类似物设计用以探索PAOA结构的两个一般要素。首先是连接子的长度和刚性。其次是官能团和其在两个芳香结合单元上的位置。连接子的电子密度指出其采取多个构象，表明在该区域中PAOA和MEF2之间的非最佳结合。另一方面，在HDAC9中，Lys144和Val143的脂族侧链很好地填补MEF2的沟，从而建立大量的范德华接触和氢键。在PAOA连接子处引入以模拟/改善这些天然相互作用的官能团可以增强结合亲和性。对所设计的化合物进行上述对接分析以过滤出能量上不利的化合物。使用标准技术合成剩余分子并进行前述的体外和体内分析。
合成了第一系列的潜在抑制剂(图2)，并且已经发现不同的化合物在其抑制哺乳动物双杂交检验中的报道信号的能力方面显示出显著不同的活性。更令人感兴趣的是，其中之一的化合物4显示出与PAOA相似的活性，但是对GAL-VP-16驱动的对照信号没有影响，表明该新型衍生物比PAOA具有更高的特异性。之前已经推测PAOA中的邻氨基酰基苯胺部分是能够与I类和II类HDAC的活性位点结合的锌螯合基团，但是尚未获得该作用模式的直接证据。化合物4中，通过将氨基移到间位消除该锌螯合基团。但该衍生物具有与PAOA同样的活性，但具有较低的非特异性效果，表明在本发明的检验条件下，细胞内所观察到的PAOA的效果主要归因于其干扰MEF2:HDAC4相互作用的能力而不是抑制催化活性。
实施例8.化合物10的合成
可以通过本领域已知的方法制备所提供的化合物。例如，化合物10的合成：
通过以下步骤制备：
步骤1：将庚二酸(1当量)和3-溴苯胺(1当量)添加至烧瓶并在130℃搅拌过夜。在EtOAc中稀释反应混合物并用10％的氢氧化钾进行提取。用浓盐酸将水性层酸化至约pH 2，并用乙酸乙酯提取。在真空下对有机层进行还原并用乙腈/水进行重结晶。
步骤2：在室温向苯二胺的二氯甲烷溶液添加(Boc)2O(1当量)，并将混合物搅拌过夜。将反应物在真空下浓缩，用乙酸乙酯稀释，并用水和盐水提取3次。在真空下对有机层进行还原并用氯仿/己烷进行重结晶。
步骤3：将步骤1的产物(100mg)溶解于DMSO(3mL)中，并且向该溶液添加N，N-二异丙基乙胺(Hunig碱)(1当量)、HBTU(1当量)和步骤2的单保护苯二胺产物。在室温将所得溶液搅拌过夜。将所述溶液用乙酸乙酯稀释，并用盐水提取3次。在真空下对有机层进行还原并通过柱层析(己烷/乙酸乙酯梯度液)进行纯化。将分离产物溶解于二氯甲烷，冷却至℃并用三氟乙酸(1mL)处理。将溶液加热至室温并搅拌过夜。用碳酸氢钠中和反应物并在真空下进行浓缩。将所得固体溶解于乙酸乙酯并用饱和氯化钠溶液提取。用硫酸镁干燥有机层，过滤，在真空下浓缩，并通过柱层析进行纯化(己烷/乙酸乙酯和二氯甲烷/甲醇梯度液)。在真空下蒸发溶剂而得到纯产品10，其结构和纯度通过NMR光谱进行验证。
虽然已经根据具体示例性实施方式和实施例描述了本发明，但应该理解，本文公开的实施方式只是用于说明目的，并且本领域技术人员可以进行各种改进和变化而无需背离以下权利要求中提出的本发明的精神和范围。
表1
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Claims (11)

1.小分子在制造用于选择性抑制MEF2的功能的药物中的应用，所述小分子选择性抑制MEF2与选自由Cabin1、HDAC4、HDAC5、HDAC7、HDAC9、p300和CBP组成的组的因子之间的相互作用，其中所述小分子选自由以下化合物组成的组中的一种：
2.一种化合物，所述化合物选自由以下式组成的组的式：
3.权利要求2所述的化合物或庚二酰基苯胺邻氨基酰基苯胺PAOA或辛二酰基苯胺邻氨基酰基苯胺BML-210在制造用于治疗与MEF2失调相关的疾病的药物中的应用，其中所述疾病选自由下述疾病组成的组：心脏肥大、心力衰竭、弗里德赖希氏共济失调、过敏、哮喘、阿尔茨海默氏病、亨廷顿病、肌强直性营养不良、脊髓性肌萎缩、病理性肌纤维改变、孤独症、精神***症、自体免疫疾病、炎性肠病、银屑病、学习力或记忆力受损、移植排斥和其它肌肉相关疾病。
4.如权利要求3所述的应用，其中所述疾病是选自肌肉和心血管***的一种疾病。
5.如权利要求3所述的应用，其中所述疾病选自由以下疾病组成的组：心脏肥大、心力衰竭、病理性肌纤维改变、肌强直性营养不良、脊髓性肌萎缩和其它肌肉相关疾病。
6.如权利要求3所述的应用，其中所述疾病是选自神经元***的一种疾病。
7.如权利要求3所述的应用，其中所述疾病选自阿尔茨海默氏病、亨廷顿病、肌强直性营养不良、脊髓性肌萎缩、弗里德赖希氏共济失调、孤独症、精神病以及学习力或记忆力受损。
8.如权利要求3所述的应用，其中所述疾病是精神***症。
9.如权利要求3所述的应用，其中所述疾病是选自免疫***的一种疾病。
10.如权利要求3所述的应用，其中所述疾病选自移植排斥、自体免疫疾病、过敏、哮喘、炎性肠病或银屑病。
11.如权利要求3所述的应用，其中所述疾病选自类风湿性关节炎或***性红斑狼疮。
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