CN102268436A - ***癌靶向基因的寡核苷酸适配体、递释载体、递释***及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种***癌靶向基因的寡核苷酸适配体、递释载体、递释***及其制备方法,所述递释载体由聚阳离子高分子材料、亲水性聚合物和的寡核苷酸适配体为基础,三者以共价方式链接构成,其中,亲水性聚合物与聚阳离子高分子的摩尔比是1~25∶1,所述寡核苷酸适配体与聚阳离子高分子材料的摩尔比为1~5∶1;所述递释***由递释载体与miRNA、siRNA或质粒DNA形成的纳米级基因递释***。本发明所述递释载体和递释***可有效提高表达***特异性膜抗原的***癌细胞上基因转染效率和表达效率,与现有的技术采用的靶向头基构筑的基因传递***比较,具有稳定性更强,靶向效果显著提高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种***癌靶向基因***癌靶向基因的寡核苷酸适配体、递释载体、递释***及其制备方法。
背景技术
***癌(prostatic cancer,PCa)是男性生殖***最常见的恶性肿瘤,其发病率随年龄的增长而提高,已成为严重威胁人类健康的恶性疾病。在2010年美国癌症学会公布的统计报告中,***癌在男性的发病率中排名第一,死亡率排名第二,仅次于肺癌。对于PCa的治疗,早期完整手术切除***是首选的治疗方案,但是手术治疗会伴有严重的并发症及医源性损伤,而且对已发生转移的PCa无效。目前临床上治疗中晚期PCa主要采用放疗、化疗(包括内分泌治疗)等手段,这些治疗方法存在用药顺应性差、组织选择性差、毒性反应大及耐药性等问题。基因治疗相对于上述方法来说具有许多无可比拟的优点,如靶向性好、毒副作用小及可特异性地杀伤肿瘤细胞等,但是外源基因自己不能主动进入细胞,因此基因治疗应用于临床还需要一种安全、高效的传递载体进行递送。
目前报道较多的基因载体主要包括病毒载体和非病毒载体,病毒载体虽然具有很高的转染率,但病毒载体的制备复杂且昂贵,需要重整病毒,更重要的是人们对于其可能引起免疫反应和基因突变引起致癌性转化的安全隐患。而非病毒载体设计灵活,制备方便,价格低廉,无毒,无免疫反应,可以实现细胞特异性和长期基因表达的优点。常见的非病毒载体主要有聚乙烯亚胺(PEI),聚精氨酸(PLR),聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状高分子等聚阳离子高分子材料,其中聚乙烯亚胺,聚精氨酸毒性较大,但通过特定的亲水性聚合物修饰,可以降低其毒性。而PAMAM的粒径大小、电泳性质和其他一些拟生态性质与球状蛋白质非常相似,被称为“人工蛋白”。
但是上述阳离子聚合物载体还存在一个严重缺陷-靶向性差。目前用于解决***癌靶向性差的方法,主要是通过在载体上连接可以特异识别***癌组织的靶向头基,来完成对癌细胞的主动靶向作用。然而,目前主要使用的靶向头基是单克隆抗体,单克隆抗体存在合成困难、造价高昂、稳定性差等缺陷,成为制约其作为进一步向临床大规模生产发展的瓶颈。因此,有必要研发一种新型的***癌靶向头基来替代单克隆抗体,以及开发一种新型的适用于***癌的靶向治疗的***癌靶向基因递释载体和相应的***癌靶向基因递释***。
发明内容
本发明需要解决的技术问题之一是提供一种***癌靶向基因的寡核苷酸适配体,这种寡核苷酸适配体制备方便、稳定性高。
本发明需要解决的另一技术问题是提供一种***癌靶向基因递释载体,该基因递释***将上述寡核苷酸适配体作为靶向头基,除了制备方便、稳定性高,而且能显著提高基因递释***的***癌靶向性和基因在***癌组织的表达。
本发明需要解决的另一技术问题是提供一种***癌靶向基因递释***,其能显著提高治疗基因在***癌组织的转染效率和表达水平
此外,本发明需要解决的另一技术问题是提供一种***癌靶向基因递释载体和***的制备方法。
为了解决上述技术问题,本发明通过如下技术方案实现:
在本发明的一个方面,提供了一种***癌靶向基因的寡核苷酸适配体,该寡核苷酸适配体的序列组成为:5′-GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCU-(CH2)6-S-S-(CH2)6-OH-3′,且具有2′-氟修饰。
本发明通过对第一代适体A10进行修饰,将原有适体A10的79个核苷酸长度裁剪到具有39个核苷酸长度的新型第二代适体A10-3.2,降低了合成难度,通过与***癌表面特异性膜抗原结合作用发现,结合效率有所提高,并且对A10-3.2的每个核苷酸进行了2’-氟修饰,增加了稳定性。因此,证明A10-3.2寡核苷酸适配体是一种有效的***癌靶向头基。
在本发明的另一个方面,提供了一种***癌靶向基因递释载体,其由聚阳离子高分子材料、亲水性聚合物和A10-3.2寡核苷酸适配体为基础,三者以共价方式链接构成,其中,亲水性聚合物与聚阳离子高分子的摩尔比是1~25∶1,A10-3.2寡核苷酸适配体与聚阳离子高分子材料的摩尔比为1~5∶1;所述A10-3.2寡核苷酸适配体的序列组成为:5′-GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCU-(CH2)6-S-S-(CH2)6-OH-3′,且具有2′-氟修饰。
优选地,所述亲水性聚合物与聚阳离子高分子的摩尔比是1~4∶1;所述寡核苷酸适配体与聚阳离子高分子材料的摩尔比为3~5∶1。
在本发明的另一个方面,提供了一种***癌靶向基因递释***,其由上述***癌靶向基因递释载体与miRNA、siRNA或质粒DNA形成纳米级基因递释***,其中,所述聚阳离子高分子材料与miRNA、siRNA或质粒DNA的N/P比是10~15∶1
在本发明的另一方面,还提供了***癌靶向基因递释载体的制备方法,包括以下步骤:
A.聚阳离子高分子材料和亲水性聚合物以1∶1~25的摩尔比溶于pH值7.7~8.3的磷酸缓冲液(PBS),室温搅拌反应1~2h,生成聚阳离子高分子材料-亲水性聚合物;超滤法除去未反应的亲水性聚合物并更换为pH值6.7~7.3磷酸缓冲液;
B.所述的寡核苷酸适配体溶于pH值7.4的PBS中,加入二硫苏糖醇(DTT),室温搅拌反应后,除去剩余DTT,生成巯基修饰的寡核苷酸适配体;
C.上述A10-3.2寡核苷酸适配体与聚阳离子高分子材料以摩尔比为1~5∶1,室温下搅拌反应24~36h后生成聚阳离子高分子材料-亲水性聚合物-A10-3.2寡核苷酸适配体,透析除去未反应的A10-3.2寡核苷酸适配体,得到***癌靶向基因递释载体。
在本发明的另一方面,还提供了***癌靶向基因递释***的制备方法,包括以下步骤:
将上述制备的***癌靶向基因递释载体溶于pH值7.4-7.7磷酸缓冲液(PBS)中,配制成所需浓度的溶液,将miRNA、siRNA或质粒DNA溶于PBS中配置成所需浓度溶液,室温下两者等体积混合后,涡旋20-40s后,静置20-40min,制成***癌靶向基因递释***,其中,所述聚阳离子高分子材料与miRNA、siRNA或质粒DNA的N/P比是10~15∶1。
优选地,本发明所述的阳离子高分子材料选自聚酰胺-胺型树状分支物(PAMAM)、聚精氨酸(PLR)、聚乙烯亚胺(PEI)、多聚赖氨酸。
优选地,所述的亲水性聚合物选自聚乙二醇(PEG)。
本发明所述的miRNA、siRAN是指任何可合成的RNA序列,质粒DNA是任何可在真核细胞表达的质粒DNA。
本发明所述的***癌靶向基因递释载体和***,其以所述A10-3.2寡核苷酸适配体为靶向头基,增加了基因在***癌细胞的转染效率和表达水平,特别是通过无创伤的静脉注射方式给药后,能显著提高基因递释***的***癌靶向性和基因在***癌组织的表达。与现有的单克隆抗体作为靶向头基构建的基因递释***相比,本发明的***癌靶向作用和外来基因的表达效率均能显著提高,且稳定性更强。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明***癌靶向基因递释载体的合成线路图;
图2是实施例1中PAMAM-PEG-A10-3.2核磁共振图谱;
图3是实施例7中琼脂糖凝胶电泳考察不同不同N/P比,PAMAM-PEG-A10-3.2包裹基因效果示意图;
图4是实施例8中荧光显微镜下观察不同N/P比下,PAMAM-PEG-A10-3.2/pEGFP、PLR-PEG-A10-3.2/pEGFP和PEI-PEG-A10-3.2/pEGFP转染的***癌细胞中pEGFP-N2绿色荧光蛋白质粒的表达情况示意图;
图5是实施例9中PAMAM-PEG-A10-3.2/DNA作用在LNCaP细胞中荧光素酶表达量示意图;
图6是实施例10中***癌裸鼠移植瘤小鼠尾静脉注射DyLight-688标记的PAMAM-PEG-A10-3.2、PLR-PEG-A10-3.2和PEI-PEG-A10-3.2活体成像仪观察结果示意图。
具体实施方式
本研究发明了一种新型***癌靶向头基-A10-3.2寡核苷酸适配体,来替代单克隆抗体,有效的解决合成难,造价高,稳定性差,等缺陷。
A10-3.2寡核苷酸适配体,简称适体,是一种能与特异性地表达于***上皮细胞表面的***特异性膜抗原(PSMA,prostate specific membrane antigen)特异高效结合的单链寡核苷酸。适体与靶细胞结合的特异性和单克隆抗体相似,甚至更高,但适体分子体积较小,比单克隆抗体更易穿透组织和器官。当适体连接到药物载体表面时,***的体积不会有很大地增加,使药物载体粒径更容易控制。而且,适体并没有明显的免疫原性,其介导的靶向药物注入人体内不会引发免疫反应,同时,适体制备方便,且比单克隆抗体有更高的稳定性,可以在许多缓冲溶液中保存,所以在生产、储存和运输当中有很大的优势。A10-3.2适体是针对PSMA细胞膜外部分的重组蛋白的第二代适体,相对于第一代A10适体,结构更加简单,不仅降低了合成难度,而且又提高了靶向性。含有A10-3.2适体的纳米粒可以显著性地增加药物对***癌细胞的毒性,因而适用于***癌的靶向治疗。
本发明采用核磁共振技术对所制备的基因递释载体及其制备过程的中间产物进行结构鉴定,结果显示,PAMAM与含有双功能基团的PEG(琥珀酰亚胺-PEG3500-马来酰亚胺)反应后,在3.5ppm处出现PEG的特征吸收峰,并在6.7ppm处出现马来酰亚胺的特征吸收峰。说明PEG已经修饰到PAMAM上,再和A10-3.2寡核苷酸适配体反应后,该马来酰亚胺的特征吸收峰消失,说明PAMAM-PEG-A10-3.2合成成功。
本发明采用0.7%琼脂糖凝胶电泳技术考察所制备的基因递释***的稳定性,结果显示,在N/P>2时,基因递释***中的DNA可以被完全包裹,并保持稳定。同时可以推断载基因递释***中在相同条件下,可以保持siRNA或miRNA稳定。
本发明所制备的基因递释***转染高表达PSMA的***癌细胞LNCaP(PSMA+),定性和定量结果均显示,PAMAM-PEG-A10-3.2/DNA基因递释***表达效果最高,其中,虫荧光素酶定量结果显示,PAMAM-PEG-A10-3.2/DNA基因递释***的基因产物表达量是PAMAM-PEG/DNA的6倍左右。
本发明所制备的基因递释***通过***癌LNCaP(PSMA+)接种的裸鼠模型尾静脉注射方式,考察体内靶向性和基因表达效果,动物活体成像定性结果显示,经A10-3.2寡核苷酸适配体修饰后的基因递释***在小鼠皮下移植瘤区域表达量显著高于其他组织。
以下通过实施例,进一步具体、详细地描述本发明。
实施例1
本发明通过对第一代适体A10进行修饰,将原有适体A10的79个核苷酸长度裁剪到具有39个核苷酸长度的新型第二代适体A10-3.2。本实施例所述的***癌靶向基因以A10-3.2寡核苷酸适配体为靶向头基,A10-3.2寡核苷酸适配体的碱基组成为:5′-GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCU(SEQ.ID.NO.1)。该寡核苷酸适配具体组成为:5′-GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCU-(CH2)6-S-S-(CH2)6-OH-3′,且具有2′-氟修饰,且具有2′-氟修饰。
本实施例所述的***癌靶向基因递释载体,其由PAMAM、PEG和上述A10-3.2寡核苷酸适配体为基础,三者以共价方式链接构成,其中,PEG与PAMAM的摩尔比是2∶1,A10-3.2寡核苷酸适配体与聚阳离子高分子材料的摩尔比为4∶1;
本实施例所述的***癌靶向基因递释载体的制备方法,包括如下步骤:
A.聚阳离子高分子材料和亲水性聚合物以1∶1~25的摩尔比溶于pH值7.7~8.3的磷酸缓冲液(PBS),室温搅拌反应1~2h,生成聚阳离子高分子材料-亲水性聚合物;超滤法除去未反应的亲水性聚合物并更换为pH值6.7~7.3磷酸缓冲液;
B.所述的寡核苷酸适配体溶于pH值7.4的PBS中,加入二硫苏糖醇(DTT),室温搅拌反应后,除去剩余DTT,生成巯基修饰的寡核苷酸适配体;
C.A10-3.2寡核苷酸适配体与聚阳离子高分子材料以摩尔比为4∶1,室温下搅拌反应24~36h后生成聚阳离子高分子材料-亲水性聚合物-A10-3.2寡核苷酸适配体,透析除去未反应的A10-3.2寡核苷酸适配体,得到***癌靶向基因递释载体。合成路线如图1。
将上述PAMAM-PEG-A10-3.2基因递释载体1.0mg,溶于0.5ml重水中,NMR(300MHz)鉴定基因递释载体的结构,获得理想的核磁共振图谱(附图2),说明PAMAM-PEG-A10-3.2合成成功。
实施例2
本实施例所述的***癌靶向基因的寡核苷酸适配体如实施例1所述。
本实施例所述的***癌靶向基因递释载体,其由PLR、PEG和上述A10-3.2寡核苷酸适配体为基础,三者以共价方式链接构成,其中,PEG与PLR的摩尔比是2∶1,A10-3.2寡核苷酸适配体与聚阳离子高分子材料的摩尔比为4∶1。
本实施例所述的***癌靶向基因递释载体的制备方法,包括如下步骤:
A.PLR和含有双功能基团的PEG按照摩尔比1∶2溶于pH8.0的磷酸缓冲液(PBS)中,室温搅拌反应2h,生成PLR-PEG,超滤除去未反应的PEG并更换缓冲液为pH7.0的PBS;
B.合成好的A10-3.2寡核苷酸适配体溶于pH值7.4的PBS中,加入DTT,室温搅拌30分钟,除去剩余DTT,生成巯基修饰的A10-3.2寡核苷酸适配体SH-A10-3.2;
C.A10-3.2寡核苷酸适配体与聚阳离子高分子材料以摩尔比为4∶1比混合,室温搅拌反应24小时后生成PLR-PEG-A10-3.2;超滤离心除去未反应的SH-A10-3.2后,即得PLR-PEG-A10-3.2构成的***癌靶向基因递释载体。
将PLR-PEG-A10-3.2基因递释载体1.0mg,溶于0.5ml重水中,NMR(300MHz)鉴定基因递释载体的结构,获得理想的核磁共振图谱(具体附图省略),说明PLR-PEG-A10-3.2合成成功。
实施例3
本实施例所述的***癌靶向基因的寡核苷酸适配体如实施例1所述。
本实施例所述的***癌靶向基因递释载体,其由PEI、PEG和上述A10-3.2寡核苷酸适配体为基础,三者以共价方式链接构成,其中,PEG与PLR的摩尔比是2∶1,A10-3.2寡核苷酸适配体与聚阳离子高分子材料的摩尔比为4∶1。
本实施例所述的***癌靶向基因递释载体的制备方法,包括如下步骤:
A.PEI和含有双功能基团的PEG按照摩尔比1∶2溶于pH8.0的磷酸缓冲液(PBS)中,室温搅拌反应2h,生成PEI-PEG,超滤除去未反应的PEG并更换缓冲液为pH7.0的PBS;
B.将合成好的A10-3.2寡核苷酸适配体溶于pH值7.4的PBS中,加入定量DTT,室温搅拌30分钟,除去剩余DTT,生成巯基修饰的A10-3.2寡核苷酸适配体SH-A10-3.2;
C.A10-3.2寡核苷酸适配体与聚阳离子高分子材料以摩尔比为4∶1,室温搅拌反应24小时后生成PEI-PEG-A10-3.2;超滤离心除去未反应的SH-A10-3.2后,即得PEI-PEG-A10-3.2构成的***癌靶向基因递释载体。
将PEI-PEG-A10-3.2基因递释载体1.0mg,溶于0.5ml重水中,NMR(300MHz)鉴定基因递释载体的结构,获得理想的核磁共振图谱(具体附图省略),说明PEI-PEG-A10-3.2合成成功。
实施例4
本实施例所述的***癌靶向基因递释***,其由实施例1所述的递释载体和pEGFP-N2制备而成。具体制备如下:
将实施例1中制备的PAMAM-PEG-A10-3.2基因递释载体和pEGFP-N2分别溶于适量的pH值7.4的PBS中,按照N/P为1∶15混合,涡旋30s后,室温孵育30分钟,制成PAMAM-PEG-A10-3.2/DNA基因递释***。并使用粒径zeta电位仪测定,结果显示,纳米复合物粒径控制在200nm以下,zata电位在25~30之间,证明PAMAM-PEG-A10-3.2可以与DNA形成稳定的纳米复合物颗粒。
实施例5
本实施例所述的***癌靶向基因递释***,其由实施例2所述的递释载体和pEGFP-N2制备而成。具体制备如下:
将实施例2中制备的PLR-PEG-A10-3.2基因递释***溶基因递释载体和pEGFP-N2分别溶于适量的pH值7.4的PBS中,按照N/P为1∶15混合,涡旋30s后,室温孵育30分钟,制成PLR-PEG-A10-3.2/DNA,基因递释***。基因递释***。并使用粒径zeta电位仪测定,结果显示,纳米复合物粒径控制在200nm以下,zata电位在25~30之间,证明PLR-PEG-A10-3.2可以与DNA形成稳定的纳米复合物颗粒。
实施例6
本实施例所述的***癌靶向基因递释***,其由实施例3所述的递释载体和pEGFP-N2制备而成。具体制备如下:
将实施例3中制备的PEI-PEG-A10-3.2基因递释***基因递释载体和pEGFP-N2分别溶于适量的pH值7.4的PBS中,按照N/P为1∶15混合,涡旋30s后,室温孵育30分钟,制成PEI-PEG-A10-3.2/DNA,基因递释***。基因递释***。并使用粒径zeta电位仪测定,结果显示,纳米复合物粒径控制在200nm以下,zata电位在25~30之间,证明PAMAM-PEG-A10-3.2可以与DNA形成稳定的纳米复合物颗粒。
实施例7
使用实施例4制备的PAMAM-PEG-A10-3.2/DNA基因递释***,在不同N/P比下,100V电压、0.7琼脂糖凝胶电泳25分钟,考察基因递释***包裹DNA的能力,结果显示该***可以有效的保护DNA免受DNase I的降解,见附图3。
实施例8
使用实施例4制备的PAMAM-PEG-A10-3.2/DNA基因递释***和***癌细胞LNCaP,于37℃。5%CO2培养箱中孵育1小时,采用pH7.4的PBS溶液润润洗细胞,48小时后采用荧光显微镜观察转染结果并拍照(200倍放大),结果显示,细胞中有绿色荧光蛋白表达。结果表明,PAMAM-PEG-A10-3.2可以将DNA递送至细胞内,并有效表达。见附图4。
使用实施例5制备的PLR-PEG-A10-3.2/DNA基因递释***和***癌细胞LNCaP,于37℃。5%CO2培养箱中孵育1小时,采用pH7.4的PBS溶液润润洗细胞,48小时后采用荧光显微镜观察转染结果并拍照(200倍放大),结果显示,细胞中有绿色荧光蛋白表达。结果表明,PLR-PEG-A10-3.2可以将DNA递送至细胞内,并有效表达。见附图4。
使用实施例6制备的PEI-PEG-A10-3.2/DNA基因递释***和***癌细胞LNCaP,于37℃。5%CO2培养箱中孵育1小时,采用pH7.4的PBS溶液润润洗细胞,48小时后采用荧光显微镜观察转染结果并拍照(200倍放大),结果显示,细胞中有绿色荧光蛋白表达。结果表明,PLR-PEG-A10-3.2可以将DNA递送至细胞内,并有效表达。见附图4。
实施例9
将实施例1中制备的PAMAM-PEG-A10-3.2基因递释载体溶于适量的pH7.4的PBS中,配制成一系列浓度。将pGL3-Control Vector溶于适量的PBS中,与PAMAM-PEG-A10-3.2按照N/P比1、5、10、15、20、25混合,涡旋30s后,室温孵育30分钟,制成PAMAM-PEG-A10-3.2/DNA,基因递释***。PAMAM-PEG/DNA作为对照。分别与***癌细胞LNCaP,于37℃。5%C02培养箱中孵育1小时,采用pH7.4的PBS溶液润润洗细胞,48小时后采用荧光素酶分析***分析LNCaP细胞中,荧光素酶的表达量,结果显示,与PAMAM-PEG-A10-3.2/DNA作用的细胞中荧光素酶表达量均大于PAMAM-PEG/DNA,且在N/P>15后,均有显著性差异。见附图5。
实施例10
使用实施例1制备的PAMAM-PEG-A10-3.2基因递释载体,标记红色荧光DyLight-688,制备具有红色荧光的DyLight-688-PAMAM-PEG-A10-3.2基因递释载体,***癌移植瘤裸鼠尾静脉注射4小时后,活体成像仪观察,结果显示,基因递释载体在移植瘤处聚集明显高于其余组织,见附图6A。说明PAMAM-PEG-A10-3.2可以在体内实现主动靶向作用,将DNA有效递送至***癌靶组织,是一种有效的基因递释载体。
使用实施例2制备的PEI-PEG-A10-3.2基因递释载体,标记红色荧光DyLight-688,制备具有红色荧光的DyLight-688-PEI-PEG-A10-3.2基因递释载体,***癌移植瘤裸鼠尾静脉注射4小时后,活体成像仪观察,结果显示,基因递释载体在移植瘤处聚集明显高于其余组织,见附图6C。说明PEI-PEG-A10-3.2可以在体内实现主动靶向作用,将DNA有效递送至***癌靶组织,是一种有效的基因递释载体。
使用实施例3制备的PLR-PEG-A10-3.2基因递释载体,标记红色荧光DyLight-688,制备具有红色荧光的DyLight-688-PLR-PEG-A10-3.2基因递释载体,***癌移植瘤裸鼠尾静脉注射4小时后,活体成像仪观察,结果显示,基因递释载体在移植瘤处聚集明显高于其余组织,见附图6B。说明PLR-PEG-A10-3.2可以在体内实现主动靶向作用,将DNA有效递送至***癌靶组织,是一种有效的基因递释载体。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.一种***癌靶向基因的寡核苷酸适配体,其特征在于,该寡核苷酸适配体的组成为:
5′-GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCU-(CH2)6-S-S-(CH2)6-OH-3′,且具有2′-氟修饰。
2.一种***癌靶向基因递释载体,其特征在于,其由聚阳离子高分子材料、亲水性聚合物和权利要求1所述的寡核苷酸适配体为基础,三者以共价方式链接构成,其中,亲水性聚合物与聚阳离子高分子的摩尔比是1~25∶1,所述寡核苷酸适配体与聚阳离子高分子材料的摩尔比为1~5∶1。
3.根据权利要求2所述的***癌靶向基因递释载体,其特征在于,所述亲水性聚合物与聚阳离子高分子的摩尔比是1~4∶1;所述寡核苷酸适配体与聚阳离子高分子材料的摩尔比为3~5∶1。
4.根据权利要求2或3所述的***癌靶向基因递释载体,其特征在于,所述阳离子高分子材料为聚酰胺-胺型树状分支物、聚精氨酸、聚乙烯亚胺或多聚赖氨酸。
5.根据权利要求2或3所述的***癌靶向基因递释载体,其特征在于,所述的亲水性聚合物为聚乙二醇。
6.一种***癌靶向基因递释***,其特征在于,其是由权利要求2-5任一项所述的***癌靶向基因递释载体与miRNA、siRNA或质粒DNA形成的纳米级基因递释***,其中,所述聚阳离子高分子材料与miRNA、siRNA或质粒DNA的N/P比是10~15∶1。
7.一种制备权利要求2所述***癌靶向基因递释载体的方法,其特征在于,包括以下步骤:
A.聚阳离子高分子材料和亲水性聚合物以1∶1~25的摩尔比溶于pH值7.7~8.3的磷酸缓冲液,室温搅拌反应1~2h,生成聚阳离子高分子材料-亲水性聚合物;超滤法除去未反应的亲水性聚合物并更换为pH值6.7~7.3的PBS;
B.权利要求1所述的寡核苷酸适配体溶于PBS中,加入二硫苏糖醇,室温搅拌反应后,除去剩余二硫苏糖醇,生成巯基修饰的寡核苷酸适配体;
C.权利要求1所述的寡核苷酸适配体与聚阳离子高分子材料以摩尔比为1~5∶1,室温下搅拌反应24~36h后生成聚阳离子高分子材料-亲水性聚合物-寡核苷酸适配体,透析除去未反应的寡核苷酸适配体,得到***癌靶向基因递释载体。
8.一种制备权利要求6所述***癌靶向基因递释***的方法,其特征在于,包括以下步骤:
将权利要求2-5任一项所述***癌靶向基因递释载体溶于pH值7.4-7.7的磷酸缓冲液中,配制成所需浓度的溶液,将miRNA、siRNA或质粒DNA溶于pH值7.4的PBS中配置成所需浓度溶液,室温下两者等体积混合后,涡旋20-40s后,静置20-40min,制成***癌靶向基因递释***,其中,所述聚阳离子高分子材料与miRNA、siRNA或质粒DNA的N/P比是10~15∶1。
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