CN102268065A - 氨基保护丝氨酸寡肽及其制备方法和用途 - Google Patents

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文永均
王晓莉
叶仲林
童光彬
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Abstract

本发明属于氨基酸修饰化合物技术领域，特别涉及氨基保护丝氨酸寡肽及其制备方法和用途。本发明的氨基保护丝氨酸寡肽，结构如式I所示，X为tBu或Trt，n为1～4。本发明的氨基保护丝氨酸寡肽为多肽类药物的合成提供了一种新的多肽片段，使多肽合成时减少杂质产生，提高产率及纯度。

Description

氨基保护丝氨酸寡肽及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于氨基酸修饰化合物技术领域，特别涉及氨基保护丝氨酸寡肽及其制备方法和用途。
技术背景
多肽类药物为生物活性物质，它们大多参与人体许多重要的生理过程，比如造血、抑制肿瘤细胞活性、免疫等。
多肽类药物的研究和开发一直是生物医药行业的热点领域，在多肽的制备过程中，常遇到重复的氨基酸序列，造成偶联不完全，从而大幅度降低了制备收率，使制备成本同时大幅度提高，本发明专利通过制备保护的氨基酸寡肽克服上述问题，具有很好的应用前景。
现有技术中仅存在丝氨酸及保护丝氨酸，还未见有氨基保护丝氨酸寡肽的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一类新的氨基保护丝氨酸寡肽，结构如式I所示：
Figure BDA0000070576400000011
X为tBu或Trt，n为1～4。
优选的，n为1～3。
Fmoc为9-芴甲氧羰基，tBu为叔丁基、Trt为三苯基甲烷。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供式I所示氨基保护丝氨酸寡肽的制备方法：以Fmoc-[Ser(X)]y-2-Cl-Trt-树脂为原料，通过固相偶联合成法与Fmoc-保护丝氨酸片段偶联得到Fmoc-[Ser(X)]n+1-2-Cl-Trt-树脂，裂解后即得；X为tBu或Trt，n为1～4，y＝1～4。
Fmoc-保护丝氨酸片段为Fmoc-Ser(X)-OH、Fmoc-Ser(X)-Ser(X)-OH、Fmoc-Ser(X)-Ser(X)-Ser(X)-OH、Fmoc-Ser(X)-Ser(X)-Ser(X)-Ser(X)-OH中的至少一种，X为tBu或Trt。
Fmoc-[Ser(X)]y-2-Cl-Trt-树脂取代值为0.2～1.2mmol/g树脂，优选的为0.4～0.6mmol/g树脂。
Fmoc-保护丝氨酸片段用量为Fmoc-[Ser(X)]x-2-Cl-Trt-树脂氨基总摩尔数的1.2～6倍，优选2.5～3.5倍。
Fmoc-[Ser(X)]y-2-Cl-Trt-树脂偶联时先脱去Fmoc保护，脱去Fmoc保护的试剂为10～30％(V/V)哌啶(PIP)/N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，优选的为20％。使用的去保护试剂用量为每克投料树脂5～15ml，优选为每克投料树脂10ml。去保护反应时间为10～60分钟，优选为15～25分钟。
偶联反应需添加缩合试剂和活化试剂，缩合试剂选自N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)，六氟磷酸苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)或O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)；优选的为N，N-二异丙基碳二亚胺。
缩合试剂的摩尔用量为氨基树脂中氨基总摩尔数的1.2～6倍，优选为2.5～3.5倍。
活化试剂选自1-羟基苯并***(HOBt)、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt)，优选的为1-羟基苯并***。
活化试剂用量为氨基树脂中氨基总摩尔数的1.2～6倍，优选的为2.5～3.5倍。
偶联反应时间为60～300分钟，优选的为100～140分钟。
裂解时添加裂解试剂，裂解试剂选自六氟异丙醇/DCM(二氯甲烷)溶液或三氟乙醇/醋酸/DCM溶液，优选六氟异丙醇/DCM(二氯甲烷)溶液。六氟异丙醇/DCM溶液中六氟异丙醇的浓度为20～60％(V/V)；三氟乙醇/醋酸/DCM溶液中三氟乙醇的浓度为10～50％(V/V)，醋酸的浓度为10～50％(V/V)，余量为DCM。
式I所示氨基保护丝氨酸寡肽能够用于制备多肽，为多肽类药物的合成提供了一种新的多肽片段，使多肽合成时减少杂质产生，提高产率及纯度。
具体实施方式
通过下述实施例将有助于理解本发明，但不能限制本发明的内容：
实施例1Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH的合成
取3.0mol Ser(tBu)和3.0mol HOBt，用适量DMF溶解；另取3.0mol DIC(N，N-二异丙基碳二亚胺)，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液。
取Fmoc-Ser(tBu)-2-Cl-Trt-树脂1Kg(取代值为1.0mmol/g)；，采用6L PIP/DMF溶液去保护25分钟，其中PIP的体积浓度为20％。过滤后树脂分别用MDF、DCM洗涤3次，加入上述保护氨基酸溶液，室温搅拌反应3小时，反应完成后，过滤后树脂分别用MDF、DCM洗涤3次，得到Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH。
重复上述反应，接入另外3个Ser(tBu)，制得Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-2-Cl-Trt-树脂。
取Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-2-Cl-Trt-树脂，加入20L六氟异丙醇/DCM溶液，六氟异丙醇的体积浓度为30％。搅拌反应2小时，过滤收集滤液，减压蒸干溶剂，减压干燥，得Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH 742g，收率为91.3％，纯度为95.7％，MS m/z：814(M+1)。
实施例2Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH在多肽合成中的应用
取Fmoc-Lys(Boc)-2-Cl-Trt-树脂，经Fmoc去保护后，与Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH偶联，制得5肽树脂。
偶联法具体为：
1、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH的活化：
取0.3mol Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH和0.3mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.3mol DIC，搅拌下慢慢加入至前述DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液。
2、Fmoc-Lys(Boc)-2-Cl-Trt-树脂的脱Fmoc保护：
取Fmoc-Lys(Boc)-2-Cl-Trt-树脂(取代值为0.5mmol/g)200g，采用1L 20％ PIP/DMF溶液去保护25分钟，过滤后用DMF洗涤5次后得到去Fmoc的树脂，备用。
3、偶联：
在去Fmoc的树脂加入活化后的保护氨基酸溶液，偶联反应60～300分钟，完成后后树脂用DMF洗涤5次。
用2L PIP(20％)/DMF溶液去保护25分钟，完成反应后分别用DMF、DCM、甲醇洗涤3次，减压干燥得5肽树脂：H-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-2-Cl-Trt-树脂233g，收率94.0％。
4、酸解：
将5肽树脂加入至裂解试剂[TFA/水/EDT＝95∶5∶5(V/V)(10ml/克树脂)中，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水***沉淀，再用无水***洗沉淀3次，抽干得白色粉末即为5肽粗品H-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-OH。
5、纯化：
将5肽粗品溶于30％乙腈水中，用0.45μm滤膜过滤，采用液相色谱纯化，色谱拄为反相C18柱，纯化用流动相为5％醋酸/水-5％醋酸/乙腈混合溶剂，检测波长230nm，收集并合并主峰溶液，在40℃以下减压浓缩，将浓缩液冷冻干燥，得H-Ser-Ser-Ser-Ser-His-OH五肽产品30.9g，纯度为99.1％，总收率为62.4％。MS m/z：495(100％ M+1)。

Claims (10)

1.氨基保护丝氨酸寡肽，结构如式I所示：
Figure FDA0000070576390000011
X为tBu或Trt，n为1～4。
2.根据权利要求1所述的氨基保护丝氨酸寡肽，其特征在于：n为1～3。
3.权利要求1或2所述氨基保护丝氨酸寡肽的制备方法：以Fmoc-[Ser(X)]y-2-Cl-Trt-树脂为原料，通过固相偶联合成法与Fmoc-保护丝氨酸片段偶联得到Fmoc-[Ser(X)]n+1-2-Cl-Trt-树脂，裂解后即得；X为tBu或Trt，n为1～4，y＝1～4。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：Fmoc-保护丝氨酸片段为Fmoc-Ser(X)-OH、Fmoc-Ser(X)-Ser(X)-OH、Fmoc-Ser(X)-Ser(X)-Ser(X)-OH、Fmoc-Ser(X)-Ser(X)-Ser(X)-Ser(X)-OH中的至少一种。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于：Fmoc-[Ser(X)]y-2-Cl-Trt-树脂取代值为0.2～1.2mmol/g树脂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：Fmoc-[Ser(X)]y-2-Cl-Trt-树脂取代值为0.4～0.6mmol/g树脂。
7.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于：Fmoc-保护丝氨酸片段用量为Fmoc-[Ser(X)]x-2-Cl-Trt-树脂总摩尔数的1.2～6倍。
8.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于：Fmoc-[Ser(X)]y-2-Cl-Trt-树脂偶联时先脱去Fmoc保护，脱去Fmoc保护的试剂为哌啶/N，N-二甲基甲酰胺溶液，用量为每克投料树脂5～15ml。
9.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于：偶联反应需添加缩合试剂和活化试剂，缩合试剂选自N，N-二异丙基碳二亚胺、N，N-二环己基碳二亚胺，六氟磷酸苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基磷、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐或O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸酯；
活化试剂选自1-羟基苯并***或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑。
10.权利要求1或2所述氨基保护丝氨酸寡肽在制备多肽中的用途。
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