CN102260351A - 流感病毒M2e蛋白的制备及其在抗甲型流感病毒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种由人血清白蛋白(HSA)与流感病毒M2e蛋白结合形成的融合蛋白，及其制备方法和在抗甲型流感病毒研究中的应用。

Description

流感病毒M2e蛋白的制备及其在抗甲型流感病毒中的应用

发明领域

本发明涉及融合蛋白质及其制备，特别是涉及人血清白蛋白(HSA)与流感病毒M2e蛋白结合形成的融合蛋白，及其制备方法和在抗甲型流感病毒研究中的应用。

发明背景

M2蛋白是流感病毒主要的膜蛋白之一。自从1933年分离到第一株人甲型流感病毒株A/WS/33(H1N1)以来，尽管经历了几次世界性大流行，M2蛋白胞外区(Extracellular domainof M2 protein，M2e)都未发现存在明显差异。研究发现，针对M2蛋白胞外功能区的单克隆抗体，具有在细胞培养中抑制流感病毒复制的功能。更重要的是，M2e蛋白诱生的抗体能够产生保护性免疫。由于目前在人群中流行的所有甲型流感病毒，其M2蛋白的胞外区M2e都没有发现存在明显差异，认为M2e在流感病毒株间是高度保守的。因此，M2e蛋白被认为是可刺激机体对不同流感变异株都能产生具有交叉保护效果的保护性抗原。

人血清白蛋白是人血浆中最丰富的蛋白，占血浆总蛋白的60％左右。除了在血浆中含有HSA外，在组织、皮肤、淋巴腔和身体的分泌液中也含有HSA。HSA也是血液中重要的功能蛋白，具有维持血液胶体渗透压，结合和运输内源性及外源性物质，清除自由基，抗凝血及影响动脉血管的渗透性等生理功能。

人血清白蛋白是由585个氨基酸残基组成的单链非糖基化的球形蛋白。同时，HSA是一种惰性蛋白，在体内较稳定，其本身即为许多内源因子和外源药物的载体。HSA的结构显示，其N端和C端处于蛋白上相反的突出部位，无论N端或C端的融合都不必在cDNA中间***连接序列，非常适于进行蛋白融合，药物和HSA结合后，可以减少其生物利用度，增加在体内的半衰期，从而可以提高疗效。由此产生了人血清白蛋白融合技术，目前此技术已经被广泛应用。同时，HSA在毕赤酵母中可以高效分泌表达，且上清杂蛋白含量较少，纯化比较方便，更容易实现大规模生产。

本发明首次制备并提供了一种由人血清白蛋白(HSA)与流感病毒M2e蛋白结合形成的融合蛋白，及其制备方法和在抗甲型流感病毒研究中的应用。

发明目的

本发明的一个目的是提供一种由人血清白蛋白与流感病毒M2e蛋白结合形成的融合蛋白。

在本发明的融合蛋白中，M2e蛋白位于人血清白蛋白融合蛋白的C-端。

根据本发明的优选实施方案，所说的融合蛋白是以DNA重组技术产生的。

根据本发明的优选实施方案，其中所使用的重组表达***是酵母表达***，可以将编码本发明融合蛋白的核苷酸序列克隆至酵母表达载体中。本发明优选的巴斯德毕赤酵母表达***可以是胞内表达的，也可以是分泌表达的，最优选的是毕赤酵母X-33。

本发明所形成的融合蛋白既保留了人血清白蛋白的活性，又保留了M2e蛋白的活性。用甲型流感病毒H1N1和H3N2对小鼠滴鼻进行攻击，融合蛋白HSA/M2e能显著地减少小鼠体重的丢失和降低小鼠的死亡率，并降低肺部病毒滴度，保护小鼠抵抗甲型流感病毒的攻击。

可以使用本领域熟知的方法，如PCR、RT-PCR方法、人工合成方法等方法获得编码人血清白蛋白的多聚核苷酸和编码流感病毒M2e的多聚核苷酸。用作PCR模板和用于构建cDNA文库的mRNA或cDNA可以来源于任何含有相应mRNA或cDNA的组织、细胞及文库等，也可以用人工合成的方法获得。人工合成时可选用宿主偏爱的密码子，借以提高产物的表达效率。通过PCR的方法，在保持各自阅读框不变的前提下，在编码序列的两侧引入适当的限制性内切酶位点，通过酶切产生粘性末端，并在DNA连接酶作用下，实现编码人血清白蛋白和编码流感病毒M2e的多聚核苷酸的粘性末端连接，得到编码本发明融合蛋白的基因。所用标准的分子克隆方法参见J.萨姆布鲁克等《分子克隆试验指南》第三版，科学出版社，2002。

得到携带融合蛋白基因的重组表达载体后，可使用通常的方法，如锂盐法、PEG法和电穿孔法等方法转化宿主细胞。其中，本发明优选的转化方法是电穿孔法。可通过人们熟知的技术加以鉴定，如收集并裂解细胞，提取DNA，然后用PCR方法鉴定被成功转化的细胞，即含有本发明DNA构建体的细胞。或者，可用抗人血清白蛋白或流感病毒M2e蛋白的抗体检测细胞培养上清中的蛋白。

可以使用摇瓶或生物反应器，培养含有本发明DNA构建体的宿主细胞，以生产本发明的融合蛋白。所使用的培养基应能提供菌体(或细胞)生长和产物表达所需的物质，包含氮源、碳源、pH调节成分等，培养基配方应根据不同培养对象，通过试验获得。培养可分为两个阶段，第一阶段主要用于菌体(或细胞)生长，第二阶段主要用于产物的合成。

可以用各种蛋白分离的方法自含有本发明DNA构建体的细菌或细胞培养物中分离、纯化融合蛋白，如盐析、有机溶剂沉淀、超滤、液相层析等技术及这些技术的组合。其中液相层析可以用分子筛、亲和、离子交换、疏水、反相等层析技术。

本发明中的融合蛋白及其衍生物或其药物组合物可以通过任何已知的方法，包括注射(如皮下或肌肉)、透皮、吸入、口服等方法给药。优选的方法为吸入或注射给药。治疗包括在一段时间内使用单一剂量或复合剂量。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1显示重组质粒pPICZαC-HSA/M2e转化酵母菌DNA的PCR鉴定电泳图谱。其中泳道1～5为不同酵母菌转化子基因组DNA的PCR产物；泳道M为DNA marker；泳道6为空质粒转化的酵母菌基因组DNA的PCR产物。

图2显示HSA/M2e融合蛋白的的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果(考马斯亮蓝染色)。其中泳道1为Mono S洗脱液；泳道2为超滤浓缩液；泳道3为MonoQ洗脱液；M为蛋白分子量marker。

图3显示HSA/M2e融合蛋白的Western免疫印迹分析结果。其中泳道1、2、3和4是本发明制备的HSA/M2e样品。图A为HSA/M2e融合蛋白与HSA抗体杂交；图B为HSA/M2e融合蛋白与M2e抗体杂交。

图4为利用流式细胞术检测免疫后小鼠T淋巴细胞数量的变化，图A为PBS阴性对照组；图B为HSA/M2e融合蛋白组；图C为裂解疫苗组。

图5为流感病毒攻击后，小鼠肺组织病理的变化结果。图A为PBS组小鼠攻毒6天后肺的病理变化结果；图B、C分别为HSA/M2e融合蛋白组小鼠攻毒6天后肺的病理变化结果；图D为裂解疫苗组攻毒6天后肺的病理变化结果。

发明内容

本发明涉及融合蛋白HSA/M2e、其制备方法和应用，特别是涉及融合蛋白HSA/M2e在抗甲型流感病毒中的应用。以下借助实施例描述本发明的最佳实施方式。这些实施例旨在进一步举例阐明本发明，而不是以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。

实施例

实施例1：人血清白蛋白HSA基因的克隆和扩增

1、RNA的制备

将新鲜分离的胚胎(流产胎儿，4～8周，来源于吉林大学第二医院，经志愿者知情同意)肝组织切成的小块儿，放入液氮中速冻。使用Trizol试剂(Invitrogen Corp.SanDiego，California，USA)一步法提取RNA。具体步骤如下：

取出冰冻的小块组织放入盛有液氮的研钵中，将组织碾碎。将碾碎后的组织移入50mL离心管中，加入约4mL Trizol。于室温用polytron匀浆器高速匀浆1分钟。加入800μL氯仿(200μL/mLTrizol)，充分振荡摇匀，于室温下放置5分钟。4℃离心(12000r/min)15分钟。将上层水相移至另一离心管中。加入等体积异丙醇，振荡摇匀，室温沉淀15分钟。4℃离心(13000r/min)15分钟，弃上清。加入75％乙醇1mL洗涤沉淀，4℃离心(12000r/min)5分钟。重复上述步骤，室温下蒸发残留乙醇。将总RNA沉淀溶于100μL经DEPC处理过的水中，-80℃保存备用。取1μL样品稀释100倍后经紫外分光光度计测定OD₂₆₀和OD₂₈₀，RNA含量按如下公式进行计算：RNA(μg/mL)＝40×OD₂₆₀×稀释倍数，OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.8～2.0表示纯度合格，以琼脂糖凝胶电泳法，观察RNA的完整性。

2、人血清白蛋白HSA基因的克隆(RT-PCR法)

取如上提取的人肝组织总RNA 1μg，按如下比例建立逆转录(RT)反应体系：人肝组织总RNA 1μg；10×RNAPCR缓冲液2μL；MgCl₂(25mmol/L)4μL；RNA酶抑制剂(40U/μL)0.5μL；dNTPs(各10mmol/L)2μL；AMV逆转录酶(200U/μL)1μL；Oligo dT(20pmol/μL)1μL；无RNA酶灭菌超纯水加入至终体积20μL。于PCR仪上42℃反应60分钟，然后99℃5分钟使逆转录酶灭活。合成cDNA后，按照如下比例建立PCR反应体系：

上述cDNA反应液20μL；MgCl₂(25mmol/L)6μL；10×LAPCR缓冲液8μL；上游引物：5’-CAGGAATTCGGCACAATGAGTGGGT-3’1μL；下游引物：5’-GCGCTCGAGGTAGATGTTATAAGCCT-3’1μL；TaKaRa LA Taq(5U/μL)1μL；加灭菌超纯水至终体积100μL。PCR反应条件是：94℃2分钟；94℃30秒，58℃30秒，72℃1分钟30秒，共30个循环，然后72℃ 10分钟。对扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，观察片段大小，确定是否得到正确目的基因。

3、克隆载体的构建、转化与扩增

将RT-PCR扩增的人HSA基因片段进行1.0％琼脂糖凝胶电泳分析并回收。回收后，将人HSA基因片段与pMD18-T载体16℃连接过夜。连接反应体系包括：人HSA基因RT-PCR产物0.1～0.3pmol；pMD18-T载体0.03pmol；溶液I(含DNA连接酶和连接缓冲液，见Takara公司T载体试剂盒)5μL；灭菌超纯水至终体积10μL。

按照常规方法，从37℃培养16小时的XL₁-Blue阴性培养板(不含抗生素的LB琼脂平板)上挑取单个菌落(直径2～3mm)，接种于含有100mL LB培养基的1L培养瓶中，以制备感受态大肠杆菌细胞，并于-80℃冻存备用。

取一份冻存的感受态细胞，融化后加入上述连接产物，进行常规转化。然后取200μL已转化的感受态细胞涂布于X-Gal(40μg/mL)、IPTG(25μg/mL)和氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板培养基上，37℃倒置培养16h。

4、重组载体的鉴定

随机挑取转化后的白色单菌落(“蓝白筛选”)，接种于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基中，37℃强烈震荡培养过夜，然后常规提取质粒DNA。取1μL溶解的DNA沉淀物进行琼脂糖凝胶电泳定量分析和酶切鉴定。37℃下用PstI双酶切鉴定消化3小时，1.0％琼脂糖凝胶电泳后根据内切酶谱鉴定为正确克隆。挑选酶切鉴定正确的克隆，提取质粒，用于DNA测序分析。

实施例2：pPICZαC-HSA/M2e毕赤酵母表达载体的构建

1、pPICZαC-HSA质粒的构建

本研究采用PCR法构建pPICZαC-HSA表达载体，取上述测序鉴定正确含HSA基因的质粒100ng，按如下比例在0.2mLEP管中建立PCR反应体系，通过PCR(所使用的引物为上游引物：5’-GCG TTC GAA ATG AAG TGG GTA ACC TTT ATT TCC C-3’和下游引物：5’-GTC GGT ACC TTA TAA GCC TAA GGC AGC TTG AC-3’)扩增引入BstBI、KpnI酶切位点：含HSA重组质粒100ng；dNTP(10mmol/L)4μL；含Mg²⁺的10×LA PCR缓冲液5μL；上游引物(20pmol/μL)1μL；下游引物(20pmol/μL)1μL；LA Taq酶(5U/μL)0.5μL加灭菌超纯水至终体积50μL。在PCR仪上进行循环扩增。扩增程序为：94℃ 4分钟；94℃30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分钟30秒，共30个循环，然后72℃ 10分钟。扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，根据DNA片段纯化/回收试剂盒的说明回收PCR扩增产物。

2、pPICZαC-HSA质粒的鉴定

用BstBI、KpnI消化上述回收的PCR产物和载体pPICZα，琼脂糖凝胶电泳定量后，16℃连接过夜。连接反应体系如下：目的基因0.1～0.3pmol；酶切后的载体pPICZα0.03pmol；10×连接缓冲液1μL；T4DNA连接酶(350U/μL)1μL；灭菌超纯水至终体积10μL。

将连接产物与感受态细胞XL1-blue轻轻混匀，常规方法转化。取200μL已转化的大肠杆菌细胞涂布于含Zeocin(25μg/mL)的低盐LB琼脂平板上，37℃培养箱培养12～16小时。挑取不同的克隆，于LB液体培养基中培养过夜，然后提取质粒，并进行XbaI酶切鉴定。选取酶切鉴定正确的克隆，用质粒快速提取试剂盒提取质粒，进行DNA序列测定。

3、pPICZαC-HSA/M2e表达载体的构建

根据报道的流感病毒M2e的通用基因序列和对应的毕赤酵母偏爱密码子，设计两条寡核苷酸单链，同时在M2e寡核苷酸链的正链和负链编码序列的5’和3’端分别加入了有利于后继序列连接的Eco81I和KpnI酶切位点。正链为5’-TTA GGC TTA TCT TTG TTG ACC GAG GTTGAG ACT CCA ATT AGA AAC GAG TGG GGT TGT AGA TGT AAC GAC TCC TCT GACTAA GGT AC-3’负链为5’-CTT AGT CAG AGG AGT CGT TAC ATC TAC AAC CCC ACTCGT TTC TAA TTG GAG TCT CAA CCT CGG TCA ACA AAG ATA AGC C-3’，两条链各取1μg与0.5mol NaCl建立40μL体系，99℃煮10分钟，50℃煮10分钟，缓慢冷却至室温。互补链退火后形成带有Eco81I和KpnI粘性末端双链的接头。

用Eco81I和KpnI酶切质粒pPICZαC-HSA，回收并进行琼脂糖凝胶电泳定量后，16℃连接过夜。连接反应体系如下：退火的M2e基因0.1～0.3pmol；pPICZαC-HSA 0.03pmol；10×连接缓冲液1μL；T4DNA连接酶(350U/μL)  1μL；灭菌超纯水至终体积10μL。

将连接产物与感受态细胞XL1-blue轻轻混匀，常规方法转化。取200μL已转化的感受态细胞涂布于含Zeocin(25μg/mL)的低盐LB琼脂平板上，37℃培养箱培养12～16小时。挑取不同的克隆，于LB液体培养基中培养过夜，然后提取质粒并进行以XbaI双酶切鉴定。

选取酶切鉴定正确的克隆，用质粒快速提取试剂盒提取质粒。进行DNA序列测定。

实施例3：HSA/M2e毕赤酵母表达体系的建立及筛选

取测序正确的培养菌液，按质粒提取试剂盒说明书提取质粒DNA并用琼脂糖凝胶电泳法进行定量分析。取15～20μg质粒pPICZαC-HSA/M2e，经PmeI酶消化(线性化)后用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。线性化的质粒用10μL超纯水溶解后置冰上备用。

从毕赤酵母X-33的YPD阴性培养板上(不含抗生素的YPD琼脂平板)挑取单个菌落，接种于5mLYPD培养基中，250r/min，30℃震荡培养18小时，常规方法制备酵母感受态细胞。然后取80μL上述感受态细胞，与15～20μg线性化的重组表达质粒混合，移入0.2cm电转化杯内进行电转化。取50～100μL转化后的菌液涂布于含Zeocin(100μg/mL)的YPD平板上，30℃培养箱培养2～3天，观察转化子的生长状况。

然后用PCR法(所使用的引物为上游引物：5’-GCG TTC GAA ATG AAG TGG GTAACC TTT ATT TCC C-3’和下游引物：5’-GTC GGT ACC TTA TAA GCC TAA GGC AGCTTG AC-3’，反应条件同上)筛选转化酵母菌。离心回收菌体后，以煮-冻-煮法提取酵母基因组DNA并进行PCR鉴定，扩增产物行1.0％琼脂糖凝胶电泳，观察是否得到预期大小的基因片段。鉴定结果如附图1所示。

实施例4：融合蛋白HSA/M2e的表达及纯化

1、融合蛋白HSA/M2e的表达

取上述鉴定结果阳性的克隆接种于10mL BMGY(pH6.0)培养基中，30℃震荡培养24小时，至OD₆₀₀达到2.0～6.0时收集细胞。用等体积(10mL)BMMY(pH6.0)重悬细胞沉淀，30℃震荡培养，诱导表达。诱导过程中，每24小时补充一次甲醇至终浓度0.5％，同时补充灭菌超纯水，使发酵液总体积保持不变。在培养的第0、24、48、72、96、120、144和168小时等时间点各取0.5mL发酵液，离心收集上清用于蛋白质分析(SDS-PAGE，WestemBlot和N-端氨基酸序列分析)。

2、融合蛋白HSA/M2e的纯化

(1)溶液与试剂：溶液A：HAc-NaAc缓冲液200mmol/L(pH3.0)；溶液B：20mmol/LHAc-NaAc缓冲液(pH 3.0)；溶液C：溶液B含1mol/LNaCl；溶液D：200mmol/LTris-HCl缓冲液(pH 8.0)；溶液E：20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，将溶液D稀释10倍即可；溶液F：溶液E含1mol/L NaCl。

(2)Mono S阳离子柱层析

用5倍柱体积溶液B平衡Mono S阳离子层析柱。用1mol/L NaOH调整发酵上清液pH值为3.0，离心(12000r/min)10分钟，去除颗粒物质，而后上清添加1/10体积溶液A。以0.4mL/min的速率加样至Mono S阳离子树脂，波长280nm在线监测。加样结束后，用溶液B冲洗至A₂₈₀值降至基线。用溶液B和溶液C梯度洗脱，并分部收集蛋白峰。用SDS-PAGE和Western Blot确定HSA/M2e的洗脱峰。

(3)Mono Q阴离子柱层析

用5倍柱体积溶液E平衡Mono Q阴离子层析柱。用1mol/L NaOH调整经Vivaflow 50超滤脱盐后的洗脱液pH值为8.0，离心(12000r/min)10分钟，去除颗粒物质，而后上清添加1/10体积溶液D。以0.4mL/min的速率加样至Mono Q阴离子树脂，波长280nm在线监测。加样结束后，用溶液E冲洗至A280值降至基线。用溶液E和溶液F梯度洗脱，并分部收集蛋白峰。用SDS-PAGE和Western Blot确定HSA/M2e的洗脱峰。将HSA/M2e的洗脱峰经Vivaflow 50再次超滤脱盐浓缩。

10％SDS-PAGE分析结果显示，经此方法纯化的HSA/M2e纯度可达到约95％，结果如附图2所示。

实施例5：融合蛋白HSA/M2e的理化性质鉴定

1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

用SDS-PAGE法进行蛋白质分子量测定和初步定量分析。方法如下：配制10％分离胶，5％浓缩胶。分别取每24小时发酵液培养上清按4∶1比例加入5×SDS样品缓冲液，混匀后，煮沸5分钟。取上述样品，冷却至室温后，离心(8000r/min)30秒，取上清每孔加样60μL。60V电泳至浓缩胶与分离胶交界处，调整电压到120V，继续恒压电泳分离。考马斯亮蓝染色并脱色后，观察分析结果。

2、表达产物的Western印迹分析

按常规方法将发酵液上清经SDS-PAGE后，转印到硝酸纤维素(NC)膜上，室温干燥30分钟。将上述NC膜置于平皿中，加入30mL封闭液(含0.2％BSA的TTBS)，4℃封闭过夜。然后，将NC膜放入杂交袋中按0.1mL抗体溶液/cm²膜加入鼠抗人HSA抗体和鼠抗人M2e抗体，室温振荡3小时。TTBS漂洗3次后，用抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体至1∶500，加入杂交袋中，与NC膜一起室温振荡3小时。加入1mL 0.3％(W/V)NiCl或CoCl₂及10μL 30％H₂O₂溶液。洗膜后，将膜移入显色液中，室温下避光轻轻摇动并观察显色反应。结果如附图3所示。

3、表达产物的氨基酸序列分析

蛋白质的一级结构是其高级结构的基础，用基因重组技术表达分泌型蛋白时，表达的异源蛋白在加工成熟过程中容易出现信号肽错误切割现象，继而影响表达产物的高级结构和生物学活性。因此，在SDS-PAGE确定分子量正确的情况下，应对所表达的重组蛋白进行蛋白质N-末端的氨基酸序列测定，以确定其一级结构的正确性。我们的测序结果表明，按照本发明的HSA/M2e融合蛋白具有与预期的氨基酸序列。

实施例6：融合蛋白HSA/M2e小鼠体内免疫及其免疫性质研究

本实例利用表达的融合蛋白HSA/M2e分别与弗氏完全佐剂和不完全佐剂结合，经三次免疫后观察小鼠免疫学状态的变化。用致死量的H1N1和H3N2流感病毒感染小鼠后，观察对小鼠肺部病毒滴度和小鼠的体重变化及死亡率的影响，并与对照组进行比较，从而判断和确定本发明所生产的HSA/M2e蛋白疫苗的保护效果。

1、本发明的融合蛋白HSA/M2e对小鼠的免疫实验

将6～8周的雄性BALB/c小鼠27只，随机分为3组，每组9只，分别为PBS阴性对照组、流感病毒裂解疫苗阳性对照组、重组蛋白加佐剂免疫组。每隔两周，小鼠眼球取血，分离多抗血清，置-20℃冰箱保存。具体步骤如下：第1周：重组抗原和完全弗氏佐剂等体积混合，100μg/只；PBS空白对照组100μL/只；阳性对照组流感病毒裂解疫苗25μL/只，腹腔注射。第3周：重组抗原和不完全弗氏佐剂等体积混合，100μg/只；空白对照和阳性对照组同上，腹腔注射。第5周：重组抗原和不完全弗氏佐剂等体积混合，100μg/只；空白对照和阳性对照组同上，腹腔注射。第6～10周：眼球取血并制备多抗血清，进行ELISA实验。最后一周眼球取血后同时颈椎脱臼处死小鼠，无菌取其脾脏制备脾细胞悬液，用于细胞免疫指标检测-T淋巴细胞亚类数量分析、淋巴细胞转化实验和IFN-γ-ELISPOT检测。

(1)免疫血清的ELISA实验

以合成的M2e多肽2μg/mL作为抗原包被ELISA板，空白对照加200μL/孔包被缓冲液，置湿盒内4℃过夜。PBST洗板，3次，每次3分钟。2％小牛血清封闭，置湿盒内，37℃孵育2小时。PBST洗板，3次，每次3分钟。加PBS稀释10倍的待测小鼠血清100μL，置37℃孵育2小时，同时用稀释相同倍数的正常小鼠血清做阴性对照。PBST洗板3次，每次3分钟。加HRP标记的羊抗小鼠IgG，置37℃孵育2小时。洗板3次，每次3分钟。称取4mg OPD溶于5mL底物稀释液中，临用前加入10μL 30％H₂O₂，混匀。100μL/孔，室温避光反应15分钟。加2mol/L H₂SO₄终止反应，50μL/孔。在波长490nm处，测定样品光密度值。

ELISA检测结果如下表1所示，与PBS组相比，重组蛋白组和流感裂解疫苗组在首次免疫后1周，血清中即检测到抗体。且在第2次和第3次免疫后抗体水平逐渐升高，至免疫后第8周抗体水平达到峰值，其后稍微下降，而PBS组不能诱生相应抗体。提示重组蛋白可以诱生体液免疫应答，其抗体效价约在1∶800～1∶1000之间。

表1不同免疫时间各组免疫血清在小鼠体内的抗体水平检测(n＝3，

)

与PBS组相比  **P＜0.01，*P＜0.05

(2)脾淋巴细胞亚类数量的检测

免疫小鼠断颈处死，75％酒精中浸泡5分钟，超净台中小心分离皮下组织和腹部肌肉露出脾脏，剪去周围***，用双层玻片研碎，柔和吹匀混液。用200目纱网过滤至含有4mL淋巴细胞分离液的50mL离心管，1500r/min离心20分钟。小心吸取中间淋巴细胞层至新50mL离心管中。PBS洗涤2次，1000r/min离心5分钟。加入1mL含10％血清的1640培养液重悬细胞，计数，调细胞数至1.0×10⁷个/mL备用。

取制备好的脾脏T淋巴细胞悬液约2×10⁶个淋巴细胞于EP管中，加入1mL的PBS洗涤2次，2000r/min离心10分钟。每管加入FITC标记anti-mouse CD4单克隆抗体(0.1mg/mL)、PE标记anti-mouse CD8单克隆抗体(0.1mg/mL)、PE-Cy5标记anti-mouse CD3e(0.2mg/mL)的PBS 200μL重新悬浮细胞，各抗体浓度均按0.25μg/10⁶个淋巴细胞。混匀后室温避光孵育30分钟。2500r/min离心10分钟，PBS洗涤2次。最后用300μL PBS重悬细胞，上样检测。同时分别制备各染色抗体单染对照管和空白管。FACS检测1×10⁶个细胞，分别得到CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞的数量，所得数据进行统计学分析。

附图4所示的流式细胞结果表明，重组蛋白组和裂解疫苗组的T淋巴细胞亚类CD4⁺和CD8⁺的比值均高于PBS组。且与PBS组相比，重组蛋白组和裂解疫苗组CD4⁺T淋巴细胞的增加比较明显，说明重组蛋白免疫后产生了以CD4⁺T淋巴细胞增殖为主的T淋巴细胞反应，在一定程度上激活了机体的细胞免疫。

(3)脾脏T淋巴细胞转化实验

淋巴细胞的增殖和分化是机体免疫应答过程中的重要阶段，淋巴细胞增殖能力的强弱，在某种程度上代表了淋巴细胞功能的高低。

于96孔板中每孔分别加入含10％血清的1640培养液稀释的ConA(4μg/mL)或流感病毒灭活病毒50μL，不加刺激原的细胞作阴性对照，各种刺激均设3个复孔。然后每孔加混匀后的脾淋巴细胞液50μL，使其总体积为100μL，置于5％CO₂、37℃培养箱中培养72小时后，每孔加入10μL MTT，继续培养4小时，用酶标仪测定波长450nm的吸光值(A)，取3个孔平均值，计算刺激指数(SI)。所得数据进行统计学分析。SI＝刺激孔A值/对照空A值×100％。

结果如表2所示，与PBS组相比，重组蛋白组和流感病毒裂解疫苗组的淋巴细胞均有一定程度的增殖，提示重组蛋白诱导了细胞免疫。

表2脾T淋巴细胞转化实验结果(n＝3，

)

与PBS组相比  **P＜0.01，*P＜0.05

(4)IFN-γ-ELISPOT检测

用含10μg/mL大鼠抗小鼠IFN-γ抗体的PBS包被96孔板，100μL/孔，4℃过夜，PBS洗板3次，每次3分钟。2％小牛血清37℃封闭2小时，PBS洗板3次，每次3分钟。将2×10⁶个/mL脾淋巴细胞添加到96孔培养板中，100μL/孔，每只鼠设3个刺激孔和3个对照孔，刺激孔每孔用50μL流感病毒灭活病毒刺激，对照孔添加50μL PBS，5％CO₂、37℃培养箱中培养24小时。弃孔内液体，晾干后加入100μL PBST溶液，4℃放置10分钟，而后用PBST溶液洗板3次，每次3分钟。每孔加入100μL生物素标记的抗IFN-γ二抗，37℃孵育2小时。PBST洗板3次，每次3分钟。加入100μL酶标抗亲和素抗体(1∶2500)，37℃孵育1小时。PBST洗板3次，每次3分钟。每孔加入100μL的BCIP/NBT缓冲液，室温反应10分钟，观察斑点形成。用水冲洗3次，终止反应，晾干，常规相差显微镜计数斑点个数。

结果如表3所示，重组蛋白和流感裂解疫苗免疫组的ELISPOT斑点数均高于对照组。

表3ELISPOT法检测各免疫组小鼠T淋巴细胞分泌IFN-γ结果(n＝9，

)

与PBS组相比  **P＜0.01

2、本发明的融合蛋白HSA/M2e对小鼠的保护作用

(1)融合蛋白HSA/M2e对小鼠体重变化和死亡率的影响

将6～8周、18～20g雄性BALB/c小鼠60只，随机分为6组，每组10只，其中PBS阴性对照组、流感病毒裂解疫苗阳性对照组、重组蛋白加佐剂免疫组各两组。(具体步骤如上所示)于免疫后第7周，将PBS阴性对照组、流感病毒裂解疫苗阳性对照组、重组蛋白加佐剂免疫组，各1组分别用H1N1和H3N2病毒悬液(TCID₅₀均约为1×10^-6)通过滴鼻法攻击小鼠。滴鼻法能够引起流感病毒在小鼠肺部快速、广泛的复制，使未免疫小鼠短期内迅速死亡。病毒攻击后第6d随机选取2只小鼠眼球采血，颈椎脱臼处死小鼠后做病毒滴定等检测。各组剩余8只，病毒攻击后14天内定期观测小鼠的体重变化和死亡，计算死亡率和保护率。保护率＝(对照组死亡率-实验组死亡率)/对照组死亡率×100％

结果如表4、表5所示，病毒攻击6天后，重组蛋白组和裂解疫苗组小鼠的体重开始回升，而PBS组小鼠体重继续下降直至死亡，提示重组蛋白可以对小鼠提供保护。

表4H1N1流感病毒对小鼠体重的影响(n＝8，

)

与PBS组相比  **P＜0.01，*P＜0.05

表5H3N2流感病毒对小鼠体重的影响(n＝8，

)

与PBS组相比  **P＜0.01，*P＜0.05

用流感病毒H1N1和H3N2攻击免疫小鼠后，逐天观察小鼠的存活情况，对照组小鼠几乎在14天内全部死亡，死亡率分别为87.5％和100％，而重组蛋白组和流感裂解疫苗组小鼠大多数都可以存活，重组蛋白组死亡率分别约为25％、37.5％，裂解疫苗组约为12.5％和12.5％，重组蛋白和流感裂解疫苗对小鼠的死亡保护率可达62.5％以上，结果见表6所示。

表6病毒攻击后重组蛋白对免疫小鼠的保护效果(n＝8，

)

(2)融合蛋白HSA/M2e对小鼠肺指数的影响

将小鼠浸入75％医用酒精内消毒10分钟，在无菌条件下，用消毒剪刀剪开皮肤，钝性剥离皮下组织与肌肉，把皮肤往两侧翻开露出胸部，用无菌镊子在肺与气管连结处把整个肺托出并用剪刀剪开。

将取出的肺组织放入无菌平皿中，除去气管和肺门***等组织，用无菌生理盐水洗2次后，用灭菌吸水纸吸干表面水分，称重。按公式计算出肺指数和肺指数抑制率。肺指数＝小鼠肺重(mg)/小鼠体重(g)×100％

肺指数抑制率＝(对照组平均肺指数-实验组平均肺指数)/对照组平均肺指数×100％

结果如表7所示，流感病毒攻击后，重组蛋白组和裂解疫苗组的肺指数明显低于PBS组，说明重组蛋白和裂解疫苗可减少病毒攻击后小鼠肺的损伤。

表7小鼠用H1N1和H3N2攻击后的肺指数和肺指数抑制率(n＝8，

)

与PBS组相比  **P＜0.01

(3)流感病毒攻击后小鼠肺部病毒滴度测定

将右侧肺叶在纱网上研磨，然后加入1mL无菌生理盐水制成肺悬液吸入离心管中，2500r/min离心10分钟，除去杂质和细胞碎片，取上清即为肺悬液。

将培养皿中的MDCK细胞用0.25％的胰酶消化，分至24孔板中，用含10％小牛血清及抗生素的生长液培养成单层细胞。将生长液吸出后，用无菌PBS冲洗24孔板两次，尽量除去小牛血清。将制备好的肺悬液用无菌PBS做系列10倍稀释，滴加稀释的肺悬液于MDCK细胞表面，轻轻晃动24孔板使加入的肺悬液均匀铺在细胞表面。每个稀释度做3个复孔，每孔滴加病毒约100μL。将感染细胞置于5％CO₂培养箱中，37℃培养24小时后，观察细胞病变。以引起细胞病变的最低稀释度计算出每个样本的病毒滴度。

结果如表8所示，病毒感染6天后，取小鼠肺组织制成肺悬液用MDCK细胞测定小鼠肺部病毒滴度(TCID₅₀)，可见用流感病毒H1N1和H3N2攻击后，重组蛋白组和裂解疫苗组的肺部病毒滴度明显低于PBS组。

表8各实验组肺部病毒滴度(n＝2，)

(4)流感病毒攻击后小鼠肺组织光镜观察

将小鼠肺组织用4％多聚甲醛固定30分钟，二甲苯透明30分钟，石蜡包埋4μm切片，烤片后二甲苯脱蜡2次，酒精脱水，蒸馏水洗，苏木精染色10分钟，洗去多余的染液，盐酸酒精分色60秒，流水胞核蓝化，入伊红液10分钟，胞质着红色，低度酒精脱水脱去过染伊红，脱水，二甲苯透明，封片，光学显微镜下观察肺组织形态。

附图5所示的结果表明，流感病毒攻击后，PBS组小鼠攻毒后肺泡中可见间质水肿，肺泡内有泡沫样渗出物，大量单核细胞、淋巴细胞浸润并见灶性肺气肿，肺泡结构被大量破坏(图A)。而重组蛋白(图B，C)和裂解疫苗(图D)免疫的小鼠攻毒后肺泡组织结构保存较好，浸润的炎性细胞较少，未见明显病理变化或有轻微病变，提示重组蛋白可以对小鼠提供保护。

序列表

<110>吉林圣元科技有限公司

<120>流感病毒M2e蛋白的制备及其在抗甲型流感病毒中的应用

<140>

<141>

<160>6

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计的用作构建克隆载体的PCR扩增引物。

<400>1

CAGGAATTCG GCACAATGAG TGGGT

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计的用作构建克隆载体的PCR扩增引物。

<400>2

GCGCTCGAGG TAGATGTTAT AAGCCT

<210>3

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计的用作构建表达载体的PCR扩增引物。

<400>3

GCGTTCGAAA TGAAGTGGGT AACCTTTATT TCCC

<210>4

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计的用作构建表达载体的PCR扩增引物。

<400>4

GTCGGTACCT TATAAGCCTA AGGCAGCTTG AC

<210>5

<211>86

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的流感病毒M2e蛋白的编码序列。

<400>5

TTAGGCTTAT CTTTGTTGAC CGAGGTTGAG ACTCCAATTA GAAACGAGTG

GGGTTGTAGA TGTAACGACT CCTCTGACTA AGGTAC

<210>6

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的流感病毒M2e蚩白的编码序列。

<400>6

CTTAGTCAGA GGAGTCGTTA CATCTACAAC CCCACTCGTT TCTAATTGGA

GTCTCAACCT CGGTCAACAA AGATAAGCC

Claims (5)

1.一种由人血清白蛋白与流感病毒M2e蛋白结合形成的融合蛋白。

2.根据权利要求1的融合蛋白，特征在于所说的融合蛋白是以DNA重组技术产生的。

3.根据权利要求1的融合蛋白，特征在于所说的融合蛋白是所使用巴斯德毕赤酵母***表达产生的。

4.根据权利要求1的融合蛋白，特征在于所说的融合蛋白分子中，M2e蛋白位于人血清白蛋白融合蛋白的C-端。

5.权利要求1的融合蛋白在于抗流感病毒中的应用。

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