CN102260271A - 细胞松弛素类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一个细胞松弛素类化合物的制备方法和用途。本发明用广西红树林植物海芒果根泥样品中的黄炳曲霉ZHN1-09(Aspergillus flavipes ZHN1-09)生产出一个新的细胞松弛素类化合物。经实验证实,该类化合物可作为细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂。
Description
技术领域:
本发明涉及用黄炳曲霉ZHN1-09(Aspergillus flavipes ZHN1-09)((2011年3月24日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心,保藏编号是:CCTCC M 2011069)生产细胞松弛素类化合物的方法;本发明还涉及该类化合物在制备细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂中的用途。
背景技术:
细胞松弛素是由真菌生产的一种结构和活性相关的次级代谢产物,科学家们发现这类化合物对细胞有许多不同寻常和有趣的作用。本发明人研究得知,黄炳曲霉ZHN1-09(Aspergillus flavipes ZHN1-09)(保藏编号是:CCTCC M 2011069)液体发酵产物经超声破碎后的粗提物有很好的细胞增殖抑制活性,遂对其活性成分进行了研究。研究发现所示化合物具有抗肿瘤活性,目前尚未见该化合物的化学结构及细胞增殖抑制活性的报道,因此市场上也尚未见有与此有关的药物。
发明内容:
本发明旨在提供一个具有抑制肿瘤细胞增殖,具有抗肿瘤活性的新化合物。其结构式为
其结构特征是:该化合物是新的环状的细胞松弛素。
本发明的化合物可通过微生物发酵培养来获取富含细胞松弛素类化合物的发酵物,然后从发酵物中采用硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、RP-18反相硅胶柱层析和半制备HPLC等方法分离纯化得到。
本发明的下述实施例中列举了利用黄炳曲霉ZHN1-09(Aspergillus flavipes ZHN1-09)(保藏编号是:CCTCC M 2011069)制备本发明化合物的实例。
具体实施方式:
在如下的实施例中所指的化合物的化学结构(结构式中的***数字是化学结构中碳原子的标位)是:
实施例1该化合物的发酵生产及分离精制
1发酵生产
生产菌的发酵培养:按培养微生物的常规方法,取黄炳曲霉ZHN1-09(Aspergillus flavipesZHN1-09)(保藏编号是:CCTCC M 2011069)适量,接种到PDA固体斜面培养基上,在28摄氏度培养箱中培养6天。
取斜面培养6天的黄炳曲霉ZHN1-09(Aspergillus flavipes)适量,接种到装有300mL培养液[培养基组成(克/升):葡萄糖10.0,麦芽糖20.0,甘露醇20.0,味精10.0,KH2PO4 0.5,MgSO4 0.3,酵母膏3.0,玉米粉0.3,pH=6.5]的1000mL锥型瓶中,在28℃静置培养40天,获得菌丝体和发酵液。
2浸膏的获得
用纱布将菌丝体和发酵液分离。将发酵液等体积乙酸乙酯萃取三次,萃取液减压浓缩至干;菌体破碎,用80%丙酮萃取3次,减压浓缩至不含丙酮,剩余水层用等体积乙酸乙酯萃取3次,萃取液减压浓缩至干;合并菌体和发酵液的萃取物,得粗浸膏,共3.4克。
3化合物的分离精制
浸膏用氯仿-甲醇混合溶剂溶解后,加100-200目硅胶(青岛海洋化工集团公司产品)拌样,减压除去溶剂后,用硅胶柱层析,以石油醚、石油醚-丙酮,氯仿,氯仿-甲醇为溶剂进行梯度洗脱,分为4个馏分(Fr-1、Fr-2、Fr-3和Fr-4)。Fr-2(氯仿-甲醇20∶1洗脱物),先后以氯仿-甲醇(1∶1)为溶剂进行LH-20柱层析,再经RP-18反相硅胶柱层析以甲醇∶水(40∶60)为溶剂进行洗脱,最后经半制备反相高效液相色谱制备(甲醇∶水=70∶30)得该化合物。
化合物白色无定形固体,[α]25 D=-5.5(c 0.1,MeOH),分子式C28H33NO6,HR-ESI-MS m/z:480.2379[M+H]+,计算值480.2386。IR vmaxcm-1(KBr):3420,2925,2866,1741,1716,1702,1459,1078,665,573。1H和13C-NMR数据见表1。
表1化合物的1H(600MHz)和13C(150MHz)在CDCl3中的NMR数据a
a)本表信号归属基于DEPT、HMQC及HMBC图谱解析结果。碳信号的多重度结合分子量确定。
b)此栏中的数字和代号分别代表在1H-1H COSY谱中与相应行中的1H给出偶合相关信号的1H核。
c)此栏中的数字和代号分别代表在HMBC谱中与相应行中的1H给出偶合相关信号的13C核。
实施例2体外抗肿瘤活性的测试
细胞增殖抑制活性测试
1实验样品及实验方法
被测样品溶液的配制测试样品为上述实施例1中分离精制的化合物纯品。精密称取适量样品,用甲醇配制成所需浓度的溶液,供测活性。
细胞系及细胞的继代培养采用人肺癌A549细胞、人白血病HL60细胞及小鼠白血病P388细胞等癌细胞系。各种细胞均用含10%FBS的RPMI-1640培养基,在37℃于通入5%二氧化碳的培养箱中继代培养。
细胞增殖抑制活性测试方法
丽丝胺罗丹明B(SRB)法取对数生长期的人肺癌A549细胞用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升2×105个细胞的细胞悬液,按每孔200微升接种于96孔板中,每孔加入2微升不同浓度的样品或空白溶液,37℃下培养24小时。取药物作用下培养后的细胞,首先在光学显微镜下观察药物处理引起的形态学变化,判断有无细胞周期抑制,细胞凋亡或细胞坏死的形态学特征,继而在4℃、3000转/分钟离心3分钟,吸去上清。每孔细胞中加入20%三氯醋酸50微升,置于4℃固定1小时,用水冲洗5次并空气干燥。每孔加入0.4%SRB的醋酸溶液50微升并在室温静置30分钟。用1%醋酸水清洗4次,除去未结合的 游离SRB染料。每孔加入150微升Tris缓冲液(10mmol/L,pH 10.5)溶解蛋白结合染料并利用MD公司产SPECTRAMAX Plus型酶标仪测定每孔在520nm处的光密度(OD)值。在同一块96孔板中样品的每个浓度均设置三孔,另设三孔空白对照和无细胞调零孔(如果药物有颜色要做相应药物浓度无细胞调零)。各孔OD值先做相应无细胞调零,再取三孔平均OD值按IR%=(OD空白对照-OD样品)/OD空白对照X100%式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率(IR%)。
四氮唑盐(MTT)法取对数生长期的人白血病HL60细胞和鼠白血病P388细胞,将细胞密度调至每毫升2×105个细胞,按每孔200微升接种于96孔细胞培养板中,于37℃通入5%CO2的培养箱中培养4小时。每孔加样品液或空白液各2微升,培养24小时后,每孔加MTT液(MTT的每毫升5毫克生理盐水溶液)10微升,继续培养4小时,37℃、2000转/分钟离心8分钟,吸去上清。每孔加入DMSO各100微升,在微量振荡器上振荡15分钟,至结晶完全溶解后,利用MD公司产SPECTRAMAX Plus型酶标仪测定每孔在570nm处的吸光值(OD值)。在同一块96孔板中样品的每个浓度均设置三孔,另设三孔空白对照和无细胞调零孔(如果药物有颜色要做相应药物浓度无细胞调零)。各孔OD值先做相应无细胞调零,再取三孔平均OD值按IR%=(OD空白对照-OD样品)/OD空白对照X100%式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率(IR%)。
2.实验结果
细胞增殖抑制活性测试结果
在SRB法或MTT法测试中,不同浓度的该化合物对人肺癌A549细胞、人白血病HL60细胞和小鼠白血病P388细胞的增殖抑制结果见表2。
表2化合物对不同癌细胞增殖的抑制活性
3结论
该化合物具有明显的多种肿瘤细胞增殖抑制作用,可作为细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂用于抗癌药物的研究。
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