CN102253216A - 一种基于青霉素结合蛋白的检测β-内酰胺类抗生素的方法及专用试剂盒和试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于青霉素结合蛋白的检测β-内酰胺类抗生素的方法及专用试剂盒和试纸条。本发明的用于检测β-内酰胺类抗生素的受体试剂盒，包括：SEQ IDNO：1所示蛋白、酶标记的氨苄西林和标准品溶液，所述标准品为青霉素G。本发明试剂盒和胶体金试纸卡具有灵敏度高、准确度高、精密度高、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点；能同时快速检测大批量样品，可实现现场高通量快速检测。因此，本发明的试剂盒、胶体金试纸及检测方法在β-内酰胺类抗生素的检测中将发挥重大作用。

Description

一种基于青霉素结合蛋白的检测β-内酰胺类抗生素的方法及专用试剂盒和试纸条

技术领域

本发明涉及一种基于青霉素结合蛋白的检测β-内酰胺类抗生素的方法及专用试剂盒和试纸条。

背景技术

β-内酰胺类抗生素是一类含有四元β-内酰胺环结构抗生素的统称，是目前医药和兽药行业应用最多的一类抗生素，广泛用于治疗和预防葡萄球菌、肺炎球菌、链球菌、大肠杆菌、嗜血杆菌、沙门氏菌引起的动物尿道、胃肠道、呼吸道感染以及奶牛***炎等疾病。长期摄入含有β-内酰胺类抗生素残留的食物可引起细菌耐药性增加，消化***菌群失调，甚至诱发过敏反应。

随着人们对食品安全的日益重视，欧盟、中国、美国、日本等国家相继对动物源性食品中β-内酰胺类药物最大残留限量值作出了规定，其中欧盟规定青霉素G、氨苄西林、阿莫西林的MRL为4ppb，苯唑西林、邻氯西林、双氯西林、新青霉素III的MRL为30ppb，头孢噻呋、头孢氨苄的MRL为100ppb，头孢唑啉、头孢哌酮的MRL为50ppb，头孢喹肟的MRL为20ppb。

免疫分析方法是目前药物残留检测常用方法之一，其原理是基于抗原抗体的特异性结合，具有高灵敏度、高特异性的特性，其中酶联免疫吸附法和胶体金法又具备高通量、检测快速、操作简便、适用于现场筛查等优势，已广泛应用于药物残留筛查。免疫分析方法建立的基础是抗体，常规的抗体制备方法主要是免疫动物获得多克隆血清以及采用杂交瘤技术获得单克隆抗体，周期长、过程复杂、费用高。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于检测β-内酰胺类抗生素的受体试剂盒。

本发明所提供的用于检测β-内酰胺类抗生素的受体试剂盒，包括：SEQ ID NO：1所示蛋白、酶标记的氨苄西林和标准品溶液，所述标准品为青霉素G。

上述受体试剂盒中，所述受体试剂盒还包括底物显色液、终止液、洗涤液、样品稀释液、包被缓冲液和封闭液；

底物显色液由A液和B液组成，A液为2％(质量百分含量)过氧化脲的水溶液，B液为1％(质量百分含量)四甲基联苯胺的水溶液；

终止液为0.2M的硫酸水溶液；

每1升所述洗涤液是按照如下方法配制得到的：将0.5ml吐温20、5g叠氮化钠和990ml磷酸盐缓冲液混合，得到所述洗涤液；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M，pH值为7.4；

样品稀释液：0.1mol/L、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液；

每1升包被缓冲液按照如下方法制备：将Na₂CO₃1.59g和NaHCO₃2.93g溶于1升水中，用水定容至1升，得到所述包被缓冲液；

每1升封闭液按照如下方法配制：将50mgBSA、1g叠氮化钠、30g酪蛋白混合，用磷酸盐缓冲液溶解并定容至1000ml，得到封闭液；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.02M，pH值为7.2。

上述任一所述受体试剂盒中，所述酶标记的氨苄西林为HRP标记的氨苄西林；

上述任一所述受体试剂盒中，所述标准品溶液为青霉素G浓度如下的溶液：8.1μg/L、2.7μg/L、0.9μg/L、0.3μg/L、0.1μg/L。

上述任一所述受体试剂盒中，所述β-内酰胺类抗生素为如下中的至少一种：青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、邻氯西林、新青霉素III、双氯西林、羧苄西林、甲氧西林、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢曲松、头孢噻肟、头孢噻吩、头孢羟氨苄、头孢噻呋、头孢喹肟。

本发明的另一个目的是提供一种检测β-内酰胺类抗生素的胶体金试纸。

本发明所提供的检测β-内酰胺类抗生素的胶体金试纸，包括样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫，其依次连接；所述胶体金垫包被有胶体金标记的带有HIS标签的SEQ ID NO：1所示蛋白；所述反应膜上含有检测带和质控带，检测带位置包被有阿莫西林与载体蛋白的偶联物，质控带位置包被有鼠抗HIS标签单克隆抗体。

上述任一所述胶体金试纸中，所述β-内酰胺类抗生素为如下中的至少一种：青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、邻氯西林、新青霉素III、双氯西林、羧苄西林、甲氧西林、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢曲松、头孢噻肟、头孢噻吩、头孢羟氨苄、头孢噻呋、头孢喹肟。

上述任一所述胶体金试纸中，所述载体蛋白为OVA。

本发明的另一个目的是提供一种检测样品中β-内酰胺类抗生素的方法。

本发明所提供的检测样品中β-内酰胺类抗生素的方法，为如下I或II所示：

I、检测样品中β-内酰胺类抗生素的方法包括如下步骤：

1)将待测样品进行前处理，得到待测样本溶液；

2)用上述任一所述受体试剂盒对所述待测样本溶液进行检测；

所述待测样品为牛奶：将牛奶用样品稀释液按1∶4稀释，4℃、10000rpm离心，取上清液，作为待测样本溶液；

所述待测样品为奶粉：称取1g奶粉，溶于5mL样品稀释液中，混合均匀，作为待测样本溶液。

所述待测样品为尿液：将尿液直接作为待测样本溶液；

所述待测样品为肌肉、鱼、虾或蛋：将待测样品匀浆处理，得到均质样品，将每5g均质样品加入10mL乙腈水溶液中，上下颠倒震荡10min，5000rpm离心10min，取上清，氮气吹干，用1mL样品稀释液重悬，得到的溶液即为待测样本溶液；乙腈水溶液中乙腈和水的体积比为9∶1；

所述待测样品为蜂蜜：将每5g待测样品加入15mL去离子水中，混合；将所述混合溶液用Oasis固相萃取柱进行纯化，用甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，用1mL样品稀释液重悬，得到的溶液即为待测样本溶液。

II、检测样品中β-内酰胺类抗生素的方法包括如下步骤：

1)将待测样品进行前处理，得到待测样本溶液；

2)用上述任一所述所述胶体金试纸对所述待测样本溶液进行检测；

所述样品稀释液为0.1mol/L、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液。

SEQ ID NO：1所示蛋白在检测β-内酰胺类抗生素中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述β-内酰胺类抗生素为如下中的至少一种：青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、邻氯西林、新青霉素III、双氯西林、羧苄西林、甲氧西林、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢曲松、头孢噻肟、头孢噻吩、头孢羟氨苄、头孢噻呋、头孢喹肟。

本发明试剂盒和胶体金试纸卡具有灵敏度高、准确度高、精密度高、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点；能同时快速检测大批量样品，可实现现场高通量快速检测。因此，本发明的试剂盒、胶体金试纸及检测方法在β-内酰胺类抗生素的检测中将发挥重大作用。

附图说明

图1为PBP 2x基因PCR琼脂糖电泳图。

图2为PBP 2x基因与pET28b载体连接后酶切鉴定图。

图3为IPTG诱导后不同时间点全蛋白SDS-PAGE图。

图4为PBP 2x蛋白纯化SDS-PAGE图。

图5为PBP 2x蛋白western blot图。

图6为试剂盒标准曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

氨苄西林购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为A9518。

表达载体pET28b购自德国Merk(Novagen)公司，产品目录号为69865；大肠杆菌BL21(DE3)购自德国Merk(Novagen)公司，产品目录号为69387；蛋白纯化用His

Columns购自德国Merk(Novagen)公司，产品目录号为70971；T4 DNA Ligase购自美国Promega公司，产品目录号为M1801S。

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)R6购自美国标准生物品收藏中心(Americantype culture collection，ATCC)，编号为ATCC 49619^TM(http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx)。辣根过氧化物酶(HRP)购自美国Sigma公司。BCA蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司。

载体PMD19-T购自TAKARA，产品目录号为D102A。

His-tag单克隆抗体和HRP标记的羊抗鼠抗体购自天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号分别为AB102-02和SA101-01。

实施例1、重组菌的制备

肺炎链球菌R6基因组作为模板，应用下述引物进行PCR扩增，得到PCR产物；用限制性内切酶NdeI和XhoI酶切PCR产物，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，回收2250bp左右的目的基因片段(即PBP2x目的基因)；电泳结果如图1所示，泳道1-6为目的基因，泳道7为marker。

上游引物：5’-TTCATATGATGAAGTGGACAAAAAGA-3’(5’端含有NdeI酶切位点、保护碱基)

下游引物：5’-TTCTCGAGTTAGTCTCCTAAAGTTAAT-3’(3’端含有XhoI酶切位点、保护碱基)

回收目的基因片段，将其与PMD19-T载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，通过抗性筛选阳性单克隆，将阳性单克隆进行液体培养，提取质粒，进行测序。结果在PMD19-T中***的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，表明构建的重组载体正确，记作PMD 19-T-PBP2x。

用限制性内切酶NdeI和XhoI酶切PMD19-T-PBP2x，回收2250bp左右的目的基因片段；用限制性内切酶NdeI和XhoI酶切pET28b，回收载体大片段；将目的基因片段和载体大片段用T4 DNA Ligase连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，通过抗性筛选阳性单克隆，将阳性单克隆进行液体培养，提取质粒，进行测序和分别作NdeI单酶切、XhoI单酶切以及NdeI+XhoI双酶切鉴定。结果在pET28b的NdeI和XhoI酶切位点间(沿着从NdeI至XhoI的方向)***的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示(记作青霉素结合蛋白PBP2x)。表明重组载体中基因***方向和序列均正确，将阳性重组载体记作重组表达载体pET28b-PBP2x。酶切鉴定结果如图2所示，单酶切大小在7300bp左右，双酶切有2300bp左右和5000bp左右的条带，说明目的基因已经正确连接入pET28b。图2中，泳道1：NdeI单酶切；泳道2：XhoI单酶切；泳道3：NdeI/XhoI双酶切；泳道4：Marker。

构建好的重组表达载体pET28b-PBP2x转化大肠杆菌BL21(DE3)，卡那霉素抗性筛选，获得阳性单克隆；将获得的阳性单克隆接种于含卡那霉素30ug/mL的LB液体培养基中培养，提取质粒，测序，结果表明提取的质粒正确，表明构建的重组菌正确，记作重组菌BL21-pET28b-PBP2x。

同时以转入pET28b的大肠杆菌BL21(DE3)为对照菌，记作重组菌BL21-pET28b。

实施例2、蛋白的制备与纯化

一、蛋白的制备

将重组菌BL21-pET28b-PBP2x接种至含卡那霉素30ug/mL的LB液体培养基中，250rpm 37℃振摇，过夜培养(12h)，得到种子液；取1mL种子液接种于100mL含卡那霉素30ug/mL的LB液体培养基，250rpm 37℃振摇，至培养体系的A₆₀₀为0.6时，先取出1mL菌液，作为未诱导对照，其余菌液加入IPTG至终浓度1mM，200pm 30℃摇菌，从诱导第3个小时开始(加入IPTG时记作第0小时)，每小时取出1mL菌液，诱导时间分别为3h、4h、5h、6h、7h、8h以及过夜(12h)；将收集的菌液在4℃下10000rpm离心5min，收集菌体；用Tris-HCL(10mM Tris pH7.0)重悬菌体，200W功率冰浴超声(超声10s，停10s)破碎菌体至悬液变澄清，再4℃、12000×g离心20min，收集上清液，即为青霉素结合蛋白提取液。将培养容器内的所有物质记作菌液。

含卡那霉素30ug/mL的LB液体培养基的制备：向LB液体培养基中添加卡那霉素，使卡那霉素在LB液体培养基中的浓度为30ug/mL，得到的混合溶液为含卡那霉素30ug/mL的LB液体培养基。

LB液体培养基组成：由酵母提取物、蛋白胨、NaCl和水组成，溶液中各成分的浓度为：酵母提取物0.5％(质量百分含量)，蛋白胨1％(质量百分含量)，NaCl 1％(质量百分含量)。

二、蛋白的纯化

青霉素结合蛋白纯化：利用表达载体上带有的组氨酸标签(His-tag)标记通过镍离子亲和层析纯化青霉素结合蛋白。先用10倍柱体积的binding buffer平衡His

Columns，取上述青霉素结合蛋白提取液，然后用5倍柱体积的wash buffer洗脱杂蛋白，最后用10倍柱体积的elution buffer洗脱目标蛋白，收集洗脱液，透析，得到纯化的青霉素结合蛋白。

同时以重组菌BL21-pET28b的表达产物为对照。

binding buffer：将20mmol Tris、0.5mol Nacl和10mmol咪唑用水溶解，用HCL调PH值至8.0，再用水定容至1L，得到1升binding buffer。

wash buffer：将20mmol Tris、0.5mol NaCl和20mmol咪唑用水溶解，用HCL调PH值至8.0，再用水定容至1L，得到1升wash buffer。

elution buffer：将20mmol Tris、0.5mol Nacl和500mmol咪唑用水溶解，用HCL调PH值至8.0，再用水定容至1L，得到1升elution buffer。

三、蛋白验证

1、将纯化前后产物及IPTG诱导前后产物进行SDS-PAGE检测，结果如图3和图4所示。

图3为重组菌BL21-pET28b-PBP2x的结果，泳道1：未诱导对照组；泳道2～8：分别为重组菌株经3、4、5、6、7、8小时以及过夜诱导后蛋白表达图；泳道9：Marker。

图4为重组菌BL21-pET28b-PBP2x的结果，泳道1：Marker；泳道2：未诱导的未纯化的重组菌株全蛋白；泳道3：诱导但未纯化的重组菌株全蛋白；泳道4：诱导且纯化后的蛋白。

结果显示，在IPTG诱导下，经IPTG诱导的重组菌BL21-pET28b-PBP2x中含有80kD左右有明显的条带，与目的蛋白的预期大小一致，PBP2x蛋白表达成功。而未经IPTG诱导的重组菌BL21-pET28b-PBP2x中不含有目的条带。

无论诱导与否，重组菌BL21-pET28b的表达产物中不含目的条带。

2、蛋白验证Western blot：

收集上述制备过程中各阶段产物，进行10％SDS-PAGE电泳；将电泳条带印迹到NC膜上，再依次与His-tag单克隆抗体以及HRP标记的羊抗鼠抗体杂交，DAB显色。

结果如图5所示。图5中，泳道1：Marker；泳道2：未诱导的未纯化的重组菌BL21-pET28b-PBP2x全蛋白；泳道3：诱导但未纯化的重组菌BL21-pET28b-PBP2x全蛋白；泳道4：重组菌BL21-pET28b-PBP2x的诱导且纯化后的蛋白。

结果表明：重组菌BL21-pET28b-PBP2x表达得到的蛋白分子量为80kD左右，与预期的蛋白分子量一致。重组菌BL21-pET28b的表达产物中未含有目的蛋白。

实施例3、检测β-内酰胺类抗生素的试剂盒

一、试剂盒由下述物质组成：

1、包被青霉素结合蛋白的酶标板：实施例2中制备纯化的青霉素结合蛋白，用包被缓冲液配置成1ug/mL；每孔100uL。

2、酶标物工作液：HRP标记的氨苄西林工作液，其工作浓度1ug/mL，用样品稀释液稀释HRP标记的氨苄西林得到。

3、β-内酰胺类抗生素标准品：标准品为青霉素G冻干粉，青霉素G购自美国Sigma-Aldrich公司；产品目录号为46616；将青霉素G用样品稀释液溶解，得到如下不同浓度的标准品溶液：8.1μg/L、2.7μg/L、0.9μg/L、0.3μg/L、0.1μg/L。

4、底物显色液：由A液和B液组成，A液为2％(质量百分含量)过氧化脲的水溶液，B液为1％(质量百分含量)四甲基联苯胺的水溶液；

5、终止液：0.2M硫酸水溶液；

6、洗涤液：每1升所述洗涤液是按照如下方法配制得到的：将0.5ml吐温20、5g叠氮化钠和990ml磷酸盐缓冲液混合，得到所述洗涤液；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M，pH值为7.4；

7、样品稀释液：0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，pH值为7.2。

8、包被缓冲液：0.05mol/L的碳酸钠的水溶液、pH9.6。

9、封闭液：每1升封闭液按照如下方法配制：将50mgBSA、1g叠氮化钠、30g酪蛋白混合，用磷酸盐缓冲液溶解并定容至1000ml，得到封闭液；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.02M，pH值为7.2。

0.01M、pH值为7.4的PBS缓冲液的配制：每1升磷酸盐缓冲液(PBS)按照如下方法制备：将8g NaCl、0.2g KCl、3.53g Na₂HPO₄.12H₂O、0.24g KH₂PO₄和去离子水混合，用去离子水定容至1升。如此得到的磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M，pH值为7.4。

0.1M、pH值为7.2的PBS缓冲液的配制：先分别配置0.1mol/L Na₂HPO₄溶液(称取Na₂HPO₄.12H₂O 35.8g，加去离子水至1000m L)和0.1mol/L NaH₂PO₄溶液(称取NaH₂PO₄.2H₂O 15.6g，加去离子水至1000m L)；取0.1mol/L Na₂HPO₄溶液72m L和0.1mol/LNaH₂PO₄溶液28m L，加入8.5g NaCL，混合均匀。

0.02M、pH值为7.2的PBS缓冲液的配制：取0.1M、pH值为7.2的PBS缓冲液200mL，加入去离子水800mL，混匀即得。

0.05mol/L、pH值为9.6的碳酸钠的水溶液的配制：Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，加去离子水定容至1升。

二、试剂盒的制备

(一)包被有青霉素结合蛋白的酶标板及其制备

包被有青霉素结合蛋白的聚苯乙烯酶标板：用包被缓冲液将青霉素结合蛋白稀释至1.0μg/mL，包被96孔聚苯乙烯酶标板，每孔100μL，4℃过夜，甩干孔中液体，用洗涤液(20倍稀释后)洗涤1次，拍干，然后在每孔中加入200μL封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

(二)标准品的制备

将青霉素G标准品用冻存液(含5％BSA的0.01M PBS，pH 7.4)配制成浓度为8.1μg/L，每冻干瓶分装1mL，置于冻干机中冻干，密封后4℃保存。

(三)酶标物的制备

用EDC法将半抗原氨苄西林偶联于HRP上。

a.取50mg氨苄西林，溶于5mL PBS(0.05mol/L，pH7.0)溶液中；

b.加入40mg EDC，4℃搅拌反应1h；

c.取100mg的HRP以及10mg EDC溶于10mLPBS(0.05mol/L，pH7.0)溶液中，与上述溶液混合，4℃搅拌反应48h；

d.装入透析袋，PBS(0.05mol/L，pH7.0)透析，得到氨苄西林与HRP的偶联物，即为酶标物。

0.05M、pH值为7.0的PBS缓冲液的配制：先分别配置0.05mol/L Na₂HPO₄溶液(称取Na₂HPO₄.12H₂O 17.9g，加去离子水至1000m L)和0.05mol/L KH₂PO₄溶液(称取KH₂PO₄.2H₂O 8.6g，加去离子水至1000m L)；取0.05mol/L Na₂HPO₄溶液60m L和0.05mol/LKH₂PO₄溶液40m L，加入8.5g NaCL，混合均匀。

三、试剂盒检测方法

1、标准曲线的制作

向包被有青霉素结合蛋白的酶标板微孔中加入不同浓度的青霉素G标准品溶液50μL，再加入酶标物工作液50μL，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min，甩干孔中液体，每孔加入350μL洗涤液，30s后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板4次，用吸水纸拍干。每孔加入底物显色液，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色10min，每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪，测定每孔吸光度值。

用每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100％，得到百分吸光度值。以标准品浓度(μg/L)的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。得到的标准曲线如图6所示。该标准曲线的函数关系式为y＝-18.95Ln^(x)+43.087，R²＝0.9918.

百分吸光度值(％)＝(B/B₀)×100％

2、样品中β-内酰胺类抗生素浓度的测定

方法与标准曲线的制备中基本相同，不同的是用待测样本溶液代替标准品溶液。测定每孔吸光度值。用每个检测样本溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100％，得到百分吸光度值。将百分吸光度值代入标准曲线的函数关系式，即得到样本溶液中β-内酰胺类抗生素的残留量。

3、检测样品的前处理方法

检测样本为牛奶、奶粉：牛奶用样品稀释液按1∶4稀释后4℃10000rpm离心，取50μL上清液用于检测。称取1g奶粉，溶于5mL样品稀释液中，混合均匀，取50μL用于检测。

检测样本为尿液：直接取50μL尿液用于检测。

检测样本为肌肉、鱼、虾及蛋类：称取5g均质样品，加入10mL乙腈水溶液(V_{乙 腈}∶V_水＝9∶1)，上下颠倒震荡10min，5000rpm离心10min，取上清，氮气吹干，用1mL样品稀释液重悬，取50μL用于检测。

检测样本为蜂蜜：称取5g样品，加入15mL去离子水，于涡旋仪上充分混合1min，过Oasis固相萃取柱后(利用离子交换，将目标物富集和纯化)，先用5mL去离子水洗柱，负压下抽干，再用3mL甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，用1mL样品稀释液重悬，取50μL用于检测。

四、试剂盒的准确度

(一)准确度试验

向不含β-内酰胺类抗生素的样品中添加青霉素G标准品，使青霉素G标准品在样品中的终浓度分别为4μg/L、8μg/L；将添加后的样品分别按照实验三中所述方法进行前处理，得到检测样本溶液。

从三个不同批次的试剂盒中各抽取3个试剂盒进行检测，每个实验重复5次，分别计算变异系数。结果分别见表1。

回收率的计算方法：RG＝测定值与真实值的比值×100％；

变异系数的计算方法：CV＝(各平行样本的标准差与各平行样本平均值的比值)×100％；

批内变异系数的计算方法：批内CV＝同一次测定中各平行样本的变异系数的平均值。

批间变异系数的计算方法：批间CV＝同一样本在不同批次测定结果的变异系数，取其平均值。

结果表明：所有样品的添加回收率在72.2％～97.5％，批内变异系数在6.4％～9.9％，批间变异系数在9.8％～13.0％。

表1、青霉素G准确度的测定结果

(二)特异性检测

检测方法与实验三中标准曲线的制备方法基本相同，不同的是分别用不同浓度的β-内酰胺类抗生素代替标准品，得到每种β-内酰胺类抗生素的50％抑制浓度(IC50)。

β-内酰胺类抗生素如下：青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、邻氯西林、双氯西林、新青霉素III、羧苄西林、甲氧西林、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢曲松、头孢噻肟、头孢噻吩、头孢噻呋、头孢喹肟。

实验设3次重复。

结果如下：

1)吸光度值与每孔所加入的各标准品浓度成反比，证明所表达纯化得到的青霉素结合蛋白具有识别多种β-内酰胺类抗生素的特性，并呈现线性关系，说明该青霉素结合蛋白可用于多种β-内酰胺类抗生素的检测。

2)各种药物的最低检测限：以各种药物的IC80为最低检测限：阳性对照孔(即不添加标准品溶液的孔)的吸光度值为B₀，各实验孔的吸光度值为B，当B/B₀为80％时所对应的标准品溶液的浓度即为最低检测限(IC80)。结果见表2。

结果如表2所示，PBP 2x蛋白可以识别包括青霉素、阿莫西林、氨苄西林、头孢氨苄等在内的至少18种β-内酰胺类药物，而且对于欧盟设定有MRL的药物均能够满足检测要求。

文中的ppb即ng/mL。

表2多种β-内酰胺药物的最低检测限

(三)试剂盒保存期

试剂盒保存条件为2-8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、β-内酰胺类抗生素添加实际测定值均在正常范围之内。考虑到运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置8天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒的各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻8天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8℃至少可以保存12个月以上。

实施例4、检测β-内酰胺类抗生素的试纸条

一、试纸的结构

所述试纸由样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫组成；

所述样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫依次按顺序连接，样品吸收垫的末端与胶体金垫的始端相连，胶体金垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连；

所述胶体金垫上包被有胶体金标记的带有HIS标签的青霉素结合蛋白(实施例2制备纯化得到)；

所述反应膜上有检测区和质控区，检测区(C线)和质控区(T线)均为与所述试纸的长相垂直的条带状；检测区位于近于胶体金垫末端的一侧；质控区位于远离胶体金垫末端的一侧；检测区包被有包被原，质控区包被有鼠抗HIS标签单克隆抗体；包被原为阿莫西林与OVA的偶联物。

样品吸收垫为纤维素滤膜，反应膜为硝酸纤维素膜(NC膜)；吸水垫为吸水纸；胶体金垫为包被有胶体金标记的链霉素抗体的玻璃纤维膜；样品孔位于试纸顶端。

二、试纸的制备

1、包被原的制备

用EDC法将半抗原阿莫西林偶联于卵清白蛋白OVA上。

a.取150mg阿莫西林，溶于40mL PBS(0.05mol/L，pH7.0)溶液中；

b.加入100mg EDC，4℃搅拌反应1h；

c.再加入100mg OVA，4℃搅拌反应24h；装入透析袋，PBS(0.05mol/L，pH7.0)透析，得到阿莫西林与OVA的偶联物，即为包被原。

2、胶体金标记抗体-胶体金标记纯化后的青霉素结合蛋白：

胶体金溶液的制备：取0.01％氯金酸水溶液100mL用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，持续搅拌的情况下加入1％柠檬酸三钠水溶液2.5mL，继续搅拌加热20min，溶液呈透亮的红色。室温冷却，用去离子水恢复到原体积，2-8℃保存。

0.1mol/L K₂CO₃水溶液调节胶体金溶液pH 8.2。将10mL胶体金溶液中加入50mL烧杯中，电磁搅拌器250r/min搅拌，逐滴加入1mL含1mg青霉素结合蛋白溶液。逐滴加入3mL 5％BSA水溶液，持续搅拌10min。将溶液常温低速(1500r/min)离心20min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀。取红色上清溶液，红色上清溶液2-8℃，11000r/min离心40min。溶液分为三层，透明上清，管底可流动的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的金颗粒层。将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中，用含1％BSA的0.01mol/L磷酸缓冲液混悬至原体积。平衡过夜，同上重复离心2次。最后用1％BSA的0.01mol/L磷酸缓冲液(含0.02％NaN₃)将沉淀混悬为原体积的1/40，即得到胶体金标记的青霉素结合蛋白，2-8℃保存。

3、喷金：将胶体金标记的青霉素结合蛋白喷到玻璃纤维上，制成胶体金垫；

4、喷膜：反应膜上的T线和C线位置分别喷上包被原和鼠抗HIS标签单克隆抗体；

5、组装：将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水纸按常规方法进行组装，然后切条，将试纸卡装入塑料制卡中，形成试纸卡。

三、用试纸卡进行检测

(1)样品前处理及检测

牛奶样品：无需前处理，直接检测。

取出试纸卡，开封后平放于桌面，吸取待测液逐滴加入4滴于样品孔中；42℃反应，10min判断结果，20min后的结果无效。

(2)结果判断

阴性：C线显色，T线肉眼可见，无论颜色深浅均判为阴性。

阳性：C线显色，T线不显色，判为阳性。

无效：C线不显色，无论T线是否显色，该试纸卡均判为无效。

该胶体金试纸的检测原理：当样品中含有过多的β-内酰胺类抗生素时，胶体金标记的青霉素结合蛋白完全被样品中的β-内酰胺类抗生素结合，所以检测线上的阿莫西林不能与胶体金标记的青霉素结合蛋白结合，因此检测线上不显色，检测结果为阳性；当样品中不含有β-内酰胺类抗生素时，胶体金标记的青霉素结合蛋白只与检测线上的阿莫西林结合，因此检测线上显色，检测结果为阴性。

四、试纸卡的效果

(1)假阳性率和假阴性率

原奶样品直接采自农场奶牛。用LC-MS/MS检测奶样中青霉素G含量，LC-MS/MS按照GB/T 22975-2008进行。

取经LC-MS/MS确证的阴性奶样(青霉素G含量小于4ng/ml)100份，取经LC-MS/MS确证的阳性奶样(青霉素G含量大于4ng/ml)100份。将样品分别用试纸卡进行检测，计算假阳性率和假阴性率。

结果：在100份阴性奶样测定中，试纸卡检测出阳性样品5份(13#、32#、58#、66#、67#)，假阳性率为6％。在100份阳性奶样测定中，试纸卡检测出阴性样品0份，假阴性率为0％。

按照相同方法检测超市购买的牛奶。用LC-MS/MS检测奶样中青霉素G含量，LC-MS/MS按照GB/T 22975-2008进行。

取经LC-MS/MS确证的阴性成品奶样(青霉素G含量小于4ng/ml)15份，取经LC-MS/MS确证的阳性奶样(青霉素G含量大于4ng/ml)10份。将样品分别用试纸卡进行检测，计算假阳性率和假阴性率。

结果：在15份阴性成品奶样测定中，试纸卡检测出阳性样品1份(8#)，假阳性率为6.67％。在10份阳性奶样测定中，试纸卡检测出阴性样品0份，假阴性率为0％。

(2)试纸卡保存期

稳定性试验结果表明，本试纸卡在2-8℃或室温条件***凉干燥处可保存1年。

Claims (10)

1.一种用于检测β-内酰胺类抗生素的受体试剂盒，包括：SEQ ID NO：1所示蛋白、酶标记的氨苄西林和标准品溶液，所述标准品为青霉素G。

2.根据权利要求1所述的受体试剂盒，其特征在于：所述受体试剂盒还包括底物显色液、终止液、洗涤液、样品稀释液、包被缓冲液和封闭液；

底物显色液由A液和B液组成，A液为2％(质量百分含量)过氧化脲的水溶液，B液为1％(质量百分含量)四甲基联苯胺的水溶液；

终止液为0.2M的硫酸水溶液；

每1升所述洗涤液是按照如下方法配制得到的：将0.5ml吐温20、5g叠氮化钠和990ml磷酸盐缓冲液混合，得到所述洗涤液；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M，pH值为7.4；

样品稀释液：0.1mol/L、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液；

每1升包被缓冲液按照如下方法制备：将Na₂CO₃1.59g和NaHCO₃2.93g溶于1升水中，用水定容至1升，得到所述包被缓冲液；

每1升封闭液按照如下方法配制：将50mgBSA、1g叠氮化钠、30g酪蛋白混合，用磷酸盐缓冲液溶解并定容至1000ml，得到封闭液；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.02M，pH值为7.2。

3.根据权利要求1或2所述的受体试剂盒，其特征在于：所述酶标记的氨苄西林为HRP标记的氨苄西林；

所述标准品溶液为青霉素G浓度如下的溶液：8.1μg/L、2.7μg/L、0.9μg/L、0.3μg/L、0.1μg/L。

4.根据权利要求1-3中任一所述的受体试剂盒，其特征在于：所述β-内酰胺类抗生素为如下中的至少一种：青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、邻氯西林、新青霉素III、双氯西林、羧苄西林、甲氧西林、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢曲松、头孢噻肟、头孢噻吩、头孢羟氨苄、头孢噻呋、头孢喹肟。

5.一种检测β-内酰胺类抗生素的胶体金试纸，包括样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫，其依次连接；所述胶体金垫包被有胶体金标记的带有HIS标签的SEQ IDNO：1所示蛋白；所述反应膜上含有检测带和质控带，检测带位置包被有阿莫西林与载体蛋白的偶联物，质控带位置包被有鼠抗HIS标签单克隆抗体。

6.根据权利要求5所述的胶体金试纸，其特征在于：所述β-内酰胺类抗生素为如下中的至少一种：青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、邻氯西林、新青霉素III、双氯西林、羧苄西林、甲氧西林、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢曲松、头孢噻肟、头孢噻吩、头孢羟氨苄、头孢噻呋、头孢喹肟。

7.根据权利要求5或6所述的胶体金试纸，其特征在于：所述载体蛋白为OVA。

8.一种检测样品中β-内酰胺类抗生素的方法，为如下I或II所示：

I、检测样品中β-内酰胺类抗生素的方法包括如下步骤：

1)将待测样品进行前处理，得到待测样本溶液；

2)用权利要求1-4中任一所述受体试剂盒对所述待测样本溶液进行检测；

所述待测样品为牛奶：将牛奶用样品稀释液按1∶4稀释，4℃、10000rpm离心，取上清液，作为待测样本溶液；

所述待测样品为奶粉：称取1g奶粉，溶于5mL样品稀释液中，混合均匀，作为待测样本溶液。

所述待测样品为尿液：将尿液直接作为待测样本溶液；

所述待测样品为肌肉、鱼、虾或蛋：将待测样品匀浆处理，得到均质样品，将每5g均质样品加入10mL乙腈水溶液中，上下颠倒震荡10min，5000rpm离心10min，取上清，氮气吹干，用1mL样品稀释液重悬，得到的溶液即为待测样本溶液；乙腈水溶液中乙腈和水的体积比为9∶1；

所述待测样品为蜂蜜：将每5g待测样品加入15mL去离子水中，混合；将所述混合溶液用Oasis固相萃取柱进行纯化，用甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，用1mL样品稀释液重悬，得到的溶液即为待测样本溶液。

II、检测样品中β-内酰胺类抗生素的方法包括如下步骤：

1)将待测样品进行前处理，得到待测样本溶液；

2)用权利要求5-7中任一所述所述胶体金试纸对所述待测样本溶液进行检测；

所述样品稀释液为0.1mol/L、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液。

9.SEQ ID NO：1所示蛋白在检测β-内酰胺类抗生素中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述β-内酰胺类抗生素为如下中的至少一种：青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、邻氯西林、新青霉素III、双氯西林、羧苄西林、甲氧西林、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢曲松、头孢噻肟、头孢噻吩、头孢羟氨苄、头孢噻呋、头孢喹肟。

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