CN102251046A - 一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法 - Google Patents
一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102251046A CN102251046A CN2011102185780A CN201110218578A CN102251046A CN 102251046 A CN102251046 A CN 102251046A CN 2011102185780 A CN2011102185780 A CN 2011102185780A CN 201110218578 A CN201110218578 A CN 201110218578A CN 102251046 A CN102251046 A CN 102251046A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sample
- gene
- damping fluid
- pcr amplification
- volume ratio
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，该方法包括以下步骤：(1)配制含TBE的聚环氧乙烷筛分介质；(2)提取血液样品中基因组DNA；(3)需检测基因目的片段扩增：将基因组DNA作为扩增模板，进行常规PCR扩增，即得p53基因PCR扩增样品和k-ras基因PCR扩增样品；(4)样品处理：将p53基因PCR扩增样品和k-ras基因PCR扩增样品经变性或酶切后分别得到变性样品溶液、酶切样品溶液；(5)样品检测：分别在变性样品溶液和酶切样品溶液中加入10×SYBR Green I荧光染料与基因组DNA，混匀后加入去离子水至体系为30～50μl；然后，使用毛细管电泳仪压力***自动填充聚环氧乙烷筛分介质，分别进行CE-SSCP或CE-RFLP检测即可。本发明操作简单、重现性好。
Description
技术领域
本发明涉及分析方法应用研究领域中的毛细管电泳检测方法，尤其涉及一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法。
背景技术
基因突变的检测在临床疾病诊断中起着十分重要的作用。目前，筛查基因点突变常常采用以PCR为基础的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳与各种基因突变检测技术相结合的方法，这些方法在满足临床快速检测基因突变的需要时有一定的局限性。因此建立一种准确快速地用于临床诊断的基因突变检测方法势在必行。
毛细管电泳(CE)是一种新型电泳与色谱相结合的分离分析技术，具有分离效率高、分析速度快、样品用量少、应用范围广等特点，广泛应用于分子生物学、分子医学和生命科学等方面。CE与各种基因突变检测技术例如SSCP(单链构象多态性检测)、RFLP(限制性内切酶片段长度多态性)相结合时，在突变基因检测方面显示了无可比拟的优越性。在1984～2010年中国专利数据库中记载了申请号为200510026931.X的中国专利《一种肿瘤相关基因突变的PCR检测方法及试剂***》、专利号为200910042599.4的中国专利《用于恶性肿瘤个体化用药相关基因突变检测的基因芯片及其应用》、申请号为200810005523.X的中国专利《检测基因突变的方法》、申请号为201010134207.X的中国专利《APC基因突变的快速检测》申请号为200910201917.7的中国专利《一种用于检测K-ras基因突变的引物及其应用》，上述专利仅仅公开了采用实时定量荧光PCR、测序、高分辨率溶解曲线法、荧光双环探针技术等基因突变检测方法对组织中或血液中肿瘤基因突变进行了检测，而采用毛细管电泳结合SSCP、RFLP用于检测血液中肿瘤突变基因的方法及应用却未见文献报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、重现性好的用于检测血液中肿瘤突变基因的方法。
为解决上述问题，本发明所述的一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，包括以下步骤：
(1)含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制：将聚环氧乙烷加入1×TBE缓冲液中，使最终溶液浓度为2.5～3.5％、pH值为7.5～9.0后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用0.22um或0.45um水系微孔滤膜过滤后，即得到聚环氧乙烷筛分介质；
(2)血液样品中基因组DNA提取：在血液样品中加入Tris缓冲液Ⅰ裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液Ⅱ将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，55～57℃水浴孵育2～6h；孵育结束后加入酚-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水乙醇，得到沉淀DNA；该沉淀DNA经室温自然干燥至恒重时，即得基因组DNA；所述Tris缓冲液Ⅰ与所述血液样品的体积比为1∶2～3；所述Tris缓冲液Ⅱ与所述血液样品的体积比为1∶0.5～1；所述蛋白酶K与所述血液样品的体积比为1∶0.03～0.05；所述酚-氯仿与所述血液样品的体积比为1∶1～1.5；所述无水乙醇与所述血液样品的体积比为1∶1.5～2.0；
(3)需检测基因目的片段扩增：将所述基因组DNA作为扩增模板，采用pp5设计p53基因及k-ras基因目的片段扩增引物，进行常规PCR扩增，即得p53基因PCR扩增样品和k-ras基因PCR扩增样品；
(4)样品处理：将p53基因PCR扩增样品和k-ras基因PCR扩增样品经94～97℃变性8～10min后，冰浴5～10min，得到变性DNA样品溶液；或分别在p53基因PCR扩增样品、在k-ras基因PCR扩增样品中加入三蒸水、Tango缓冲液，并在p53基因PCR扩增样品中加入MspⅠ内切酶、在k-ras基因PCR扩增样品中加入BstNⅠ内切酶，在37℃孵育4～8h，在80℃灭活15～20min后，得到酶切DNA样品溶液；所述p53基因PCR扩增样品、k-ras基因PCR扩增样品分别与三蒸水、Tango缓冲液的体积比为1∶1.5～1.8∶0.2～0.3；所述p53基因PCR扩增样品与所述MspⅠ内切酶的体积比为1∶0.1～0.2；所述k-ras基因PCR扩增样品与所述BstNⅠ内切酶的体积比为1∶0.1～0.2；
(5)样品检测：
①在17～22ul变性DNA样品溶液中分别加入10×SYBR Green I荧光染料、所述步骤(2)所得的基因组DNA，混匀后加入去离子水至体系为30～50μl；然后，使用毛细管电泳仪压力***自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为10～20kv、温度为15～20℃的条件下采用负极-10kv电动进样的方式进行CE-SSCP检测即可；
②在17～22ul酶切DNA样品溶液中分别加入10×SYBR Green I荧光染料、所述步骤(2)所得的基因组DNA，混匀后加入去离子水至体系为30～50μl；然后，使用毛细管电泳仪压力***自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为10～20kv、温度为15～20℃的条件下采用负极-10kv电动进样的方式进行CE-RFLP检测即可。
所述步骤(1)中的1×TBE缓冲液是指将在800毫升去离子水中分别加入三羟甲基氨基甲烷(Tris)10.8克、硼酸5.5克、乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)0.74克经搅拌溶解后，加去离子水将溶液定容至1升所得的缓冲液。
所述步骤(2)中的血液样品是指胃癌、肺癌患者及正常人外周静脉血液样品。
所述步骤(2)中的Tris缓冲液Ⅰ是指由pH值为8.0且10mmol/L的Tris-HCl缓冲液、10mmol/L的氯化钾、10mmol/L的氯化镁、pH值为8.0且2mmol/L的EDTA和25mL/L的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)混合而成的缓冲液。
所述步骤(2)中的Tris缓冲液Ⅱ是指由pH值为8.0且10mmol/L的Tris-HCl缓冲液、10mmol/L的氯化钾、10mmol/L的氯化镁、pH值为8.0且2mmol/L的EDTA、0.4mol/L氯化钠和10g/L十二烷基硫酸钠(SDS)混合而成的缓冲液。
所述步骤(2)中的酚-氯仿是指将饱和酚与氯仿等体积混合所得的溶液。
所述步骤(3)中的扩增条件为：94℃变性30s，50～60℃退火30s，72℃延伸30s，共行30个循环。
所述步骤(4)中的Tango缓冲液是指由33mM三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐(Tris-acetate)、10mM醋酸镁(Mg-acetate)、66mM醋酸钾(K-acetate)、0.1mg/ml N，O-双三甲硅基乙酰胺(BSA)混合后，加去离子水定容至1升所得的缓冲液；所述三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐(Tris-acetate)的pH值为7.9，温度为37℃。
所述步骤(5)中10×SYBR Green I荧光染料与所述基因组DNA样品的体积比为1∶3～1∶4。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明采用毛细管电泳结合SSCP、RFLP突变检测技术，与传统平板电泳检测基因突变相比较，具有良好的温度控制***，能有效控制温度在15～20℃，从而保证了检测结果的准确性和重现新。
2、本发明以含有1×TBE缓冲液的聚环氧乙烷(PEO)作为筛分介质，具有良好分离效能，可完成对血液样品中肿瘤突变基因的检测(参见图2、图3、图4、图5、图6、图7、图8、图9)。同时，选用了10×SYBR greenⅠ作为荧光染料，有效提高了检测的灵敏度。
3、本发明操作简单、快速简便、样品用量少、结果直观可靠、重现性好，可广泛应用于临床血液样品中肿瘤突变基因的检测。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明实施例1的毛细管电泳图。
图2为本发明实施例2的毛细管电泳图。
图3为本发明实施例2的毛细管电泳图。
图4为本发明实施例2的毛细管电泳图。
图5为本发明实施例2的毛细管电泳图。
图6为本发明实施例3的毛细管电泳图。
图7为本发明实施例3的毛细管电泳图。
图8为本发明实施例3的毛细管电泳图。
图9为本发明实施例3的毛细管电泳图。
图10为本发明实施例4的毛细管电泳图。
图11为本发明实施例4的毛细管电泳图。
图12为本发明实施例4的毛细管电泳图。
图13为本发明实施例4的毛细管电泳图。
图14为本发明实施例5的毛细管电泳图。
图15为本发明实施例5的毛细管电泳图。
图16为本发明实施例5的毛细管电泳图。
图17为本发明实施例5的毛细管电泳图。
具体实施方式
实施例1一种用于检测血液样品中肿瘤突变基因的方法，用于pUC19DNA/MspⅠ/HpaⅡDNA Marker的分离。
(1)含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制：
将聚环氧乙烷加入1×TBE缓冲液中，使最终溶液浓度为3.0％、pH值为8.3后，并用河南巩义市予华仪器有限责任公司生产的DF-101S型磁力搅拌器以400转/分钟的速率搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用0.45um水系微孔滤膜过滤后，即得到聚环氧乙烷筛分介质。
其中：1×TBE缓冲液是指将在800毫升去离子水中分别加入上海生物工程公司生产的三羟甲基氨基甲烷(Tris)10.8克、上海生工公司生产的硼酸5.5克、上海生工公司生产的乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)0.74克经搅拌溶解后，加去离子水将溶液定容至1升所得的缓冲液。
该方法在分离pUC19 DNA/MspⅠ/HpaⅡDNA Marker中的应用，包括以下步骤：
①使用毛细管电泳仪(P/ACE 5000，美国Beckman公司)，在分离时使用压力为10psi(磅/平方英寸)的压力***自动填充含TBE的聚环氧乙烷筛分介质。
②将10×SYBR Green I的荧光染料(厦门百信威公司提供)与pUC19DNA/MspⅠ/HpaⅡDNA Marker(BBI公司提供)按4∶1的体积比混匀，以-10KV负极电动进样10s，然后加入去离子水至体系为30～50μl。
③在分离电压为15kV、电泳温度为15℃下进行电泳分离。
其分离电泳图参见图1，共得到11个色谱峰。图中1为26bp；2为34bp；3为67bp；4为110和111bp；5为147bp；6为190bp；7为242bp；8为331bp；9为404bp；10为489bp；11为501bp。
从图中可以看出，该方法对不同长度DNA片段进行了良好的分离。
实施例2一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，包括以下步骤：
(1)含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制：
将聚环氧乙烷加入1×TBE缓冲液中，使最终溶液浓度为2.5％、pH值为8.0后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用0.22um水系微孔滤膜过滤后，即得到聚环氧乙烷筛分介质。
其中1×TBE缓冲液同实施例1。
(2)血液样品中基因组DNA提取：
在血液样品中加入Tris缓冲液Ⅰ裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液Ⅱ将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，55℃水浴孵育4h；孵育结束后加入酚-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水乙醇，冰浴1h，10000rmp离心2min，得到沉淀DNA；该沉淀DNA经室温自然干燥至恒重时，即得基因组DNA。
Tris缓冲液Ⅰ与血液样品的体积比为1∶2；Tris缓冲液Ⅱ与血液样品的体积比为1∶0.5；蛋白酶K与血液样品的体积比为1∶0.03；酚-氯仿与血液样品的体积比为1∶1；无水乙醇与血液样品的体积比为1∶1.5。
其中：血液样品是指胃癌患者外周静脉血液样品。
Tris缓冲液Ⅰ是指由pH值为8.0且10mmol/L的Tris-HCl缓冲液、10mmol/L的氯化钾、10mmol/L的氯化镁、pH值为8.0且2mmol/L的EDTA和25mL/L的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)混合而成的缓冲液。
Tris缓冲液Ⅱ是指由pH值为8.0且10mmol/L的Tris-HCl缓冲液、10mmol/L的氯化钾、10mmol/L的氯化镁、pH值为8.0且2mmol/L的EDTA、0.4mol/L氯化钠和10g/L十二烷基硫酸钠(SDS)混合而成的缓冲液。
酚-氯仿是指将饱和酚与氯仿等体积混合所得的溶液。
(3)需检测基因目的片段扩增：将基因组DNA作为扩增模板，采用pp5设计p53基因及k-ras基因目的片段扩增引物，进行常规PCR扩增，即得p53基因PCR扩增样品和k-ras基因PCR扩增样品。
其中扩增条件为：94℃变性30s，50～60℃退火30s，72℃延伸30s，共行30个循环。
(4)样品处理：分别取p53基因PCR扩增样品和k-ras基因PCR扩增样品各22ul，在96℃变性10min，立即冰浴5min，得到变性DNA样品溶液。
(5)样品检测：在20ul变性DNA样品溶液中分别加入10×SYBR Green I荧光染料、步骤(2)所得的基因组DNA，10×SYBR Green I荧光染料与基因组DNA样品的体积比为1∶3。混匀后加入去离子水至体系为30～50μl；然后，使用毛细管电泳仪压力***自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为13kv、温度为15℃的条件下采用负极-10kv电动进样的方式进行CE-SSCP检测即可。
其分离电泳图参见图2、图3、图4、图5。图2、图3分别为p53基因正常对照和肿瘤样品CE-SSCP检测电泳图；图4、图5分别为k-ras基因正常对照和肿瘤样品CE-SSCP检测电泳图。图中1为未变性完全双链DNA，2，3为变性所得正常单链DNA，4为变性所得异常单链DNA。
从图中可以看出，该用于血液中肿瘤突变基因检测方法对双链DNA、单链DNA均能得到良好的分离。
实施例3一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，包括以下步骤：
(1)含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制：
将聚环氧乙烷加入1×TBE缓冲液中，使最终溶液浓度为2.5％、pH值为7.5后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用0.22um水系微孔滤膜过滤后，即得到聚环氧乙烷筛分介质。
其中1×TBE缓冲液同实施例1。
(2)血液样品中基因组DNA提取：
在血液样品中加入Tris缓冲液Ⅰ裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液Ⅱ将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，56℃水浴孵育2h；孵育结束后加入酚-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水乙醇，冰浴1h，10000rmp离心2min，得到沉淀DNA；该沉淀DNA经室温自然干燥至恒重时，即得基因组DNA。
Tris缓冲液Ⅰ与血液样品的体积比为1∶2.5；Tris缓冲液Ⅱ与血液样品的体积比为1∶0.55；蛋白酶K与血液样品的体积比为1∶0.04；酚-氯仿与血液样品的体积比为1∶1.2；无水乙醇与血液样品的体积比为1∶1.7。
其中：血液样品是指胃癌患者外周静脉血液样品。
Tris缓冲液Ⅰ、Tris缓冲液Ⅱ、酚-氯仿同实施例2。
(3)需检测基因目的片段扩增：将基因组DNA作为扩增模板，采用pp5设计p53基因及k-ras基因目的片段扩增引物，进行常规PCR扩增，即得p53基因PCR扩增样品和k-ras基因PCR扩增样品。
其中扩增条件同实施例2。
(4)样品处理：分别取p53基因PCR扩增样品和k-ras基因PCR扩增样品各22ul，在94℃变性9min，立即冰浴7min，得到变性DNA样品溶液。
(5)样品检测：在17ul变性DNA样品溶液中分别加入10×SYBR Green I荧光染料、步骤(2)所得的基因组DNA，10×SYBR Green I荧光染料与基因组DNA样品的体积比为1∶3.5。混匀后加入去离子水至体系为30～50μl；然后，使用毛细管电泳仪压力***自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为10kv、温度为20℃的条件下采用负极-10kv电动进样的方式进行CE-SSCP检测即可。
分离电泳图参见图6、图7、图8、图9。图6、图7分别为p53基因正常对照和肿瘤样品CE-SSCP检测电泳图；图8、图9分别为k-ras基因正常对照和肿瘤样品CE-SSCP检测电泳图。图中1为未变性完全双链DNA，2，3为变性所得正常单链DNA，4，5为变性所得异常单链DNA。其中图9中k-ras基因发生缺失只检测到一条单链。
从图中可以看出，该用于血液中肿瘤突变基因检测方法对双链DNA、单链DNA均能得到良好的分离。
实施例4一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，包括以下步骤：
(1)含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制：
将聚环氧乙烷加入1×TBE缓冲液中，使最终溶液浓度为2.5％、pH值为8.5后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用0.35um水系微孔滤膜过滤后，即得到聚环氧乙烷筛分介质。
其中1×TBE缓冲液同实施例1。
(2)血液样品中基因组DNA提取：
在血液样品中加入Tris缓冲液Ⅰ裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液Ⅱ将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，55℃水浴孵育4h；孵育结束后加入酚-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水乙醇，冰浴1h，10000rmp离心2min，得到沉淀DNA；该沉淀DNA经室温自然干燥至恒重时，即得基因组DNA。
Tris缓冲液Ⅰ与血液样品的体积比为1∶2；Tris缓冲液Ⅱ与血液样品的体积比为1∶0.5；蛋白酶K与血液样品的体积比为1∶0.03；酚-氯仿与血液样品的体积比为1∶1；无水乙醇与血液样品的体积比为1∶1.5。
其中：血液样品是指胃癌患者外周静脉血液样品。
Tris缓冲液Ⅰ、Tris缓冲液Ⅱ、酚-氯仿同实施例2。
(3)需检测基因目的片段扩增：将基因组DNA作为扩增模板，采用pp5设计p53基因及k-ras基因目的片段扩增引物，进行常规PCR扩增，即得p53基因PCR扩增样品和k-ras基因PCR扩增样品。
其中扩增条件同实施例2。
(4)样品处理：分别取p53基因PCR扩增样品和k-ras基因PCR扩增样品各22ul，在97℃变性8min，立即冰浴10min，得到变性DNA样品溶液。
(5)样品检测：在22ul变性DNA样品溶液中分别加入10×SYBR Green I荧光染料、步骤(2)所得的基因组DNA，10×SYBR Green I荧光染料与基因组DNA样品的体积比为1∶3。混匀后加入去离子水至体系为30～50μl；然后，使用毛细管电泳仪压力***自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为20kv、温度为18℃的条件下采用负极-10kv电动进样的方式进行CE-SSCP检测即可。
其分离电泳图参见图10、图11、图12、图13。图10、图11分别为p53基因正常对照和肿瘤样品CE-RFLP检测电泳图；图12、图13分别为k-ras基因正常对照和肿瘤样品CE-RFLP检测电泳图。其中图10经酶切所得53bp和147bp两条片段，图11可见由于突变未能酶切开所得的200bp单一片段。其中图12经酶切所得45bp和117bp两条片段，图13可见由于突变未能酶切开所得的162bp单一片段。
从图中可以看出，该用于血液中肿瘤突变基因检测方法对酶切肿瘤及正常对照样品均能得到良好的分离。
实施例5一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，包括以下步骤：
(1)含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制：
将聚环氧乙烷加入1×TBE缓冲液中，使最终溶液浓度为3.5％、pH值为9.0后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用0.45um水系微孔滤膜过滤后，即得到聚环氧乙烷筛分介质。
其中1×TBE缓冲液同实施例1。
(2)血液样品中基因组DNA提取：
在血液样品中加入Tris缓冲液Ⅰ裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液Ⅱ将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，57℃水浴孵育6h；孵育结束后加入酚-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水乙醇，冰浴1h，10000rmp离心2min，得到沉淀DNA；该沉淀DNA经室温自然干燥至恒重时，即得基因组DNA。
Tris缓冲液Ⅰ与血液样品的体积比为1∶3；Tris缓冲液Ⅱ与血液样品的体积比为1∶1；蛋白酶K与血液样品的体积比为1∶0.05；酚-氯仿与血液样品的体积比为1∶1.5；无水乙醇与血液样品的体积比为1∶2.0。
其中：血液样品是指肺癌患者外周静脉血液样品。
Tris缓冲液Ⅰ、Tris缓冲液Ⅱ、酚-氯仿同实施例2。
(3)需检测基因目的片段扩增：将基因组DNA作为扩增模板，采用pp5设计p53基因及k-ras基因目的片段扩增引物，进行常规PCR扩增，即得p53基因PCR扩增样品和k-ras基因PCR扩增样品。
其中扩增条件同实施例2。
(4)样品处理：分别在p53基因PCR扩增样品、在k-ras基因PCR扩增样品中加入三蒸水、Tango缓冲液，并在p53基因PCR扩增样品中加入MspⅠ内切酶、在k-ras基因PCR扩增样品中加入BstNⅠ内切酶，在37℃孵育4～8h，在80℃灭活15～20min后，得到酶切DNA样品溶液。
其中：Tango缓冲液是指由33mM三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐(Tris-acetate)、10mM醋酸镁(Mg-acetate)、66mM醋酸钾(K-acetate)、0.1mg/ml N，O-双三甲硅基乙酰胺(BSA)混合后，加去离子水定容至1升所得的缓冲液。三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐(Tris-acetate)的pH值为7.9，温度为37℃。
p53基因PCR扩增样品、k-ras基因PCR扩增样品分别与三蒸水、Tango缓冲液的体积比为1∶1.8∶0.3；p53基因PCR扩增样品与MspⅠ内切酶的体积比为1∶0.2；k-ras基因PCR扩增样品与BstNⅠ内切酶的体积比为1∶0.2。
(5)样品检测：在22ul酶切DNA样品溶液中分别加入10×SYBR Green I荧光染料、步骤(2)所得的基因组DNA，10×SYBR Green I荧光染料与基因组DNA样品的体积比为1∶4。混匀后加入去离子水至体系为30～50μl；然后，使用毛细管电泳仪压力***自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为15kv、温度为18℃的条件下采用负极-10kv电动进样的方式进行CE-RFLP检测即可。
其分离电泳图参见图14、图15、图16、图17。图14、图15分别为p53基因正常对照和肿瘤样品CE-RFLP检测电泳图；图16、图17分别为k-ras基因正常对照和肿瘤样品CE-RFLP检测电泳图。其中图14经酶切所得87bp和94bp两条片段，图15可见由于突变未能酶切开所得的181bp单一片段。其中图16经酶切所得39bp和136bp两条片段，图17可见由于突变未能酶切开所得的175bp单一片段。
从图中可以看出，该用于血液中肿瘤突变基因检测方法对酶切肿瘤及正常对照样品均能得到良好的分离。
实施例6一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，包括以下步骤：
(1)含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制：
将聚环氧乙烷加入1×TBE缓冲液中，使最终溶液浓度为3.5％、pH值为9.0后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用0.45um水系微孔滤膜过滤后，即得到聚环氧乙烷筛分介质。
其中1×TBE缓冲液同实施例1。
(2)血液样品中基因组DNA提取：
在血液样品中加入Tris缓冲液Ⅰ裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液Ⅱ将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，57℃水浴孵育6h；孵育结束后加入酚-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水乙醇，冰浴1h，10000rmp离心2min，得到沉淀DNA；该沉淀DNA经室温自然干燥至恒重时，即得基因组DNA。
Tris缓冲液Ⅰ与血液样品的体积比为1∶3；Tris缓冲液Ⅱ与血液样品的体积比为1∶1；蛋白酶K与血液样品的体积比为1∶0.05；酚-氯仿与血液样品的体积比为1∶1.5；无水乙醇与血液样品的体积比为1∶2.0。
其中：血液样品是指肺癌患者外周静脉血液样品。
Tris缓冲液Ⅰ、Tris缓冲液Ⅱ、酚-氯仿同实施例2。
(3)需检测基因目的片段扩增：将基因组DNA作为扩增模板，采用pp5设计p53基因及k-ras基因目的片段扩增引物，进行常规PCR扩增，即得p53基因PCR扩增样品和k-ras基因PCR扩增样品。
其中扩增条件同实施例2。
(4)样品处理：分别在p53基因PCR扩增样品、在k-ras基因PCR扩增样品中加入三蒸水、Tango缓冲液，并在p53基因PCR扩增样品中加入MspⅠ内切酶、在k-ras基因PCR扩增样品中加入BstNⅠ内切酶，在37℃孵育4～8h，在80℃灭活15～20min后，得到酶切DNA样品溶液。
其中：Tango缓冲液同实施例5。
p53基因PCR扩增样品、k-ras基因PCR扩增样品分别与三蒸水、Tango缓冲液的体积比为1∶1.5∶0.2；p53基因PCR扩增样品与MspⅠ内切酶的体积比为1∶0.1；k-ras基因PCR扩增样品与BstNⅠ内切酶的体积比为1∶0.1。
(5)样品检测：在17ul酶切DNA样品溶液中分别加入10×SYBR Green I荧光染料、步骤(2)所得的基因组DNA，10×SYBR Green I荧光染料与述基因组DNA样品的体积比为1∶3。混匀后加入去离子水至体系为30～50μl；然后，使用毛细管电泳仪压力***自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为10kv、温度为20℃的条件下采用负极-10kv电动进样的方式进行CE-RFLP检测即可。
实施例7一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，包括以下步骤：
(1)含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制：
将聚环氧乙烷加入1×TBE缓冲液中，使最终溶液浓度为3.5％、pH值为9.0后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用0.45um水系微孔滤膜过滤后，即得到聚环氧乙烷筛分介质。
其中1×TBE缓冲液同实施例1。
(2)血液样品中基因组DNA提取：
在血液样品中加入Tris缓冲液Ⅰ裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液Ⅱ将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，57℃水浴孵育6h；孵育结束后加入酚-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水乙醇，冰浴1h，10000rmp离心2min，得到沉淀DNA；该沉淀DNA经室温自然干燥至恒重时，即得基因组DNA。
Tris缓冲液Ⅰ与血液样品的体积比为1∶3；Tris缓冲液Ⅱ与血液样品的体积比为1∶1；蛋白酶K与血液样品的体积比为1∶0.05；酚-氯仿与血液样品的体积比为1∶1.5；无水乙醇与血液样品的体积比为1∶2.0。
其中：血液样品是指肺癌患者外周静脉血液样品。
Tris缓冲液Ⅰ、Tris缓冲液Ⅱ、酚-氯仿同实施例2。
(3)需检测基因目的片段扩增：将基因组DNA作为扩增模板，采用pp5设计p53基因及k-ras基因目的片段扩增引物，进行常规PCR扩增，即得p53基因PCR扩增样品和k-ras基因PCR扩增样品。
其中扩增条件同实施例2。
(4)样品处理：分别在p53基因PCR扩增样品、在k-ras基因PCR扩增样品中加入三蒸水、Tango缓冲液，并在p53基因PCR扩增样品中加入MspⅠ内切酶、在k-ras基因PCR扩增样品中加入BstNⅠ内切酶，在37℃孵育4～8h，在80℃灭活15～20min后，得到酶切DNA样品溶液。
其中：Tango缓冲液同实施例5。
p53基因PCR扩增样品、k-ras基因PCR扩增样品分别与三蒸水、Tango缓冲液的体积比为1∶1.6∶0.25；p53基因PCR扩增样品与MspⅠ内切酶的体积比为1∶0.15；k-ras基因PCR扩增样品与BstNⅠ内切酶的体积比为1∶0.15。
(5)样品检测：在20ul酶切DNA样品溶液中分别加入10×SYBR Green I荧光染料、步骤(2)所得的基因组DNA，10×SYBR Green I荧光染料与所述基因组DNA样品的体积比为1∶3.5。混匀后加入去离子水至体系为30～50μl；然后，使用毛细管电泳仪压力***自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为20kv、温度为15℃的条件下采用负极-10kv电动进样的方式进行CE-RFLP检测即可。
Claims (9)
1.一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，包括以下步骤：
(1)含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制：将聚环氧乙烷加入1×TBE缓冲液中，使最终溶液浓度为2.5～3.5％、pH值为7.5～9.0后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用0.22um或0.45um水系微孔滤膜过滤后，即得到聚环氧乙烷筛分介质；
(2)血液样品中基因组DNA提取：在血液样品中加入Tris缓冲液Ⅰ裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液Ⅱ将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，55～57℃水浴孵育2～6h；孵育结束后加入酚-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水乙醇，得到沉淀DNA；该沉淀DNA经室温自然干燥至恒重时，即得基因组DNA；所述Tris缓冲液Ⅰ与所述血液样品的体积比为1∶2～3；所述Tris缓冲液Ⅱ与所述血液样品的体积比为1∶0.5～1；所述蛋白酶K与所述血液样品的体积比为1∶0.03～0.05；所述酚-氯仿与所述血液样品的体积比为1∶1～1.5；所述无水乙醇与所述血液样品的体积比为1∶1.5～2.0；
(3)需检测基因目的片段扩增：将所述基因组DNA作为扩增模板，采用pp5设计p53基因及k-ras基因目的片段扩增引物，进行常规PCR扩增，即得p53基因PCR扩增样品和k-ras基因PCR扩增样品；
(4)样品处理：将p53基因PCR扩增样品和k-ras基因PCR扩增样品经94～97℃变性8～10min后，冰浴5～10min，得到变性DNA样品溶液；或分别在p53基因PCR扩增样品、在k-ras基因PCR扩增样品中加入三蒸水、Tango缓冲液，并在p53基因PCR扩增样品中加入MspⅠ内切酶、在k-ras基因PCR扩增样品中加入BstNⅠ内切酶，在37℃孵育4～8h，在80℃灭活15～20min后，得到酶切DNA样品溶液；所述p53基因PCR扩增样品、k-ras基因PCR扩增样品分别与三蒸水、Tango缓冲液的体积比为1∶1.5～1.8∶0.2～0.3；所述p53基因PCR扩增样品与所述MspⅠ内切酶的体积比为1∶0.1～0.2；所述k-ras基因PCR扩增样品与所述BstNⅠ内切酶的体积比为1∶0.1～0.2；
(5)样品检测：
①在17～22ul变性DNA样品溶液中分别加入10×SYBR Green I荧光染料、所述步骤(2)所得的基因组DNA，混匀后加入去离子水至体系为30～50μl；然后，使用毛细管电泳仪压力***自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为10～20kv、温度为15～20℃的条件下采用负极-10kv电动进样的方式进行CE-SSCP检测即可；
②在17～22ul酶切DNA样品溶液中分别加入10×SYBR Green I荧光染料、所述步骤(2)所得的基因组DNA，混匀后加入去离子水至体系为30～50μ1；然后，使用毛细管电泳仪压力***自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为10～20kv、温度为15～20℃的条件下采用负极-10kv电动进样的方式进行CE-RFLP检测即可。
2.如权利要求1所述的一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的1×TBE缓冲液是指将在800毫升去离子水中分别加入三羟甲基氨基甲烷10.8克、硼酸5.5克、乙二胺四乙酸二钠盐0.74克经搅拌溶解后，加去离子水将溶液定容至1升所得的缓冲液。
3.如权利要求1所述的一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的血液样品是指胃癌、肺癌患者及正常人外周静脉血液样品。
4.如权利要求1所述的一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的Tris缓冲液Ⅰ是指由pH值为8.0且10mmol/L的Tris-HCl缓冲液、10mmol/L的氯化钾、10mmol/L的氯化镁、pH值为8.0且2mmol/L的EDTA和25mL/L的聚乙二醇辛基苯基醚混合而成的缓冲液。
5.如权利要求1所述的一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的Tris缓冲液Ⅱ是指由pH值为8.0且10mmol/L的Tris-HCl缓冲液、10mmol/L的氯化钾、10mmol/L的氯化镁、pH值为8.0且2mmol/L的EDTA、0.4mol/L氯化钠和10g/L十二烷基硫酸钠混合而成的缓冲液。
6.如权利要求1所述的一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的酚-氯仿是指将饱和酚与氯仿等体积混合所得的溶液。
7.如权利要求1所述的一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的扩增条件为：94℃变性30s，50～60℃退火30s，72℃延伸30s，共行30个循环。
8.如权利要求1所述的一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，其特征在于：所述步骤(4)中的Tango缓冲液是指由33mM三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐、10mM醋酸镁、66mM醋酸钾、0.1mg/ml N，O-双三甲硅基乙酰胺混合后，加去离子水定容至1升所得的缓冲液；所述三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐的pH值为7.9，温度为37℃。
9.如权利要求1所述的一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，其特征在于：所述步骤(5)中10×SYBR Green I荧光染料与所述基因组DNA样品的体积比为1∶3～1∶4。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011102185780A CN102251046A (zh) | 2011-07-29 | 2011-07-29 | 一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011102185780A CN102251046A (zh) | 2011-07-29 | 2011-07-29 | 一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102251046A true CN102251046A (zh) | 2011-11-23 |
Family
ID=44978614
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2011102185780A Pending CN102251046A (zh) | 2011-07-29 | 2011-07-29 | 一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102251046A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107677820A (zh) * | 2016-08-02 | 2018-02-09 | 北京金沐医疗科技有限公司 | 一种检测肿瘤抗原的试剂盒及其检测方法 |
| CN107677823A (zh) * | 2016-08-02 | 2018-02-09 | 北京金沐医疗科技有限公司 | 一种用于检测肿瘤抗原的蛋白芯片试剂盒及其检测方法 |
| CN110387419A (zh) * | 2019-08-20 | 2019-10-29 | 裕策医疗器械江苏有限公司 | 实体瘤多基因检测基因芯片及其制备方法和检测装置 |
| WO2021190124A1 (zh) * | 2020-03-23 | 2021-09-30 | 南京梅傲红清生物科技有限公司 | 红细胞核酸在鉴定肿瘤的突变类型中的应用 |
-
2011
- 2011-07-29 CN CN2011102185780A patent/CN102251046A/zh active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107677820A (zh) * | 2016-08-02 | 2018-02-09 | 北京金沐医疗科技有限公司 | 一种检测肿瘤抗原的试剂盒及其检测方法 |
| CN107677823A (zh) * | 2016-08-02 | 2018-02-09 | 北京金沐医疗科技有限公司 | 一种用于检测肿瘤抗原的蛋白芯片试剂盒及其检测方法 |
| CN110387419A (zh) * | 2019-08-20 | 2019-10-29 | 裕策医疗器械江苏有限公司 | 实体瘤多基因检测基因芯片及其制备方法和检测装置 |
| CN110387419B (zh) * | 2019-08-20 | 2023-06-13 | 裕策医疗器械江苏有限公司 | 实体瘤多基因检测基因芯片及其制备方法和检测装置 |
| WO2021190124A1 (zh) * | 2020-03-23 | 2021-09-30 | 南京梅傲红清生物科技有限公司 | 红细胞核酸在鉴定肿瘤的突变类型中的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109468384B (zh) | 一种同时检测45个y基因座的复合扩增检测试剂盒 | |
| CN104024426B (zh) | Dna二代测序技术中待测样品的追踪方法及检测试剂盒 | |
| CN102618624A (zh) | 中国人群耳聋基因筛查用试剂盒及其使用方法 | |
| CN105296619A (zh) | 中国人群肥胖易感基因snp分型用试剂盒及其使用方法 | |
| CN103820559B (zh) | 21个短串联重复序列的复合扩增体系及试剂盒 | |
| CN102251046A (zh) | 一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法 | |
| CN109554448A (zh) | 一种人类红细胞血型***abo抗原的多重pcr-sbt基因分型方法及试剂 | |
| CN109517881A (zh) | 一种体液微量游离rna的高通量测序文库构建方法 | |
| CN109593847B (zh) | 检测微卫星nr24位点稳定性的引物对、试剂盒及方法 | |
| CN109321563A (zh) | 外泌体的制备及构建外泌体小rna文库的方法 | |
| US10323241B2 (en) | Method for recovering short-chain nucleic acids | |
| CN106497916A (zh) | 一种用于高通量测序检测的nk细胞多基因变异文库的构建方法及其应用 | |
| CN105132571A (zh) | 利用微滴式数字化pcr检测外周血游离线粒体dna含量的方法 | |
| CN110791813A (zh) | 对单链dna进行处理的方法及应用 | |
| CN107641649B (zh) | 检测微卫星nr27位点稳定性的引物对、试剂盒及方法 | |
| CN105238861A (zh) | 中国儿童哮喘易感基因snp分型用试剂盒及其使用方法 | |
| CN103757109B (zh) | 一种指导噻嗪类利尿药用药的引物组合物、多重基因检测试剂盒及其使用方法 | |
| CN108913774B (zh) | 一种c-KIT体细胞突变基因检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN117210612A (zh) | 一种检测呼吸道合胞病毒的探针和引物组合及其应用 | |
| CN109266653B (zh) | 一种耐药异质性循环肿瘤细胞捕获与基因分析的试剂、装置和方法 | |
| CN107988334B (zh) | 口腔拭子直接pcr进行snp分型的方法 | |
| CN103571959B (zh) | 用于检测基因位点突变的引物、探针、试剂盒 | |
| CN103131782B (zh) | 一种检测早期非小细胞肺癌多位点关联基因的试剂盒 | |
| CN110894550A (zh) | 鳗鲡疱疹病毒（hva）的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
| CN110551830B (zh) | 人y-str基因座荧光标记试剂盒及检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20111123 |