CN102250815A

CN102250815A - 一种内生多粘类芽孢杆菌

Info

Publication number: CN102250815A
Application number: CN 201110205215
Authority: CN
Inventors: 刘爱勤; 桑利伟; 谭乐和; 邬华松; 苟亚峰
Original assignee: Spice and Beverage Research Institute of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Spice and Beverage Research Institute of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2011-07-21
Filing date: 2011-07-21
Publication date: 2011-11-23
Anticipated expiration: 2031-07-21
Also published as: CN102250815B

Abstract

本发明涉及微生物领域，具体公开了一种内生多粘类芽孢杆菌。本发明所述内生多粘类芽孢杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4843。本发明所述内生多粘类芽孢杆菌传代至40代仍然具有较高抑制胡椒瘟病菌株孢子的活性，具有较高的遗传稳定性，同时其防治胡椒瘟病的效果达到化学防治的效果，且不污染环境，生态、安全，能够广泛应用在胡椒瘟病的防治以及制备防治胡椒瘟病制剂中。

Description

一种内生多粘类芽孢杆菌

技术领域

本发明涉及微生物领域，更具体的说是涉及一种内生多粘类芽孢杆菌。

背景技术

胡椒(Piper nigrum L.)是胡椒科胡椒属多年生常绿攀缘藤本植物，是世界重要的热带特色香辛料作物，为人们最常用、最喜爱的调味品之一，在食品、医疗保健等领域用途广泛。

胡椒瘟病是一种气候依赖性病害，常在雨季时发生，它是由疫霉菌感染而引起的一种传染力很强的土传性病害。自引种胡椒以来，胡椒瘟病就一直是危害我国胡椒生产的首要病害，病情严重时胡椒园损失达90％以上，甚至全园毁灭，给我国胡椒种植业带来不可估量的损失，为此我国对胡椒瘟病的防治技术进行了较为深入的研究。

目前，对胡椒瘟病的防治主要依赖化学防治技术，如喷施甲霜灵霜·霉威WP。虽然化学防治能够达到较好的防治效果，但长期使用化学农药不仅会产生农药残留，降低胡椒品质，而且还会随着化学农药的长期频繁使用引起胡椒瘟病病菌的抗药性，致使胡椒瘟病近年来有逐年加重之势。因此，有效、安全、生态地防治胡椒瘟病就成为胡椒种植业的首要目标。

生物防治是现阶段提出的一种防治胡椒瘟病的技术手段，它以胡椒瘟病菌株为指示菌，从土壤中中筛选出能够抑制胡椒瘟病菌株的微生物进行生物防治，这种方法有效避免了利用化学防治技术所带来的抗药性以及环境污染问题。然而，胡椒瘟病菌株的组成类群十分复杂，而现有筛选时以典型或单一的胡椒瘟病菌株为指示菌，故筛选出的微生物具有一定局限性，其防治效果远不如化学防治效果。此外，现有筛选出的微生物随着传代次数的增加，其对胡椒瘟病病菌孢子的抑制活性逐渐降低，遗传稳定性较差。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种内生多粘类芽孢杆菌，使得该菌株防治胡椒温病的效果与化学防治胡椒瘟病的效果无明显差别，且具有较高的遗传稳定性。

为实现上述目的，本发明提供一种从胡椒叶片中分离得到的内生菌，命名为菌株S，菌株S在PDA平板表面生长的菌落为圆形，表面中间突起，有光泽，并且生长物粘稠；革兰氏染色为阴性；芽孢染色为阳性，芽孢一般在菌体中间；荚膜染色为阳性(有荚膜形成)；鞭毛染色为阳性，鞭毛为两端生，运动能力不强；菌体形态为杆状，单生。接触酶、V.P.反应、淀粉水解、硝酸盐还原反应、明胶液化均为阳性。柠檬酸盐利用、脲酶试验、甲基红反应均为阴性。菌体在pH5.7的培养基上生长良好，不能在含有7％NaCl的培养基上生长。此外，经16S DNA检测分析，与菌株S同源性高的50个菌株均是类芽孢杆菌，同源性高达99％，结合生理生化特征，鉴定其为内生多粘类芽孢杆菌。

本发明所述内生多粘类芽孢杆菌已于2011年5月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.4843。

本发明所述内生多粘类芽孢杆菌传代培养的第1代、第10代、第20代、第30代、第40代对胡椒瘟病病菌孢子的抑制试验显示，所述内生多粘类芽孢杆菌从第1代至第40代抑制胡椒瘟病病菌孢子萌发的EC₅₀无显著差异，且均在5.13％以下，表明本发明所述内生多粘类芽孢杆菌具有较好的抑制效果，且遗传稳定性较高，不会随传代次数的增加而降低对胡椒瘟病病菌孢子的抑制活性。

本发明所述内生多粘类芽孢杆菌与甲霜灵霜·霉威WP对胡椒瘟病防效试验结果显示，两者的防效相当，无明显差异。表明本发明所述内生多粘类芽孢杆菌防效较高，达到化学防治的效果，能够应用在防治胡椒瘟病以及制备防治胡椒瘟病制剂中。

本发明还提供一种生防制剂，包括保藏编号为CGMCC No.4843的内生多粘类芽孢杆菌。本发明所述生防制剂可以在胡椒移栽前喷雾使用，也可以做成堆肥使用，或者稀释后在移栽时灌根使用。

本发明所述所述生防制剂的制备方法如下：

将保藏编号为CGMCC No.4843的内生多粘类芽孢杆菌于PDA培养液中培养，然后过滤并调节菌液孢子数为10⁸-10¹⁰个/mL，即得生防制剂成品。

其中，所述培养的温度优选为26-30℃，更优选为28℃，所述培养的天数优选为4-6d，更优选为5d。

由以上技术方案可知，本发明所述内生多粘类芽孢杆菌传代至40代仍然具有较高抑制胡椒瘟病菌株孢子的活性，具有较高的遗传稳定性，同时其防治胡椒瘟病的效果达到化学防治的效果，且不污染环境，生态、安全，能够广泛应用在胡椒瘟病的防治以及制备防治胡椒瘟病制剂中。

生物保藏说明

分类命名：多粘类芽孢杆菌，Paenibacillus polymyxa.于2011年5月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.4843。

具体实施方式

本发明公开了一种内生多粘类芽孢杆菌，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述内生多粘类芽孢杆菌已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：本发明所述内生多粘类芽孢杆菌的分离方法

从胡椒瘟病发病重区采回生长健康的叶片，用无菌手术刀切成约2cm×2cm规格的组织块，无菌水冲洗数次，在75％的酒精中浸泡1min，灭菌水冲洗3次，将组织块置于无菌研钵中，用剪刀剪碎后加无菌水研磨，静置30min，稀释成10^-1、10^-2、10^-33个梯度，分别移取最后1次冲洗液和研磨液各0.3mL，涂抹于PDA培养基平板上，最后1次冲洗液作为CK，于28℃下培养，逐日观察。选择CK中无菌落，而研磨液中长出菌落的菌株，并根据菌落形态、颜色等特征挑取单菌落，纯化编号后，在平皿内对峙培养检测其对胡椒瘟病病菌的抑制作用，选择形成抑菌带的菌株，命名为菌株S。

实施例2：本发明所述内生多粘类芽孢杆菌生理生化以及16S DNA序列的测定

1、生理生化检测

检测菌株S在PDA平板上的生长情况、菌落形态与颜色、革兰氏染色、芽孢染色和鞭毛染色等，方法参照方仲达主编的《植病研究方法》182页的方法进行。

检测菌株S的的生理生化特性，包括：石蕊牛奶、接触酶、V.P.反应、淀粉水解、硝酸盐还原反应、明胶液化反应、氧化酶、M.R、苯丙氨酸脱氨酶、柠檬酸盐利用、脲酶试验、丙酸盐的利用、是否可以在含7％NaCl和pH5.7的培养基上生长等试验，方法参照东秀珠、蔡妙英主编的《常见细菌***鉴定手册》353-385页的方法。

检测结果如下：

在PDA平板表面生长的菌落为圆形，表面中间突起，有光泽，并且生长物粘稠；革兰氏染色为阴性；芽孢染色为阳性，芽孢一般在菌体中间；荚膜染色为阳性(有荚膜形成)；鞭毛染色为阳性，鞭毛为两端生，运动能力不强；菌体形态为杆状，单生。接触酶、V.P.反应、淀粉水解、硝酸盐还原反应、明胶液化均为阳性。柠檬酸盐利用、脲酶试验、甲基红反应均为阴性。菌体在pH5.7的培养基上生长良好，不能在含有7％NaCl的培养基上生长。

2、16S DNA序列的测定

参照Ausubel的细菌基因组DNA制备方法，用细菌通用引物27F和1492R进行PCR扩增。

PCR反应体系为25μl，其中10×PCR Buffer 2.5μl，Primer27F和Primer1492R(25pmoL)各1μl，dNTP Mixture 0.5μl，Taq DNA Polymerase(5U/μl)0.5μl，ddH₂O 17.5μl，DNA模板2μl。

PCR扩增反应条件：95℃ 4min；95℃ 1min，55℃ 40s，72℃ 2min，共30个循环；然后72℃保持7min。PCR产物用EZ-10 SpinColum DNA GelExtraction Kit回收试剂盒进行回收，并委托宝生物工程(大连)有限公司进行测序。测得的基因序列用BLAST软件进行序列比对分析，并与GenBank中已知的16S rDNA进行同源性比较。

检测结果如下：

将该PCR扩增产物在GenBank中(登录号：JF747221)进行BLAST比对。结果表明，与S菌株同源性高的50个菌株均是类芽孢杆菌属(Paenibacillussp.)，其同源性达99％，其中表1所示为与菌株S的16S rDNA同源性最高的10个菌株，由此可推断菌株S属于类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)。

表1 16S rDNA同源性比较

序列登录号	菌株	同源性
			GQ849013.1	Paenibacillus polymyxa strain y-10	99％
GU328684.1	Paenibacillus sp.Nz29	99％
			EU362601.1	Paenibacillus polymyxa isolate TN61	99％
GU328691.1	Paenibacillus sp.Sx52	99％
			AB480885.1	Paenibacillus sp.Mis2	99％
AB247329.2	Paenibacillus sp.Mis2	99％
			GU328683.1	Paenibacillus sp.Nz28	99％
EU430119.1	Paenibacillus polymyxa strain YC0136	99％
			EF634024.1	Paenibacillus polymyxa strain ISSDS-851	99％
EF620468.1	Paenibacillus polymyxa strain ISSDS-792	99％

结合生理生化和16S rDNA检测结果，将菌株S鉴定为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa.)。

实施例3：本发明所述内生多粘类芽孢杆菌对胡椒瘟病病菌孢子萌发的抑制试验

将活化的本发明所述内生多粘类芽孢杆菌划线接种于PDA培养皿内，28℃培养，每隔24h转皿1次，共转40次。用悬滴法测定第1代、10代、20代、30代和40代的内生多粘类芽孢杆菌菌株对胡椒瘟病病菌孢子萌发的抑制效果，结果见表2。

表2 本发明所述内生多粘类芽孢杆菌对胡椒瘟病病菌孢子萌发的抑制试验

由表2结果可知，本发明所述内生多粘类芽孢杆菌从第1代到第40代的菌液抑制胡椒瘟病病菌孢子萌发的EC₅₀差异很小，表明本发明所述内生多粘类芽孢杆菌不会随传代次数的增加而降低对胡椒瘟病病菌孢子的抑制活性，具有较高的遗传稳定性。同时，本发明所述内生多粘类芽孢杆菌菌液抑制胡椒瘟病病菌孢子萌发的EC₅₀在5.13％以下，表明其具有良好的抑制孢子萌发效果。

实施例4：本发明所述内生多粘类芽孢杆菌对胡椒瘟病的防效试验

试验设3个处理：本发明所述内生多粘类芽孢杆菌菌液(孢子数为10⁸个/mL)的500倍稀释液；市售25％甲霜灵霜·霉威WP 1000倍稀释液；清水。

保护作用的测定：先在胡椒盆栽苗上喷洒3个处理的药液，整株均喷湿，以滴下药液为度。24h后在保湿条件下接种胡椒瘟病病原菌。每个处理3次重复，每重复10棵苗，每棵苗接种3片叶。5d后按表3分级标准进行病情调查。

治疗作用的测定：在保湿条件下接种胡椒瘟病病原菌，24h后在盆栽苗上喷施3个处理的药液，整株均喷湿，以滴下药液为度。每个处理3次重复，每重复10棵苗，每棵苗接种3片叶。5d后按表3分级标准进行病情调查。

表3 病情严重度分级标准

0级	无病斑
		1级	病斑面积占整片叶面积的1/8以下
3级	病斑面积占整片叶面积的1/8-1/4
		5级	病斑面积占整片叶面积的1/4-1/2
7级	病斑面积占整片叶面积的1/2以上

其中，病情指数＝∑(各级病叶数×该病级级值)/(调查叶总数×最高病级值)×100，防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％，将统计的保护作用以及治疗作用的防效用SAS软件进行方差分析，清水对照的防效以0记，结果分别见表4和表5。

表4 本发明所述内生多粘类芽孢杆菌保护作用的防效

表5 本发明所述内生多粘类芽孢杆菌治疗作用的防效

由表4和表5结果可知，本发明所述内生多粘类芽孢杆菌对胡椒瘟病保护作用的防效达80.64％，治疗作用的防效为78.54％，与用25％甲霜灵霜·霉威WP进行的化学防治效果相当，无明显差异。

实施例5：制备本发明所述生防制剂

将保藏编号为CGMCC No.4843的内生多粘类芽孢杆菌于PDA培养液中培养，培养温度为28℃，天数为5d，转速为200rpm，然后过滤并调节菌液孢子数为10⁹个/mL，即得生防制剂成品。

实施例6：制备本发明所述生防制剂

将保藏编号为CGMCC No.4843的内生多粘类芽孢杆菌于PDA培养液中培养，培养温度为30℃，天数为4d，转速为200rpm，然后过滤并调节菌液孢子数为10¹⁰个/mL，即得生防制剂成品。

实施例7：制备本发明所述生防制剂

将保藏编号为CGMCC No.4843的内生多粘类芽孢杆菌于PDA培养液中培养，培养温度为26℃，天数为6d，转速为200rpm，然后过滤并调节菌液孢子数为10⁸个/mL，即得生防制剂成品。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种内生多粘类芽孢杆菌，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.4843。

2.权利要求1所述内生多粘类芽孢杆菌在防治胡椒瘟病中的应用。

3.权利要求1所述内生多粘类芽孢杆菌在制备防治胡椒瘟病制剂中的应用。

4.一种生防制剂，其特征在于，包括保藏编号为CGMCC No.4843的内生多粘类芽孢杆菌。

5.权利要求4所述生防制剂在防治胡椒瘟病中的应用。

6.一种生防制剂的制备方法，其特征在于，将保藏编号为CGMCCNo.4843的内生多粘类芽孢杆菌于PDA培养液中培养，然后过滤并调节菌液孢子数为10⁸-10¹⁰个/mL，即得生防制剂成品。

7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述培养的温度为26-30℃。

8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述培养的温度为28℃。

9.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述培养的天数为4-6d。

10.根据权利要求9所述制备方法，其特征在于，所述培养的天数为5d。