CN102245196A

CN102245196A - 新型Na+/K+-ATP酶衍生肽作为新型SRC抑制剂和乌本苷拮抗剂以及它们的治疗作用

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Publication number: CN102245196A
Application number: CN2009801497362A
Authority: CN
Inventors: Z-J·谢; Z·李; J·I·沙皮罗
Original assignee: University of Toledo
Current assignee: University of Toledo
Priority date: 2008-12-12
Filing date: 2009-12-14
Publication date: 2011-11-16
Anticipated expiration: 2029-12-14
Also published as: US9226952B2; US20140187484A1; WO2010071767A2; US20110245167A1; WO2010071767A3; EP2361097A2; EP2361097A4; CN102245196B

Abstract

本发明公开了一种新型的Src抑制剂，其靶向Na/K-ATPase/Scr受体复合物并且拮抗乌本苷-诱导的蛋白质激酶级联及其用途。

Description

新型Na+/K+-ATP酶衍生肽作为新型SRC抑制剂和乌本苷拮抗剂以及它们的治疗作用

相关申请的交叉引用

本申请要求2008年12月12日提交的美国临时申请号61/122,205的权益，将其公开内容引入本文作为参考。

关于联邦政府资助的研究的申明

本发明由政府支持，具体为美国国家心脏、肺和血液研究所授予的美国国立卫生研究院(NIH)项目HL-36573和基础医学科学研究所授予的NIH项目GM-78565。美国政府在本发明中享有权利。

氨基酸肽的列表

该申请中包含一个氨基酸肽的列表，列表已通过EFS-web提交并且将其并入参考内容中。上述ASC II拷贝创建于2009年12月14日，命名为420_50445_SEQ_LIST_D2009-07.txt，文件大小为4kb。

本发明的技术领域和工业实用性

本项发明部分基于Na+/K+-ATP酶/SRC受体复合物的发现，在此基础上开发新的受体激动剂或拮抗剂。在许多疾病，包括癌症，组织纤维化，充血性心力衰竭和缺血再灌注损伤中，Na+/K+-ATP酶/SRC受体复合物的受体功能发生改变。

发明背景

Na+/K+-ATP酶广泛表达在绝大多数真核细胞中，通过泵出Na离子、泵入K离子来维持细胞膜内外的离子梯度(1)。结构上，此酶由两个非共价结合的α和β亚基组成。和其他P型ATP酶，包括胃H/K-ATP酶和肌浆网Ca-ATP酶(SERCA)一样，Na+/K+-ATP酶的α亚基含有10个跨膜区，并且N端和C端都位于细胞质侧(2，3)。基于已经发表的Na+/K+-ATP酶和SERCA的晶体结构可知，α亚基由以下几个已经确定的结构域组成：由N端和第二个胞浆区(CD2)链接的跨膜螺旋结构M2和M3组成的执行结构域(A)；和细胞质膜接近，高度保守且不连续的磷酸化结构域(P)；相对分开的核苷酸结合结构域(N)(4)。这些晶体结构同时显示，在离子泵运转周期，A结构域和N结构域有明显的运动，具体表现为在转运周期，A结构域旋转而N结构域关闭，以此打开(E1)和关闭(E2)A、P、N这三个结构域。有趣的是，研究表明这些结构域也参与了和其他蛋白搭档的相互作用，包括肌醇1，4，5-三磷酸(IP3)受体(IP3Rs)、磷酸肌醇3’激酶(PI3K)、磷脂酶C-γ(PLC-γ)、锚蛋白(ankyrin)和丝切蛋白(confilin)的相互作用(7-12)。

发明人和其他的研究人员已经报道过强心类固醇(CTS)，比如乌本苷(ouabain)作用于Na+/K+-ATP酶后能激活多个蛋白激酶级联反应(13，14)，而敲除Src蛋白能消除大部分激活反应(10，15，16)。Src作为Src非受体酪氨酸激酶家族的一员，在细胞外刺激(比如细胞因子、生长因子、应激反应)引起的信号转导中起到重要作用(17)，已经作为治疗某些癌症(18)和骨疾病(19)的有效靶标。已经报道过的内源性的Src抑制剂包括C端结构域Src激酶(CSK)，CSK同源性激酶(CHK)，Wiscott-Aldrich综合症蛋白(WASP)，RACK1和小窝蛋白(caveolin)(20-23)。

Na+/K+-ATP酶通过至少两个结合位点和Src蛋白直接相互作用：一个是α1亚基的CD2和Src的SH2；另一个是第三个胞浆区(CD3)和Src的激酶结构域。Na+/K+-ATP酶和Src的这种相互作用可以使Src维持在非活性状态。形成的Na+/K+-ATP酶和Src的复合物作为乌本苷的一个受体可以激发蛋白激酶级联反应。尤其是，乌本苷与Na+/K+-ATP酶的结合将破坏后一个结合位点的相互作用，从而造成不同通路的组装和激活，包括ERK级联反应，PLC/PKC通路和线粒体活性氧ROS的产生(24)。因此，Na+/K+-ATP酶可以作为一个内源性的负性Src蛋白调控子。这和在培养的细胞、α1杂合的小鼠组织中基础Src活性和Na+/K+-ATP酶α1亚基的表达量成反比的研究结果所一致(25，26)。相关资料可以参考同一发明人的待定专利申请PCT/US07/023011，存档于2007年10月17日(Pub.No.WO2808/054792，2008年5月8日)，申请从专利US Ser.No.60/855,482处获得优先权，将其内容引入本文做参考。

目前仍有需要研究Na+/K+-ATP酶和Src的相互作用的分子机制，在此基础上研究新的拮抗乌本苷诱导的信号转导的Src调节子。

此外，将新发现的Na+/K+-ATP酶和Src受体复合物作为靶标开发具有药用价值的化合物，包括新的受体激动剂激活受体复合物，可用于治疗缺血再灌注损伤，而受体拮抗剂即拮抗乌本苷的受体复合物激活作用，可以治疗组织纤维化，持续性心力衰竭和癌症。

这个方法可以普遍应用于相关蛋白家族成员的研究，可用来研究各相关蛋白感兴趣的功能结构域。对于相关蛋白的知识的了解可增加人们对各种生理病理过程的了解，比如细胞生长、死亡，恶性肿瘤，肾脏/心血管功能和免疫反应。

此方法可促进研究开发更有效果且低副作用的的治疗、诊断或是预防试剂。

根据此项发明，新的合成物和研究方法将做提供。

附图简述

图1A-1E：与Src相互作用的Na+/K+-ATP酶α1亚基的N结构域-N端的鉴定：

图1A：不同GST融合蛋白的图解。

图1B，1D：GST-ND、GST-CD3和GST-ND1、GST-ND1R、GST-ND2、GST-ND2R纯化蛋白的考马斯亮蓝染色图。

图1C，1E：GST-ND、GST-ND1和Src蛋白的结合。纯化的His-Src(200ng)和GST融合蛋白(5μg)共孵育于含0.5％Triton X-100的PBS溶液中30分钟后用同样的溶液洗三遍。三次独立实验的代表性的蛋白免疫印迹图显示下拉(pulldown)产物对抗his抗体的反应。

图2A-2D：ND1对Src的调控：

图2A：可溶性GST融合蛋白(100ng)和重组的Src(4.5U)在PBS中共孵育15分钟。在ATP/Mg2+的作用下，Src的活性用位点Y418的磷酸化显示。

图2B：GST-ND1对Src抑制作用的剂量依赖性。

图2C-2D：在LLC-PK1细胞中，YFP-ND1和其他的融合蛋白对Src的作用。细胞瞬时转染质粒pEYFP、pEYFP-ND1、pEYFP-ND和pEYFP-CD3质粒，24小时后，蛋白免疫印迹图显示为用抗pY418的抗体检测细胞裂解产物中的磷酸化Src。代表性的蛋白免疫印迹图和组合的数据来源于3-5次独立实验。**表示和对照组比较p＜0.01。

图3A-3B：在活细胞中YFP-ND1对Na+/K+-ATP酶/Src复合物的靶向作用：

图3A：在LLC-PK1细胞中YFP-ND1的定位。LLC-PK1细胞转染质粒pYFP-ND1后用聚焦显微镜检测YFP-ND1的定位。箭头表示YFP-ND1在胞浆膜上的位置。

图3B：用Na+/K+-ATP酶α1免疫沉淀转染细胞的裂解物，蛋白免疫印迹分析分别用抗GFP和抗Na+/K+-ATP酶α1的抗体。代表性的蛋白免疫印迹图来自三次独立实验。

图4A-4F：ND1衍生肽对Src活性的作用：

图4A：不同ND1衍生肽的序列：

肽1[SEQ ID NO：1]...MTVAHMWFDNQIHEADTTEN；

肽2[SEQ ID NO：2]...IHEADTTENQSGVSFDKTSA；

肽3[SEQ ID NO：3]...SATWLALSRIAGLCNRAVFQ；

肽4[SEQ ID NO：4]...ALSRIAGLCNRAVFQANQEN；

ND1[SE Q ID NO：5]...LTQNRMTVAHMWFDNQIHEADTTENQSGVSFDKTSATWLALSRIAGLCNRAVFQANQEN。

图4B：每个肽(1μM)和重组Src共孵育15分钟，然后检测pY418活性。

图4C：NaKtide(肽3)对Src抑制作用的剂量依赖。曲线由GraphPad软件分析拟合。

图4D：ATP浓度对NaKtide(肽3)的Src抑制作用的影响。NaKtide(肽3)(0.1μM)和Src共孵育15分钟，在不同浓度ATP/Mg2+的作用下检测pY418活性。

图4E：NaKtide(肽3)对Lyn激酶活性的作用。重组Lyn(100ng)和一定量得肽3共孵育15分钟，用蛋白免疫印迹检测pY396活性。曲线由GraphPad软件分析拟合。

图4F：NaKtide(肽3)对PKC激酶混合物活性的作用。数据统计至少三次试验，结果用平均值±SE表示。**表示和对照组比较p＜0.01。

图5A-5E：肽化合物的细胞通透性：

图5A：不同肽的序列信息：

pC1 [SEQ IDNO：6]...GRKKRRQRRRPPQMTVAHMWFDNQIHEADTTEN；

pNaKtide [SEQ ID NO：7]...GRKKRRQRRRPPQSATWLALSRIAGLCNRAVFQ；

AP-NaKtide [SEQ IDNO：8]...RQIKIWFQNRRMKWKKSATWLALSRIAGLCNRAVFQ；

A1N-NaKtide [SEQ IDNO：9]...KKGKKGKKSATWLALSRIAGLCNRAVFQ。

图5B：pNaKtide和对照pC1对Src抑制作用的剂量依赖。曲线由GraphPad软件分析拟合。

图5C，5D：LLC-PK1细胞对pNaKtide和AP-NaKtide的载量分析。细胞用无血清培养基饥饿12小时，37℃下分别加入1μMFITC-pNaKtide和FITC-AP-NaKtide作用60分钟。细胞用PBS洗两次后用聚焦显微镜进行图像分析。比例尺表示20μm。

图5E：A1N-NaKtide对Src的抑制作用。

图6A-6C：pNaKtide对Na+/K+-ATP酶/Src复合物的形成的影响：

图6A：用质粒EYFP-rat α1(黄色)和Src-ECFP(蓝绿色)共转染LLC-PK1细胞。按照以下描述进行荧光共振能量转移(FRET)分析。感兴趣的区域1(加框区域标记为ROI 1)进行光漂白后用FRET分析。同样方法对不进行光漂白的ROI 2区域进行分析。

图6B，6C：转染细胞经1μM pC1或是不同浓度的pNaKtide的1小时处理后进行相同的FRET分析。对平均FRET效率(图6B)和显示FRET效率(切除值4.0％)的细胞百分率(图6C)进行统计。在各个条件下进行三次实验至少20个细胞的测量。

图7A-7B：pNaKtide对Src和Src介导的信号通路的影响：

图7A：细胞用无血清培养基饥饿12小时后，用1μM pC1和pNaKtide分别作用1小时。细胞裂解物进行蛋白免疫印迹分析。进行3次实验，^＊和**分别表示跟对照组pC1比较p＜0.05和p＜0.01。

图7B：用1μM pC1和pNaKtide作用于SYF和SYF+Src细胞系。细胞裂解物进行蛋白免疫印迹分析。进行3次实验，^＊表示和对照组pC1比较p＜0.05。

图8A-8C：pNaKtide对乌本苷诱导的信号转导作用的影响：

图8A，8B：用1μM肽预先处理LLC-PK1(图8A)和原代培养的心肌细胞(图8B)1小时后，分别加上100nM(LLC-PK1)和100μM(心肌细胞)乌本苷进行作用。细胞裂解物进行蛋白免疫印迹分析。进行3次实验，**表示和对照组肽比较p＜0.01。

图8C：用1μM肽或是PP2预先作用原代培养的心肌细胞30分钟后，再加上20ng/ml IGF-1作用5分钟。进行3次实验，**表示p＜0.01。

图9：表1列出了ND1、NaKtide、pNaKtide和PP2对Src的作用。

图10A-10D：Na+/K+-ATP酶含量和Src活性之间的关系：

图10A：不同细胞系中Na+/K+-ATP酶α1的表达水平。将细胞密度达到95％的各种细胞收获后使用抗Na+/K+-ATP酶抗体对细胞裂解物进行蛋白免疫印迹分析。

图10B：小鼠肝脏中Na+/K+-ATP酶基因敲低后对Src活性的作用。用蛋白免疫印迹分析来源于野生型(WT)和Na+/K+-ATP酶基因敲低小鼠的肝脏样本。样本数为6，**表示p＜0.01。

图10C，10D：不同细胞密度下Na+/K+-ATP酶表达量的变化。用蛋白免疫印迹分析指定细胞密度下的LLC-PK1和DU145细胞的裂解物中Na+/K+-ATP酶α1，pY418和Src的表达。

图11A-11C：pNaKtide对Src和Src介导的信号转导的调控：

图11A：pNaKtide对基础FAK和ERK磷酸化的调节。TCN23-19用无血清培养基饥饿12小时后，用1μM pNaKtide作用指定时间。蛋白免疫印迹分别用抗pFAK576/7和抗磷酸化ERK抗体分析FAK和ERK的磷酸化。

图11B：在不同细胞系中pNaKtide对Src的作用。1μM pNaKtide作用于培养的LLC-PK1，LNCaP和DU145细胞1小时，用冰冷的甲醇固定细胞后用抗Na+/K+-ATP酶α1和pY418抗体进行免疫染色。

图11C：在DU145细胞中pNaKtide对Src和Src介导的信号转导的调节作用。蛋白免疫印迹用抗pY418、磷酸化ERK、pFAK576/7和c-Myc抗体分析对应蛋白。膜strip后用抗Src，ERK和FAK重新孵育再检测相应蛋白表达。

图12：pNaKtide对***癌细胞迁移性的作用。融合的单层DU145细胞进行划痕处理，在24小时后检测含有或不含有pNaKtide的条件下划痕的闭合情况。

图13A-13B：过度表达ND1对癌细胞生存率的影响。在LipfectAMINE2000作用下用重组质粒YFP和YFP-ND1转染DU145细胞(图13A)或是MCF-7细胞(图13B)。在转染后指定的时间拍摄细胞的荧光和相差图像，并用软件SPOT Version 4.6(诊断仪器)进行图像融合。小框区域放大后显示在底部右侧方框。原始放大率为400倍。实验至少重复3次。

图14A-14D：pNaKtide对不同癌细胞生存率的影响。实验次数为4，^＊表示p＜0.05；**表示p＜0.01：

图14A：pNaKtide对***癌细胞LNCaP、DU145和PC-3生存率抑制作用的浓度依赖曲线。

图14B：pNaKtide对DU145细胞生存率抑制作用的时间依赖性。

图14C，14D：对神经瘤细胞(图14C)和乳腺细胞(图14D)生存率抑制作用的剂量依赖性。

图15A-15D：pNaKtide对DU145细胞异种移植肿瘤的生长的作用。将5×10⁶个DU145细胞皮下注射到NOD/SCID小鼠的侧面。用卡尺测量肿瘤的长(L)和宽(W)，肿瘤体积(V)＝(L×W²)/2。当肿瘤体积达到100mm³时，用不同浓度的pNaKtide对小鼠进行腹腔注射，对照组为生理盐水。

图15A：pNaKtide对DU145细胞在NOD/SCID小鼠肿瘤发生率的影响作用。在第44天时处死小鼠，将肿瘤摘除并称重。^＊表示p＜0.05；**表示p＜0.01。

图15B：小鼠对移植肿瘤的耐受性。箭头代表肿瘤部位。

图15C：注射生理盐水或是pNaKtide后对DU145细胞异种移植所形成肿瘤的生长状况的影响。

图15D：pNaKtide对异种移植肿瘤内Src活性的抑制作用。将移植的肿瘤摘除称重后，肿瘤匀浆用蛋白免疫印迹进行分析。**表示p＜0.01。

图16A-16D：pNaKtide对血管生成的作用。^＊表示p＜0.05；**表示p＜0.01：

图16A：pNaKtide对内皮细胞增殖的抑制作用。将人的脐静脉内皮细胞(HUVVEC)和动脉内皮细胞(HAEC)接种于12孔板中，用指定浓度的pNaKtide作用72小时后，用血细胞计数仪计数细胞数。

图16B：用***固定，石蜡包埋移植肿瘤后，对CD31进行免疫组化染色。

图16C：pNaKtide对肿瘤血管密度的作用。血管密度用血管对肿瘤面积的占有率计算。

图16D：用生理盐水或是pNaKtide作用后移植肿瘤匀浆中VEGF的表达量。蛋白免疫印迹分析肿瘤匀浆液，检测抗体为抗VEGF抗体。

发明的详细描述

在本申请的附件中，引用了各种出版物，专利和专利的说明书作为参考。这些出版物，专利和专利的说明书作为本专利的附件更详细地描述了此项发明的属性。

此项发明联合应用了分子生物，微生物和重组DNA等技术。这些技术在将在以下文献中详细阐述。如下：

Sambrook等，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1989)”(分子克隆：实验室指南)；

“Current Protocols in Molecular Biology”卷1-3[Ausubel，R.M.，等(1994)](现代分子生物学技术)；

“Cell Biology：A Laboratory Handbook”卷1-3[J.E.，等(1994)](细胞生物学：实验室手册)；

“Current Protocols in Immunology”卷1-3[Coligan，J.E.，等(1994)](现代免疫学)

“Oligonucleotide Synthesis”[M.J.Gait.，等(1984)](寡核苷酸合成)

“Nucleic Acid Hybridization”[B.D.Hames&S.J.Higgins等(1985)](寡核苷酸合成)

“Transcription And Translation”[B.D.Hames&S.J.Higgins等(1984)](转录和翻译)

“Animal Cell Culture”[R.I.Freshney等(1986)](动物细胞的培养)

“Immobilized Cells And Enzymes”[IRL Press(1986)](细胞和酶的固定)

“A Practical Guide To Molecular Cloning””[B.Perbal(1984)](分子克隆实验技术指南)

除非特殊说明，本发明所用的条款，注释和科学术语都可理解为本技术领域一般通用的含义。在某些情况下，为了更清晰的理解或是作为参考，会定义一些通用的条款，当然这并没有本质上改变之前的通用含义。当操作过程涉及到试剂盒或是试剂时，除非有特殊说明，都遵照产品的说明和参数进行实验。

本发明基于或是部分基于发明人发现的Na+/K+-ATP酶能结合Src并抑制Src。发明人在本发明中更深入的揭示了Na+/K+-ATP酶调节Src信号转导的分子机制。

一方面，本发明叙述了一个新型的肽类Src抑制剂。此肽来源于Na+/K+-ATP酶α1亚基，能靶向作用于Na+/K+-ATP酶/Src受体复合物，并能在培养的细胞中拮抗乌本苷诱导的蛋白激酶级联反应。

本发明也基于或是部分基于发明人的发现：Na+/K+-ATP酶的核苷酸结合结构域的N端能和Src的激酶结构域结合从而抑制Src。发明人进一步发现并鉴定了一个由20个氨基酸组成的肽(NaKtide)可以作为Src的有效抑制剂(IC₅₀＝70nM)。与小分子Src抑制剂比如PP2不同，NaKtide不是ATP的类似物，代表了一类新型的Src抑制剂。而且，它不和丝氨酸/苏氨酸家族的PKC和ERK直接作用；它也能抑制Lyn和其他的一些Src家族酪氨酸激酶，只是效能比较低(IC₅₀＝2.5μM)。

本发明也基于或是部分基于发明人发现含多个正电荷氨基酸引导肽的复合物，比如HIV-Tat-NaKtide(pNaKtide)，α1N端-NaKtide(A1N-NaKtide)比较容易进入培养的细胞中。

本发明也基于或是部分基于发明人发现对pNaKtide进行功能研究时，它能特异性作用于Na+/K+-ATP酶结合的Src，并能在培养细胞中作为高效的乌本苷拮抗剂。

本发明也基于或是部分基于发明人发现对AP-NaKtide进行功能研究时，它能特异性靶向细胞内囊泡，在培养的细胞中可作为一个高效的Src抑制剂和乌本苷拮抗剂。

本发明也基于或是部分基于发明人发现对NaKtide进行功能研究时，用去污剂或是HIV-Tat-SS-NaKtide(ssNaKtide)将可溶性NaKtide装载到细胞时，能产生显著的Src活性抑制和乌本苷拮抗作用。

本发明也基于或是部分基于发明人发现对A1N-NaKtide进行功能研究时，它能特异性进入细胞内区室，强效抑制Src和拮抗乌本苷的作用。

跟PP2不同，pNaKtide主要存定位于细胞质膜上。因此，相比于PP2，pNaKtide对基础Src的活性影响比较小。AP-NaKtide和A1N-NaKtide主要定位于囊泡，它对基础Src的活性影响也比较小。相反，ssNaKtide和PP2一样，能对基础Src的活性产生显著影响。

pNaKtide能有效的破坏Na+/K+-ATP酶/Src受体复合物的形成，并且具有剂量依赖性。在细胞中，pNaKtide能进一步地阻断乌本苷引起的Src激活及其下游信号通路，比如ERK1/2。

跟PP2不同，在心肌细胞中pNaKtide对IGF诱导的ERK激活不产生影响。因此，本发明是关于将pNaKtide作为乌本苷的拮抗剂的使用。

另一方面，本发明揭示了可以使用pNaKtide作为探针，检测基于发明人发现的Na+/K+-ATP酶和CTS的信号功能所引起的生理和病理意义。

本发明也基于或是部分基于发明人发现在某些癌细胞中，Na+/K+-ATP酶的表达量比较低，而同时，Src具有较高活性。

本发明也基于或是部分基于发明人发现在癌细胞中pNaKtide和AP-NaKtide能模拟Na+/K+-ATP酶从而抑制Src和FAK。

本发明也基于或是部分基于发明人发现pNaKtide和AP-NaKtide能够有效抑制癌细胞的迁移。

本发明也基于或是部分基于发明人发现pNaKtide能够抑制内皮细胞增殖并能抑制肿瘤发生。

本发明也基于或是部分基于发明人发现YFP-ND1的表达能够抑制Src，而且添加pNaKtide或是AP-NaKtide能够抑制某些癌细胞的生长和引起癌细胞的死亡。

本发明也基于或是部分基于发明人发现在NOD/SCID小鼠中，pNaKtide能后有效阻断异种移植的***癌细胞的生长。

另一方面，本发明发现了一种能够抑制Src或是拮抗CTS诱导的信号转导的方法，即给予有效剂量的源于Na+/K+-ATP酶的肽或是生物活性多肽化合物。

另一方面，本发明发现了一种能有效抑制Src的非ATP类似物的化合物，它不直接作用于丝氨酸和苏氨酸的PKC和ERK家族，但是它能抑制Src家族酪氨酸激酶的Lyn。此化合物为来源于Na+/K+-ATP酶的肽或是生物活性多肽化合物。

另一方面，本发明发现一些含多个正电荷氨基酸引导肽的结合能增加NaKtide的细胞通透性。

另一方面，本发明提供了一种能将NaKtide特异性靶向到不同细胞区室的方法，从而达到细胞区室Src的特异性抑制。例如以下的结合：HIV-Tat-NaKtide靶向到细胞膜；Penetratin-NaKtide(AP-NaKtide)和Na+/K+-ATP酶α1亚基-N端-NaKtide(A1N-NaKtide)靶向到囊泡；HIV-Tat-S-S-NaKtide(ss NaKtide)靶向到细胞胞浆。

另一方面，本发明提供了一种在细胞中能特异性靶向作用于Na+/K+-ATP酶结合的Src，并能产生强大的乌本苷拮抗作用的方法，即给予有效剂量的pNaKtide。

另一方面，本发明提供了一种在细胞中能特异性靶向囊泡中的Src，从而抑制Src活性，并能产生强大的乌本苷拮抗作用的方法，即给予有效剂量的AP-pNaKtide或是A1N-NaKtide。

另一方面，本发明提供了一种能靶向整个细胞的Src，从而强效抑制Src活性，并能产生强大的乌本苷拮抗作用的方法，即给予有效剂量的ssNaKtide。

另一方面，本发明提供了一种具有剂量依赖性的破坏Na+/K+-ATP酶/Src受体复合物的方法，即给予有效剂量的一种或是多种源于Na+/K+-ATP酶的肽或是生物活性的多肽。

另一方面，本发明提供了一种能阻断乌本苷对Src的激活及其下游信号通路，比如ERK1/2的方法，即给予有效剂量的一种或是多种从Na+/K+-ATP酶的肽或是生物活性的多肽。

另一方面，本发明发现运用一种或是多种从Na+/K+-ATP酶或是生物活性片段衍生的肽化合物可以作为乌本苷的拮抗剂。

另一方面，本发明提供了一种用Na+/K+-ATP酶或是生物活性片段衍生的肽作为探针，检测基于发明者发现的Na+/K+-ATP酶和CTS的信号功能所引起的生理或是病理变化。

另一方面，本发明提供了一种能靶向细胞胞浆膜上Na+/K+-ATP酶/Src复合物的组分，来源于SEQ ID NO：1-5的肽或是生物活性片段。

另一方面，本发明提供了一种能在多种细胞中选择性靶向Na+/K+-ATP酶和Src结合池的组分，它可作为乌本苷的拮抗剂。此组分来源于Na+/K+-ATP酶的肽或是生物活性的多肽。

另一方面，本发明提供了一种能特异性靶向Src的Src抑制剂，并且它对PKC激酶家族不产生作用。此抑制剂由一种或是多种肽化合物(ND1，NaKtide，pNaKtide，A1N-NaKtide，AP-NaKtide，ssNaKtide)及生物活性的多肽组成。

另一方面，本发明提供了一种特异性的乌本苷拮抗剂，它属于Na+/K+-ATP酶衍生的肽或是生物活性的多肽，并于含多个正电荷氨基酸引导肽结合。其包括将HIV-Tat、Penetratin、Na+/K+-ATP酶α1亚基N端肽或是其他的正离子引导肽连接到NaKtide上。

另一方面，本发明提供了一种能检测Na+/K+-ATP酶和内源性CTS的生理或是病理意义的方法。即使用一种或是多种从Na+/K+-ATP酶衍生的肽或是生物活性多肽。

另一方面，本发明提供了一种新的能治疗Na+/K+-ATP酶/Src复合物过度刺激所引起的心血管疾病的成分，即一种或是多种从Na+/K+-ATP酶衍生的肽或是生物活性多肽。

另一方面，本发明提供了一种能够抑制细胞生长的方法，即给予有效治疗剂量的Src抑制剂或是CTS拮抗剂。

另一方面，本发明提供了一种能够抑制CTS激发的信号通路的组分，即一种或是多种从Na+/K+-ATP酶酶衍生的肽或是生物活性多肽。

另一方面，本文提供了一种在所需受试者心脏中能有效抑制乌本苷引起的信号转导通路的方法，该方法包括施用有效剂量的一种或多种Na+/K+-ATP酶衍生肽或者相关有生物活性的多肽。

另一方面，本文提供了如何将一种或多种Na+/K+-ATP酶衍生肽或者相关有生物活性的多肽应用于制备肿瘤和心脏相关疾病的治疗药物。

另一方面，本文提供了药物成份，其包括一种或多种Na+/K+-ATP酶衍生肽或者相关有生物活性的多肽，以及生理可接受的药物载体。

在某些具体实例中，该成份可用于治疗心肌肥大、组织纤维化以及充血性心力衰竭。

在某些具体实例中，该成份可用作化疗药物。

在某些具体实例中，该成份可用于***相关疾病。

在某些具体实例中，该成份可应用于治疗以下一种或多种肿瘤相关疾病例，如***癌、乳腺腺癌以及成神经细胞瘤。

另一方面，本文提供了一种鉴定候选化合物是否可用于治疗以下一种或多种疾病例如心肌肥大、组织纤维化、充血性心力衰竭和肿瘤的方法。该方法包括：提供一种检测方法以检测Na+/K+-ATP酶和Src的相互作用，该相互作用可以抑制Src活性；用该检测方法测试某种测试化合物；鉴定该测试化合物是非ATP竞争性的Src抑制剂和CTS拮抗剂。如果该测试化合物可显著抑制某种疾病则该化合物可作为治疗该疾病的候选化合物。

另一方面，本文提供了一种鉴定候选化合物是否可用于治疗以下一种或多种疾病例如心肌肥大、组织纤维化、充血性心力衰竭和肿瘤的方法。该方法包括：提供一种疾病模型；将测试化合物用于该模型；在样本中检测以下水平：i)一种或多种Na+/K+-ATP酶衍生肽或者有生物活性的多肽以及活化的Src，ii)Na+/K+-ATP酶或者CTS的结合；并且将多肽和活化Src的水平与参照组比较。如果相对于参照组测试化合物能够引起多肽水平的显著改变则该化合物可作为治疗该疾病的候选化合物。

另一方面，本文提供了一种诊断受试者是否罹患以下一种或多种疾病例如心肌肥大、组织纤维化、充血性心力衰竭和肿瘤的方法。该方法包括：提供来自受试者的样本；在样本中检测以下水平：i)一种或多种Na+/K+-ATP酶衍生肽或者有生物活性的多肽以及活化的Src，ii)Na+/K+-ATP酶或者CTS的结合；将这些参数与参照组比较。如果相对于参照组在受试者体内多肽水平的显著改变，则表示受试者罹患上疾病的风险较高。

另一方面，本文提供了一种评估以下一种或多种疾病的治疗措施例如心肌肥大、组织纤维化、充血性心力衰竭和肿瘤的方法。该方法包括：提供来自受试者的样本；在样本中检测以下水平：i)一种或多种Na+/K+-ATP酶衍生肽或者有生物活性的多肽以及活化的Src，ii)Na+/K+-ATP酶或者CTS的结合；施用不同剂量的某种治疗措施，并且将多肽和活化Src的水平与参照组比较。如果相对于一个未受上述疾病影响的个体以及参照组，多肽水平显著改变，则表示该治疗措施是有效的。

在某些具体实例中，参照组是施予某种治疗措施前的多肽水平。

在某些具体实例中，样本来自受试者的心脏组织或肿瘤细胞。

另一方面，本文提供了一种检测受试者发生以下一种或多种并发症例如心肌肥大，组织纤维化，充血性心力衰竭和肿瘤的风险。该方法包括：提供来自受试者的样本；在样本中检测以下水平：i)一种或多种Na+/K+-ATP酶衍生肽或者有生物活性的多肽以及活化的Src，ii)Na+/K+-ATP酶或者CTS的结合；并且将多肽水平与参照组比较。如果相对于参照组，多肽水平显著变化则表示该受试者发生并发症的风险较高。

另一方面，本文提供了一种决定何时给予患一有种或多种以下疾病例如心肌肥大，组织纤维化，充血性心力衰竭和肿瘤的受试者治疗的方法。该方法包括：提供来自受试者的样本；在样本中检测以下水平：i)一种或多种Na+/K+-ATP酶衍生肽或者有生物活性的多肽以及活化的Src，ii)Na+/K+-ATP酶或者CTS的结合；并且将该水平与参照组比较。如果相对于参照组，多肽水平显著变化则表示需对该受试者给予治疗。

在某些具体实例中，参照组为未受影响个体的Na+/K+-ATP酶衍生肽或者Na+/K+-ATP酶或者CTS结合的水平。

另一方面，本文提供了一种防治乌本苷受体介导的病症的方法，其包括使用一种或多种Na+/K+-ATP酶衍生肽或者有生物活性的多肽，以及相关激活剂或拮抗剂。

在某些具体实例中，病症是指以下一种或多种疾病，例如肿瘤、心肌肥大、组织纤维化、充血性心力衰竭。

另一方面，本文提供了一种方法用以鉴定以下一种或多种情况：i)能调整乌本苷受体、Na+/K+-ATP酶受体以及Na+/K+-ATP酶/Src受体复合物的物质，ii)由乌本苷受体、Na+/K+-ATP酶受体以及Na+/K+-ATP酶/Src受体复合物介导的过程，iii)乌本苷受体、Na+/K+-ATP酶受体以及Na+/K+-ATP酶/Src受体复合物的降解，iv)由乌本苷受体、Na+/K+-ATP酶受体介导的信号转导途径，v)由乌本苷受体、Na+/K+-ATP酶受体以及Na+/K+-ATP酶/Src受体复合物介导的情况，vi)甾体类受体的交互激活，乌本苷受体的抑制或激活，Na+/K+-ATP酶受体以及Na+/K+-ATP酶/Src受体复合物的相互作用，包括某种物质是否抑制或激活乌本苷受体、Na+/K+-ATP酶受体以及Na+/K+-ATP酶/Src受体复合物的检测方法。

另一方面，本文提供了一种方法以评估某种物质，该方法包括：将该物质与一种或多种Na+/K+-ATP酶衍生肽或者相关有生物活性的多肽以及受体反应，在该情况下多肽与受体将结合形成复合物；将结果与不含该物质的对照组比较以决定该物质是否激活或者抑制多肽与受体的结合。

一种商业性开发新药的方法，包括：a)用此处提及的一种或几种方法鉴别某种物质；b)对步骤a)中所述的新化合物或其衍生化合物进行疗效、毒性等药物特性的分析；c)对步骤b)中研发的化合物进行药物剂型的开发以用于临床治疗。

在某些具体实例中，受体是乌本苷受体、Na+/K+-ATP酶受体以及Na+/K+-ATP酶/Src受体复合物。

在某些具体实例中，多肽的一部分包含与乌本苷受体结合的结构域，此结构域也是与Src的激酶结构域结合的Na+/K+-ATP酶核苷酸结合结构域的N端。

另一方面，本文提供了一种在受试者体内调控Na+/K+-ATP酶/Src受体复合物的方法，包括抑制或刺激一种或多种Na+/K+-ATP酶衍生肽或者相关有生物活性的多肽的表达；或者抑制或激活上述物质与受体的相互作用。

另一方面，本文提供了一种鉴定受试者是否具有以下一种或多种病理状态例如心肌肥大，组织纤维化，充血性心力衰竭和肿瘤的方法，包括检测受试者样本中一种或多种Na+/K+-ATP酶衍生肽是否改变，或者Na+/K+-ATP酶和乌本苷的结合是否改变，或相关者有生物活性的多肽是否改变。

在某些具体实例中，此方法包括：收集来自于受试者的样品；测定样品中一种或多种肽的水平；并且将样品的多肽水平和未罹患肿瘤和心脏疾病的受试对象的样品进行比较。

在某些具体实例中，如果和未患疾病的受试者样品比较，受试对象的多肽水平显著降低，则提示该对象有较高危险性患上该疾病。

另一方面，本文提供了一系列由上述方法鉴定的制剂、化合物和物质。这些制剂，化合物和物质在治疗和预防由甾体类受体介导的病理状态，特别是乌本苷受体介导的病理状态是十分有效的。

另一方面，本文提供了对特异性针对Na+/K+-ATP酶衍生肽或者相关有生物活性的多肽的抗体。

另一方面，本文提供了标记有探测物质的抗体，该抗体可用于在生物样品、组织和细胞中检测Na+/K+-ATP酶衍生的蛋白质或者复合物，或者相关有生物活性的多肽。

另一方面，本文提供了有治疗应用价值的抗体。该抗体还可制成免疫辅剂和免疫毒素，作为多种有治疗效果的制剂的靶向选择载体，这些制剂包括化疗药物、毒素、免疫反应调节剂、酶和放射性同位素。

另一方面，本文提供了一种可施予受试者的用于预防或治疗由甾体类受体介导的病理情况的药物成份，该成份包括由上述方法鉴定的有效剂量的一种或多种Na+/K+-ATP酶衍生肽、相关的有生物活性的多肽、相关的激活物和拮抗物、药剂、化合物和物质，以及可药用的载体，稀释剂和辅料。

另一方面，本文提供了一种能应用于心脏疾病或者肿瘤患者的药物成份，该成份包括有效剂量的一种或多种Na+/K+-ATP酶衍生肽或者相关的有生物活性的多肽，以及可药用的盐类。

另一方面，本文提供了一种药物成份，该成份包括有效剂量的一种或多种Na+/K+-ATP酶衍生肽或者相关的有生物活性的多肽、相关的激活物和拮抗物，以及合适的载体、稀释剂和辅料。

另一方面，本文提供了一种能施予受试者的用于预防或治疗由甾体类受体介导的，尤其是由乌本苷受体介的病理状态的药物成份，以及合适的载体、稀释剂和者辅料。

另一方面，本文提供了Na+/K+-ATP酶衍生肽或者相关的有生物活性的多肽、相关的激活物和拮抗物在药物制造和药物制备的用途。

另一方面，本文提供了能抑制乌本苷介导的信号转导途径的物质，包括一种或多种多肽和相关复合物。在某些具体实例中，该复合物能有效穿透细胞。

在无数实例中，本发明或是一个氨基酸肽，该肽包含至少10个连续的氨基酸残基，其序列为SATWLALSRIAGLCNRAVFQ[SEO IDNO：3]；或是在该多肽基础上保守的替代一个或多个氨基酸残基；或是在该多肽基础上以非自然氨基酸替代因而改善其药物动力和药物代谢；这些多肽都可以结合Src的激酶结构域。

此发明包括一系列治疗所允许的辅料。在某些具体实例中，氨基酸多肽包括以下序列：SATWLALSRIAGLCNRAVFQ[SEO IDNO：3]。

在其他情况下，氨基酸多肽序列可从以下成份选择：SEQ IDNO：3；SEQ ID NO：4；和SEQ ID NO：5。

在某些具体实例中，氨基酸多肽包括SEQ ID NO：7。在另一些情况下，氨基酸多肽包括SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9。

此发明包括编码以上成份的核苷酸序列。

此发明包括含上述核苷酸序列的质粒。在某些具体实例中，质粒包括pEYFP。

此发明包括表达有上述质粒的细胞。在某些具体实例中，细胞是E.coli。在某些具体实例中，细胞可为哺乳动物细胞。在某些具体实例中，细胞可为肿瘤细胞。

另一方面，本文提供了一个对上述肽特异的单克隆抗体。在某些具体实例中，这个单克隆抗体可进一步包含一种可探测的标记物如放射信标记物、化学标记物、荧光标记物、抗体或蛋白。

此发明包括能影响细胞内过程的成份，所述细胞内过程包括：拮抗CTS介导的蛋白激酶级联反应；上调CTS介导的蛋白激酶级联反应；抑制Src；激活Src；模拟Na+/K+-ATP酶；Na+/K+-ATP酶竞争性抑制剂；抑制Lyn；激活Lyn；拮抗乌本苷；激活乌本苷；激活ERK1/2；抑制ERK1/2；膜对钠离子的通透性；膜对钾离子的通透性。在某些具体实例中，该成份是非A T P类似物。

此发明包括可用于治疗的穿透细胞膜的方法。

此发明包括至少一种的额外治疗成份用以治疗如下疾病：肿瘤；血管疾病；心血管疾病；心脏病；***癌；乳腺癌；成神经细胞瘤；心肌肥大；组织纤维化；充血性心力衰竭；缺血/再灌注损伤。

在某些具体实例中，成份包括第二个可与氨基酸多肽结合在非SEQ ID NO：3区域的化合物，例如：化疗药物；毒素；免疫反应调节物；酶；放射性同位素。

在某些具体实例中，成份包括第二个可与氨基酸多肽结合在非SEQ ID NO：3区域的化合物，例如：HIV-Tat；Penetratin；HIV-Tat-S-S；GST。

在某些具体实例中，包括HIV-Tat-SEQ ID NO：3。

在某些具体实例中，包括融合蛋白，如果该融合蛋白没有破坏至少10个连续的来自SEQ ID NO：3的残基。在某些具体实例中，融合蛋白是GST融合蛋白。

另一方面，本文提供了一种在表达Src的细胞内使化合物结合到Src激酶结构域的方法，该方法包括将上述化合物结合到至少一种表达Src的细胞。在某些具体实例中，表达Src的细胞是哺乳动物细胞。

在某些具体实例中，哺乳动物细胞可为如下细胞类型：心脏细胞；肝细胞；血管细胞；乳腺细胞；***细胞；肾细胞；肌肉细胞；血细胞；脑细胞。在某些具体实例中，哺乳细胞是在体外培养的。在某些具体实例中，哺乳细胞是一种动物模型。在某些具体实例中，哺乳细胞是人体。

另一方面，本文提供了一种可治疗哺乳动物Src相关疾病的方法，包括施予上述治疗成份。在某些具体实例中，Src相关疾病包括：肿瘤；血管疾病；心血管疾病；心脏病；***癌；乳腺癌；成神经细胞瘤；心肌肥大；组织纤维化；充血性心力衰竭；缺血/再灌注损伤。在某些具体实例中，哺乳动物是人体。在某些具体实例中，治疗成份包括一种具有以下序列的氨基酸多肽：SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：8；和SEQ ID NO：9。

另一方面，本文提供了一种治疗哺乳动物肿瘤的方法，包括施予上述具有抑制Src作用的治疗成份。

另一方面，本文提供了一种治疗哺乳动物血管疾病的方法，包括施予上述具有抑制Src作用的治疗成份。

另一方面，本文提供了一种治疗哺乳动物心血管疾病的方法，包括施予上述具有抑制Src作用的治疗成份。

另一方面，本文提供了一种治疗哺乳动物心脏病的方法，包括施予上述具有抑制Src作用的治疗成份。

另一方面，本文提供了一种治疗哺乳动物***癌的方法，包括施予上述具有抑制Src作用的治疗成份。

另一方面，本文提供了一种治疗哺乳动物乳腺癌的方法，包括施予上述具有抑制Src作用的治疗成份。

另一方面，本文提供了一种治疗哺乳动物成神经细胞瘤的方法，包括施予上述具有抑制Src作用的治疗成份。

另一方面，本文提供了一种治疗哺乳动物心肌肥大的方法，包括施予上述具有抑制Src作用的治疗成份。

另一方面，本文提供了一种治疗哺乳动物组织纤维化的方法，包括施予上述具有抑制Src作用的治疗成份。

另一方面，本文提供了一种治疗哺乳动物充血性心力衰竭的方法，包括施予上述具有抑制Src作用的治疗成份。

另一方面，本文提供了一种治疗哺乳动物缺血再灌注损伤的方法，包括施予上述具有抑制Src作用的治疗成份。

另一方面，本文提供了一种在肿瘤细胞中降低已升高的Src基础活性的方法，包括向表达Src的肿瘤细胞施予上述具有抑制Src作用的成份。

另一方面，本文提供了在肿瘤细胞中抑制FAK的方法，包括向表达Src的肿瘤细胞施予上述具有抑制Src作用的成份。在某些具体实例中，表达Src的细胞是TCN23-19细胞。

另一方面，本文提供了在肿瘤细胞实验模型中降低肿瘤细胞迁移的方法，包括向表达Src的肿瘤细胞施予上述具有抑制Src作用的成份。

另一方面，本文提供了当Na+/K+-ATP酶表达量下降时可以消灭肿瘤细胞的方法，包括向表达Src并且其Na+/K+-ATP酶表达量下降的肿瘤细胞施予上述具有抑制Src作用的成份。

另一方面，本文提供了在肿瘤细胞中抑制细胞生长的方法，包括向表达Src的肿瘤细胞施予上述具有抑制Src作用的成份。

另一方面，本文提供了一种方法，可进一步比较上述成份和测试化合物在同种肿瘤细胞中抑制细胞生长的作用。

另一方面，本文提供了一种在***癌细胞中抑制***癌细胞生长的方法，包括向表达Src的***癌细胞使用上述具有抑制Src作用的成份。

另一方面，本文提供了一种方法，可进一步比较上述成份和测试化合物在同种***癌细胞中抑制***癌细胞生长的作用。

另一方面，本文提供了一种在乳腺癌细胞中抑制乳腺癌细胞生长的方法，包括向表达Src的乳腺癌细胞施予上述具有抑制Src作用的成份。

在某些具体实例中，此方法可进一步比较上述能抑制***癌细胞生长的成份与测试化合物在同种乳腺癌细胞中抑制乳腺癌细胞生长的作用。

另一方面，本文提供了一种在成神经细胞瘤细胞中抑制成神经细胞瘤细胞生长的方法，包括在表达Src的成神经细胞瘤细胞内施予上述具有抑制Src作用的成份。

在某些情况下，此方法可进一步比较上述能抑制***癌细胞生长的成份与测试化合物在同种成神经细胞瘤细胞中抑制成神经细胞瘤细胞生长的作用。

另一方面，本文提供了可以筛选至少一种影响Src活性的测试成分的方法，包括：引进一种含SATWLALSRIAGLCNRAVFQ[SEO IDNO：3]序列的经修饰的氨基酸多肽，该修饰包括至少一个保守氨基酸的替代；并且测试这个测试成分是否影响Src活性。

在某些具体实例中，影响活性体现在如下方面：Src结合；Src抑制；Src激活；Src功能；Lyn结合；Lyn功能；Lyn抑制；乌本苷拮抗；Na+/K+-ATP酶功能；ERK1/2功能；FAK抑制。

在某些具体实例中，该方法包括引进一个已完成离体实验的测试成分。

在某些具体实例中，该方法包括引进一个已至少完成一种哺乳动物细胞实验的测试成分。

在某些具体实例中，该方法包括引进一个已至少完成一种肿瘤细胞实验的测试成分。

在某些具体实例中，该方法包括以相对于对照组该成分是否影响细胞生长来决定该成分是否影响Src。

在某些具体实例中，该方法包括以相对于对照组该成分是否影响细胞迁移来决定该成分是否影响Src。

在某些具体实例中，至少一种的哺乳动物细胞是一种动物模型。在某些具体实例中，该动物模型是NOD/SCID小鼠。在某些具体实例中，以相对于对照组该成分是否影响肿瘤生长来决定该成分是否影响Src。在某些具体实例中，至少一种的哺乳动物细胞是人类。

在某些具体实例中，该方法包括以相对于对照组该成分是否影响肿瘤生长来决定该成分是否影响Src。

本发明将以以下实施例作进一步的阐释。在实施例中，除非另行说明，all parts and percentages are by weight，温度是摄氏单位。可以想见，这些实施例仅是本发明的一些特殊实例，仅作参考。通过以上讨论和实施例，聪明之人可以确定此发明的重要独到之处，并且在未偏离主旨和相关权限的前提下，对此发明做各种变化和调整以使其适用于更广泛的用途和情况。凡本文所引用的所有发表物，包括专利和非专利文献，均在引用文献部分注解。如权利要求书所述，除非另行说明，以下实施例旨在阐释本发明的一些具体实例，并不代表本发明的应用仅局限于此。

实施例一

材料

最高纯度的化学品和细胞培养基购自Sigma(St.Louis，MO)。Src抑制剂PP2、非特异性PKC抑制剂星形孢菌素购自Calbiochem(San Diego，CA)。以下抗体均购自Santa Cruz Biotechnology(SantaCruz，CA)：抗Src多克隆抗体(B12)、抗E R K多克隆抗体、抗磷酸化E R K单克隆抗体、抗CD31多克隆抗体、羊抗兔和羊抗小鼠二级抗体。抗His单克隆购自GE HealthCare(Buckinghamshire，England)。多克隆抗体抗磷酸化Akt(丝氨酸473)、抗磷酸化FAK(576/7)、抗Akt和抗FAK均购自Cell Signaling Technology(Danvers，MA)。抗VEGF多克隆抗体和抗α1单克隆抗体(α6f)分别购自Abcam(Cambridge，MA)和University of Iowa the Developmental StudiesHybridoma Bank(Iowa City，IA)。为纯化GST融合蛋白和His标记蛋白，谷胱甘肽珠购自Amersham Bioscience(Uppsala，Sweden)，ProBound纯化***购自Invitrogen(Carlsbad，CA)。用于激酶活性测定的于Sf9昆虫细胞表达的重组人类Src和Lyn蛋白，和在Escherichia Coli表达的IGF-1蛋白购自Upstate Biotechnology(LakePlacid，NY)。pEYFP-C1质粒购自Clontech(Palo Alto，CA)。pGEX-4T-1和pTrc-HisA质粒购自Invitrogen。用于蛋白质印迹分析的Optitran硝化纤维素膜购自Schleicher and Schuell(Dassel，Germany)。所有合成多肽为95％以上纯度。多肽成分和纯度由高效液相层析质谱仪进一步确定。

质粒构建

进行表达GST融合蛋白的质粒制备(24)。表达GST-CD3(氨基酸残基350-785)、GST-ND(氨基酸残基379-594)、GST-ND2(氨基酸残基379-475)、GST-ND2R(氨基酸残基476-594)、GST-ND1(氨基酸残基379-435)和GST-ND1R(氨基酸残基436-594)的质粒是以猪肾Na+/K+-ATP酶α1亚基序列为基础构建的。His-标记的质粒是先在GST-Src质粒切取相应Src cDNA(27)然后***pTrc-HisA质粒。pEYFP-ND1、pEYFP-ND和pEYFP-CD3是将相应GST质粒上的cDNA克隆入pEYFP-C1质粒。所有质粒由DNA测序确定。

细胞制备、培养和瞬时转染

猪肾近端LLC-PK1、小鼠成纤维细胞SYF和SYF+Src细胞购自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)并培养在含有10％肽牛血清(FBA)和青霉素(100U/ml)/链霉素(100gg/ml)的DMEM培养基中。Na+/K+-ATP酶α1敲减细胞PY-17和TCN23-19由LLC-PK1构建(25)。进行实验前，LLC-PK1、PY-17和TCN23-19均用血清饥饿24小时，SYF和SYF+Src细胞培养在含有0.5％肽牛血清的培养基中24小时。所有成神经细胞瘤细胞、乳腺癌细胞、大肠癌细胞和***癌细胞购自美国典型培养物保藏中心并按照说明培养。瞬时转染按照LipofectAMINE2000(Invitrogen)说明书进行。所有实验在转染后24小时进行。

制备原代新生大鼠心肌细胞按照之前所述(28)。心肌细胞取自1至2天大的Sprague-Dawley大鼠心室，后将心室组织在37℃下用0.04％胶原酶II(Worthington)和0.05％胰酶(Sigma)消化。为去除非心肌细胞，可在37℃下将细胞提前接种1.5小时。心肌细胞以8＊102细胞/mm²的密度接种在100-mm Corning细胞培养皿，并在37℃下培养在含有10％肽牛血清的DMEM-M199(4∶1)培养基中24小时，然后用无血清饥饿48小时再进行实验。所有大鼠实验均按照由theInstitutional Animal Care and Use Committee制定的程序和准则进行。

制备Src、Na+/K+-ATP酶、GST融合蛋白和His标记蛋白

从sf-9细胞纯化出没有前85个氨基酸残基的Src(27)并用于最初的结合实验以确保Src结合Na+/K+-ATP酶。在Src磷酸化测定实验中，所用纯化重组的全长Src来自Upstate Biotechnology。使用Jorgensen方法从猪肾外髓质纯化Na+/K+-ATP酶并使用具有1200到1400μmol Pi/mg/h的比活性的制备物。将GST融合蛋白和His标记蛋白表达于Escherichia Coli BL21(Invitrogen)中，并且用谷胱甘肽珠或者ProBond纯化***(Invitrogen)纯化。可溶性GST融合蛋白用洗脱缓冲液[10mM还原谷胱甘肽珠、0.1％TritonX-100、50mMTris-HCl(pH8.0)]洗脱，然后在含0.1％TritonX-100、50mMTris-HCl(pH8.0)的缓冲液中透析以除去多余谷胱甘肽珠。

体外GST下拉

GST下拉实验按如下过程进行：室温下5μg GST融合蛋白与谷胱甘肽珠结合并且和100ng纯化His-Src在含有0.5％TritonX-100的500μl PBS中温育30分钟。谷胱甘肽珠用相同的缓冲液洗涤4次。结合的His-Src在10％SDS-PAGE分离并通过蛋白质印迹法以抗-His抗体检测。

Src和Lyn激酶活性

为测定源于Na+/K+-ATP酶的构建体或者多肽如何影响Src、Lyn激酶活性，在37℃下将纯化Src(4.5U)或Lyn(20ng)与不同量的纯化GST融合Na+/K+-ATP酶构建体或者多肽在磷酸缓冲盐水(PBS)中于温育30分钟。之后，加入2mM ATP/Mg2+并继续在37℃下温育5分钟。该反应通过加入SDS样品缓冲液终止。然后，通过抗pY418抗体测量Src pY418和Lyn pY396以指示Src/Lyn活性。为测定在TCN23-19细胞和原代新生大鼠心肌细胞中Src活性，细胞以含有1％Nonidet P40、0.25％脱氧胆酸钠、150mM氯化钠、1mM EDTA、1mM苯甲基磺硫化氟、1mM钒酸钠、1mM氟化钠、10μg/ml抑肽酶、10μg/ml亮肽素和50mM Tris-HCl(pH7.4)的冰冷RIPA缓冲液裂解。细胞裂解液在16,000Xg离心15分钟以得到澄清液。上清液以SDS-PAGE分离(60u g/泳道)并且转移到Optitran膜上，然后用抗pY418抗体检测。pY418信号用增强化学发光试剂盒(Pierce)检测并且用Bio-RadGS-670成像密度计定量(29)。

PKC激酶活性

PKC活性用PepTag磷酸化非放射性实验测定(Promega)。简而言之，在30℃下40ng PKC在含有5μl反应缓冲液、5μl PepTagC1(0.4μg/μl)、5μl PKC激活溶液、1μl多肽保护性溶液和10μM星形孢菌素以及多肽的反应混合物中温育30分钟。反应混合物在100V下0.8％琼脂糖胶中电泳20分钟。电泳后，带负电的磷酸化PepTagC1多肽移向正极，未磷酸化PepTagC1多肽移向负极。磷酸化PepTagC1多肽的比例是PKC活性的指标。

免疫印迹分析

在相应给药后，用冰冷的PBS洗涤细胞。细胞洗涤后溶解在冰冷的RIPA缓冲液中，并用抗-磷酸化Akt抗体(丝氨酸473)、抗-磷酸化MAPK抗体、抗磷酸化FAK抗体进行蛋白质印记分析。相同的膜剥除后再以抗Akt、抗MAPK、抗FAK抗体重新孵育分析。

共焦荧光显微成像分析

将培养在盖玻片上的细胞进行指定的药物处理。细胞用PBS洗涤两遍后用在-20□C预冷的甲醇固定15分钟。然后将固定的细胞用PBS洗涤三次并在室温下用200μl Image-iT FX信号增强剂封闭30分钟。再次洗涤细胞并用含有1％牛血清白蛋白的PBS中的抗pY418抗体在室温下温育1小时。用PBS洗涤三次后，细胞用Alexa Fluor缀合的抗-兔二级抗体(Invitrogen)温育。使用Leica DMIRE2共焦显微镜(Leica，Mannheim，Germany)进行图像显示。Leica共焦软件用于数据分析。

pNaKtide在活细胞中的分布测定

在37℃下将培养在盖玻片上的细胞用FITC-PNaKtide进行相应处理。用PBS洗涤细胞两次，并用Olympus荧光显微镜观测FITC荧光以检测pNaKtide在细胞中的亚分布。

细胞活性测定

当细胞密度达到60％左右后，以不同多肽浓度处理细胞不同时间。将细胞消化后，向细胞悬液中加入台酚蓝并在室温下反应5分钟。用细胞计数板计数活细胞数目。

伤口愈合分析

将DU145细胞接种于六孔板中，用含10％胎牛血清的培养液进行培养。细胞单层长满后，使用塑料加样枪尖划过细胞层造成伤口以引起伤口诱导的细胞迁移。细胞在含有不同浓度的pNaKtide或不含pNaKtide的培养液中的愈合情况用倒置相差显微镜(10×物镜倍数)观察至24小时。

在NOD/SCID小鼠身上引入DU145异种移植肿瘤

NOD/SCID小鼠于无菌层流房中饲养，照明及黑灯时间各为12小时，饲以高压灭菌的标准食物及水。分别于4-6周龄的母NOD/SCID小鼠身体两侧皮下接种5×106DU145细胞。肿瘤的体积通过用卡尺测量长度(L)和宽度(w)进行估计。V＝(L×W²)/2。当肿瘤体积达到100mm³时开始pNaKtide治疗。在靠近肿瘤部位的皮下注射溶于生理盐水中的pNaKtide，注射剂量为2mg/kg和10mg/kg体重，隔日一次，共注射一周。所有在NOD/SCID小鼠身上进行的研究均遵照托莱多大学生命科学校区动物研究委员会批准的程序及指南进行。

数据分析

数据以均值±标准误表示。采用student’s t检验进行统计分析。p＜0.05认为有统计学意义。

结果

ND1是Na+/K+-ATP酶α1亚单位中与Src相互作用的区域。

CD3与Src相互作用并抑制Src的活性(24)。如图1所示，Na+/K+-ATP酶CD3区域包含P和N结构域。Na+/K+-ATP酶的三维结构显示，N区域是暴露的，而P区域相对距离细胞膜更近(3，5，6)。因此，发明者认为N区域是Na+/K+-ATP酶与Src激酶区域相互作用的区域。为验证这一点，发明者构建了GST-ND，并检测其是否与纯化的His-Src结合。GST-CD3作为阳性对照，而纯化的GST则作为阴性对照。下拉实验证实α1亚单位的N结构域的确是与Src相互作用的区域。

如图1A所示，N结构域含有超过200个氨基酸残基。为进一步确定N结构域中与Src结合的位点，发明者构建了如图1A所示的ND2和ND2残基(ND2R)GST融合蛋白。GST下拉实验显示GST-ND2，而不是GST-ND2R与Src结合(图1E)。

对ND2进一步的结构分析显示，ND2的N末端是高度无结构的，可以经受诱导适应(30)。此外，这一区域也是高度暴露的，对和ATP结合相对不重要，进而对Na+/K+-ATP酶的催化作用也相对不重要。因此，为了验证ND的N末端是否与Src相互作用，发明者构建了另两个GST融合蛋白(ND1和ND1R)，并通过GST下拉实验评价了它们与Src的结合。如图1E所示，ND1，而不是ND1R，可与Src相互作用。

作为潜在的Src抑制剂，ND1在培养的细胞中靶向作用于Na+/K+-ATP酶/Src复合体。

为了验证ND1是否可以像CD3那样抑制Src，发明者在试管中将Src和100ng可溶的GST融合蛋白共孵育，并通过蛋白免疫印迹法检测Src pY418的水平。GST-CD3在实验中用作阳性对照，GST-ND也同时进行了检测。

如图2A所示，GST-ND1和GST-ND在抑制Src活性上显示了与阳性对照同样的效果。而且，ND1对Src的抑制效应呈剂量依赖性(IC₅₀＝50nM)(图2B)。为进一步验证ND1是否可以作为微小基因的产物在活细胞中抑制Src，发明者在用不同YFP表达载体转染的LLC-PK1细胞中检测了Src pY418水平的变化。YFP-ND1，YFP-ND和YFP-CD3的表达，而不是YFP本身，降低了细胞裂解液中Src的活性(图2C，2D)。

这些示例证明了ND1在活细胞中作为Src抑制剂的有效性。为进一步检测ND1是否可作用于细胞质膜表面的Na+/K+-ATP酶/Src复合体，发明者进行了下述三套实验。

首先，如图3A所示，YFP-ND1是作为可溶性蛋白表达的。但是，发明者确在靠近细胞质膜的位置检测到YFP-ND1的存在。其次，为了检测这些YFP-ND1是否与Src相互作用，发明者在LLC-PK1细胞上进行了YFP-ND1和Src-CFP的共转染，并进行FRET分析。在共转染的细胞中可检测到显著的FRET(13.4±2.4％)，显示YFP-ND1与胞膜的Src-CFP可能是相连的。最后，当用抗α1抗体免疫沉淀细胞裂解液后，发明者发现YFP-ND1一起共沉降了(图3B)。这些结果显示，YFP-ND1非常有可能与Na+/K+-ATP酶/Src复合体相互作用。

NaKtide作为Src的特异抑制剂。

由于上述结果显示，ND1结合并抑制Src的活性，发明者合成了4个覆盖整个ND1区域的含20个氨基酸残基的多肽，并检测哪一个可以像ND1一样抑制Src(图4A)。

基于Na+/K+-ATP酶的晶体结构(6)，多肽1和2是无结构的，而多肽3和4可以形成α螺旋。如图4B显示，1uM的多肽3可以引起几乎100％的Src抑制，而多肽4只引起部分抑制。另一方面，多肽1和2则完全没有作用。剂量-效应曲线显示，与GST-ND1相比，多肽3可以非常有效的抑制Src，其IC₅₀约为70nM(图4C)。多肽1无作用。由于多肽3来自于Na+/K+-ATP酶，发明者将其命名为NaKtide。由于多肽1对Src无作用，被用作对照。发明者将其命名为“C1”。

为检测NaKtide是否像合成的Src抑制剂PP2那样作为ATP类似物发挥作用，发明者检测了其在不同浓度ATP水平下对Src的作用。如图4D所示，ATP浓度从0.1mM到2mM的变化均不影响NaKtide对Src的抑制。

为检测NaKtide对Src的相对特异性，发明者检测了它对Src家族另一激酶Lyn的剂量依赖效应。如图4E显示，NaKtide对Lyn有剂量依赖性抑制效应。但是，其IC₅₀为2.5uM，比其抑制Src的IC₅₀高40倍。

为检测NaKtide是否可影响丝/苏氨酸激酶，发明者将PKC激酶家族混合物和NaKtide及C1共孵育，并检测其活性。如图4F所示，与星孢菌素(一个PKC家族激酶的非特异抑制剂)不同，NaKtide和C1的浓度即使达到10uM，也无明显效果。

建立可通透细胞的NaKtide作为乌本苷的拮抗剂。

近来研究显示，将生物分子和各种带正电荷的细胞穿透性多肽结合起来，可以使它们更易被培养的哺乳动物细胞及组织摄取(32，33)。基于此，发明者合成了HIV-Tat-NaKtide(pNaKtide)(见图5A)。

HIV-Tat-P1(pC1)同时合成以作为对照。通过仔细查看Na+/K+-ATP酶α1的序列，发明者发现N端的一个多碱性氨基酸片段可能能够帮助NaKtide的透膜。发明者于是合成了Na+/K+-ATP酶α1N末端-NaKtide(A1N-NaKtide)。为了比较，发明者还合成了Penetratin-NaKtide(AP-NaKtide)。体外激酶测定显示，NaKtide是很强的Src抑制剂，而作为对照的pC1是无作用的(图5B)。有趣的是，加上HIV-Tat增加了NaKtide的能力(肽3)。IC₅₀从70nM降到5nM。对AP-NaKtide和A1N-NaKtide也是如此(图5E)。

为评价细胞通透性，pNaKtide和AP-NaKtide均用FITC标记。如图5c所示，激光共聚焦活细胞图像分析显示，pNaKtide，而不是NaKtide，具有细胞通透性。几乎所有培养的LLC-PK1细胞在和1uMpNaKtide孵育30-60分钟后观察到了荧光。与YFP-ND1不同，pNaKtide主要停留在细胞质膜上，部分分布到细胞内的膜结构中。另一方面，当用同样的实验来评价AP-NaKtide时，绝大部分AP-NaKtide存在于细胞内的囊泡中。与pNaKtide不同，极少数AP-NaKtide可在胞膜上检测到(图5D)。因此，不同的tag可能导致NaKtide在细胞内不同的分布。

为检验pNaKtide作为潜在的乌本苷拮抗剂的有效性，发明者采用FRET分析评估pNaKtide对Na+/K+-ATP酶/Src复合体形成的影响。LLC-PK1细胞共转染了YFP-α1和Src-CFP后，再暴露于不同浓度的pNaKtide。发明者专注于pNaKtide，是因为这一结合体主要驻留在细胞膜上，而这正是Na+/K+-ATP酶/Src复合体所在地。

如图6A所示，YFP-α1和Src-CFP均作用在细胞膜上。此外，在对照组的LLC-PK1细胞中，可以观察到明显的FRET。加入pNaKtide，可呈剂量依赖性抑制总体FRET有效性(图6B)以及检测到FRET有效性的细胞百分比(图6C)，提示pNaKtide和YFD-ND1一样，可与胞膜的Src相互作用，阻止稳定的Na+/K+-ATP酶/Src复合体的形成。因为pNaKtide浓度从100nM到1uM均有显著效果，所以在下述的三个系列实验中，选择了1uM的浓度来检测pNaKtide作为乌本苷拮抗剂的有效性和特异性。

首先，为检测pNaKtide对基础Src和ERK1/2活性的影响，发明者将LLC-PK1细胞及Na+/K+-ATP酶敲除的TCN23-19细胞暴露于1uM pC1或pNaKtide不同时间后，采用蛋白免疫印迹法检测Src和ERK1/2活性。TCN23-19细胞来自于LLC-PK1细胞(25)。在这些细胞中敲除Na+/K+-ATP酶减少了与Src结合的Na+/K+-ATP酶池，从而增加了基础Src和ERK1/2的活性(25)。如图7A所示，pNaKtide引起了LLC-PK1细胞中Src活性10％的抑制。但是这一抑制并未达成统计学差异(P＝0.07)。另一方面，pNaKtide显著抑制了LLC-PK1细胞中ERK1/2的基础活性(超过20％)，这可以用ERK1/2是Src下游的效应者来解释。有趣的是，pNaKtide对LLC-PK1细胞Src和ERK1/2活性的影响远远小于对TCN23-19细胞(图7A)，提示pNaKtide可能更选择性的作用于与Na+/K+-ATP酶相互作用的Src。

为明确pNaKtide对ERK1/2的作用是由于抑制了Src，发明者在SYF+Src和SYF细胞中重复了上述实验。如图7B所示，pNaKtide对敲除了Src激酶家族(Src，Yes和Fyn)的SYF细胞中的ERK1/2没有作用。但是，pNaKtide可降低Src挽救的SYF细胞中ERK1/2的活性。

为了检测是否由于pNaKtide主要驻留在细胞膜而使它成为与Na+/K+-ATP酶结合的Src的相对特异的抑制剂，发明者在皂甙存在的情况下用NaKtide刺激LLC-PK1细胞。如图9-表1所示，NaKtide，像YFP-ND 1的表达一样，在皂甙存在的情况下引起了超过50％的基础Src活性的抑制。有趣的是，当检测AP-NaKtide对基础Src活性的影响时，像pNaKtide一样，它几乎不影响LLC-PK1细胞基础Src的活性。

第二步，发明者测定了pNaKtide对乌本苷诱导的LLC-PK1细胞中ERK1/2活化的影响。1uM pNaKtide完全阻断了乌本苷诱导的LLC-PK1细胞中ERK1/2的活化(图8A)。为了证实这不是细胞特异性的反应，发明者在培养的原代心肌细胞中重复了上述实验。如图8B所示，乌本苷诱导的ERK1/2的活化同样被阻断了。

发明者还比较了pNaKtide和PP2(合成的Src抑制剂)。如图9-表1所示，pNaKtide和PP2有着相似的抑制Src的IC₅₀。但是，在LLC-PK1和心肌细胞中，PP2对基础Src活性的抑制较pNaKtide更强。当用IGF刺激心肌细胞时，PP2，而不是pNaKtide，引起了显著的ERK1/2的活化抑制(图8C)。

Na+/K+-ATP酶α1在一些肿瘤细胞系中表达减少。

由于许多肿瘤中Src的活性都增高，发明者对这种增高是否与α1表达减少有关进行了检测。蛋白免疫印迹法证实，一些***癌细胞系(如DU145和PC-3细胞系)，乳腺癌细胞系(MCF-7)，及所有检测的成神经细胞瘤细胞中α1表达确实减少(图10A)。Na+/K+-ATP酶α1免疫染色也支持这一发现(图11B)。如果在体内敲除Na+/K+-ATP酶α1，可以在多种组织中，包括肝脏中增加基础Src的活性(图10B)。发明者还发现，当LLC-PK1细胞密度从50％增到90％时，α1的表达增加了一倍有余，而Src的活化降低了80％多(图10C)。但是，这种调控在DU145细胞中消失了，很明显是因为α1和Src表达的缺陷(图10D)。当在LNCaP和PC3细胞中重复同样的实验时，我们观察到了一样的缺陷(数据未给出)。

pNaKtide抑制FAK，减少细胞迁移。

因为Src可影响FAK，而后者是调控细胞迁移和肿瘤转移的关键激酶，发明者检测了pNaKtide是否可抑制FAK及肿瘤细胞的迁移。如图11A所示，pNaKtide在TCN23-19细胞中引起了时间依赖性的FAK和ERK的抑制，而FAK的活化是由于Na+/K+-ATP酶敲除激活Src所致(25)。当在DU145细胞中评价pNaKtide的效应时，Src的活化在LNCaP和DU145细胞中因pNaKtide明显降低，但在LLC-PK1细胞中则不(图11B)。当用蛋白免疫印迹法检测DU145细胞裂解液时，发明者发现pNaKtide不但呈剂量依赖性抑制Src的活性，而且还可抑制Src的效应者，阻断Src调控的原癌基因-c-Myc的表达(图11C)。此外，发明者还发现，pNaKtide可呈剂量依赖性抑制DU145的迁移(图12)。

ND1的表达足以杀死Na+/K+-ATP酶表达减少的肿瘤细胞。

一些肿瘤细胞Na+/K+-ATP酶表达减少，表现出更高的Src活性。发明者检测了抑制Src的Na+/K+-ATP酶结构域(ND1)的表达是否可抑制细胞生长。如图13A和13B所示，YFP-ND1的表达引起了DU145和MCF-7细胞的生长抑制或死亡。

pNaKtide可有效抑制一些肿瘤细胞系的细胞生长。

发明者检测了pNaKtide是否可用来抑制肿瘤的生长。如图14所示，pNaKtide可有效阻断一些肿瘤细胞系，包括***癌，乳腺癌和成神经细胞瘤的生长。

pNaKtide可有效抑制体内肿瘤的生长。

发明者进一步检测了pNaKtide在NOD/SCID鼠中抑制肿瘤生长的作用。如图15A和15B所示，给有异种移植的***癌的NOD/SCID鼠注射pNaKtide，pNaKtide对肿瘤的发生率及肿瘤重量呈现剂量依赖性的抑制。对肿瘤体积的测定确证了pNaKtide抑制肿瘤发生的效应发生很快并呈剂量依赖性(图15C)。每公斤体重给予10mgpNaKtide可引起肿瘤体积和实际重量超过75％的减少。而且很明显，给予pNaKtide后，肿瘤的Src活性显著降低。

pNaKtide抑制血管生成。

内皮细胞增生是血管生成的前提。如图16A所示，pNaKtide呈剂量依赖性抑制HUVEC和HAEC的增殖。此外，通过CD31染色显示的血管密度在肿瘤对照鼠中为10％，而pNaKtide治疗将其减少到2.5％(图16C和16D)。pNaKtide治疗使肿瘤匀浆中血管生长因子VEGF水平降低(图16D)。

讨论

发明者在这里展示了一个可与Src结合并抑制其活性的Na+/K+-ATP酶α1亚单位的分子结构。同时，他们还合成了一个新的多肽Src抑制剂，可作用于Na+/K+-ATP酶/Src复合体，从而可在培养细胞中用作有效的乌本苷拮抗剂。

确立NaKtide为一类新的Src抑制剂。

Na+/K+-ATP酶α1亚单位的CD3同时包含N和P结构域。发明者展示了CD3可在体外与Src激酶结合并抑制其活性(24)。基于这些新发布的Na+/K+-ATP酶的晶体结构，N结构域是暴露的，而P结构域相对更靠近细胞膜。(3，5，6)

发明者证明N结构域与Src结合并抑制其活性。有趣的是，众所周知，结构性稍差的SERCA的N结构域与受磷蛋白结合。发明者证实ND1，α1结构域的前50个氨基酸残基，可抑制Src。但是，进一步的绘图分析显示ND1的相应受磷蛋白结合区域(多肽2，见图4A)实际上对Src激酶的活性无影响。

多肽3和多肽4均显示了对Src很强的抑制作用。基于晶体结构及NMR的数据，两种多肽均有螺旋结构，提示ND1和Src激酶之间螺旋/螺旋的相互作用可能与Na+/K+-ATP酶引起的Src抑制有关。文献复习显示一些内源性蛋白结合并抑制Src。其中值得关注的是RACK1和WASP。RACK1通过与SH2结构域结合抑制Src(34)，WASP则通过与Src的激酶结构域结合发挥抑制作用。但是没有详细的结构信息供进一步的相互比较。

像其它酪氨酸激酶抑制剂一样，大多数Src的抑制剂是ATP的类似物(35)。当检测ATP的依赖性时，发明者发现改变ATP的浓度并不影响NaKtide引起的Src抑制。而且，由于这个多肽并不含有酪氨酸残基，因此，它不是以Src抑制剂底物的方式发挥作用的(36)。此外，有限的结构分析显示NaKtide与N叶作用，而不是与有底物结合区域的激酶结构域的C叶反应(Li和Xie，未发表)。因此，NaKtide代表了一类新的Src抑制剂。

NaKtide和ND1都是很强的Src抑制剂，IC₅₀接近50nM，可与已报道的大多数Src抑制剂媲美。当检测NaKtide对其它激酶的作用时，发明者发现NaKtide对Src更特异。NaKtide对PKC激酶家族无作用。它对ERK1/2的作用依赖于Src的表达，提示它不是一个ERK抑制剂，而是通过抑制Src影响ERK的信号。这与已知的ERK1/2是Src激酶的效应者一致。有趣的是，虽然NaKtide抑制Lyn，另一个Src家族的激酶，但其能力远低于对Src的作用(图4E)。

pNaKtide作为特异的乌本苷拮抗剂。

瞬时转染显示YFP-ND1以一种可溶性蛋白的形式存在，并像PP2一样有效地抑制基础Src活性(图3A和图9-表1)。而且，一小部分YFP-ND1可在细胞膜内检测到。FRET和免疫沉淀均显示这部分驻留于膜上的YFP-ND1剥夺了Na+/K+-ATP酶和Src之间的结合(图3B和6A)。汇总到一起，这些发现展示了ND1和其衍生物NaKtide依靠其细胞内的分布可用作有效的Src抑制剂或相对特异的乌本苷拮抗剂。

实验证据支持，当发明者通过皂甙将NaKtide引入LLC-PK1细胞中，可像PP2或YFP-ND1的表达一样，抑制约60％的基础Src活性。而且，通过用一个带正电的多肽，如HIV-Tat标记NaKtide，可以使它获得细胞通透性。共聚焦图像分析显示大部分pNaKtide驻留在细胞膜上，而且对LLC-PK1细胞和心肌细胞的基础Src活性无太大作用。有趣的是，当将pNaKtide作用于TCN23-19细胞(与Na+/K+-ATP酶结合的Src被敲除)时，与在LLC-PK1细胞中观察到的不同，pNaKtide可引起细胞Src活性50％的抑制。因此，作用于细胞膜的pNaKtide被发明者认为对与Na+/K+-ATP酶结合的Src有相对特异的作用。

pNaKtide在阻止Na+/K+-ATP酶/Src复合体形成上有很强的能力(图6B)。与此相应，乌本苷引起的LLC-PK1细胞的ERK1/2的活化可以被1uM pNaKtide完全阻断(图8A)。而且，pNaKtide在心肌细胞中也主要驻留在细胞膜上，也同样可抑制乌本苷引起的ERK1/2的活化(图8B)。

pNaKtide对Na+/K+-ATP酶/Src复合体的特异性通过进一步的实验得到验证，PP2，而不是pNaKtide，可以显著抑制IGF引起的ERK1/2活化(图8C)。

虽然乌本苷及其他一些CTS从发现开始就只被视作药物，近来的研究已经证实乌本苷和海蟾蜍毒素(MBG)是内源性的激素，它们的合成和分泌被多种生理刺激，包括ACTH和血管紧张素II调控(37-41)。此外，它们还被发现在调控肾脏对钠的处理，血管和心脏收缩方面发挥重要作用(42)。病理状态下，它们可能参与慢性肾衰竭时心脏的重塑，以及通过刺激肾脏上皮细胞的增生参与常染色体显性多囊肾(ADPKD)的发生。

因此，pNaKtide可在探索Na+/K+-ATP酶和内源性CTS的生理及病理意义中发挥作用。因为生理剂量的乌本苷和MBG已经足够引起心脏和肾脏中的Src和其下游的激酶活化，这就显得尤其重要(44，45)。此外，PST2238，一种乌本苷拮抗剂，已经被证实是一种有效的抗高血压药(44)。因此，pNaKtide还可被用作Na+/K+-ATP酶/Src受体被过度激活的心血管疾病的新的治疗措施。

确定NaKtide中与Src结合并抑制其活性的关键氨基酸残基，NaKtide结合的激酶结构域，以及这种结合如何抑制Src非常有用，不但可以揭示Na+/K+-ATP酶介导的Src调控的分子机制，而且可以评价这种调控是否同工体特异的。

有4种α亚单位得到确认。而Src家族则含有至少9个成员。有趣的是，虽然Src和Lyn高度同源，NaKtide似乎对Src比对Lyn的作用要强。因此，这种调控很可能是同工体特异的。而明确NaKtide是否影响PKC，ERK和Src之外的激酶也会更有用。

AP-NaKtide和A1N-NaKtide主要在细胞内的囊泡中存在。像pNaKtide一样，它对基础Src活性几乎无作用。因此，明确AP-NaKtide或A1N-NaKtide是否可以阻断乌本苷引起的ERK1/2活化会非常有用。此外，由于Src在胞吞、胞吐或囊泡循环中发挥作用，AP-NaKtide和A1N-NaKtide可能会对此有相对特异的作用。在动物体内或分离的器官中评价pNaKtide作为乌本苷拮抗剂的能力可进一步提供NaKtide有用的证据。

发展pNaKtide为可能的抗肿瘤治疗。

许多肿瘤有Src活性的升高。体外及体内研究均证实细胞Src的活性与Na+/K+-ATP酶的量成反比。因此，补充抑制Src的Na+/K+-ATP酶或它的等效物(ND1或pNaKtide)可能降低肿瘤的生长。此外，因为Src控制FAK的活性，而后者是肿瘤发生转移所需的，因此，Na+/K+-ATP酶或它的等效物可能在抑制肿瘤转移上也有效果。与此一致的是，发明者证实许多肿瘤细胞系Na+/K+-ATP酶表达减少，Src活性升高(图10和图11)。用YFP-ND1或pNaKtide对这些细胞进行挽救，可以有效地抑制这些肿瘤细胞的生长(图13和图14)。而且，pNaKtide还可在体外抑制FAK，阻断肿瘤细胞的迁移(图11和图12)。体内实验证实，皮下注射pNaKtide可以阻止异种移植的***肿瘤在NOD/SCID小鼠的生长(图15)。pNaKtide抑制肿瘤的Src可能还参与了血管生成的调控(图16)，进一步限制了肿瘤生长所需的营养获得。归纳在一起，这些发现指出pNaKtide可能作为抗肿瘤治疗的制剂。

定义：用到的缩写为：A结构域，执行结构域；CD2，第二胞内结构域；CD3，第三胞内结构域；CTS，强心甙；EYFP，强化黄荧光蛋白；ERK，胞外信号激活的蛋白激酶；FAK，局灶粘附激酶；FRET，荧光共振能量传送；GST，谷胱甘肽-S-转移酶；IGF，***；MAPK，丝裂素原活化蛋白激酶；N结构域，核苷酸结合结构域；P结构域，磷酸化结构域；PI3K，磷酸肌醇3’激酶；PKC，蛋白激酶C；PLC，磷脂酶C；PP2，4-氨基-5-[4-氯苯基]-7-[t-丁基]吡唑并吡嗪[3，4-d]比嘧啶；SERCA，胞质内质网Ca-ATP酶

序列清单：

peptide 1[SEQ ID NO：1]...MTVAHMWFDNQIHEADTTEN

peptide 2[SEQ ID NO：2]...IHEADTTENQSGVSFDKTSA

peptide 3[SEQ ID NO：3]...SATWLALSRIAGLCNRAVFQ

peptide 4[SE Q ID NO：4]...ALSRIAGLCNRAVFQANQEN

ND1 [SEQ ID NO：5] ...LTQNRMTVAHMWFDNQIHEADTTENQSGVSFDKTSATWLALSRIAGLCNRAVFQANQEN

pC1[SEQ ID NO：6]...G R K K R R Q R R R P P Q M T V A HM W F D N Q I H E A D T T E N

pNaKtide[SEQ ID NO：7]...G R K K R R Q R R R P P Q S A TW L A L S R I A G L C N R A V F Q

AP-NaKtide[SEQ ID NO：8]....R Q I K I W F Q N R R M K WK K S A T W L A L S R I A G L C N R A V F Q

A1N-NaKtide[SEQ ID NO：9]...K K G K K G K K S A T W L AL S R I A G L C N R A V F Q

虽然本发明通过引用多种具体实验结果进行了阐述，那些受过良好科学训练的人应该明白这些阐述还可能做多种改变，并被等同证据替换，而不与本发现的核心发生歧义。此外，还可以做许多修改以适应一种特殊的情境或教授这一发现的材料，而不与本发现的核心发生歧义。因此，这一发现应该不只限于这里披露的相关具体研究结果为模板来推广，而应该包括所有的与这一发现有关的研究结果。

参考文献

将上面讨论的参考文献和下面的参考文献(在它们提供的补充本文给出方案的示例性程序或者其他细节的程度上)特别引入本文作为参考。本文参考文献的引用将不被理解为承认其是本发明的现有技术。

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Claims

1.一种含有氨基酸肽类能够结合Src或Src家族激酶的激酶结构域的物质的组合物，其包含序列SATWLALSRIAGLCNRAVFQ[SEQID NO：3]中至少10个连续的氨基酸残基。所述药物组合物包含经保守性改变的氨基酸残基或者非天然类氨基酸替代物，以改善药效学和药动学特征。

2.权利要求1的组合物，其含有可药用的赋形剂。

3.权利要求1的组合物，其含有氨基酸序列SATWLALSRIAGLCNRAVFQ[SEQ ID NO：3]。

4.权利要求1的组合物，其含有SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5中一种氨基酸序列。

5.权利要求1的组合物，其含有SEQ ID NO：7的pNaKtide。

6.权利要求1的组合物，其含有SEQ ID NO：8的AP-NaKtide。

7.权利要求1的组合物，其含有SEQ ID NO：9的A1N-NaKtide。

8.一种编码权利要求1组合物的核苷酸序列。

9.含有权利要求5的肽的编码核苷酸序列的表达载体。

10.含有权利要求6的肽的编码核苷酸序列的表达载体。

11.含有权利要求7的肽的编码核苷酸序列的表达载体。

12.含有权利要求9，权利要求10或权利要求11的表达载体的细胞。

13.一种权利要求12的细胞，其为E.Coli。

14.一种权利要求12的细胞，其为哺乳动物细胞。

15.一种权利要求12的细胞，其为肿瘤细胞。

16.一种权利要求1组合物的选择性单克隆抗体。

17.一种权利要求1的组合物，其能够影响一种细胞进程：拮抗CTS诱导的蛋白激酶级联、抑制Src、Na+/K+-ATP酶的类似物、抑制Lyn、乌本苷拮抗剂、抑制FAK/ERK1/2、抑制血管生成和抑制细胞生长。

18.权利要求1的组合物，其不是ATP类似物。

19.权利要求2的组合物，其含有具有治疗用途的渗透细胞质膜的方法。

20.权利要求2的组合物，其含有至少一种额外的治疗用组合物，可用于治疗一种疾病，如癌症、血管疾病、心血管疾病、心脏病、骨病、***癌、***癌、成神经细胞瘤、心肌肥大、组织纤维化、充血性心力衰竭、缺血再灌注损伤或骨质疏松症。

21.权利要求3的组合物，其含有第二种结合于SEQ ID NO：3序列外的氨基酸残基的化合物，所述化合物是化疗药物、毒素、免疫反应修饰剂、酶或放射性同位元素。

22.权利要求3的组合物，其含有第二种结合于SEQ ID NO：3序列外的氨基酸残基的化合物，例如HIV-Tat、Penetratin、HIV-Tat-S-S、Na+/K+-ATP酶α1的氨基末端、GST或EYFP。

23.权利要求3的组合物，其含有HIV-Tat-SEQ ID NO：3。

24.权利要求3的组合物，其含有一种融合蛋白，前提是融合并没有破坏至少10个连续的SEQ ID NO：3的氨基酸残基。

25.权利要求3的组合物，其融合蛋白为GST。

26.一种将肽结合到细胞Src的激酶结构域的方法，其用于权利要求1的组合物结合到至少一种表达Src的细胞。

27.权利要求26的方法，其中所述表达Src的细胞为哺乳动物细胞。

28.权利要求26的方法，其中所述的哺乳动物细胞为心脏细胞、肝细胞、血管细胞、***细胞、***细胞、肾细胞、肌肉细胞、骨细胞或脑细胞。

29.权利要求26的方法，其中所述的哺乳动物细胞至少一种系体外培养。

30.一种治疗哺乳动物Src相关的疾病的方法，所述治疗药物含有权利要求2的药用成分。

31.权利要求30的方法，其中所述的Src相关的疾病包括：癌症、血管疾病、心血管疾病、心脏病、骨病、***癌、***癌、成神经细胞瘤、心肌肥大、组织纤维化、充血性心力衰竭、缺血再灌注损伤或骨质疏松症。

32.权利要求30的方法，其中所述的哺乳动物是人。

33.权利要求30的方法，其中药用组分中含有源于SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9序列的氨基酸肽。

34.使用权利要求2中的抑制Src的组合物以治疗哺乳动物癌症的方法。

35.使用权利要求2中的抑制Src的组合物以治疗哺乳动物血管疾病的方法。

36.使用权利要求2中的抑制Src的组合物以治疗哺乳动物心脏病的方法。

37.使用权利要求2中的抑制Src的组合物以治疗哺乳动物***癌的方法。

38.使用权利要求2中的抑制Src的组合物以治疗哺乳动物***癌的方法。

39.使用权利要求2中的抑制Src的组合物以治疗哺乳动物成神经细胞瘤的方法。

40.使用权利要求2中的抑制Src的组合物以治疗哺乳动物心肌肥大的方法。

41.使用权利要求2中的抑制Src的组合物以治疗哺乳动物组织纤维化的方法。

42.使用权利要求2中的抑制Src的组合物以治疗哺乳动物充血性心力衰竭的方法。

43.使用权利要求2中的抑制Src的组合物以治疗哺乳动物缺血再灌注损伤的方法。

44.使用权利要求2中的抑制Src的组合物以治疗哺乳动物骨质疏松症的方法。

45.一种抑制肿瘤细胞本底Src活性的方法，其中所述的肿瘤细胞中表达的Na+/K+-ATP酶量低于正常细胞。这种方法包括对表达Src的肿瘤细胞施用权利要求1的抑制Src的组合物。

46.一种抑制肿瘤细胞FAK活性的方法，对表达Src的肿瘤细胞施用权利要求1的抑制Src的组合物。

47.一种筛选影响Src活性化合物的方法，其包括将经修饰的SATWLALSRIAGLCNRAVFQ[SEQ ID NO：3]氨基酸肽于Src结合，这种修饰至少包含1个保守性的氨基酸替代；进一步确定修饰氨基酸肽是否影响Src活性。

48.权利要求47的方法，其中所述的对Src的影响包括Src的结合、Src的抑制、Src的激活、Src的功能、Lyn的结合、Lyn的功能、Lyn的抑制、乌本苷的拮抗、Na+/K+-ATP酶的功能、ERK1/2的功能和FAK的抑制。

49.权利要求47的方法，其中所述的一种实验组合物的方法是体外使用。

50.权利要求47的方法，其中所述的一种实验组合物使用在至少一种哺乳动物细胞。

51.权利要求47的方法，其中所述的一种实验组合物使用在至少一种肿瘤细胞株。

52.权利要求51的方法，检测细胞生长与对照组的不同以确定组合物对Src的影响。

53.权利要求51的方法，检测细胞迁移与对照组的不同以确定组合物对Src的影响。

54.权利要求51的方法，其中所述的至少一种哺乳动物细胞是动物模型。

55.权利要求51的方法，其中所述的动物模型是NOD/SCID小鼠。

56.一种新型Src抑制剂，其含有一种成分，以Na+/K+-ATP酶/Src受体复合体为靶点，拮抗CTS在一个或多个细胞内诱导的蛋白激酶级联。

57.一种抑制Src活性或拮抗CTS诱导的信号传导的方法，其包括使用有效剂量的一个或多个源于Na+/K+-ATP酶的肽或具有生物活性的多肽。

58.有效的Src抑制剂的组合物，不是ATP类似物，不直接影响PKC和ERK丝氨酸/苏氨酸激酶家族激酶的活性，抑制Src家族酪氨酸激酶的Lyn，其包含一个或多个源于Na+/K+-ATP酶的肽或具有生物活性的多肽。

59.含有多个正电荷氨基酸的引导肽的复合物HIV-TAT-NaKtide(pNaKtide)可轻易进入细胞并分布在细胞质膜。

60.含有多个正电荷氨基酸的引导肽的复合物Penetratin-NaKtide(AP-NaKtide)可轻易进入细胞并分布在细胞囊泡。

61.含有多个正电荷氨基酸的引导肽的复合物HIV-TAT-ss-NaKtide(ssNaKtide)可轻易进入细胞并分布在细胞浆。

62.含有多个正电荷氨基酸的引导肽的复合物Na+/K+-ATP酶α1氨基末端-NaKtide(A1N-NaKtide)可轻易进入细胞并分布在细胞浆。

63.在一个或多个细胞内特异作用于Na+/K+-ATP酶结合的Src激酶，并强效拮抗乌本苷的作用的方法，其包括使用有效剂量的pNaKtide。

64.在一个或多个细胞内以细胞囊泡Src为靶点，并拮抗乌本苷的作用的方法，其包括使用有效剂量的AP-NaKtide。

65.在一个或多个细胞内以所以细胞Src为靶点，并拮抗乌本苷的作用的方法，其包括使用有效剂量的ssNaKtide。

66.在一个或多个细胞内以细胞囊泡Src为靶点，并拮抗乌本苷的作用的方法，其包括使用有效剂量的A1N-NaKtide。

67.一种剂量依赖性干扰Na+/K+-ATP酶/Src受体复合物形成的方法，其包括使用有效剂量的一个或多个源于Na+/K+-ATP酶的肽或具有生物活性的多肽。

68.一种阻断乌本苷诱导的Src以及下游信号途径(如ERK1/2)的激活的方法，其包括使用有效剂量的一个或多个源于Na+/K+-ATP酶的肽或具有生物活性的多肽。

69.使用一个或多个源于Na+/K+-ATP酶的肽或具有生物活性的多肽作为乌本苷拮抗剂。

70.一种检测Na+/K+-ATP酶和CTS信号传导功能的生理和毒理意义的方法，其包括使用一个或多个源于Na+/K+-ATP酶的肽或具有生物活性的多肽作为探针。

71.能够作用于细胞质膜上Na+/K+-ATP酶/Src受体复合物的Src抑制剂，其含有SEQ ID NOs：1，2，3，4和5中的至少一个序列或生物活性的多肽。

72.在一个或多个细胞内能够选择性作用于Na+/K+-ATP酶结合的Src激酶，并有效拮抗乌本苷作用的组合物，其包括一个或多个源于Na+/K+-ATP酶的肽或具有生物活性的多肽。

73.特异作用于Src并且不直接影响PKC激酶家族活性的Src抑制剂，其包括ND1、NaKtide、pNaKtide、AP-NaKtide、ssNaKtide、A1N-NaKtide或生物活性多肽。

74.特异的乌本苷拮抗剂，其含有一个或多个源于Na+/K+-ATP酶的肽或具有生物活性的多肽，并结合有多个正电荷氨基酸的引导肽。

75.权利要求74中所述拮抗剂，与NaKtide连接的引导肽含有HIV-Tat、Penetratin、HIV-Tat-SS(通过SS健与NaKtide连接)、或Na+/K+-ATP酶α1的氨基末端。

76.一种检测Na+/K+-ATP酶和内源性CTS的生理和毒理意义的方法，其包括使用一个或多个源于Na+/K+-ATP酶的肽或具有生物活性的多肽。

77.一种治疗含过分刺激的Na+/K+-ATP酶/Src受体的心血管疾病的组合物，其包括一个或多个源于Na+/K+-ATP酶的肽或具有生物活性的多肽。

78.一种抑制细胞生长和/或诱导细胞死亡的方法，其包括使用有效治疗剂量的非ATP竞争性的Src抑制剂和CTS拮抗剂。

79.一种用于预防CTS诱导的信号途径的组合物，其包括一个或多个源于Na+/K+-ATP酶的肽或具有生物活性的多肽。

80.一种显著消除乌本苷在心脏内诱导的信号传导的方法，其包括使用有效剂量的一个或多个源于Na+/K+-ATP酶的肽或具有生物活性的多肽。

81.将一个或多个源于Na+/K+-ATP酶的肽或具有生物活性的多肽用于治疗癌症或心脏病有关的疾病。

82.含有一个或多个源于Na+/K+-ATP酶的肽或具有生物活性的多肽以及生理可接受的载体的药用组合物。

83.权利要求82的组合物成分可用于心肌肥大、组织纤维化和充血性心力衰竭的治疗。

84.权利要求82的组合物成分可作为化疗药物。

85.权利要求82的组合物成分可用于治疗癌症相关疾病。

86.权利要求82的组合物成分可用于治疗***癌、***癌或成神经细胞瘤的相关疾病。

87.鉴定用于治疗心肌肥大、组织纤维化、充血性心力衰竭或癌症相关疾病的候选化合物的方法，其包括：建立一种检测Na+/K+-ATP酶与Src作用而抑制Src活性的方法；用该检测方法测试候选化合物；鉴定一种非ATP竞争性的Src抑制剂和CTS拮抗剂的化合物。可显著抑制疾病的化合物可视为候选治疗用化合物。

88.鉴定用于治疗心肌肥大、组织纤维化、充血性心力衰竭或癌症相关疾病的候选化合物的方法，其包括：建立疾病模型；在疾病模型中测试候选化合物；检测i)一个或多个源于Na+/K+-ATP酶的肽或具有生物活性的多肽和活性Src的水平，ii)或者Na+/K+-ATP酶或CTS结合的水平；于对照组比较肽和Src活性的水平。与对照组相比，可显著改变肽和Src活性水平的化合物是候选治疗用化合物。

89.诊断心肌肥大、组织纤维化、充血性心力衰竭或癌症相关疾病的方法，其包括：获取生物样本；检测样本中的i)一个或多个源于Na+/K+-ATP酶的肽或具有生物活性的多肽和活性Src的水平，ii)或者Na+/K+-ATP酶或CTS结合的水平；于对照组比较肽和Src活性的水平。与对照组相比，肽水平的显著改变暗示该生物体存在相关疾病。

90.一种评估心肌肥大、组织纤维化、充血性心力衰竭或癌症相关疾病的疗效的方法，其包括：获取生物样本；检测样本中的i)一个或多个源于Na+/K+-ATP酶的肽或具有生物活性的多肽和活性Src的水平，ii)或者Na+/K+-ATP酶或CTS结合的水平；单剂量或多剂量给药后于对照组比较肽的水平。与非治疗个体相比，肽和活性Src水平的显著改变暗示治疗方法的有效性。

91.权利要求90的方法，其中所述的对照组代表了个体在接受治疗前的肽和Src水平。

92.权利要求90的方法，其中所述的生物样本是源于心脏器官或肿瘤细胞。

93.一种心肌肥大、组织纤维化、充血性心力衰竭或癌症相关疾病适应症的患病风险的评估方法，其包括：获取生物样本；检测样本中的i)一个或多个源于Na+/K+-ATP酶的肽或具有生物活性的多肽和活性Src的水平，ii)或者Na+/K+-ATP酶或CTS结合的水平；于对照组比较肽和Src活性的水平。与对照组相比，肽水平的显著改变暗示该生物体患病的风险。

94.一种决定心肌肥大、组织纤维化、充血性心力衰竭或癌症相关疾病的治疗程式能否停止的方法，其包括：获取生物样本；检测样本中的i)一个或多个源于Na+/K+-ATP酶的肽或具有生物活性的多肽和活性Src的水平，ii)或者Na+/K+-ATP酶或CTS结合的水平；于对照组比较肽和Src活性的水平。肽和Src活性的水平与对照组水平一致暗示该治疗程式能够停止。

95.一种决定心肌肥大、组织纤维化、充血性心力衰竭或癌症相关疾病的治疗程式是否应该执行的方法。其包括：获取生物样本；检测样本中的i)一个或多个源于Na+/K+-ATP酶的肽或具有生物活性的多肽和活性Src的水平，ii)或者Na+/K+-ATP酶或CTS结合的水平；于对照组比较肽和Src活性的水平。于对照组相比，肽和活性Src的水平的显著差异暗示该治疗程式应该开始。

96.权利要求95的方法，其对照组指健康个体的肽和活性Src的水平。

97.一种防治乌本苷甾体介导的病症的方法，其包括使用一个或多个源于Na+/K+-ATP酶的肽或具有生物活性的多肽，以及使用乌本苷的激动剂或拮抗剂。

98.权利要求97的方法，其中所述的病症包括癌症、心肌肥大、组织纤维化和充血性心力衰竭。

99.一种方法，其可用于鉴定：i)可以调控乌本苷甾体受体、Na+/K+-ATP酶受体或Na+/K+-ATP酶/Src受体复合物的化合物；ii)乌本苷甾体受体、Na+/K+-ATP酶受体或Na+/K+-ATP酶/Src受体复合物介导的生化进程；iii)乌本苷甾体受体、Na+/K+-ATP酶受体或Na+/K+-ATP酶/Src受体复合物的降解；iv)乌本苷甾体受体或Na+/K+-ATP酶/Src受体复合物的信号传导途径；v)乌本苷甾体受体、Na+/K+-ATP酶受体或Na+/K+-ATP酶/Src受体复合物介导的病症；vi)甾体受体转活化、减少或增加与乌本苷甾体受体、Na+/K+-ATP酶受体或Na+/K+-ATP酶/Src受体复合物的结合。其包括对化合物抑制或者刺激乌本苷甾体受体、Na+/K+-ATP酶受体或Na+/K+-ATP酶/Src受体复合物的测试方法。

100.对化合物是否增加或抑制肽与受体的结合的评估方法，其中一个或多个源于Na+/K+-ATP酶的肽或具有生物活性的多肽与受体结合，形成一个复合物。试验化合物加入所述的复合物中，与不含该试验化合物的对照组相比较，以决定该化合物是否增加或抑制肽与受体的结合的作用。

101.一种进行药物商业开发的方法，其包括：a)提供权利要求100所述的研发新化合物的方法；b)对步骤a)中所述的新化合物或其衍生化合物进行疗效、毒性等药物特性的分析；c)对步骤b)中研发的化合物进行药物剂型的开发以用于临床治疗。

102.一种在生物体内调控Na+/K+-ATP酶/Src受体复合物的方法，其包括使用一个或多个源于Na+/K+-ATP酶的肽或具有生物活性的多肽、复合物或与受体的结合。

103.特异于源于Na+/K+-ATP酶的肽或具有生物活性的多肽的抗体。

104.标记有示踪物质的抗体，用于检测生物样品、器官或细胞中蛋白、源于Na+/K+-ATP酶的肽或具有生物活性的多肽。

105.具有治疗用途的抗体，可作为免疫辅剂和免疫毒素用于修饰化疗药物、毒素、免疫反应修饰剂、酶和放射性同位元素等疗效显著的药物的靶向性载体。

106.药物组合物用于预防载体受体介导的病症，其包括使用有效剂量的一个或多个源于Na+/K+-ATP酶的肽或具有生物活性的多肽，或激动剂拮抗剂，或者从权利要求99所述方法研发出的一种化合物以及可药用的载体、稀释剂及辅料。

107.药物组合物含有有效剂量的一个或多个源于Na+/K+-ATP酶的肽或具有生物活性的多肽，或激动剂拮抗剂以及可药用的载体、稀释剂及辅料。

108.药物组合物修改后可用于预防生物体经载体受体介导的病症，尤其是经乌本苷受体和相应的载体、稀释剂或辅料介导的病症。

109.源于Na+/K+-ATP酶的肽、生物活性多肽或激动剂拮抗剂用于生产或制备药物。