CN102242161A - 一种利用酶工程法生产γ-氨基丁酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用酶工程法生产γ-氨基丁酸的方法，属于发酵法产酶技术领域。本发明以乳糖作为诱导剂，进行诱导产酶，通过陶瓷膜过滤收集菌体并在线洗菌体，然后在菌体中加入乙酸-乙酸钠缓冲液，少量多次加入底物谷氨酸，使谷氨酸转化为γ-氨基丁酸；然后采用陶瓷膜在线过滤除菌体，采用卷式有机膜脱色；最后采用三效浓缩至浓缩产品含量达550～600g/L时，停止浓缩，将浓缩液打入真空浓缩结晶罐，继续浓缩至产品含量达700～900g/L时，停止加热，常压下自然降温养晶1-1.5h，得到柱状或粉末状晶体。一次结晶得到的晶体纯度≥99.0％，收率≥85％。本发明为清洁生产工艺，三废排放少，菌渣可作为饲料蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用酶工程法生产γ-氨基丁酸的方法，属于发酵法产酶技术领域。
背景技术
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，简称GABA)又名氨酪酸，化学名4-氨基丁酸，伽玛氨基丁酸。外观为几乎白色结晶或结晶性粉末，微臭，有强引湿性。GABA具有安定、抗惊厥、降血压、增进脑活力、营养神经细胞、促进生长激素分泌以及保肝利肾的作用。对GABA在畜禽养殖业中的应用研究结果表明，GABA对畜禽具有很好的抗热应激和促生长的作用。
γ-氨基丁酸的生产方法主要有化学合成法、固态发酵法和植物提取法。化学合成法是采用吡咯烷酮、氢氧化钠和水按一定比例混合后，在高温下进行反应，然后通过树脂分离纯化，浓缩结晶而成。吡咯烷酮与氢氧化钠都为腐蚀性物质，影响人体健康。特别是吡咯烷酮在高温下，有引起燃烧的危险，且可分解释放有毒的氧化氮烟气，操作过程存在危险性，不利于工业化大规模生产。固态发酵法效率低下，产量仅为0.35mg/g，最终纯度只有45％，制作成本大，没有市场竞争力。植物提取法利用有机溶剂从植物中萃取，有机溶剂危险性大，易燃易爆，而且植物中γ-氨基丁酸的含量较低，而杂质含量高，导致植物提取法生产的γ-氨基丁酸产量低，产品纯度低。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种酶工程法生产γ-氨基丁酸的方法。该方法生产工艺简单，生产过程污染小，无危险性，成本低廉，产品纯度高，含量稳定。
本发明是通过如下方式实现：一种利用酶工程法生产γ-氨基丁酸的方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)、酶诱导发酵：在培养基中接入大肠杆菌菌种进行常规培养，加入培养基质量0.01-1％的乳糖作为诱导剂，进行诱导产酶，接种量为2-5％，培养温度为35-39℃，pH为4.0-7.0，培养16-24h，得到菌液。
所述大肠杆菌培养基为常规培养液，主要成分及其含量为：玉米浆10.0-30.0g/L，酵母粉5.0-30.0g/L，酵母膏2.0-15.0g/L，KH2PO4 1.0-10.0g/L，MgSO4 0.05-5.0g/L。
(2)、陶瓷膜过滤收集菌体并在线洗菌体：将步骤(1)得到的菌液经陶瓷膜过滤收集菌体，并对菌体进行在线洗涤；由于pH对酶活力影响比较大，在膜内进行菌体循环洗涤菌体时，需用酸(乙酸等)调节洗涤水pH使菌体pH保持在4.0-7.0，控制洗涤温度35-45℃，当透析液透光率在450nm下达到60％时终止洗涤，得到菌体，备用。
(3)、酶催化谷氨酸脱羧转化为γ-氨基丁酸：将步骤(2)陶瓷膜过滤洗涤得到的菌体加入乙酸溶液和乙酸钠溶液，配制成浓度为0.08-1mol/LpH值为3.0-7.0的乙酸-乙酸钠缓冲液(转化液)，按膜收集菌体前(陶瓷膜过滤洗涤前菌液)体积与转化液体积比5∶3的比例进行转化缓冲液的配制，进行转化前加入转化液体积0.01-0.1％的吐温80；少量多次加入底物谷氨酸进行转化，使反应体系中谷氨酸含量维持在30-50g/L，所述谷氨酸加入总量为转化液的30-40％(w/v)；反应温度为30-40℃，反应时间为30-50h。
(4)、采用陶瓷膜在线过滤除菌体，陶瓷膜孔径50nm，控制膜温度65-90℃，进膜压力1.0-3.1bar。通过膜过滤可将料液中菌体除去。经膜过滤出的菌渣，经浓缩可做菌体蛋白。
(5)、卷式有机膜脱色：经陶瓷膜处理的料液无法将料液中的色素去除，该工艺采用卷式有机膜截留分子量大于800的色素分子及大量蛋白分子，脱色过程控制过滤温度在20-45℃，控制过滤压力10-20bar，在脱色滤液450nm透光率达93％以上时，停止循环，收集滤液。
(6)、三效浓缩与直接浓缩结晶采用三效浓缩，控制一效温度60-95℃，二效温度90-115℃，三效温度50-85℃，控制真空度-0.08Mpa～-0.1Mpa；在浓缩产品含量达550～600g/L时，停止浓缩，将浓缩液打入真空浓缩结晶罐，控制真空浓缩结晶罐真空度-0.08Mpa～-0.1Mpa，温度为60-75℃，在浓缩产品含量达700～900g/L时，停止加热，常压下自然降温养晶1-1.5h，得到柱状或粉末状晶体。
本发明的有益效果是：整个γ-氨基丁酸发酵法为清洁生产工艺，三废排放少(只有少量清洗设备、工具、场地的废水)，经过简单污水处理就能达标排放，菌渣可作为饲料蛋白，洗菌水可以以一定比例与发酵用水混合做为发酵之用。本发明一次结晶得到的晶体纯度≥99.0％，收率≥85％。
具体实施方式
实施例1
在培养基中接入菌种进行常规培养，培养基的组成为每升培养液所含组分以g计：玉米浆10.0，酵母粉15.0，酵母膏10.0，KH2PO4 2.0，MgSO4 0.5，诱导剂乳糖以50％浓度单独灭菌(使加入发酵罐中最终浓度为0.01％)。将配制好的培养基加入发酵罐中，121℃，灭菌30min。采用火焰接种法接入菌种，接种量为3％。发酵时间为18h，在12h时逐渐加入诱导剂，制得菌液；
小试酶活检测：取100ml菌液进行离心，将菌体离心出来后倒掉上清，加入0.1mol/L pH为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液，将菌体混匀，加吐温800.1ml，然后加入谷氨酸10g进行转化。反应温度40℃，反应时间36h。检测谷氨酸残留为0.5g/L，将转化液进行提取，得到8.59g氨基丁酸，收率85％，纯度为99.5％(国标法)。
生产处理：将15t菌液过陶瓷膜过滤洗涤菌体，在所得菌体中加入乙酸溶液和乙酸钠溶液，配制成9t 0.1mol/L pH为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液，进行转化前加入3L吐温80；少量多次共加入谷氨酸3t进行转化，使反应体系中谷氨酸含量维持在30-50g/L。反应温度40℃，反应时间36h。检测谷氨酸残留为0.5g/L，将转化液过陶瓷膜，得滤液450nm下透光率9％。滤液经有机膜脱色，透光率上升为95.3％，经三效浓缩产品浓度达580g/L，将浓缩液快速打入真空浓缩罐中，继续浓缩使产品浓度达850g/L，常压下自然降温养晶1.5h，离心烘干得到2.69t氨基丁酸，收率88.7％，纯度为99％(国标法)。
实施例2
在培养基中接入大肠杆菌进行上罐常规培养，培养基的组成为每升培养液所含组分以g计：玉米浆10.0，酵母粉15.0，酵母膏10.0，KH2PO4 2.0，MgSO4 0.5，加入培养基质量0.2％的乳糖作为诱导剂，进行诱导产酶，接种量为3％，培养温度35-39℃，pH为5.0，培养24h，制得菌液，放罐体积为15t。
小试酶活检测：取100ml菌液进行离心，将菌体离心出来后倒掉上清，加入0.1mol/L pH为5.0的乙酸钠-乙酸缓冲液，将菌体混匀，加入吐温80 0.03ml，加入10g谷氨酸进行转化。反反应温度40℃，反应时间36h。检测谷氨酸残留为0.2g/L，将转化液进行提取，得到8.6g氨基丁酸，收率85.1％，纯度为99.5％(国标法)。
生产处理：将15t菌液过陶瓷膜过滤洗涤菌体，在所得菌体中加入乙酸溶液和乙酸钠溶液，配制成9t 0.1mol/L pH为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液，加入吐温80 2.7L。少量多次共加入谷氨酸3t进行转化，使反应体系中谷氨酸含量维持在30-50g/L。反应温度40℃，反应时间38h。检测谷氨酸残留为0.3g/L。将转化液过陶瓷膜，得滤液450nm下透光率11％。滤液经有机膜脱色，透光率上升为97.3％，经三效浓缩产品浓度达550g/L，将浓缩液快速打入真空浓缩罐中，继续浓缩使产品浓度达900g/L，常压下自然降温养晶1.5h，离心烘干得到2.8t氨基丁酸，收率89.1％，纯度为99％(国标法)。
Claims (2)
1.一种利用酶工程法生产γ-氨基丁酸的方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)、酶诱导发酵：在培养基中接入大肠杆菌菌种进行常规培养，加入培养基质量0.01-1％的乳糖作为诱导剂，进行诱导产酶；接种量为2-5％，培养温度为35-39℃，pH为4.0-7.0，培养16-24h，得到菌液；
(2)、陶瓷膜过滤收集菌体并在线洗菌体：将步骤(1)得到的菌液经陶瓷膜过滤收集菌体，并对菌体进行在线洗涤；洗涤菌体时用酸调节洗涤水pH使菌体pH保持在4.0-7.0，控制洗涤温度35-45℃；当透析液透光率在450nm下达到60％时终止洗涤，得到菌体，备用；
(3)、酶催化谷氨酸脱羧转化为γ-氨基丁酸：将步骤(2)陶瓷膜过滤洗涤得到的菌体加入乙酸溶液和乙酸钠溶液，配制成浓度为0.08-1mol/L pH值为3.0-7.0的乙酸-乙酸钠缓冲液，所述乙酸-乙酸钠缓冲液即为转化液，所述转化液按陶瓷膜过滤洗涤前菌液体积与转化液体积比5∶3的比例配制，进行转化前加入转化液体积0.01-0.1％的吐温80；然后少量多次加入底物谷氨酸进行转化，使反应体系中谷氨酸含量维持在30-50g/L，所述谷氨酸加入总量为转化液的30-40％(W/V)；反应温度为30-40℃，反应时间为30-50h；
(4)、采用陶瓷膜在线过滤除菌体，陶瓷膜孔径50nm，控制膜温度65-90℃，进膜压力1.0-3.1bar；
(5)、卷式有机膜脱色：采用卷式有机膜截留分子量大于800的色素分子及大量蛋白分子，脱色过程中控制过滤温度在20-45℃，控制过滤压力10-20bar；在脱色滤液450nm透光率达93％以上时，停止循环，收集滤液；
(6)、三效浓缩与直接浓缩结晶：采用三效浓缩，控制一效温度60-95℃，二效温度90-115℃，三效温度50-85℃，控制真空度-0.08Mpa～-0.1Mpa；在浓缩产品含量达550～600g/L时，停止浓缩，将浓缩液打入真空浓缩结晶罐，控制真空浓缩结晶罐真空度-0.08Mpa～-0.1Mpa，温度为60-75℃，在浓缩产品含量达700～900g/L时，停止加热，常压下自然降温养晶1-1.5h，得到柱状或粉末状晶体。
2.如权利要求1所述的一种利用酶工程法生产γ-氨基丁酸的方法，其特征是，所述大肠杆菌培养基的主要成分及其含量为：玉米浆10.0-30.0g/L，酵母粉5.0-30.0g/L，酵母膏2.0-15.0g/L，KH2PO4 1.0-10.0g/L，MgSO4 0.05-5.0g/L。
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