CN102242148A - 重组载体以及转基因骨髓基质细胞修饰的丝素膜及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物领域，具体公开了重组了VEGF165与Ang-1的pAdTrack-CMV-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-质粒和pAdTrack-CMV-VEGF165-IRES-Ang-1质粒，其保藏编号分别为CCTCC NO：M 2010221、CCTCC NO：M 2010220。本发明还公开了经所述质粒与腺病毒同源重组和QBI-293A细胞中包装产生的重组腺病毒。本发明还提供转基因骨髓基质细胞修饰的丝素膜。兔角膜缘注射本发明所述重组腺病毒能成功诱导角膜新生血管形成；转基因细胞修饰的丝素膜植入兔角膜层后新生血管长入丝素膜植入区域的角膜内且血管密度明显增多，VEGF165、Ang-1、CD34在兔角膜层中获得成功表达。大鼠创伤修复实验进一步证明本发明所述转基因骨髓基质细胞修饰的丝素膜还可促进创伤组织的血管生成和创伤修复，说明本发明所述重组腺病毒以及转基因骨髓基质细胞修饰的丝素膜具有医学应用价值。

Description

重组载体以及转基因骨髓基质细胞修饰的丝素膜及其应用
技术领域
本发明涉及生物领域，具体涉及重组载体以及转基因骨髓基质细胞修饰的丝素膜及其应用。 
背景技术
机体损伤修复的机制是必须先有微血管的生成，随后形成新生的肉芽组织，然后才能输入所需的各种细胞和营养成分，促进损伤组织的修复。血管新生是一个复杂的、有步骤、有序的过程，不仅需要刺激因素的激发，诸多细胞的参与，还需要各种细胞因子、生长因子的参与以及细胞外基质的协作。Ang-1、VEGF、FGF、PDGF对伤口肉芽组织形成、血管增生和胶原纤维合成有重要作用。 
VEGF是由两个相同亚基以二硫键交联结合成的二聚体糖蛋白，分子量40-45KD，其基因位于染色体6p21.3，全长14kb，由8个外显子和7个内含子组成，由于其mRNA的剪接方式不同，形成多种存在形式，其中VEGF121和VEGF165为分泌性可溶性蛋白，可通过与邻近的血管内皮受体结合，发挥促进血管内皮细胞增殖、迁移和增加血管通透性的作用。血管新生中，VEGF及其受体被认为是作用最强、特异性最高的关键调控因子。VEGF是血管内皮细胞的特异性有丝***原，在体外可促进内皮细胞的生长，在体内可以诱导血管发生。 
近年来，在血管新生过程中Ang-1及受体Tie2对新生血管的形成、重塑、成熟等的重要调节作用正逐渐受到关注。Ang-1和VEGF在血管的再生中二者协同发挥作用，VEGF作用于血管形成的早期，可促进原始血管网的形成，而Ang则作用于随后的血管改建、塑形，促进形成成熟且有空间结构的血管网，因而VEGF和Ang-1双基因共表达的基因治疗有可能是促进血管新生的创新探索。 
目前，双基因共表达载体的构建策略主要有：1.基因之间以IRES (internal ribosome entry site)(内部核糖体进入位点)序列连接；2.双启动子表达载体；3.剪切载体；4.基因之间以Furin的切割靶点序列连接；5.基因之间以2A序列连接；6.表达融合基因。 
基因之间以IRES(internal ribosome entry site)(内部核糖体进入位点)序列连接，该IRES序列及与之相连的基因可同时转录，并以不依赖帽的方式启动远端mRNA的翻译，从而在同一个转录本上翻译出不同的蛋白；基因之间***polyA-promotor(CMV)双启动子表达盒构建双基因共表达载体，带有polyA-promotor(CMV)各自独立启动子的两个表达盒构建于一个载体上，双基因各自独立转录出两种不同的mRNA，并各自独立翻译出不同的蛋白。 
本领域技术人员公知：腺病毒载体是一类很有应用前景的基因治疗病毒载体，腺病毒是一种双链DNA病毒，腺病毒载体与其他载体相比有如下许多优点：1.宿主范围广，对人致病性低；2.具有感染率高、对***和非***细胞都能感染；3.能携带很长的治疗基因和同时表达多个基因；4.不整合到染色体中，无***致突变性，安全性好；5.能有效进行增殖，滴度高，易加工制备等。采用pAdEasy腺病毒表达***具有明显优点：1.腺病毒质粒的同源重组可在大肠杆菌BJ5183中高效进行，且细菌繁殖快，同源重组能力强，因而从根本上克服细胞内同源重组率低的缺陷；2.腺病毒中可***11kb的基因片段或同时***多个基因片段；3.由于在腺病毒骨架中含有的GFP报告基因，非常便于监测病毒包装成功与否、检测病毒滴度及感染效率等。所有这些都避免了病毒的空斑克隆纯化过程，大大减少了病毒的制备时间。 
构建双基因共表达重组转移载体是作为肿瘤的基因治疗药物的有效途径之一，但到目前为止，国内外没有关于利用IRES策略构建VEGF和Ang-1双基因载体的报道；另外，利用构建polyA+promoter双启动子策略构建双基因重组转移载体，虽然理论有相关研究，实践中却并没有相关报道，而且该方法存在以下难点：在利用在构建polyA+promoter双启动子策略构建双基因重组转移载体的过程中，发现polyA中有pacI酶切位点，无法采用pacI酶切线性化后在293A细 胞中进行腺病毒包装，影响双基因的正常表达。 
丝素蛋白膜作为一种新型医用生物材料，具有无毒性、无刺激性、透湿性好等许多优异性能，可以用作伤口敷料，也可用作组织修复的支架材料，甚至可以开发成人工皮肤。而如何使支架材料充足血管化，进一步开发和制备血管诱生丝素蛋白基支架材料联合MSC的小口径人工血管仍未见进展。 
发明内容
本发明的一个目的是提供基因表达效率高，血管诱导能力强的VEGF165及Ang-1的重组载体。 
本发明提供的VEGF165与Ang-1双转基因重组质粒pAdTrack-CMV-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-1，其保藏号为：CCTCCM 2010221。 
所述质粒转移的基因VEGF165在Genebank中登录号为AF016050.1，基因Ang-1公开在NCBI Reference Sequence：NM_001146.3中。 
本发明还提供所述重组质粒M 2010221与腺病毒pAdEasy-1同源重组，在QBI-293A细胞中包装产生的重组腺病毒Ad-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-1。 
本发明提供的VEGF165与Ang-1双转基因重组质粒pAdTrack-CMV-VEGF165-IRES-Ang-1，其保藏号为；CCTCCM 2010220。 
本发明还提供所述重组质粒M 2010220与腺病毒pAdEasy-1同源重组，在QBI-293A细胞中包装产生的重组腺病毒Ad-VEGF165-IRES-Ang-1。 
通过在Ad-polyA+promoter及Ad-IRES空载体间亚克隆入Ang-1和VEGF165构建Ang-1和VEGF165双基因共表达腺病毒表达载体。PCR、酶切及基因测序表明polyA-promoter/IRES介导的Ang-1和VEGF165双基因共表达载体构建成功；RT-PCR结果表明，上述Ang-1 和VEGF165双基因共表达腺病毒载体均能介导外源性Ang-1和VEGF165基因的转录，成功获得了Ang-1和VEGF165双基因共表达重组腺病毒。 
ELISA结果证实，不仅polyA-promoter比IRES介导的双基因表达效率高，而且还进一步证明了在用腺病毒表达载体中Ang-1和VEGF165基因位于IRES或PolyA-promoter下游基因的表达量均明显低于上游基因表达量。 
本发明还提供所述重组腺病毒Ad-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-1、Ad-VEGF165-IRES-Ang-1在制备促血管生长药物中的应用。 
兔角膜缘注射本发明所述重组腺病毒Ad--VEGF165-PolyA-promoter-Ang-1及Ad--VEGF165-IRES-Ang-1能成功诱导角膜新生血管形成，在腺病毒表达载体中，VEGF165基因位于IRES或polyA-promoter上游比位于其下游时能更好的诱导角膜新生血管形成。这一结果与ELISA所检测到的Ang-1及VEGF165细胞因子表达水平也基本一致。 
兔角膜缘注射重组腺病毒Ad-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-1及Ad-VEGF165-IRES-Ang-1能成功诱导角膜新生血管形成，且前者比后者效果更为显著，而无论是IRES载体还是polyA-promoter载体，VEGF165基因位于载体下游时则不能很好的诱导角膜新生血管形成。这可能与VEGF165基因位于载体下游时的表达量的高低有关。因为血管生成是多种正、负性调节因子直接或间接作用的结果，VEGF/VEGFR、Ang/Tie 2只有在空间、时间和数量上进行精细调节才能形成有功能的血管，VEGF165作用于血管形成早期，促进原始血管网形成，而Ang1则作用于随后的血管改建、塑形，促进形成成熟、有空间结构的血管网。VEGF在此过程中起主要作用，Ang1则起到协同作用。当VEGF165位于载体下游时，表达量很低，仅为上游基因表达量30％-40％，所以兔角膜边缘注射Ad-Ang-1-polyA-promoter-VEGF165、Ad-Ang-1-IRES-VEGF165一月后，几乎未见角膜新生血管生成，结果不能很好的诱导角膜新生血管形成。 
本发明的另一个目的是提供一种制备转基因细胞修饰的丝素膜的方法，包含以下步骤： 
将骨髓基质细胞接种于丝素膜上，加入所述重组腺病毒Ad-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-1或Ad-VEGF165-IRES-Ang-1，所述再生丝素膜每平方厘米上骨髓基质细胞浓度为0.5×105--1×105，重组腺病毒接种量为20-30MOI，于37℃，5％CO2条件培养。 
骨髓基质细胞(Marrow stromal cells，MSC)具有典型的干细胞特点，有多向分化潜能和强大的增殖能力，骨髓基质细胞取材方便，可在细胞培养时利用该细胞贴壁生长的特性将其分离纯化，而造血细胞在换液时逐步被清除，便于自体移植。 
作为优选，所述骨髓基质细胞处于对数生长期。 
作为优选，所述骨髓基质细胞为原代培养的骨髓基质细胞，细胞浓度1×108L-1。 
作为优选，所述培养时间为48-72小时。 
本发明还提供所述方法制备的转基因细胞修饰的丝素膜。 
本发明还提供所述转基因细胞修饰的丝素膜在制备制备血管诱导性的医用生物材料的应用。 
丝素膜是由丝素蛋白经物理或化学方法合成一种生物相容性很好的新型医用生物材料，不仅无细胞毒性，对种子细胞遗传学特性无影响，对细胞周期和凋亡没有不良影响，对机体也不引起炎症反应，不引起溶血，而且表现出卓越的生物相容性，细胞在丝素材料上能很好的粘附、扩增和增殖，利于内皮化形成血管样组织，体内试验能修复骨缺损和愈合皮肤创伤。 
在本发明的实施例中，丝素膜是物理交联再生丝素膜，家蚕丝素是由乙氨酸、丙氢酸、丝氨酸等18种氨基酸所组成的天然蛋白质，将家蚕丝用Na2CO3溶液脱胶，CaCl2·CH3CH2OH·H2O(摩尔比为1∶2∶8)三元溶剂溶解，经透析、过滤后，流延法60℃干燥成膜，经Co-60辐照灭菌后密封保存备用，即为物理交联再生丝素膜，以下简称为再生丝素膜。 
将处于对数生长期的兔骨髓基质细胞消化调至细胞浓度1×105/ml，以1ml/孔接种于铺有再生丝素膜的24孔细胞培养板上，实验分组同前，感染病毒48h后，取各组上清，按ELISA检测试剂盒说明测定Ang1、VEGF的含量。结果显示：未经转基因修饰的兔骨髓基质细胞仅能低水平自分泌VEGF165及Ang-1细胞因子，但接种本发明所述重组腺病毒组表达VEGF165及Ang-1水平明显提高。 
植入转Ad-VEGF165-PolyA-promoter-Ang1基因细胞修饰的再生丝素膜后角膜基质内SF+MSC+Ad-VEGF165-Ang-1组的HE染色可见丰富的毛细血管，CD34免疫组化分析呈现明显强阳性，微血管密度为(17±3.5)个/高倍视野，而SF+MSC+Ad-GFP组与SF+MSC组角膜基质内毛细血管少见，未见明显CD34阳性表达，差别有统计学意义(*P＜0.05)。 
兔角膜层植入转VEGF165及Ang-1基因细胞修饰的再生丝素膜后的SF+MSC+Ad-VEGF165-Ang-1组角膜基质内可见VEGF165、Ang-1阳性表达，呈现棕黑色，而而SF+MSC+Ad-GFP组与SF+MSC组角膜基质内未见明显VEGF及Ang-1阳性表达，差别有统计学意义(P＜0.05)。 
兔角膜层植入转VEGF165及Ang-1基因细胞修饰的再生丝素膜后的SF+MSC+Ad-VEGF165-Ang-1组HIF-α、bFGF的表达呈棕黑色，显著高于SF+MSC+Ad-GFP组与SF+MSC对照组(P＜0.05)；而EGF、PDGF的表达与SF+MSC+Ad-GFP组与SF+MSC对照组均呈现棕色，组间无统计学意义(P＞0.05)，说明转VEGF165及Ang-1基因细胞修饰的再生丝素膜不仅VEGF165及Ang-1目的基因使能在角膜层中有效表达，而且能促进骨髓基质细胞自分泌的HIF-α、bFGF水平提高，并维持骨髓基质细胞自分泌的EGF、PDGF的正常稳定表达。 
与现有技术相比，本发明提供的经PolyA-promoter和IRES构建的VEGF165及Ang-1双基因重组转移质粒pAdTrack-CMV-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-1(保藏编号为CCTCCM 2010221)和pAdTrack-CMV-VEGF165-IRES-Ang-1(保藏编号为 CCTCC M 2010220)，以及经QBI-293A细胞包装产生的Ad-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-1和Ad-VEGF165-IRES-Ang-1重组腺病毒载体使VEGF165和Ang-1基因理想而又成功的组合在同一个载体上，均能获得成功表达，并且通过双基因表达产物的联合作用，促进血管生成和创伤修复。 
大鼠创伤修复实验进一步证明，本发明所述转基因骨髓基质细胞修饰的丝素材料还可促进创伤组织的血管生成，为进一步研制出具血管诱导性的医用生物材料如小口径人工血管创造了条件。 
生物材料保藏信息说明： 
1、pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES-VEGF165质粒，已于2010年9月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2010220，分类命名为大肠杆菌DH5a/pAdTrack-CMV-hVEGF165-IRES-hAng-1。 
2、pAdTrack-CMV-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-1质粒，已于2010年9月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2010221，分类命名为大肠杆菌DH5a/pAdTrack-CMV-hVEGF165-polyA-Promter-hAng-1。 
附图说明：
图1示本发明所述AdTrack-CMV-PolyA-promoter质粒图谱。 
图2示兔角膜新生血管生长面积计算图例。 
图3示HE及免疫组化法检测病毒注射角膜缘后诱导血管形成的能力。 
图4示再生丝素膜上兔骨髓基质细胞中VEGF165、Ang-1基因的RT-PCR电泳图。 
1.SF+MSC组；2.SF+MSC+Ad-GFP组；3.SF+MSC+Ad-VA组。 
图5示转基因细胞修饰的再生丝素膜植入兔角膜层后对角膜新生血管形成的影响；SF：再生丝素膜；MSC：兔骨髓基质细胞。 
图6示植入转基因细胞修饰的再生丝素膜的兔角膜层中VEGF165、 Ang-1、HIF-α、bFGF、EGF、PDGF免疫组化分析统计图。 
图7示免疫组化检测大鼠创伤恢复组织中VEGF的表达：SFMSCVA组分别与PBS组，SF组，SFMSC组比较，ΔP＜0.05；SFMSC组分别与PBS组，SF组比较，*P＜0.05。 
图8示免疫组化检测大鼠创伤恢复组织中Ang-1的表达：SFMSCVA组分别与PBS组，SF组，SFMSC组比较，ΔP＜0.05；SFMSC组分别与PBS组，SF组比较，*P＜0.05。 
图9示免疫组化检测大鼠创伤恢复组织中CD34的表达：SFMSCVA组分别与PBS组，SF组，SFMSC组比较，ΔP＜0.05；SFMSC组分别与PBS组，SF组比较，*P＜0.05。 
具体实施方式：
本发明公开了一种双基因共表达载体以及转基因骨髓基质细胞修饰的再生丝素膜，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。 
按照本发明，角膜缘注射本发明所述重组腺病毒能成功诱导角膜新生血管形成；培养于丝素膜上生长的兔骨髓基质细胞经本发明所述重组腺病毒感染细胞后，可成功表达VEGF165及Ang-1基因；转基因细胞修饰的丝素膜植入兔角膜层后2周新生血管长入丝素膜植入区域的角膜内且维持1月以上，HE染色与免疫组化显示血管密度明显增多，VEGF165、Ang-1、CD34在兔角膜层中获得成功表达。大鼠创伤修复实验进一步证明本发明所述转基因骨髓基质细胞修饰的丝素膜还可促进创伤组织的血管生成，说明本发明所述重组腺病毒以及转基因骨髓基质细胞修饰的丝素膜具有潜在的应用价值。 
下面结合实施例，进一步阐述本发明： 
实施例1：pAdTrack-CMV-Ang-1-PolyA-promoter-VEGF 165双基因重组转移质粒图谱 
在申请号为200810244301.3中国发明专利申请说明书公开polyAΔ296～298-promoter(简称PolyA-promoter)和IRES序列。本发明所述双基因重组转移质粒是在pAdTrack-CMV-PolyA-promoter转移质粒的基础上，在Bgl II、Sal I酶切位点间***Ang-1片段，在Not I、Xho I酶切位点间***VEGF165片段，质粒图谱如图1所示。 
实施例2：目的基因的克隆 
比对Ang-1的保守序列，设计引物P1、P2(如表1)，两端分别引入Bgl II、Sal I酶切位点；以本科室已构建的含有Ang-1片段的pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES-VEGF165质粒为模板，PCR扩增获得的Ang-1目的片段的PCR产物经琼脂糖电泳鉴定。 
比对VEGF165的保守序列，设计引物P3、P4(如表1)，两端分别引入Not I、Xho I酶切位点，以本科室已构建的含有VEGF165片段的pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES-VEGF165质粒为模板，PCR扩增获得的VEGF165目的片段的PCR产物经琼脂糖电泳鉴定。 
表1PCR引物 
Figure BSA00000310391700091
PCR条件为：94℃预变性2min，94℃变性50s，58℃退火50s，72℃延伸50s，共循环30次，最后72℃后延伸10min。 
PCR体系如下： 
10×PCR缓冲液(含有Mg2+)        5μl 
dNTPmix(10mM each)             1μl 
引物P1(25μM)                  1μl 
引物P2(25μM)                  1μl 
pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES-VEGF165 
质粒模板                       1μl 
ddH2O                          40μl 
Taq DNA聚合酶(5U/μl)          1μl 
                                      
终体积                         50μl 
实施例3：pAdTrack-CMV-Ang-1-PolyA-promoter单基因重组转移质粒的构建 
将由DNA清洁试剂盒纯化的Ang-1基因的PCR产物和小量质粒抽提试剂盒提取的转移质粒pAdTrack-CMV-PolyA-promoter分别用Bgl II、Sal I 37℃双酶切5h后，割胶回收目的片段，按试剂盒胶回收方法和步骤操作，然后用T4DNA连接酶将其在4℃连接过夜，继而再将连接产物转化大肠杆菌DH5α，并在含Kana(50μg/ml)抗性平板中挑选阳性单克隆，经PCR、双酶切鉴定和DNA序列测定鉴定后，阳性克隆菌-20℃冰箱保种备用。 
双酶切体系如下： 
pAdTrack-CMV-PolyA-promoter 质粒双酶切体系  Ang-1PCR产物双酶切体系 
10×Buffer H                2μl            10×Buffer H         3μl 
pAdTrack-CMV-PolyA-promoter 质粒 15μl      VEGF165PCR产物   23μl 
Bgl II                      1.5μl          Bgl II           2μl 
Sal I                       1.5μl          Sal I            2μl 
                                                                   
终体积                      20μl           终体积           30μl 
连接体系如下： 
纯化的双酶切Ang-1PCR产物                       8μl 
纯化的双酶切pAdTrack-CMV-PolyA-promoter大片段  8μl 
10×Buffer                                     2μl 
T4DNA ligase                                   2μl 
                                                       
终体积                                         20μl 
CaCl2法制备DH5α大肠杆菌感受态细胞和转化技术路线如下： 
转化前一天，DH5α按1％接种5ml LB培养基37℃培养过夜，按1％转种5ml LB培养基37℃培养，至OD600nm约为0.2(约培养1.3h)，将菌液倒入5ml离心管中5000r/min，离心5min收集菌体，加入5ml预冷的100mM CaCl2，悬浮菌体后0℃，20～30min后，5000r/min，离心5min收集菌体用约600μl 100mM预冷CaCl2悬浮菌体，并按下表进行转化，并置隔水式恒温培养箱37℃培养16h挑阳性克隆鉴定，即得到pAdTrack-CMV-Ang-1-PolyA-promoter单基因重组转移质粒，质粒抽提、PCR和双酶切鉴定方法同上。 
Figure BSA00000310391700111
实施例4：构建pAdTrack-CMV-Ang-1-PolyA-promoter-VEGF165双基因重组转移质粒 
在VEGF165基因克隆和实施例2构建的pAdTrack-CMV-Ang-1-PolyA-promoter单基因重组转移质粒的基础上，将经Not I、Xho I双酶切并经胶回收的VEGF165基因片段和pAdTrack-CMV-Ang-1-PolyA-promoter质粒片段，用T4DNA连接酶连 接，构建pAdTrack-CMV-Ang-1-PolyA-promoter-VEGF165双基因重组转移质粒。 
实施例5：pAdTrack-CMV-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-1双基因重组转移质粒的构建 
参照实施例1-4，对VEGF165和Ang-1的保守序列，设计引物P5、P6及P7、P8(如表1)，VEGF165引物两端分别引入Bgl II、Sal I酶切位点；Ang-1引物两端分别引入Not I、Xho I酶切位点，以含有VEGF 165和Ang-1片段的pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES-VEGF 165质粒为模板，PCR扩增获得的VEGF165和Ang-1目的片段的PCR产物经琼脂糖电泳鉴定。 
双酶切目的基因PCR产物及pAdTrack-CMV-PolyA-promoter空载体质粒，胶回收后用T4DNA连接酶将其4℃连接过夜，继而连接产物转化大肠杆菌DH5α和含Kana(50μg/ml)的LB琼脂平板筛选挑单克隆，由此在多克隆位点(MCS)中在Bgl II、SalI酶切位点间***VEGF165片段，在Not I、Xho I酶切位点间***Ang-1片段。并用PCR、双酶切鉴定和DNA序列测定，阳性克隆菌保种备用。 
pAdTrack-CMV-VEGF165-IRES-Ang-1双基因重组转移质粒的构建：在pAdTrack-CMV-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-1双基因重组转移质粒构建的基础上，将经Bgl II、Sal I双酶切并经胶回收的pAdTrack-CMV-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-1的VEGF165基因片段和pAdTrack-CMV-IRES质粒大片段，用T4DNA连接酶连接，构建pAdTrack-CMV-VEGF165-IRES单基因重组转移质粒。其构建方法同实施例3。 
经Not I、Xho I双酶切并经胶回收的pAdTrack-CMV-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-1的Ang-1基因片段和pAdTrack-CMV-VEGF165-IRES单基因重组转移质粒大片段，并用T4DNA连接酶将其4℃连接过夜，继而连接产物转化大肠杆菌DH5α和含Kana(50μg/ml)的LB琼脂平板筛选挑单克隆，并用PCR、双酶切鉴定，阳性克隆菌 保种备用。其方法同实施例4，所述双基因重组转移质粒pAdTrack-CMV-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-1已于2010年9月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM 2010221。 
参照上述方法构建pAdTrack-CMV-VEGF165-IRES-Ang-1、pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES-VEGF165质粒，其中所述双基因重组转移质粒pAdTrack-CMV-VEGF165-IRES-Ang-1已于2010年9月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM 2010220。 
实施例6：双基因重组转移质粒的鉴定 
重组载体pAdTrack-CMV-Ang-1-PolyA-promoter-VEGF165质粒为模板，P1、P2为引物PCR能扩增出Ang-1目的基因片段，其大小与预期扩增的Ang-1理论值大小(1497bp)相一致，以P3、P4为引物PCR能扩增出VEGF165目的基因片段，其大小与预期扩增的VEGF165理论值大小(576bp)相一致。经Bgl II、Sal I酶切释放出1497bp大小的Ang-1片段，Not I、Xho I酶切释放出576bp大小的VEGF165片段，均表明Ang-1及VEGF165目的基因片段已成功亚克隆于pAdTrack-CMV-PolyA-promoter改造空转移质粒中。DNA序列测定进一步证实成功构建了pAdTrack-CMV-Ang-1-PolyA-promoter-VEGF165双基因重组转移质粒。 
参照上述方法，对其他双基因重组转移质粒pAdTrack-CMV-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-1、pAdTrack-CMV-VEGF165-IRES-Ang-1等进行鉴定及DNA序列测定，进一步证实构建成功。 
实施例7：同源重组腺病毒质粒的构建和鉴定 
将pAdTrack-CMV-Ang-1-PolyA-promoter-VEGF165、pAdTrack-CMV-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-1和pAdTrack-CMV-VEGF165 -IRES-Ang-1重组转移质粒分别与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌中同源重组后挑克隆提取质粒，据分子量大小初步筛选pAd-Ang-1-PolyA-promoter-VEGF165、pAd-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-1和pAd-VEGF165-IRES-Ang-1同源重组阳性克隆，琼脂糖电泳结果表明，pAd-Ang-1-PolyA-promoter-VEGF165与pAdEasy-1共转化组所挑的5个克隆有4个为阳性克隆；pAd-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-1与pAdEasy-1共转化组所挑的6个克隆有5个为阳性克隆；pAd-VEGF165-IRES-Ang-1与pAdEasy-1共转化组所挑的4个克隆有2个为阳性克隆；PacI酶切鉴定均可获得30kb大小左右的腺病毒基因组片段和独特的4.5kb或者3.0kb大小的ori及卡那霉素抗性编码基因片段。 
实施例8：重组腺病毒的包装、扩增及其效价检测 
Pac I线性化的pAd-Ang-1-PolyA-promoter-VEGF165、pAd-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-1、pAd-VEGF165-IRES-Ang-1和pAd-Ang-1-IRES-VEGF165同源重组腺病毒质粒按LipofectamineTM2000操作说明经Lipofectamin脂质体分别转染293A细胞后，荧光显微镜下可见GFP的表达，且荧光强度随培养时间延长逐渐增强。转染10d后分别收集Ad-Ang-1-PolyA-promoter-VEGF165、Ad-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-1、Ad-VEGF165-IRES-Ang-1和Ad-Ang-1-IRES-VEGF165第一代病毒，再二次感染293A细胞，在倒置荧光显微镜下可观察到荧光，并出现CPE，结果表明该四种病毒在293A细胞中包装成功。经多轮感染、扩增后，最终获得可达5×109pfu/ml效价病毒子于-80℃保存备用。 
实施例9：重组腺病毒的RT-PCR鉴定 
分别收集经Ad-Ang-1-PolyA-promoter-VEGF165、Ad-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-1、Ad-VEGF165-IRES-Ang-1感染的QBI-293A细胞和未感染病毒的QBI-293A细胞，提取其总RNA进行RT-PCR，以制备的3组cDNA为模板，P1、P2；P3、P4为引物分 别鉴定VEGF165、Ang-1、内参照β-actin基因在QBI-293A细胞中的转录。可见各感染组均可产生预期大小的576bp VEGF165、1497bpAng-1产物；QBI-293A未感染病毒的细胞对照组在相应位置均未产生上述条带。RT-PCR鉴定结果初步表明成功构建了由IRES介导和polyA+promoter介导的三套Ang-1和VEGF165双基因共表达重组腺病毒表达载体。 
实施例10：ELISA法比较四种重组腺病毒在WI-38细胞中VEGF165和Ang-1细胞因子分泌水平 
将处于对数生长期的WI-38细胞消化调至细胞浓度1×108L-1，以1ml/孔接种于24孔细胞培养板上，细胞培养24h后用50MOI的Ad-Ang-1-PolyA-promoter-VEGF165、Ad-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-1、Ad-Ang-1-IRES-VEGF165、Ad-VEGF165-IRES-Ang-1和空载体Ad-GFP腺病毒感染WI-38细胞，每组设3个复孔，感染病毒48h后，观察细胞生长形态及病毒感染后荧光强度。 
上述各组细胞在病毒感染48h后，取各组细胞培养上清，用ELISA法测定上清中VEGF165和Ang-1的含量，结果显示：PBS组与Ad-GFP组中各组WI-38细胞分泌较少水平的VEGF165和Ang-1细胞因子，但IRES/PolyA-promoter介导的VEGF165及Ang-1双基因组可使导入VEGF165和Ang-1目的基因各组的WI-38细胞中的表达水平均有更明显的提高(P＜0.05)；IRES介导的Ang-1及VEGF165基因，无论在IRES上游或下游，其表达量均低于由polyA-promoter介导的相同位置的Ang-1及VEGF165基因表达量(P＜0.05)，同时Ang-1/VEGF165在同一载体上、下游不同位置，其下游基因的表达量均明显低于上游基因表达量(P＜0.05)。 
结果表明，腺病毒介导的VEGF165及Ang-1双基因载体能在WI38细胞中有效表达；polyA-promoter比IRES介导的双基因表达效率高，同时两者下游基因的表达量均明显低于上游基因表达量。 
实施例11：兔角膜缘注射IRES/PolyA-promoter介导的VEGF165及Ang-1双基因病毒诱导角膜新生血管能力的比较 
取新西兰大白兔10只，随机分为五组，分别注射Ad-Ang-1-PolyA-promoter-VEGF165、Ad-VEGF165-PolyA-promoter--Ang-1、Ad-Ang-1-IRES-VEGF165、Ad-VEGF165-IRES-Ang-1及Ad-GFP病毒。肌肉注射***5mg/kg全身麻醉，兔眼周擦拭安尔碘消毒，每只眼滴1～2滴倍诺喜表面麻醉，置开睑器，用庆大霉素注射液冲洗双眼结膜囊。每只兔眼上方12点角巩膜缘处角膜基质内注射上述五种病毒各0.05ml，注射结束庆大霉素注射液再次冲洗结膜囊，涂金霉素眼膏。角膜基质内注射病毒第3天，第1周，第1月分别照相记录角膜新生血管形成情况。角膜新生血管生长面积计算按Robert电脑数学模型公式计算：C/12×3.1416[r2-(r-l)2](图2)。其中C为发生新生血管的角膜圆周钟点数，r为角膜半径，l为血管长度。 
结果显示：注射Ad-VEGF165-polyA-promoter-Ang-1、Ad-VEGF165-IRES-Ang-1的兔角膜边缘，1w后角膜缘注射区附近结膜血管中度充血，充血局限在病毒注射区域；注射后2w角膜缘附近结膜充血稍有减轻，可见毛刷样新生血管长入角膜内；注射后第4w结膜充血明显减轻，可见角膜新生血管已延伸至瞳孔缘，其顶端分叉，部分交织呈网状；且前者比后者更为显著(p＜0.05)；而注射Ad-Ang-1-polyA-promoter-VEGF165、Ad-Ang-1-IRES-VEGF165及Ad-GFP的兔角膜边缘，1w后仅引起角膜缘注射区附近结膜轻度充血，注射后2w结膜充血既明显减轻，仅少量血管长入角膜内，且局限于角膜边缘，注射后第4w结膜充血完全消退，角膜内仅存极少量新生血管，该三组间无明显统计学差异(p＞0.05)。 
表明兔角膜缘注射Ad-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-1及Ad-VEGF165-IRES-Ang-1能成功诱导角膜新生血管形成，且前者比后者效果更为显著，而无论是IRES载体还是polyA-promoter载体，VEGF165基因只有位于载体上游时才能成功的诱导角膜新生血管形成，位于载体下游时则不能很好的诱导角膜新生血管形成。 
实施例12：免疫组化法检测兔角膜中VEGF165及Ang-1的表达。 
参照实施例10所述方法兔角膜注射病毒一月后，注射处死实验兔，摘除眼球，取全角膜片立即置10％***固定，常规石蜡包埋，垂直于角膜表面连续切片，厚约5μm。将包埋的角膜组织按免疫组化SP法分别检测VEGF165、Ang-1因子的表达，染色结果：细胞浆黄色(+)；棕色(++)；棕黑色(+++)。 
结果显示：注射含VEGF165及Ang-1病毒的兔角膜层中均可见VEGF165、Ang-1不同程度的阳性表达，其中VEGF165和Ang-1位于polyA-promoter/IRES上游时比位于下游时阳性表达更为明显，呈棕黑色(+++)，而注射Ad-GFP病毒的角膜层中未见明显VEGF165及Ang-1阳性表达。 
实施例13：HE染色及CD34免疫组化法检测兔角膜中新生血管密度 
参照实施例10所述方法兔角膜缘注射双基因病毒，分别于注射病毒1月后空气注射处死实验兔，摘除眼球。取全角膜片立即置10％***固定，常规石蜡包埋，垂直于角膜表面连续切片，厚约5μm。HE染色及CD34免疫组化法检测兔角膜中微血管密度。以含红细胞的红色血管腔(HE染色)或棕黄色血管腔(CD34染色)为阳性血管数。免疫组化检测每张切片100倍光镜下观察，共记数10个视野进行分析统计。所有数据用 
Figure BSA00000310391700171
表示，用SAS软件对所有实验数据进行统计学处理，采用方差分析，P＜0.05。 
结果如图3所示，注射Ad-VEGF165-polyA-promoter-Ang-1、Ad-VEGF165-IRES-Ang-1的兔角膜与注射Ad-Ang-1-polyA-promoter-VEGF165、Ad-Ang-1-IRES-VEGF165及Ad-GFP的角膜相比，HE染色可见丰富的毛细血管，CD34免疫组化分析呈现明显强阳性，微血管密度为(11.9±2.4)个/高倍视野，差别有统计学意义(P＜0.05)，且前者比后者更为显著(P＜0.05)；而注射Ad-Ang-1-polyA-promoter-VEGF165、Ad-Ang-1-IRES-VEGF165及 Ad-GFP的三组兔角膜边缘内毛细血管均少见，未见明显CD34阳性表达，差别无统计学意义(P＞0.05). 
实施例14：兔骨髓基质细胞的分离和培养 
取新西兰大白兔一只(苏州大学实验动物中心)，骨髓穿刺法获得兔骨髓原代细胞，加入含5％胎牛血清的合成细胞培养基(EBM-2-MV)中，置37℃，5％CO2下培养。将3d后换液，以去除未贴壁的血细胞。7～14d细胞即可铺满细胞培养瓶底，兔骨髓基质细胞(Rabbit bonemarrow mesenchymal stem cells，BMSCs)呈贴壁生长，并形成细胞集落，经换液或传代，非贴壁的杂细胞被清除，基质细胞得以纯化而继续培养。 
0.25％胰酶消化原代分离培养的骨髓基质细胞[MSC]，调至细胞浓度1×108L-1，以1ml/孔接种于铺有再生丝素膜[SF]的24孔培养板上，分三组：实验组(加入50MOI Ad-VEGF 165-polyA-promoter-Ang-1的SF+MSC+Ad-VEGF165-polyA-promoter-Ang-1组，简称：SF+MSC+Ad-VA组)、阴性对照组(加入50MOI Ad-GFP的SF+MSC+Ad-GFP组)、细胞对照组(SF+MSC组)，每组设三个复孔，于37℃，5％CO2条件下培养72h后在倒置荧光显微镜下观察细胞形态变化及荧光感染情况。 
再生丝素膜上生长的兔骨髓基质细胞呈贴壁生长，状态良好，细胞透明，形态完整，呈梭形伸展。感染腺病毒Ad-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-1、Ad-GFP的兔骨髓基质细胞在荧光显微镜下可见强绿色荧光，而未感染腺病毒的细胞则无荧光。这显示再生丝素膜对转基因细胞生长无不良作用。 
实施例15：RT-PCR法检测再生丝素膜上Ad-VEGF165-PolyA-promoter-Ang1转基因兔骨髓基质细胞的细胞因子转录水平 
用50MOI的Ad-VEGF 165-PolyA-promoter-Ang1和Ad-GFP病毒分别感染再生丝素膜上培养的兔骨髓基质细胞48h后，收集细胞，PBS 洗涤2-3次，按试剂盒说明书要求提取细胞总RNA，用VEGF165引物 
P5：5’-gcaagatctatgaactttctgctgtcttgggtg-3’， 
P6：5’-taagtcgacctcaccgcctcggcttgtcacatc-3’， 
Ang 1引物P7：5’-taggcggccgcatgacagttttcctttcctttgc-3’， 
P8：5’-accctcgagtcaaaaatctaaaggtcgaatcatc-3’进行RT-PCR鉴定，PCR反应条件为94℃ 4min，94℃ 50sec、58℃ 50sec、72℃ 1min、35cycle，72℃ 10min，最后各取10μl产物与DNAMarker行琼脂糖凝胶电泳。 
结果如图4显示：SF+MSC+Ad-VA组的VEGF165、Ang-1基因和β-actin均出现阳性条带；而SF+MSC组及SF+MSC+Ad-GFP组均只有β-actin出现阳性条带。 
实施例16：ELISA法检测再生丝素膜上Ad-VEGF165-PolyA-promoter-Ang1转基因兔骨髓基质细胞的细胞因子分泌水平 
将处于对数生长期的兔骨髓基质细胞消化调至细胞浓度1×105/ml，以1ml/孔接种于铺有再生丝素膜的24孔细胞培养板上，实验分组同前，感染病毒48h后，取各组上清，按ELISA检测试剂盒说明测定Ang1、VEGF的含量。结果显示：SF+MSC组与SF+MSC+Ad-GFP组中兔骨髓基质细胞仅能低水平自分泌VEGF165及Ang-1细胞因子，但SF+MSC+Ad-VA组表达水平明显提高(*P＜0.05)。 
实施例17：Ad-VEGF165-PolyA-promoter-Ang1转基因兔骨髓基质细胞修饰的再生丝素膜植入兔角膜层后新生血管的观察及测量 
肌肉注射***5mg/kg全身麻醉，兔眼周擦拭安尔碘消毒，每只眼滴1～2滴倍诺喜表面麻醉，置开睑器，用庆大霉素注射液冲洗双眼结膜囊。以角膜12点方向为中心”L”形(5×4mm)切开角膜基质，深度为1/2角膜厚度，用钻石刀水平分离角膜基质层，在角膜基质内形成5×4mm囊袋，将4×3mm转基因细胞修饰的再生丝素膜埋入角膜层间，角膜切口缝合3针，植入结束后庆大霉素注射液再次冲洗结膜囊，涂金霉素眼膏。 
兔角膜植入转基因细胞修饰的再生丝素膜后第1周，第2周，第1月分别照相记录角膜新生血管形成情况。角膜新生血管生长面积计算按Robert电脑数学模型公式计算：C/12×3.1416[r2-(r-l)2](图2)。其中C为发生新生血管的角膜圆周钟点数，r为角膜半径，l为血管长度，统计结果见图5。 
兔角膜层植入转基因细胞修饰的再生丝素膜1w后，五组兔角膜缘均出现的中度结膜充血，充血局限于手术切口周围；丝素材料(SF)植入区域的角膜轻度水肿；角膜缘可见毛刷样细小毛细血管；再生丝素材料植入2w后各组角膜缘附近结膜充血均减轻，丝素材料植入区域的角膜水肿稍有减轻；SF+MSC+Ad-GFP组及SF+MSC组角膜缘周围毛刷样细小血管逐渐消退，而SF+MSC+Ad-A(Ad-PolyA-promoter-Ang-1)、SF+MSC+Ad-V(Ad-VEGF-PolyA-promoter)、SF+MSC+Ad-VA组毛刷样新生血管***，由角膜缘延伸入丝素膜植入区域，且SF+MSC+Ad-V、SF+MSC+Ad-VA组比SF+MSC+Ad-A组更为明显；植入第4w后各组结膜充血基本消退；角膜缘处毛细血管完全消退；SF植入区域的角膜逐渐透明，SF+MSC+Ad-GFP组及SF+MSC组再生丝素膜植入区域内的新生血管基本消退，而SF+MSC+Ad-A、SF+MSC+Ad-V、SF+MSC+Ad-VA组血管形成较多，其中SF+MSC+Ad-VA组血管形成更为明显，粗大新生血管已完全覆盖再生丝素膜移植区域，并达到角膜中央区域(*P＜0.05)。 
实施例18：HE染色及CD34免疫组化法检测转基因细胞修饰的再生丝素膜植入后兔角膜中新生血管密度 
分别于角膜植入转基因修饰的再生丝素膜1月后空气注射处死实验兔，摘除眼球。取全角膜片立即置10％***固定，常规石蜡包埋，垂直于角膜表面连续切片，厚约5μm。HE染色及CD34免疫组化法检测兔角膜中微血管密度。免疫组织化学染色(武汉博士德公司提供一抗，上海基因公司提供二抗)具体方法如下：石腊切片，0.3％过氧化氢孵育30min，PBS浸泡，加入10％正常山羊血清(PBS稀释)10min， 加入VEGF(1∶30)一抗，PBS冲洗，滴加广谱生物素标记的二抗37℃孵育，ABC显色剂显色，复染，封片。以含红细胞的红色血管腔(HE染色)或棕黄色血管腔(CD34染色)为阳性血管数。免疫组化检测每张切片100倍光镜下观察，共记数10个视野进行分析统计。 
结果显示，植入转Ad-VEGF165-Ang1基因细胞修饰的再生丝素膜后角膜基质内SF+MSC+Ad-VEGF165-Ang-1组的HE染色可见丰富的毛细血管，CD34免疫组化分析呈现明显强阳性，微血管密度为(17±3.5)个/高倍视野，而SF+MSC+Ad-GFP组与SF+MSC组角膜基质内毛细血管少见，未见明显CD34阳性表达，差别有统计学意义(*P＜0.05)。 
实施例19：免疫组化法观察转基因细胞修饰的再生丝素膜植入后角膜层中VEGF165、Ang-1、HIF-α、bFGF、EGF、PDGF的表达 
兔角膜植入转基因修饰的再生丝素膜一月后，注射处死实验兔，摘除眼球，取全角膜片立即置10％***固定，常规石蜡包埋，垂直于角膜表面连续切片，厚约5μm。将包埋的角膜组织按免疫组化SP法分别检测VEGF165、Ang-1、HIF-α、bFGF等因子的表达，染色结果：细胞浆黄色(+)；棕色(++)；棕黑色(+++)。免疫组化检测每张切片400倍光镜下观察，共记数10个视野，使用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分别测量所采集角膜组织中VEGF165、Ang-1、HIF-α、bFGF、EGF、PDGF阳性面积百分比(Ratio of positive area)，计算其平均值。所有数据用 
Figure BSA00000310391700211
表示，用SAS软件对所有实验数据进行统计学处理，采用方差分析，P＜0.05。 
结果见图6，显示：兔角膜层植入转VEGF165及Ang-1基因细胞修饰的再生丝素膜后的SF+MSC+Ad-VEGF165-Ang-1组角膜基质内可见VEGF165、Ang-1日性表达，呈现棕黑色(+++)，而SF+MSC+Ad-GFP组与SF+MSC组角膜基质内未见明显VEGF及Ang-1阳性表达，差别有统计学意义(P＜0.05)。 
兔角膜层植入转VEGF165及Ang-1基因细胞修饰的再生丝素膜后 的SF+MSC+Ad-VEGF165-Ang-1组HIF-α、bFGF的表达呈棕黑色(+++)，显著高于SF+MSC+Ad-GFP组与SF+MSC对照组(P＜0.05)；而EGF、PDGF的表达与SF+MSC+Ad-GFP组与SF+MSC对照组均呈现棕色(++)，组间无统计学意义(P＞0.05)，说明转VEGF165及Ang-1基因细胞修饰的再生丝素膜不仅VEGF165及Ang-1目的基因使能在角膜层中有效表达，而且能促进骨髓基质细胞自分泌的HIF-α、bFGF水平提高，并维持骨髓基质细胞自分泌的EGF、PDGF的正常稳定表达。 
实施例20：大鼠骨髓基质细胞的分离和培养 
取雄性SD大鼠(苏州大学实验动物中心)，拉颈处死后无菌条件下取双侧胫骨和股骨，剪去干骺端，用EBM-2-MV完全培养液冲洗骨髓腔，培养液中添加了SingleQuots，其中含血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维生长因子(FGF2)、R3胰岛素生长因子(R3-IGF-1)、内皮生长因子(EGF)、抗坏血酸及5％胎牛血清等相关组分，将含5％胎牛血清的合成细胞培养基(EBM-2-MV)，收集冲洗液于培养皿中，轻轻吹匀，置37℃，5％CO2下培养。3d后换液，以去除未贴壁的血细胞。7～14d细胞即可铺满细胞培养瓶底，大鼠骨髓基质细胞(ratmarrow stromal cells，rMSCs)呈贴壁生长，并形成细胞集落，经换液2-3次后，非贴壁的杂细胞大部分被清除，骨髓基质细胞得以初步纯化而继续培养。 
0.25％胰酶消化原代分离培养的骨髓基质细胞，调至细胞浓度1×108L-1，以1ml/孔接种于铺有再生丝素膜的24孔培养板上，细胞培养24h后用50MOI的Ad-VEGF165-Ang1重组腺病毒(Ad-AV组)和空载体Ad-PolyA-promoter与Ad-IRES(空载体对照组)，同时设未感染病毒的细胞对照组。 
实施例21：大鼠创伤修复实验 
1、实验方法 
6～8周健康雄性SD大鼠40只，体重180～220g，实验时动物用3.5％水合氯醛按10ml/kg体重经腹腔注射麻醉，在脊柱旁腰背部两侧分别作约2cm×2cm的方形切口，深达皮下即皮肤全层。将创伤大鼠分为4组：再生丝素膜(SF)组、再生丝素膜+MSC细胞(SFMSC)组、再生丝素膜+MSC细胞+Ad-VEGF-Ang1(SFMSCVA)组及空白对照(PBS)组，每组为10只。选取伤后7、14d共两个时相点，每组每个时相点各10个创面(每只大鼠2个创面)。距创口周围的0.5cm处，在上下左右4处将实施例20准备好的各组丝素材料用手术线将其与皮肤缝合覆盖创口，空白对照组不作任何处理；术后在其创面外涂红霉素软膏以防感染，将动物单笼喂养，自由进食、水。 
术后每天观察动物创口愈合情况，7、14d以水合氯醛作腹腔注射麻醉后观察各组血管分布结果，并取其组织置于10％中性甲醛溶液中固定、石蜡包埋，制作病理切片行HE染色，再采用Ang-1、VEGF和CD34抗体检测组织中目的基因的表达和血管密度。 
石蜡切片用免疫组化染色步骤按SP免疫组化试剂盒说明书检测VEGF、Ang-1和CD34因子的表达，初步研究创面愈合的机制。每张切片400倍光镜下观察，共记数10个视野，使用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分别测量所采集全层皮肤缺损创面中VEGF、Ang-1和CD34阳性面积百分比(Ratio of positive area)，计算其平均值。所有数据用 
Figure BSA00000310391700231
表示，用SAS软件对所有实验数据进行统计学处理，采用方差分析，P＜0.05。 
2结果 
2.1创面一般观察 
伤后1d，再生丝素膜+MSC的SFMSC组、再生丝素膜+MSC+Ad-VA的SFMSCVA组伤口开始收缩且出现少许红晕，表明肉芽组织已在生长，而其他各组伤口湿润；伤后3d，SFMSC组、SFMSCVA组较空白对照PBS组和再生丝素膜SF组肉芽组织生长明显，创缘皮肤收缩明显；伤后7d，前者伤口干燥、无感染，创面底部及创缘可见 不同程度的新生毛细血管，而后者伤口湿润、有渗出。伤后14d，前者大鼠创缘端表皮增生并覆盖部分创面，肉芽组织趋于成熟，而后者创面内肉芽组织疏松，并且SFMSCVA组均高于SFMSC组。 
2.2HE染色观察 
结果显示，术后7d，SFMSC组、SFMSCVA组大鼠创面底部及创缘肉芽组织较致密，毛细血管和成纤维细胞丰富，而PBS组、SF组大鼠创面内新生毛细血管较少，深层肉芽组织疏松；术后14d，SFMSC组、SFMSCVA组大鼠创缘端表皮增生并覆盖部分创面，肉芽组织趋于成熟，成纤维细胞较丰富，毛细血管与创面垂直生长，并且SFMSCVA组均高于SFMSC组。 
2.3免疫组织化学观察 
创伤恢复的组织切片经VEGF抗体免疫组化SP法染色检测，结果见图7-9，显示VEGF主要分布在成纤维细胞及血管内皮细胞的胞浆中，术后7d，PBS组、SF组VEGF为阳性，而SFMSC组、SFMSCVA组则为强阳性，其差异有统计学意义(P＜0.05)。术后14d，各组VEGF表达均减弱，但SFMSC组、SFMSCVA组仍高于PBS组、SF组(P＜0.05)，并且SFMSCVA组均高于SFMSC组，而PBS组与SF组均没有明显差别。 
创伤恢复的组织切片经Ang-1抗体免疫组化SP法染色检测，结果显示，术后7d，PBS组、SF组Ang-1为阳性，而SFMSC组、SFMSCVA组则为强阳性，其差异有统计学意义(P＜0.05)。术后14d，各组Ang-1表达均减弱，但SFMSC组、SFMSCAV组仍高于PBS组、SF组，并且SFMSCVA组均高于SFMSC组(P＜0.05)，而PBS组与SF组均没有明显差别。 
创伤恢复的组织切片经CD34抗体免疫组化SP法染色检测，结果显示，术后7d，PBS组、SF组大鼠全层皮肤缺损创面内毛细血管内皮细胞胞质内CD34呈阳性，而SFMSC组、SFMSCVA组则为强阳性，其差异有统计学意义(P＜0.05)，术后14d，各组CD34阳性的毛细血 管数均减少，但SFMSC组、SFMSCVA组大鼠全层皮肤缺损创面中毛细血管数仍高于PBS组、SF组，并且SFMSCVA组均高于SFMSC组(P＜0.05)，而PBS组与SF组均没有明显差别。 
实施例22：其它三种双基因重组腺病毒的效果检测 
参照实施例14-21所述方法，对另外三种双基因重组腺病毒Ad-Ang-1-IRES-VEGF165、Ad-VEGF165-IRES-Ang-1、Ad-Ang-1-PolyA-promoter-VEGF165检进行转基因细胞修饰的再生丝素膜植入后观察兔角膜中新生血管密度，角膜层中VEGF165、Ang-1、HIF-α、bFGF、EGF、PDGF的表达，兔骨髓基质细胞的细胞因子转录水平以及大鼠创伤修复实验，检测结果显示，仅仅双基因重组腺病毒Ad-VEGF165-IRES-Ang-1具有与Ad-VEGF165-PolyA-promoter-Ang1重组腺病毒类似的促进血管增生的作用，其转骨髓基质细胞修饰的丝素材料可促进创伤组织的血管生成，实验过程在此不再赘述。 
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。 

Claims (10)

1.一种重组质粒pAdTrack-CMV-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-1，其保藏号为：CCTCC M 2010221。
2.经权利要求1所述重组质粒与腺病毒pAdEasy-1同源重组在QBI-293A细胞中包装产生的重组腺病毒Ad-VEGF 165-PolyA-promoter-Ang-1。
3.一种重组质粒pAdTrack-CMV-VEGF 165-IRES-Ang-1，其保藏号为；CCTCC M 2010220。
4.经权利要求3所述重组质粒与腺病毒pAdEasy-1同源重组，在QBI-293A细胞中包装产生的重组腺病毒Ad-VEGF165-IRES-Ang-1。
5.权利要求2或4所述重组腺病毒在制备促血管生长药物中的应用。
6.一种制备转基因细胞修饰的丝素膜的方法，其特征在于，包含以下步骤：
将骨髓基质细胞接种于丝素膜上，加入权利要求2或4所述重组腺病毒，所述再生丝素膜每平方厘米上骨髓基质细胞浓度为0.5×105--1×105，重组腺病毒接种量为20-30MOI，于37℃，5％CO2条件培养。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述骨髓基质细胞处于对数生长期。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述骨髓基质细胞为原代培养的骨髓基质细胞，细胞浓度1×108L-1。
9.根据权利要求6-8任一项所述方法制备的转基因细胞修饰的丝素膜。
10.根据权利要求9所述的转基因细胞修饰的丝素膜在制备血管诱导性和创伤修复的医用生物材料的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103602625A (zh) * 2013-08-16 2014-02-26 苏州大学 含有重组腺病毒质粒的大肠杆菌及重组腺病毒的应用
WO2021091434A3 (ru) * 2019-11-06 2021-09-23 Общество С Ограниченной Ответственностью "Генная И Клеточная Терапия" Генно-инженерная конструкция для стимуляции ангиогенеза

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101591658A (zh) * 2008-11-21 2009-12-02 苏州大学 Ing4和il-24双基因共表达载体及其用途

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1307582B1 (en) * 2000-08-08 2008-05-28 M.G.V.S. Ltd. Nucleic acid constructs, vascular cells transformed therewith, pharmaceutical compositions and methods utilizing same for inducing angiogenesis
CN1594556B (zh) * 2004-07-16 2011-04-20 谭最 受重组共基因腺相关病毒感染的骨髓单个核细胞及其应用
EP1655035A1 (en) * 2004-11-05 2006-05-10 Seyedhossein Aharinejad Treatment of heart failure with CSF-1
CN102191209A (zh) * 2010-08-26 2011-09-21 苏州大学 VEGF165和Ang-1双基因共表达载体及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101591658A (zh) * 2008-11-21 2009-12-02 苏州大学 Ing4和il-24双基因共表达载体及其用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘铁连: "ANG-1 或/和VEGF165转基因细胞修饰的再生丝素膜诱导血管形成效应及分子机制研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库，医药卫生科技辑》 *
孟国林 等: "血管生成素1和报告基因EGFP双基因共表达腺病毒的构建", 《第四军医大学学报》 *
张金康等: "携带人VEGF165 和ANG-1双基因的腺病毒载体的构建及目的基因的表达", 《中国矫形外科杂志》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103602625A (zh) * 2013-08-16 2014-02-26 苏州大学 含有重组腺病毒质粒的大肠杆菌及重组腺病毒的应用
CN103602625B (zh) * 2013-08-16 2015-09-30 苏州大学 含有重组腺病毒质粒的大肠杆菌及重组腺病毒的应用
WO2021091434A3 (ru) * 2019-11-06 2021-09-23 Общество С Ограниченной Ответственностью "Генная И Клеточная Терапия" Генно-инженерная конструкция для стимуляции ангиогенеза

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