CN102242097A - 一种提高beta葡聚糖酶活力持续性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种使β葡聚糖酶成为酿酒酵母细胞有机组成部分的技术，使β葡聚糖酶只要酿酒酵母细胞保持存活即可保持活力，从而显著提高β葡聚糖酶活力持续性。将beta葡聚糖酶基因(Genbank号：U60830)连接(常规方法连接)在酿酒酵母细胞壁成份FLO序列(Genbank号：S73336)的N端，然后***(通过常规方法***)酿酒酵母表达载体GAL 1启动子(Genbank号：AY428072)下游MFα1信号肽序列(Genbank号：M17301)的C端，构建成表达框，表达框从N端到C端：GAL1启动子+MFα1信号肽序列+beta葡聚糖酶基因+FLO序列；将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞。本发明的优点：将β葡聚糖酶与酿酒酵母细胞壁成分FLO连接，如此则只要酿酒酵母细胞保持存活状态，β葡聚糖酶即可保持活力。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物工程领域，特别涉及一种在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞壁外表面展露表达β葡聚糖酶以提高该酶活力持续性的方法。
背景技术
谷物及其加工副产物是常用的饲料原料，但这些饲料含有高含量β葡聚糖，会提高单胃动物消化道粘度，妨碍动物消化酶对饲料的消化利用。添加外源β葡聚糖酶具有提高单胃动物消化率、报酬率和生产性能的效果。
外源β葡聚糖酶在饲料中已广泛应用，但酶活力持续性不足是目前应用的β葡聚糖酶存在的一个问题。包括β葡聚糖酶在内的各种酶的重组表达方式有细胞内表达和分泌表达两种，这两种酶的重组表达方式使酶分子与宿主细胞之间没有关联，即酶分子不是宿主细胞的组成部分，从而很容易失活。如果使酶分子成为细胞的有机组成部分，则只要细胞保持存活状态酶分子也会保持活力，从而可以显著提高酶的活力持续性。
本发明开发一种使β葡聚糖酶成为酿酒酵母细胞有机组成的技术，即将β葡聚糖酶与酿酒酵母细胞壁成分FLO连接而成为酿酒酵母细胞的组成部分，只要酿酒酵母细胞保持存活则β葡聚糖酶始终保持活性状态，从而显著提高了β葡聚糖酶活力持续性。
发明内容
针对现有的β葡聚糖酶活力持续性不足的问题，本发明提供一种使β葡聚糖酶成为酿酒酵母细胞有机组成部分的技术，使β葡聚糖酶只要酿酒酵母细胞保持存活即可保持活力，从而显著提高β葡聚糖酶活力持续性。
将beta葡聚糖酶基因(Genbank号：U60830)连接(常规方法连接)在酿酒酵母细胞壁成份FLO序列(Genbank号：S73336)的N端，然后***(通过常规方法***)酿酒酵母表达载体GAL1启动子(Genbank号：AY428072)下游MFα1信号肽序列(Genbank号：M17301)的C端，构建成表达框，表达框从N端到C端：GAL1启动子+MFα1信号肽序列+beta葡聚糖酶基因+FLO序列；将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞。
将包含“权利要求1”所述表达框的酿酒酵母细胞培养于添加有3-5％(重量百分比)半乳糖(普通半乳糖)的YPD培养基中。
本发明的优点：
将β葡聚糖酶与酿酒酵母细胞壁成分FLO连接，如此则只要酿酒酵母细胞保持存活状态，β葡聚糖酶即可保持活力。
具体实施方式
以下通过实施例进一步对本发明进行描述：
实施例1β葡聚糖酶展露表达
将β葡聚糖酶基因(来自Bacillus subtilis，Genbank号：U60830)连接在酿酒酵母细胞壁成份FLO序列的N端(来自酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，Genbank号：S73336)，然后***酿酒酵母表达载体GAL1启动子下游(来自酿酒酵母表达载体pYES263，Genbank号：AY428072)MFα1信号肽(来自酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，Genbank号：M17301)序列的C端，构建成表达框(从N端到C端)：GAL1启动子+MFα1信号肽序列+β葡聚糖酶基因+FLO序列。将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞(Saccharomycescerevisiae，购自安琪酵母股份有限公司)，则MFα1信号肽将引导β葡聚糖酶向酿酒酵母细胞外分泌，而β葡聚糖酶下游的FLO序列则锚定在酿酒酵母细胞壁中，从而使β葡聚糖酶展露表达在酿酒酵母细胞壁外表面。
实施例2β葡聚糖酶展露表达的诱导
在培养酿酒酵母的YPD培养基中，添加3-5％半乳糖(购自上海生工生物工程有限公司，Shanghai Sangon Biological Engineering Technology & ServicesCo.，Ltd.)，则表达框“GAL1启动子+MFα1信号肽序列+β葡聚糖酶基因+FLO序列”中的GAL1启动子就会活化，诱导β葡聚糖酶在酿酒酵母细胞壁外表面展露表达。
实施例3半乳糖对β葡聚糖酶展露表达的作用
在培养酿酒酵母的YPD培养基中，如果不含半乳糖，则未检测到β葡聚糖酶活性，这是因为表达框“GAL1启动子+MFα1信号肽序列+β葡聚糖酶基因+FLO序列”中的GAL1启动子无法活化。
实施例4β葡聚糖酶展露表达后其活力持续性显著提高
按照实施例1和实施例2所示步骤进行展露表达的β葡聚糖酶活性为867U/mL(3％半乳糖)和827U/mL(5％半乳糖)，半衰期均为62天，即第62天时能保持起始活性的一半。而如果在实施例1和实施例2所示的展露表达表达框“GAL1启动子+MFα1信号肽序列+β葡聚糖酶基因+FLO序列”中去除FLO序列序列，则β葡聚糖酶进行分泌表达，活性为338U/mL(3％半乳糖)和341U/mL(5％半乳糖)，半衰期均仅为6天，即第5天时能保持起始活性的一半。因此，将β葡聚糖酶与酿酒酵母细胞壁成分FLO连接而成为酿酒酵母细胞的组成部分，只要酿酒酵母细胞保持存活则β葡聚糖酶始终保持活性状态，从而显著提高了β葡聚糖酶活力持续性。
对β-葡聚糖酶活性测定采用还原糖测定法，活性单位定义为：在pH 5.0、40℃条件下，每分钟从1％β-葡聚糖(购自上海生工生物工程有限公司，Shanghai Sangon Biological Engineering Technology & Services Co.，Ltd.)底物溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活单位，简称为U。
最后，需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种提高beta葡聚糖酶活力持续性的方法，其特征在于包括以下步骤：
将beta葡聚糖酶基因连接在酿酒酵母细胞壁成份FLO序列的N端，然后***酿酒酵母表达载体GAL1启动子下游MFα1信号肽序列的C端，构建成表达框，表达框从N端到C端：GAL1启动子+MFα1信号肽序列+beta葡聚糖酶基因+FLO序列；将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将包含“权利要求1”所述表达框的酿酒酵母细胞培养于添加有重量百分比3-5％半乳糖的YPD培养基中。
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| CN2010101728130A CN102242097A (zh) | 2010-05-14 | 2010-05-14 | 一种提高beta葡聚糖酶活力持续性的方法 |
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| CN (1) | CN102242097A (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1681942A (zh) * | 2002-09-13 | 2005-10-12 | 韩国生命工学研究院 | 使用酵母表面展示载体筛选具有改良的酶活性的脂肪酶的方法和该脂肪酶 |
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2010
- 2010-05-14 CN CN2010101728130A patent/CN102242097A/zh active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN1681942A (zh) * | 2002-09-13 | 2005-10-12 | 韩国生命工学研究院 | 使用酵母表面展示载体筛选具有改良的酶活性的脂肪酶的方法和该脂肪酶 |
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