CN102241751B - 一种具有抗肿瘤活性的新型真菌免疫调节蛋白fip-nha及其基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的新型真菌免疫调节蛋白FIP-NHA及其基因。根据本发明的真菌免疫调节蛋白FIP-NHA，其具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，编码该真菌免疫调节蛋白的基因fip-nha，其具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。本发明的真菌免疫调节蛋白FIP-NHA具有以下性质：对脾淋巴细胞具有催***作用，增加细胞介素2的合成，对三种肿瘤细胞包括肝癌细胞HepG2、胃癌细胞MGC823和白血病细胞HL60均具有明显的抑制增殖作用，因此作为一种新型抗肿瘤生物制剂，可广泛用于保健品及生物医药领域。

Description

一种具有抗肿瘤活性的新型真菌免疫调节蛋白FIP-NHA及其基因

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种具有抗肿瘤活性的新型真菌免疫调节蛋白FIP-NHA及其基因。

背景技术

真菌免疫调节蛋白(FIPs)是近年来从一些高等担子菌(蘑菇类)子实体中提取得到的一类小分子蛋白质，具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、降低胆固醇和抑制肌体自体免疫等多种生物学活性，因而FIPs具有重要的保健、医学、药学价值。它与传统的免疫调节蛋白植物凝集素相似，却具有其自身明显的特点和优势，具体表现为以下几个方面：1)凝集素分子量一般较大，为20-100kD，而FIPs分子量较小，为13kD左右；2)单糖及二糖都不减弱FIPs的血凝集和免疫调节活性，而典型的凝集素会受到单糖或者二糖的抑制；3)FIPs N端10个氨基酸的α螺旋对于诱导免疫活性十分重要，而此结构在一些凝集素中并不存在。

目前国际上已报道从赤灵芝(Ganoderma lucidum)，紫灵芝(Ganodermajaponcium)，松杉灵芝(Ganoderma tsugae)，小孢灵芝(Ganoderma microsporum)，金针菇(Flammulina velutipes)和草菇(Volvariella volvacea)分离纯化了6种FIPs蛋白，分别命名为LZ-8、Gja、Gts、Gmi、Fve、Vvo和Vvl。6种FIPs蛋白由110～114个氨基酸组成，没有His、Cys和Met，但是富含Asp和Val。其N端的氨基酸均为乙酰化阻断氨基酸，分子量约为12～13kD。该类蛋白与人类及鼠类的免疫球蛋白重链可变区的保守部分有较高的同源性。不同的FIPs之间具有较高的同源性，约为57％～100％。天然的真菌免疫调节蛋白都是由两个相同的亚基组成的同源二聚体。N端大约13个氨基酸形成的α螺旋对真菌免疫调节蛋白二聚化的形成以及有效行使其免疫调节功能十分必要。近年来，随着真菌免疫调节蛋白功能的发现以及人们对健康需求的增强，对免疫调节蛋白的研究和利用提出了更高的要求，而真菌免疫调节蛋白作为一类新型免疫调节蛋白，具有很大的潜在应用价值。基于已知的FIPs蛋白又很少，人们对它的生物学特性、免疫调节功能和分子生物学研究有浓厚的兴趣，尤其是随着分子生物学和生物工程技术的迅速发展，利用工程菌株的培养获得大量重组免疫调节蛋白深入开展对真菌免疫调节蛋白的结构、功能和工程菌高效表达的研究具有重要的意义和应用价值，真菌免疫调节蛋白的开发利用具有广阔前景。

临床与医药应用均具有一定的剂量要求，实验过程中发现不同的FIP家族成员在促发免疫反应过程中存在剂量效应，比如在激活人外周血淋巴细胞增殖实验中，FIP-fve的有效浓度为100μg/ml，FIP-vvo的有效浓度仅为5μg/ml，而LZ-8促进鼠脾细胞增殖的最佳浓度是3.13μg/ml。开发和应用此类药品，必须获得相当数量的蛋白质纯品，然而蘑菇含有大量多糖及其它复杂成分，从蘑菇提取天然FIPs难度大又量少，从每千克蘑菇只能提取毫克级蛋白，因此蘑菇提取蛋白成本高，耗时，费力，高消费，量少。1997年HSU等从3kg草菇子实体中提纯FIP-vvo，经不同纯化步骤最终所获得的蛋白质仅94mg。因此获得高产稳定的重组表达FIPs蛋白势在必得。

本发明选取新的思路，利用生物信息学方法得到一种新的真菌免疫调节蛋白，并且利用基因工程的方法得到纯品FIP-NPA蛋白，对其进行一系列免疫学功能鉴定和抗肿瘤等免疫学活性分析。目前世界上报道的FIPs蛋白只有六种，并且全部是从蘑菇中得到的，这样本发明既丰富了FIPs家族的种类，避免了蘑菇蛋白提取的种种缺陷，又满足了临床研究的需求和产业化的需要。

发明内容

本发明的目的是提供来源于菌株Nectria haematococca mpVI 77-13-4(其ATCC保藏号为：MYA-4622)的真菌免疫调节蛋白FIP-NHA。

本发明的再一目的是提供上述真菌免疫调节蛋白FIP-NHA的基因。

本发明的再一目的是提供包含上述真菌免疫调节蛋白FIP-NHA的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述真菌免疫调节蛋白FIP-NHA的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种制备真菌免疫调节蛋白FIP-NHA的方法。

本发明的再一目的是提供上述含有上述真菌免疫调节蛋白FIP-NHA的抗肿瘤药物。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种快速简便获取适合于在保健品和医药中应用的新型真菌免疫调节蛋白FIP-NHA。本发明人通过生物信息学方法筛选到一种来源真菌的免疫调节蛋白FIP-NHA，其适合于在保健品和医药中使用。

从上述菌株中获得了一种真菌免疫调节蛋白FIP-NHA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1：

MATTNDSAVL FYIVASQKKL SFDYTPNWGR GSPNSYIDNL TFPRVLTNKP

YKYRVVKAGQ DLGVRDSYSV QSDGSQKVNF LEYNAGRGIA DTQTIQVYVV

DPDNGNQYLV AQWK

该真菌免疫调节蛋白FIP-NHA全长114个氨基酸，理论分子量为12.837kDa

本发明还提供并合成了编码上述真菌免疫调节蛋白FIP-NHA的基因。

该全基因序列如SEQ ID NO.2所示：

GCTACTACCAACGATTCCGCCGTCTTGTTCTACATTGTCGCATCTCAGAAAAAATTGTCCTTTGACTATACT

CCTAACTGGGGAAGAGGTTCACCAAACAGTTACATTGATAATTTGACCTTTCCAAGAGTTCTTACTAACAAG

CCTTACAAATATAGAGTTGTCAAGGCTGGTCAAGATTTGGGAGTTAGAGACTCTTACTCCGTCCAATCTGAT

GGATCCCAGAAAGTCAACTTCCTTGAATATAATGCTGGTAGAGGAATTGCCGACACTCAGACAATCCAAGTC

TATGTTGTTGACCCAGATAACGGAAACCAATACCTTGTCGCCCAATGGAAGTAA

本发明通过一对引物FIP-nha-F(EcoRI 5’-GAA TTC GCT ACT ACC AAC G-3’)和FIP-nha-R(XhoI 5’-CTC GAG TTA CTT CCA TTG GGC GAC-3’)，用基因合成的方法克隆了这一真菌免疫调节蛋白FIP-NHA，DNA全序列分析结果表明，FIP-NHA全长342bp，其cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。

该蛋白属于一种新型的真菌免疫调节蛋白。将其cDNA序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对发现，该基因与来源于小孢灵芝(Ganodermamicrosporum)真菌免疫调节蛋白GMI的序列一致性最高为67％，与来源于赤灵芝(Ganoderma lucidum)LZ-8为66％；松杉灵芝(Ganoderma tsugae)同源性为66％；紫灵芝(Ganoderma japoncium)FIP-gja 64％，草菇(Volvariellavolvacea)FIP-vvo63％；金针菇(Flammulina velutipes)FIP-fve为59％。说明FIP-NHA是一种新的新型的真菌免疫调节蛋白。并为此编码此蛋白的基因改造和在各种外源基因表达***中高效表达提供优良的基因材料。

本发明还提供了包含上述新型的真菌免疫调节蛋白FIP-NHA基因的重组载体，优选为pGEX-4T-1。将本发明的真菌免疫调节蛋白FIP-NHA基因***到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将真菌免疫调节蛋白FIP-NHA基因***到pGEX-4T-1上的EcoRI和XhoI限制性酶切位点之间，得到重组大肠表达质粒pGEX-FIP-nha。

本发明还提供了包含上述真菌免疫调节蛋白FIP-NHA基因的重组菌株，优选为重组菌株ROS/GST-FIP-NHA。

本发明还提供了一种制备真菌免疫调节蛋白FIP-NHA的方法，包括以下步骤：

1)上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组真菌免疫调节蛋白FIP-NHA的表达；以及

3)回收并纯化所表达的真菌免疫调节蛋白FIP-NHA。

其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌Rosetta细胞，优选将重组表达质粒转化大肠杆菌细胞Rosetta，得到重组菌株ROS/GST-FIP-NHA。运用基因工程手段来产业化生产真菌免疫调节蛋白FIP-NHA产品还未见报道。本发明首次提供了一个新的真菌来源的免疫调节蛋白FIP-NHA，该蛋白对脾淋巴细胞具有催***作用，增加细胞介素2的合成，对三种肿瘤细胞包括肝癌细胞HepG2、胃癌细胞MGC823和白血病细胞HL60均具有明显的抑制增殖作用，可作应用于保健品和医药等工业。根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产真菌免疫调节蛋白FIP-NHA。

附图说明

图1本发明真菌免疫调节蛋白FIP-NHA在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE分析，1，纯化的FIP-NHA 2，GST-FIP-NHA 3，GST-FIP-NHA 4，分子量标准。

图2本发明真菌免疫调节蛋白FIP-NHA的质谱鉴定结果。

图3本发明真菌免疫调节蛋白FIP-NHA促进脾淋巴细胞增殖实验。

图4本发明真菌免疫调节蛋白FIP-NHA促进细胞介素2合成实验。

图5本发明真菌免疫调节蛋白FIP-NHA抗肿瘤实验结果。

图6本发明真菌免疫调节蛋白FIP-NHA抗肿瘤实验结果。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、细胞株：人血红细胞(A、B、AB或O型血)；兔血红细胞；人白血病细胞株HL60；人肝癌细胞HepG2；人胃癌细胞MGC823；4-6周无致敏环境下生长的BalB/C小鼠。

2、试剂盒、酶类、生化试剂和仪器：

试剂盒：Annexin-V-EGFP细胞凋亡检测试剂盒购；ECL发光试剂盒为北京华特生公司产品；小鼠白介素IL-2定量ELISA检测试剂盒和细胞培养板购于北京鼎国生物公司。96孔血凝板，细胞计数板。

PCR引物合成和基因测序均由上海生工生物公司完成。

酶类：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。

仪器：离心机；振荡摇床；显微镜；酶标仪；流式细胞仪

生化试剂：氨苄青霉素，青霉素(钠盐)，硫酸链霉素，溴酚兰，刀豆蛋白A(ConA)，脂多糖(LPS)，噻唑兰(MTT)，小牛血清(BSA)，植物凝集素(PHA)；二甲基亚砜(DMSO)为Sigma产品。

3、培养基

RPM11640培养基(pH7.2)：加入10％BSA，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，0.22μn滤膜过滤灭菌后4℃保存。高糖DMEM培养液。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1真菌免疫调节蛋白FIP-NHA酶编码基因fip-nha的筛选和克隆

根据已发表的真菌免疫调节蛋白保守序列从NCBI真菌基因组数据库中筛选真菌基因。设计了一对引物FIP-nha-F(EcoRI 5’-GAA TTC GCT ACT ACC AAC G-3’)和FIP-nha-R(XhoI 5’-CTC GAG TTA CTT CCA TTG GGC GAC-3’)，用基因合成的方法克隆了来源于真菌Nectria haematococca的真菌免疫调节蛋白FIP-NHA基因，DNA全序列分析结果表明，FIP-NHA全长342bp，其cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2重组真菌免疫调节蛋白FIP-NHA的制备。

将表达载体pGEX-4T-1进行双酶切(EcoRI和XhoI)，同时将合成的编码真菌免疫调节蛋白FIP-NHA的基双酶切(EcoRI和XhoI)，切出编码成熟真菌免疫调节蛋白FIP-NHA的基因片段与表达载体pGEX-4T-1连接，获得含有真菌Nectriahaematococca真菌免疫调节蛋白FIP-NHA基因的重组质粒pGEX-FIP-nha并转化大肠杆菌Rosetta，获得重组菌株ROS/GST-FIP-NHA。

取含有重组质粒的Ros/GST-FIP-NHA菌株，接种于200mL含有0.1mM IPTG和50μg/ml氨苄LB培养液中，25℃250rpm诱导培养6h后，离心收集菌体。然后于用超声破碎，并离心收集上清。过GST纯化后用100U/ml thrombin在30℃作用24h切除GST标签。研究结果显示重组真菌免疫调节蛋白FIP-NHA的表达量为20mg/L。SDS-PAGE结果表明，重组真菌免疫调节蛋白FIP-NHA在大肠杆菌中得到了表达。所表达的真菌免疫调节蛋白FIP-NHA经过纯化之后，其蛋白质的含量达到电泳纯(图1)。经质谱鉴定表达正确(图2)。

实施例3重组真菌免疫调节蛋白的血细胞凝集活性测定

(1)来自健康人细胞(A、B、AB或O型)和兔血细胞2mL，2000rpm，室温离心5分钟。

(2)小心吸出血浆上清，收集离心管底部血红细胞，用pH 7.2 10mM PBS小心洗涤充分重悬浮血细胞，2000rpm，室温离心5分钟，共洗涤5次。

(3)最终使血细胞悬浮于1.5％(V/V)PBS中。

(4)配制0.2％的明胶PBS溶液。

(5)准确称量重组灵芝免疫调节蛋白1mg，溶于1mL PBS中，调节样品浓度使其终工作浓度为1、2、4、8和16μg/mL。

(6)血细胞凝集反应液由25μl血细胞悬浮液，25μL重组蛋白液和50μL明胶(0.2％)混合，加至96孔血凝板，在振荡摇床上轻轻振荡30秒，放入湿润托盘，置于37℃培养箱培养。于1.5和24小时后肉眼和显微镜下观察血细胞凝集结果。

研究结果显示在1.275μg/mL的浓度下对兔血细胞有凝集作用，在100μg/mL的浓度下对人血细胞有凝集作用。

实施例4重组真菌免疫调节蛋白的促脾淋巴细胞增殖活性测定

采用MTT法测定重组真菌免疫调节蛋白对小鼠脾淋巴细胞的催***作用。所用抗生素、重组蛋白样、ConA、LPS和MTT都用0.22μm超滤膜过滤，-20℃保存。

(1)取4-6周无致敏环境下生长的BalB/C小鼠，断颈处死小鼠，75％酒精浸泡3分钟，在超净工作台中无菌条件取脾脏。

(2)采用研磨法(4-6层灭菌纱布)分离脾淋巴细胞。

(3)用3mL RPM11640培养液(不含BSA和双抗)悬浮脾细胞，2000rpm离心，2分钟。

(4)小心吸取上清，重复步骤(3)3-5次。

(5)将脾细胞悬浮于1mL配制好的RPM11640培养液(含有10％BSA、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素)中，稀释浓度至1x10⁶细胞/mL。

(6)在96孔培养板上每孔加入100μL脾淋巴细胞悬浮液，加入重组免疫调节蛋白PBS溶液(终浓度1、2、4、8、16和32μg/mL)，同时加pH7.210mM PBS、ConA(终浓度5μg/mL)和LPS(终浓度2μg/mL)分别做为负对照和正对照。另外，为了观察重组蛋白的协同作用，分别加入重组蛋白与ConA和LPS的混合液。每个测试样品做3个平行孔。

(7)将培养板封口，放置于5％CO2，37℃培养箱中培养48-72小时，在显微镜下观察细胞增殖效果。

(8)沿培养板孔内壁小心加入20μl MTT的PBS液，轻轻振荡30秒混匀，继续培养4-5小时。

(9)小心吸取上清，尽量吸干细胞培养液，加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，轻轻振荡10分钟后，放入酶标仪(Model 680，Bio-Rad)，于570nm测定吸光值，记录读数。制作反应-柱状图。

研究结果显示在很低的浓度(2μg/mL)时，重组真菌免疫调节蛋白对小鼠脾淋巴细胞的催***作用最强(图3)。

实施例5重组真菌免疫调节蛋白的促细胞因子白介素IL-2分泌活性测定

通过ELISA方法检测重组免疫调节蛋白促进小鼠脾淋巴细胞分泌白介素(IL-2)的作用，以测定其免疫调节活性。

(1)BaIB/C小鼠脾淋巴细胞悬浮液制备同上，最终稀释于配制好的RPM11640培养液(含有10％BSA、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素)中，稀释浓度至1x10⁷细胞/mL。

(2)在96孔培养板加入100μL细胞悬浮液，100μL重组蛋白液终工作浓度为1、2、4、8、16和32μg/mL，同时加100μL ConA(5μg/mL)和pH7.2 10mM PBS做正负对照，每个样品做2个平行孔。密封好后，轻轻震荡混匀，放于5％CO₂，37℃培养箱中培养48小时。

(3)吸出细胞培养液，2000rpm室温离心5分钟，收集上清。以下步骤用小鼠IL-2定量ELISA试剂盒操作。

(4)加入100μL样品上清，同时取标准品小鼠IL-2，分别稀释至终浓度为15.6、31.2、62.5、125、250、500和1000μg/mL作为正对照和制作标准，用PBS做负对照，加入100μL标准品和PBS，每个样品做2个平行孔。

(5)轻微震荡混匀后，放于37℃培养箱中培养2小时，小心吸出上清液，用洗涤液每孔200μL洗涤5次，倒置滤纸上尽量空干液体，最后一次拍干。

(6)每孔加入一抗50μL，放于37℃培养箱中培养1小时。洗涤液洗板同上。

(7)加入二抗(HRP标记抗体)100μL，放于37℃培养箱中培养1小时，洗板同上。

(8)每孔加入底物工作液100μL，放于37℃培养箱中暗反应10分钟。每孔加入50μL终止反应液。

(9)将培养板放入酶标仪，于492nm测定吸光值，记录读数。制备标准曲线并计算样品IL-2含量。

研究结果表明在2μg/mL，细胞介素-2合成量最大，结合上面增殖实验结果可知，该蛋白通过刺激Th1细胞，激活Th1特异性的细胞介素-2合成(图4)。

实施例6流式细胞术(FACS)测定重组真菌免疫调节蛋白

采用FACS法进一步准确测定重组免疫调节蛋白的抗肿瘤活性。

(1)在5％CO₂，37℃培养箱中用高糖DMEM培养液培养NB-4细胞，使其生长至浓度为1x10⁶细胞/mL。

(2)在12孔培养板中每孔加入0.8mL肿瘤细胞悬浮液，加入0.2mL终浓度为8、16和32μg/ml的重组真菌免疫调节蛋白，以正常生长的NB-4细胞做负对照，每个样品浓度做2个平行孔。在5％CO₂，37℃培养箱中培养24小时。

(3)3000rpm，室温离心5分钟，收集肿瘤细胞。诱导肿瘤细胞的凋亡率用Annexin-V-EGFP细胞凋亡检测试剂盒测定。

(4)用pH7.2 10mM PBS洗涤NB-4细胞，3000rpm，室温离心5分钟，共2次。确保最终收集细胞数为1.5×10⁵。

(5)加入试剂盒内结合缓冲液500μL，混匀；再加入2μL Annexin-V-EGFP，混匀；最后加入5μL碘化丙啶(PI)，充分混匀。

(6)室温避光暗处反应10-15分钟，在1个小时内送至流式细胞仪进行测试。

(7)FACS采用488nm激发波长，530nm发射波长；Annexin-V-EGFP的绿色荧光通过FITC通道(FLl)；PI红色荧光通过PI通道(FL3)。

(8)以未经PI和EGFP染色的正常生长的NB-4细胞做纯阴性对照，用于圈定细胞群并且调整2种荧光滤光片的基础电压和增益值，以十字门法记录所有被荧光标记的肿瘤细胞，同时计算诱导细胞凋亡率。

研究结果显示在FIP-NHA浓度为32μg/mL，处理时间为24小时时，对三种肿瘤细胞(肝癌细胞HepG2，胃癌细胞MGC823，白血病细胞HL60)都具有明显的抑制增殖作用。随着浓度的增加，抑制作用增强，其中对肝癌细胞的杀伤作用最强，细胞存活比例仅占13.31％；对胃癌次之，为31.34％；对白血病的作用相对较低，为43.67％(图5)。进一步延长处理白血病HL60细胞时间，检测该蛋白对其杀灭作用，结果表明随着时间的延长和浓度的增加，杀肿瘤作用增强，在浓度32μg/mL70小时处理时，活细胞存活比例为30％(图6)。

Claims (1)

1.真菌免疫调节蛋白FIP-NHA用于制备抗肿瘤药物的应用，

所述真菌免疫调节蛋白FIP-NHA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，

所述抗肿瘤药物为治疗肝癌的药物、治疗胃癌的药物或治疗白血病的药物。

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