CN102230008A - 一种快速检测犬的巴贝西虫pcr方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明介绍了一种快速检测犬的巴贝西虫PCR方法及应用，使用Taq酶1U、Taq酶自带10×PCRBuffer2.5μl、Taq酶自带25mmol·L^-1Mg^{2 ＋}盐3.0μl、10mmol·L^-1mixdNTP0.5μl、 10pmol·μl^-1犬的巴贝西虫特异性PCR上下游引物各0.5μl、待测DNA样品4.0μl，加水至25.0μl，95℃预变性5min，变性、退火、延伸进行35个循环，72℃延伸7min，冷却结束反应。本方法检测速度快，2小时可得结果，样品稀释1000倍仍能检测，选择性强不与其他DNA反应。

Description

一种快速检测犬的巴贝西虫PCR方法及应用

 

技术领域

     本发明涉及一种生物工程技术，特别是一种快速检测犬的巴贝西虫PCR方法及应用，基于巴贝西虫18s RNA基因序列设计合成的1对特异性诊断引物，同时公开了PCR诊断方法的操作。

背景技术

巴贝西虫病是广泛发生于各种家畜，经蜱传播的一种血源性原虫病。其在家畜体内单个或成对寄生于红细胞内，引起严重的贫血和血红蛋白尿症。引起犬的巴贝西虫病的病原体有3 种，即犬巴贝西虫(Babeisa canis)、韦氏巴贝西虫（B. vitlli）和吉氏巴贝西虫（B. gibsoni）。犬巴贝西虫分布于欧洲、美洲和印度，韦氏巴贝西虫分布于南美洲，吉氏巴贝西虫分布于亚洲。我国主要流行的虫种为吉氏巴贝西虫，该病在国内广泛分布，有蜱滋生的地方，春、夏、秋季均可发病，故对这类疾病应当有一定的认识。

目前，血液原虫诊断方法主要有涂片染色镜检、酶联免疫反应、间接荧光、多聚酶链式反应（PCR）等。涂片染色镜检法虽然设备简单、操作简便，但是检测率低。在检测隐性带虫感染时则易出现假阴性。血清学诊断法不能区别是现在感染还是过去感染。而PCR技术以其较高的特异性和敏感性被学者认为是检测巴贝西虫的最有效方法。因此建立行之有效的巴贝西虫检测方法，进而为诊断和治疗犬巴贝西虫病提供良好的基础，对巴贝西虫的防控工作有着积极的作用。

本发明利用PCR技术，提供了一对特异性引物，扩增出包含犬的巴贝西虫18s RNA基因差异序列的片段，并在此基础上建立了诊断方法，该方法可在犬的巴贝西虫的诊断和流行病学调查中发挥一定作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速检测犬的巴贝西虫PCR方法及应用，针对现有诊断巴贝西虫方法的不足，提供一种能够快速，特异性的诊断方法；基于巴贝西虫18s RNA基因序列设计合成的1对特异性诊断引物，同时公开了PCR诊断方法的操作。

为了实现解决上述技术问题的目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明的一种快速检测犬的巴贝西虫PCR方法，包括下述步骤：

（1）样品DNA抽提

首先于待检犬前肢隐静脉取300μl抗凝血，之后提取DNA，获得DNA即可作为PCR检测的DNA样品；

（2）样品检测

犬的巴贝西虫PCR的诊断方法如下：其反应体系为25μl ，即Taq酶即热稳定性的DNA 聚合酶1 U、Taq酶自带10×PCR Buffer 2.5 μl、Taq酶自带25 mmol· L^-1 Mg^2＋盐3.0 μl、10 mmol·L^-1 mix dNTP即三磷酸脱氧核糖核苷0.5 μl、 10pmol·μl^-1本发明提供的一对犬巴贝西虫特异性PCR引物的上下游引物各0.5 μl、待测犬全血DNA样品4.0 μl，加纯水至25.0 μl；反应程序为95 ℃预变性5 min，之后95 ℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，将变性、退火、延伸三个过程 进行35个循环，最后再72 ℃延伸7 min，之后冷却至4℃，PCR反应结束；所述的一对犬的巴贝西虫特异性PCR引物，其上游引物F1核苷酸序列为GTAATTCCAGCTCCAATA，下游引物F2核苷酸序列为 TTTCGCAGTAGTTCGTC；

（3）结果判定

反应结束后取5 μl PCR产物在2.0 %EB（溴化乙锭）染色的琼脂糖凝胶上电泳；电泳后，紫外灯下观察结果，出现大小约为319bp的片段的样品为阳性结果，即为巴贝西虫感染犬。

提取DNA的方法可以为使用市售全血DNA提取试剂盒按说明书进行操作提取，以TAKARA公司全血DNA提取试剂盒为例，步骤如下：

（1）、按处理样品数准备1.5 ml离心管，并各加入GenTLE SolutionⅠ500 μl。

把混合均匀的100 μl血液，加入到分装好的GenTLE SolutionⅠ的离心管中，立即震荡数秒钟，例如3~15秒；

（2）、室温放置10分钟以上，然后在室温条件下12,000 rpm以上离心5分钟；

（3）、用移液枪小心除去管中溶液，此时沉淀看不清，紧贴在离心管微车的内壁上，除去溶液时，枪头不要碰到离心管外侧的内壁，插到离心管内侧的底部，不要吸走沉淀物；

（4）、加入1 ml的GenTLE SolutionⅡ；此时GenTLE SolutionⅡ应沿着理性管内侧壁加入大离心管中；

（5）、轻柔地上下颠倒离心管2~10次，室温12,000 rpm以上离心2分钟，用移液枪小心地除去上清溶液；

（6）、向离心管中加入GenTLE SolutionⅢ 500 μl，轻微震荡10秒充分混合；

室温12,000 rpm以上离心5分钟，把上清溶液移至另一个新的离心管中；

（7）、加入等体积（500 μl）的异丙醇，上下轻柔颠倒2~10次，均匀混合；

（8）、4℃、12,000 rpm离心5分钟，小心除去上清溶液；

（9）、加入1ml的70%乙醇清洗沉淀，4℃、12,000 rpm离心5分钟，小心除去上清溶液；

（10）、干燥沉淀；离心管中没有乙醇气味即可；

（11）、用10-50μl的TE缓冲液（10mM Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液），1mM EDTA （乙二胺四乙酸），pH=8.0）溶解沉淀。

注：以上步骤中出现的试剂GenTLE SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ均为试剂盒自带试剂。

本发明的上述快速检测犬的巴贝西虫PCR方法在检测犬巴贝西虫上的应用。

通过采用上述技术方案，本发明具有以下的有益效果：

1、利用本发明中的方法对犬的巴贝西虫进行检测，检测速度快——仅需2小时即可得到结果、灵敏度高——样品稀释1000倍仍能检测出虫体DNA的存在、选择性强不与其他DNA反应；

2、利用本发明中的方法对犬巴贝西虫进行检测，只需一台PCR仪和一台电泳仪即可检测，另外，PCR扩增获得的片段包含三种犬的巴贝西虫（犬巴贝西虫、韦氏巴贝西虫和吉氏巴贝西虫）差异序列可作为犬巴贝西虫流行病学调查之用。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

1.发病情况

2010年7月16日，洛阳市郊区某厂一德国牧羊犬，雄性，4个月，按正常程序免疫。据了解，场内有许多草地运动场，犬只常在草地上玩耍，经常能在犬只身上找到蜱虫，隔壁厂内有一只患血虫病的犬只。临床观察，该犬只精神沉郁，少食或者不食，尿液呈黄褐色，体温高达40摄氏度，可视粘膜为贫血轻度黄疸，尿液呈黄色。经镜检未发现虫体，建议进行PCR检测。操作过程如下：

（1）样品DNA抽提

首先于待检犬前肢隐静脉取300μl抗凝血，之后使用全血DNA提取试剂盒（TAKATA公司）按说明书进行操作提取DNA，获得DNA即可作为PCR检测的DNA样品。

（2）样品检测

将DNA样品进行PCR检测。其反应体系为25μl ，即Taq酶（TAKARA公司）1 U、Taq酶自带10×PCR Buffer 2.5 μl、Taq酶自带25 mmol· L^-1 Mg^2＋盐3.0 μl、10 mmol·L^-1 mix dNTP（三磷酸脱氧核糖核苷） 0.5 μl、 10pmol·μl^-1本发明提供的上下游引物各0.5 μl、第一步获得的待测犬全血DNA样品4.0 μl，加双蒸水至25.0 μl。另其反应程序为95 ℃预变性5 min，之后95 ℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，将变性、退火、延伸三个过程 进行35个循环，最后再72 ℃延伸7 min，之后冷却至4℃，PCR反应结束。

（3）结果判定

反应结束后取5 ul PCR产物在2.0%EB染色的琼脂糖凝胶上电泳。电泳后，紫外灯下观察结果。出现大小约为319bp的片段的样品为阳性结果，即判定为巴贝西虫感染犬。

其检测结果具体图片表现为：测试结果琼脂糖凝胶上自左至右依次为Marker、犬的巴贝西虫DNA PCR结果、阳性犬PCR结果的特性条带；阳性犬PCR结果的特性条带与犬的巴贝西虫DNA PCR结果的特性条带出现在与Marker 300bp条带大体相同的水平位置。

检测犬的巴贝西虫PCR诊断方法的特异性的结果图片为：测试结果琼脂糖凝胶上自左至右依次为Marker、阳性犬PCR结果、阴性对照、灭菌三蒸水、巴氏杆菌、附红细胞体的的特性条带。阳性犬PCR结果的特性条带与Marker 300bp条带大体相同的水平位置。其他阴性对照、灭菌三蒸水、巴氏杆菌、附红细胞体未出现近似位置特性条带。

检测犬的巴贝西虫PCR方法的灵敏度的结果图片为：测试结果琼脂糖凝胶上自左至右依次为Marker、阳性犬PCR结果、阴性对照、10倍稀释样品PCR结果、100倍稀释样品PCR结果、1 000倍稀释样品PCR结果、10 000倍稀释样品PCR结果、100 000倍稀释样品PCR结果、1 000 000倍稀释样品PCR结果。阳性犬PCR结果、10倍稀释样品PCR结果、100倍稀释样品PCR结果、1 000倍稀释样品PCR结果均出现的特异性条带与Marker 300bp条带出现在近似位置。其他阴性对照、10 000倍稀释样品PCR结果、100 000倍稀释样品PCR结果、1 000 000倍稀释样品PCR结果未出现近似位置特性条带。

2.诊断与治疗

根据流行病学、临床症状观察和PCR方法检测将该病犬诊断为患有巴贝西虫病。病犬按犬的巴贝西虫病常规治疗，治疗后症状基本消失，食欲、饮欲恢复。

3.小结

目前血液原虫诊断方法主要使用涂片染色镜检的方法，但该方法往往出现漏检的情况，本发明提供的PCR诊断引物及PCR方法在不失快速简便的前提下，提高了检出率为临床正确治疗犬的巴贝西虫病提供了有力支持。

Claims (4)

1.一种快速检测犬的巴贝西虫PCR方法，其特征是包括下述步骤：

（1）样品DNA抽提

首先于待检犬前肢隐静脉取300μl抗凝血，之后提取DNA，获得DNA即可作为PCR检测的DNA样品；

（2）样品检测

犬的巴贝西虫PCR的诊断方法如下：其反应体系为25μl ，即Taq酶即热稳定性的DNA 聚合酶1 U、Taq酶自带10×PCR Buffer 2.5 μl、Taq酶自带25 mmol· L^-1 Mg^2＋盐3.0 μl、10 mmol·L^-1 mix dNTP即三磷酸脱氧核糖核苷0.5 μl、 10pmol·μl^-1本发明提供的一对犬巴贝西虫特异性PCR引物的上下游引物各0.5 μl、待测犬全血DNA样品4.0 μl，加纯水至25.0 μl；反应程序为95 ℃预变性5 min，之后95 ℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，将变性、退火、延伸三个过程 进行35个循环，最后再72 ℃延伸7 min，之后冷却至4℃，PCR反应结束；所述的一对犬的巴贝西虫特异性PCR引物，其上游引物F1核苷酸序列为GTAATTCCAGCTCCAATA，下游引物F2核苷酸序列为 TTTCGCAGTAGTTCGTC；

（3）结果判定

反应结束后取5 μl PCR产物在2.0 %EB（溴化乙锭）染色的琼脂糖凝胶上电泳；电泳后，紫外灯下观察结果，出现大小约为319bp的片段的样品为阳性结果，即为巴贝西虫感染犬。

2.根据权利要求1所述快速检测犬的巴贝西虫PCR方法，其特征是：提取DNA的方法为使用市售全血DNA提取试剂盒按说明书进行操作进行提取。

3.根据权利要求1所述快速检测犬的巴贝西虫PCR方法，其特征是：抗凝血提取DNA使用市售全血DNA提取试剂盒按说明书进行操作，具体使用TAKARA公司全血DNA提取试剂盒，步骤如下：

（1）、按处理样品数准备1.5 ml离心管，并各加入GenTLE SolutionⅠ500 μl；

把混合均匀的100 μl血液，加入到分装好的GenTLE SolutionⅠ的离心管中，立即震荡3~15秒钟；

（2）、室温放置10分钟以上，然后在室温条件下12,000 rpm以上离心5分钟；

（3）、用移液枪小心除去管中溶液，此时沉淀看不清，紧贴在离心管微车的内壁上，除去溶液时，枪头不要碰到离心管外侧的内壁，插到离心管内侧的底部，不要吸走沉淀物；

（4）、加入1 ml的GenTLE SolutionⅡ；此时GenTLE SolutionⅡ应沿着理性管内侧壁加入大离心管中；

（5）、轻柔地上下颠倒离心管2~10次，室温12,000 rpm以上离心2分钟，用移液枪小心地除去上清溶液；

（6）、向离心管中加入GenTLE SolutionⅢ 500 μl，轻微震荡10秒充分混合；

室温12,000 rpm以上离心5分钟，把上清溶液移至另一个新的离心管中；

（7）、加入等体积（500 μl）的异丙醇，上下轻柔颠倒2~10次，均匀混合；

（8）、4℃、12,000 rpm离心5分钟，小心除去上清溶液；

（9）、加入1ml的70%乙醇清洗沉淀，4℃、12,000 rpm离心5分钟，小心除去上清溶液；

（10）、干燥沉淀；离心管中没有乙醇气味即可；

（11）、用10-50μl的TE缓冲液（10mM Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液），1mM EDTA （乙二胺四乙酸），pH=8.0）溶解沉淀。

4.一种权利要求1所述快速检测犬的巴贝西虫PCR方法在检测犬巴贝西虫上的应用。