CN102226188A - 水稻转录因子OsAP21基因的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于作物遗传育种领域，涉及水稻转录因子OsAP21基因的应用。本发明根据转录因子OsAP21基因序列设计引物，利用PCR技术从水稻IR36总cDNA中扩增得到OsAP21基因。利用农杆菌蘸花法将OsAP21基因转化拟南芥，研究OsAP21基因在拟南芥体内的抗逆功能和提高植物抗逆特性中的应用。公开了所述的水稻OsAP21基因能用于植物转化，提高植物的抗旱、耐盐和耐冷能力。

Description

水稻转录因子OsAP21基因的应用

技术领域

本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及水稻转录因子OsAP21基因的功能及其应用。

背景技术

对作物产量危害的自然灾害中，干早、低温和盐渍是诸多非生物逆境中最为严重的，这些不利的环境因素能够对植物造成伤害。例如，干早胁迫能够影响光合作用，抑制植物生长，而且会在细胞内导致大量活性氧和自由基的产生，从多方面影响植物的正常生长。低温会使细胞内结冰，从而导致类似于干旱引起的渗透胁迫发生。高盐胁迫则会破坏水势的平衡和离子分布的平衡，导致植物受到分子损伤、生长延迟。这些非生物逆境不仅严重制约了粮食生产，而且日益恶化植物的生存环境乃至影响到人类。

在缓解环境日益恶化的同时，使植物自身对这些逆境具有更强的抵抗力是保证作物产量、质量不受影响的一个重要手段。

转录因子是植物体内非常重要的一类基因，它们是一群能与真核基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异性结合，从而调控目的基因以特定的强度、在特定的时间与空间表达蛋白质。转录因子可以单独或协同调节各种胁迫诱导功能基因的表达，从而形成不同的基因调控网络，在这些网络中，转录因子往往作为网络的节点将不同逆境的调控网络连接在一起，形成更大的基因调控网络。因此，要使植物的抗逆性得到综合的、根本性的改良，转录因子具有很好的潜能。

转录因子OsAP21基因序列于2005年由Ohyanagi等在NCBI上登陆（NM_001048853），但对其功能至今还没有任何研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供水稻转录因子OsAP21基因的功能，并进一步公开了该基因的应用。

本发明通过对OsAP21基因在水稻受激素及非生物逆境时的诱导表达模式判断，该基因可能参与植物抗逆途径。根据该基因的cDNA序列设计引物，利用PCR技术从水稻IR36总cDNA中扩增得到OsAP21基因。利用农杆菌蘸花法转化到拟南芥植株中，并研究其在拟南芥体内的抗逆功能，为OsAP21基因在其他植物上的应用提供了很好的基础。

本发明所述的水稻OsAP21基因可用于植物转化，提高植物的抗旱、耐盐和耐冷能力。

本发明还公开了一种提高植物抗旱、耐盐和耐冷能力的方法，是用水稻OsAP21基因转化目标植物，从而获得转基因植物。

所述的提高植物抗旱、耐盐和耐冷能力的方法，包括下述步骤：

（1）提取水稻RNA，

（2） PCR获得水稻OsAP21基因片段，

（3）将水稻OsAP21基因片段构建到pCAMBIA-1304中获得农杆菌双元载体命名为YG8473，

（4）利用电击法质粒YG8473转化农杆菌，

（5）带有转化质粒的农杆菌采用蘸花法转化目标植物，

（6）转基因阳性苗的筛选。

本发明根据OsAP21基因的序列（NM_001048853）设计如下引物：

R6995： 5’-GGATCCATGGCTGCCAGCGAGGAAAGCTC-3’（SEQ ID NO.1），

R6996： 5’–GAGCTCTAGTACTCC CAGAGGAGAGG-3’ （SEQ ID NO.2）。

利用PCR技术从水稻IR36总cDNA中扩增得到OsAP21基因全长cDNA。经测序为正确，OsAP21的全长cDNA为687bp（SEQ ID NO：7），编码一个由229个氨基酸组成的蛋白（SEQ ID NO：8）。

本发明根据OsAP21基因的cDNA序列设计如下检测引物：

OsAP21F1：5’- CCCTCCTCCTCCACCTCCACC-3’ （SEQ ID NO.3）

OsAP21Z1：5’-GCGCATCGTACGCCGTCCAGC -3’ （SEQ ID NO.4）。

检测水稻经过ABA、PEG、NaCl和冷处理后体内OsAP21基因的表达情况。结果表明OsAP21受ABA、PEG、NaCl和冷诱导表达。

本发明将含OsAP21的质粒经Bam HI＋Sac I双酶切后，利用DNA回收试剂盒回收687bp左右的DNA片段，将此片段与相应酶切的pCAMBIA-1304载体相连构建成一个新的载体，命名为YG8473。为了更好的表达外源基因，在YG8473载体的多克隆位点处两侧***了烟草的染色质附着SAR序列，这有利于转基因的稳定遗传及表达；外源基因的表达单元内，在目的基因的两侧导入了BamHI和SacI酶切位点，便于外源基因的***，外源基因的表达由双CAMV 35S启动子+ TMV Omega leader sequence控制；CAMV 35S+TMV Omega leader sequence控制Hyg抗性基因的表达，作为转基因植物的筛选标记基因。

本发明利用电击法将构建好的双元载体YG8473导入根癌农杆菌中，根癌农杆菌菌株为EHA105。通过农杆菌蘸花法将OsAP21基因转化到拟南芥中，然后验证了转基因拟南芥对ABA、NaCl敏感性的提高，对高盐、干旱和低温的耐受性提高。

本发明的OsAP21基因是能够调控植物耐旱、耐冷和耐高盐的转录因子基因；且该抗逆基因来自植物本身，对环境影响较小。

本发明通过对OsAP21基因转化拟南芥进行该基因的功能研究，获得效果如下：

1 .获得了对干旱、高盐、冷逆境有高耐性的拟南芥转基因植株；2. OsAP21基因具有抗干旱、高盐、低温等逆境的功能，为利用该基因在其他植物上的应用而提高抗逆性提供了理论依据及利用价值。

附图说明

图1：OsAP21在ABA、PEG、NaCl和Cold条件下的诱导表达模式。

图2：双元载体YG8473的构建示意图。

图3：转基因阳性植株的PCR鉴定。

图4：OsAP21转基因拟南芥对ABA敏感性的提高。

图5：OsAP21转基因拟南芥对NaCl敏感性的提高。

图6：OsAP21转基因拟南芥提高了植物对干旱的耐受性。

图7：OsAP21转基因拟南芥提高了植物对高盐的耐受性。

图8：OsAP21转基因拟南芥提高了植物对低温的耐受性。

图9： OsAP21的转基因拟南芥植株的脯氨酸含量。

具体实施方式

实施例1：OsAP21在ABA、PEG、NaCl及冷条件下的表达模式分析。

1．RNA的抽提

水培2周的IR36水稻苗分别用100μM 的ABA溶液、15%的PEG溶液和250mM NaCl溶液和4℃±1光照培养处理不同时间（1、2、4、8、12和24h）后取样，分别提取植株总RNA并反转录为cDNA以备后用。具体操作为：

1）RNA的抽提：按照上海华舜生物公司的RNA抽提试剂盒进行。

2）RNA中基因组DNA的去除：参照DNase I（RNase Free）说明书；

①  在微量离心管中配制下列反应液，总量50μL：

全RNA                                      20-50μg

10×DNase I Buffer                              5μ

DNase I (RNase-free, 5U/μL)                      2μL

RNase Inhibitor (40 U/μL)                        0.5μL

DEPC处理水                                up to 50μL。

②  37℃反应20-30min。

③  加入50μL的DEPC处理水。

④  加入100μL(等量)的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，充分混匀。

⑤  离心，取上层(水层)移至另一微量离心管中。

⑥  加入100μL(等量) 的氯仿/异戊醇(24：1) ，充分混匀。

⑦  离心，取上层(水层)移至另一微量离心管中。

⑧  加入1/10量的3M NaAC(pH5.2)。

⑨  加入2.5倍量预冷的无水乙醇，-20℃（-70℃）放置30-60min。

⑩  离心回收沉淀，用70%的冷无水乙醇清洗沉淀，真空干燥。用适量的DEPC水处理水溶解后，进行琼脂糖凝胶电泳确认是否除去基因组DNA。

3）RNA含量和质量的分析

将抽提好的RNA稀释50倍，分光光度计测定。质量好的RNA其OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.8-2.0之间，按照RNA含量将其调整为同一浓度进行反转录。

2、反转录为cDNA

反转录方法参照TOYOBO 反转录试剂盒说明书进行。

在微量离心管中配制下列反应液，总量20μL。

10×RT Buffer                   4μL

dNTP mix(2.5mM each)           2μL

OligdT2                        1Μl

RNase Inhibitor (40 U/μL)         0.5μL

RNA                           x μL

Rnase free H₂O                 11-x μL

反转录反应的条件：42℃，1h；85℃，5min；4℃，5min。

3、RT-PCR检测

以水稻组织在各个胁迫处理下的RNA反转录的cDNA为模板进行RT-PCR反应，通过调整模板量和模板浓度，将内标准扩增量调为一致，再按相同条件扩增OsAP21基因，可方便地鉴定出水稻在各种不同处理下以及各个组织中OsAP21基因的表达量，得出水稻转录因子OsAP21基因在激素和逆境处理下的表达模式（图1）。

根据水稻内标基因actin（登录号：X16280）设计内标引物如下：

Rac1Z1: 5’-AAGATCCTGACGGAGCGTGGTTAC-3’ （SEQ ID NO.5）

Rac1F1: 5’-CTTCCTAATATCCACGTCGCACTTC-3’ （SEQ ID NO.6）

用该引物进行扩增，可扩增出269bp的条带。

PCR反应体系：

试剂                      用量           终浓度

10×reaction buffer           2μl              1×

dNTP mix(2.5mM each)       1μl           0.125mM

模板cDNA                 1μl            2.5ng/μl

Rac1Z1(0.1μg/μl)            0.2μl           1 ng/μl

Rac1F1(0.1μg/μl)            0.2μl           1 ng/μl

Taq plus (5U/μl)             0.2μl          0.05 U/μl

ddH20                    15.4μl

总体积                    20 μl。

PCR反应程序：预变性94℃，5 min；94℃，20s；56℃，20s；72℃ 20s；72℃，5min, 26 cycles。

OsAP21目的基因的检测引物如下（扩增片段243bp）：

OsAP21F1：5’- CCCTCCTCCTCCACCTCCACC-3’ （SEQ ID NO.3）

OsAP21Z1：5’-GCGCATCGTACGCCGTCCAGC -3’ （SEQ ID NO.4）。

PCR反应体系：

试剂                     用量               终浓度

2×GC buffer              10μl                 1×

dNTP mix(2.5mM )         1μl               0.125mM

模板cDNA               1μl               2.5ng/μl

OsAP21F1               0.2μl               1 ng/μl

OsAP21Z1               0.2μl               1 ng/μl

La-Taq(5U/μl)             0.2μl              0.05 U/μl

ddH20                  7.4μl

总体积                 20 μl。

PCR反应程序：预变性94℃，10 min；94℃，30s；68℃，30s；72℃ 40s；72℃，10min, 35 cycles。

实施例2：水稻OsAP21基因的获得

水稻IR36水培2周后提取总RNA并反转录为cDNA（与实施例1同）。以上述cDNA为模板，经R6995 5’-GGATCCATGGCTGCCAGCGAGGAAAGCTC-3’ （SEQ ID NO.1）和R6996 5’–GAGCTCTAGTACTCC CAGAGGAGAGG-3’ （SEQ ID NO.2）为引物进行扩增。PCR反应体系：

试剂                 用量               终浓度

2×GC buffer              10μl                 1×

dNTP mix(2.5mM )             1μl               0.125mM

模板DNA               1μl               2.5ng/μl

R19105                0.2μl               1 ng/μl

R19106                0.2μl               1 ng/μl

La-Taq(5U/μl)             0.2μl              0.05 U/μl

ddH20                 7.4μl

总体积                20 μl。

PCR反应条件：预变性94℃，10 min；94℃，30s；54℃，30s；72℃ 1min；72℃，10min, 35 cycles。

PCR结束后，1% 琼脂糖胶回收，取10 μl 直接与T/A 克隆载体相连（大连宝生物公司）。4℃连接过夜，高效转化DH5 α感受态中，获得阳性克隆经过上海桑尼公司测序比对，所得序列为水稻OsAP21基因。

实施例3：农杆菌双元载体YG8473的构建

将含OsAP21基因的T/A 克隆载体质粒经BamHI＋SacI双酶切后，利用DNA回收试剂盒回收687bp左右的DNA片段，将此片段与相应酶切的pCAMBIA-1304载体（AF234300.1）（购买于上海皓嘉生物科技有限公司）相连，获得的载体命名为YG8473。

为了更好的表达外源基因，可在YG8473载体的多克隆位点处两侧***烟草的染色质附着SAR序列，这有利于转基因的稳定遗传及表达；外源基因的表达单元内，在目的基因的两侧导入了BamHI和SacI酶切位点，便于外源基因的***，外源基因的表达由双CAMV 35S启动子+ TMV Omega leader sequence控制；CAMV 35S+TMV Omega leader sequence控制Hyg抗性基因的表达，作为转基因植物的筛选标记基因（图2）。

实施例4：电击法转化农杆菌

1）制备农杆菌EHA105（中国大连Takara公司购买）感受态，方法参照MicroPulser^TMElectroporation Apparatus Operating Instructions and Application Guide(BIO-RAD公司)；

2) 取70μL EHA105感受态细胞，加入16μL YG8473质粒DNA，转入0.1cm的电击杯中转化，电击参数（200Ω，1.7KV，25μf）。电击后立即加入800μL修复液混匀，转入1.5mL离心管中；

3）28℃培养1h后，涂LB平板（利福平50μg/ml，庆大霉素50μg/ml，氯霉素100μg/ml）；

4）挑取几个克隆，碱法抽提农杆菌质粒，酶切鉴定，PCR检测。

实施例5：农杆菌的准备及转化拟南芥

农杆菌的准备：

1）挑取农杆菌单菌接种于5mL LB液体培养基（利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL）中，28℃，250rpm培养20小时（Rashid et al., 1996）；

2）取1mL菌液转接入20－30mL LB液体培养基（利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL）中，28℃，250rpm培养约12小时，使菌液OD600≈1.5；

3）4℃，8000rpm离心10min，收集菌体，用农杆菌转化渗透液（5％蔗糖，0.05% Silwet L-77）将菌体悬起并稀释至OD₆₀₀≈0.8。

蘸花法转化拟南芥：

1）将拟南芥的花苔浸入渗透液中轻轻摇动约10s后取出, 全部转化完毕后，用保鲜膜将拟南芥罩住，以保持湿润的环境，托盘中加入PNS营养液，置于22℃培养室低光强度下生长24小时，即可正常培养。

2）初次转化四天后，再进行一次转化，重复两次，总共转化三次，这样可以在花发育的不同时期进行转化，提高转化效率。

3）生长约两个月后，收集拟南芥T₀植株上所结T₁种子，利用50 μg/mL 潮霉素进行转化种子的筛选。

阳性种子的筛选：

1）称25－30mg种子放入1.5ml 离心管。

2）1ml 75％乙醇消毒1min (不停摇晃振荡)，8000 转/分钟离心5s，去上清。

3）加入1ml过滤后的漂白粉（5%）消毒15 min (不停摇晃振荡，充分消毒)，8000转/分钟离心5s，去上清。

4）无菌水洗涤3－4次。

5）将种子均匀的播撒到1/2 MS平板（50μg/mL 潮霉素）上，Parafilm膜封口，4 ℃冰箱放置两天，22℃，16h光照培养6天。

6）将抗性植株移栽到盆中培养，苗稍大后，进行GUS检测，选出阳性植株（T₁）培养至开花结实，收集T₁植株上所结T₂种子。按阳性种子的筛选方法继续进行直至获得纯系。

实施例6：OsAP21转基因拟南芥的抗逆分析

将转基因拟南芥自交3代，获得4个纯合转化株系(图3)，收取种子。选取P1和P2株系做进一步分析，主要有以下几个方面。

1）植株对ABA的敏感性研究。将野生型和转基因株系P1、P2的种子同时铺在含有0、1.0、2.0μM ABA的板上，22℃，16h光照培养2周后，观察转基因和野生型生长差异（图4A）。另外，ABA对拟南芥根生长的影响也做了更进一步的分析。将萌发后生长较一致的苗子移到分别含有0、1.0、2.0、6.0μM ABA的MS培养基上，垂直放置于22℃，16h光照条件下，一周后观察并统计转基因和野生型拟南芥的根长情况（图4B、C）。结果表明转基因种子比野生型种子对ABA更敏感。在不含ABA的MS培养基上，野生型和转基因株系P1、P2的平均根长分别为1.92、1.88、1.87cm 没有显著差异；但是当ABA的浓度为1.0μM时，WT的平均根长为1.68cm，P1、P2分别为0.57、0.66cm；ABA浓度为2.0μM时，WT、P1、P2的根长分别为1.67、0.42、0.55 cm；ABA浓度为6.0μM时，WT、P1、P2的根长分别为1.35、0.32、0.39 cm。这表明ABA的存在影响了根的生长，但是相对于野生型而言OsAP21转基因株系明显表现出对ABA的敏感性。

2）植株对NaCl的敏感性研究。将野生型和转基因株系P1、P2的种子同时铺在含有0、80、100mM NaCl的板上，22℃，16h光照培养1周后，观察转基因和野生型生长差异并统计萌发率（图5）。在不含NaCl的MS培养基上，野生型和转基因株系P1、P2的萌发没有差异；当NaCl的浓度为80mM时，WT的萌发率为93%，P1、P2分别为31%、58%；当NaCl的浓度为100mM时，WT的萌发率为86%，P1、P2分别为6%、28%。这表明NaCl的存在影响了拟南芥种子的萌发，且相对于野生型而言OsAP21转基因株系明显表现出对NaCl的敏感性。

3）植株抗干旱研究。取22℃，16小时光照培养约四周且生长比较一致的转基因植株P1、P2与未转基因的对照植株WT各两钵（要保证培养土中的含水量比较低）分成两组，一组正常条件下培养，一组直接将整钵浸泡于15% PEG溶液中进行模拟干旱处理，实时观测各株系的表型（图6）。结果表明，OsAP21的转基因株系P1、P2的存活率分别为85%和75%，而野生型的存活率只有40%，大多数的植株叶片干枯死亡。这些结果表明OsAP21基因的转入提高了拟南芥植株对干旱的耐受力。

4）植株耐高盐研究。将22℃，16h光照培养三周，且生长比较一致的野生型和OsAP21转基因株系的植株用于高盐耐受实验（图7）。待培养土中的含水量比较少时，直接将培养钵浸于250mM NaCl溶液中，实时观察各植株的表型变化。野生型植株在经高盐处理后所有的植株都出现很明显的萎蔫，而OsAP21转基因拟南芥株系P1和P2几乎没有萎蔫的现象。这些结果表明OsAP21基因的转入提高了拟南芥植株的对高盐的耐受力。

5）植株耐冷研究。将MS平板上的野生型和OsAP21转基因拟南芥株植株22℃，16小时光照培养约两周后，用于低温耐受实验。MS平板置于4℃冰箱低温驯化48h，-20℃放置约30min，然后置于22℃，16小时光照下正常培养，实时观测各株系的表型（图8）。野生型植株死亡率高于转基因株系，表明转基因植株在恢复过程中比野生型植株具有良好的耐冷性。

6）OsAP21的转基因拟南芥植株的脯氨酸含量

脯氨酸是植物体内主要渗透调节物质之一。在逆境条件下（干旱、盐碱、冷），植物体内脯氨酸的含量显著增加，因此植物体内脯氨酸含量在一定程度上反应了植物的抗逆性大小。本发明检测了野生型和转基因拟南芥在高盐和干旱处理前后的脯氨酸含量（图9）。在常温条件下，脯氨酸含量很低的，野生型的脯氨酸含量为0.5890 μmol/ g ，而OsAP21的转基因株系中脯氨酸含量分别为0.3179和0.9157μmol/ g。经过高盐胁迫后，脯氨酸含量大大的增加了，野生型的含量为1.5373 μmol/g，而转基因株系中的最大值为2.6926 μmol/g。经过干旱胁迫后，野生型的脯氨酸含量为0.9507μmol/g，而OsAP21的转基因株系中脯氨酸含量分别为1.6439和2.3871μmol/g。转基因株系经高盐和干旱胁迫后的脯氨酸含量显著的高于野生型植株的脯氨酸含量。

Claims (4)

1.水稻OsAP21基因用于植物转化，提高植物的抗旱、耐盐和耐冷能力。

2.一种提高植物抗旱、耐盐和耐冷能力的方法，是用水稻OsAP21基因转化目标植物，获得转基因植物。

3.根据权利要求2所述的提高植物抗旱、耐盐和耐冷能力的方法，其特征在于包括下述步骤：

（1）提取水稻RNA，

（2） PCR获得水稻OsAP21基因片段，

（3）将水稻OsAP21基因片段构建到pCAMBIA-1304中获得农杆菌双元载体命名为YG8473

（4）利用电击法质粒YG8473转化农杆菌，

（5）带有转化质粒的农杆菌采用蘸花法转化目标植物，

（6）转基因阳性苗的筛选。

4.根据权利要求3所述的提高植物抗、耐盐和耐冷能力的方法，其特征在于所述的目标植物是拟南芥。

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