CN102219865A

CN102219865A - 具有抗肿瘤活性的金樱子多糖衍生物的制备方法

Info

Publication number: CN102219865A
Application number: CN 201110146765
Authority: CN
Inventors: 肖凯军; 刘晓红; 董浩
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2011-06-02
Filing date: 2011-06-02
Publication date: 2011-10-19
Anticipated expiration: 2031-06-02
Also published as: CN102219865B

Abstract

本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的金樱子多糖衍生物的制备方法，其制备方法是先将金樱子果实粉碎、脱脂、去低聚糖、热水浸提2次后合并提取液、过滤、浓缩、沉淀、干燥后即得金樱子粗多糖，加入DEAE-纤维素52静态吸附30min，再用蒸馏水冲洗DEAE-纤维素52，过滤，收集滤液，得脱色后的金樱子粗多糖。采用酶法与Sevag法结合的方法对粗多糖溶液脱蛋白，采用DEAE-52将金樱子粗多糖进一步分离，收集，透析，冻干得到金樱子多糖，最后对金樱子多糖进行硫酸酯化、羧甲基化、盐酸降解以及对降解产物羧甲基化。得到的几种金樱子多糖衍生物具有体外抗肿瘤特性，可用于抑制卵巢癌、肝癌和直肠癌三种肿瘤细胞的生长。

Description

具有抗肿瘤活性的金樱子多糖衍生物的制备方法

技术领域

本发明创造属于生物活性多糖技术领域，主要涉及植物多糖化学改性和抗肿瘤药物制备方法。

背景技术

糖类是生物体内除蛋白质和核酸以外的一类重要生物分子，尤其是一类重要的信息分子，具有多种多样的生物功能。其中，多糖是自然界中储量丰富的生物聚合物，它是由醛糖或酮糖通过糖苷键连接在一起的多聚物，广泛存在于动物细胞膜、植物和微生物细胞壁中。目前已发现的活性多糖有几百种，有真菌多糖、高等植物多糖、藻类地衣多糖、动物多糖、细菌多糖。多糖具有能量储存、结构支持、防御作用和抗原决定性等多方面的生物功能。

植物多糖，尤其是从中药中提取的水溶性多糖尤为重要，已发现有多种中药中的多糖类化合物具有丰富多彩的生物活性，如抗肿瘤、免疫调节、降血糖、抗病毒、降血脂、抗凝血以及促进伤口愈合等活性，这类多糖没有细胞毒性，而且药物质量通过化学手段容易控制，已经成为当今新药的发展方向之一。

金樱子（Rosa laevigata Michx），别名刺榆子、刺梨子、金罂子、糖莺子、棠球、糖罐、糖果、黄刺果、蜂糖罐、金壶瓶、野石榴、糖橘子等。为常绿攀援灌木，茎枝密生倒钩状皮刺和刺毛，蔷薇果近球形或倒卵形，紫褐色，外面密被刺毛。花期4-6月，果期7-11月。生于海拔100-1600m的向阳山野、田边、溪畔灌丛中。分布于华东、华南、西南及河南、陕西、台湾、湖北、湖南等地。

金樱子果实中总糖含量达24%，其中多糖含量约为金樱子果实的8.73%。金樱子果实营养成分丰富，具有抗菌、提高免疫等多种生物活性，特别是其锌、硒的含量分别为20.140×10^-6g/100g和0.072×10^-6g/100g。这两种元素为人体必需的具有特定保健和防癌功效的微量元素。这些为金樱子多糖活性研究提供了理论基础。

目前对金樱子多糖（RLP）已经开展初步的研究，且取得一些研究成果，主要集中于抗氧化作用、抑脂作用、免疫活性、抑菌和抗炎作用等方面，但是对于金樱子多糖的结构修饰及其抗肿瘤生物活性的研究尚未开展。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术，首先制备纯度较高的金樱子多糖，通过对金樱子多糖进行降解，然后，将金樱子多糖的降解产物进行硫酸酯化和羧甲基化修饰，可显著提高改性后的金樱子多糖衍生物对肿瘤细胞生长的抑制作用，对于充分利用我国特有的植物资源，开发新型天然活性药物和保健品具有重要意义。

本发明的目的通过以下技术方案来实现

几种具有抗肿瘤活性的金樱子多糖衍生物的制备方法，包括以下步骤：

（1）将粉碎后的金樱子果实脱脂、去除低聚糖后采用热水浸提80℃浸提2h后，合并提取液、过滤、浓缩后加入无水乙醇沉淀，再将沉淀干燥后得到金樱子粗多糖；

（2）金樱子粗多糖溶于H₂O或0.1～0.2mol/LNaCl溶液，加入DEAE-纤维素52静态吸附30min，冲洗DEAE-纤维素52，过滤洗脱液，收集滤液即为脱色后的粗多糖溶液；

（3）脱色后的粗多糖溶液加入木瓜蛋白酶，45～65℃水浴中降解2～4h，离心取上清液，加入占上清液体积1/5的氯仿-正丁醇溶液，振荡20 min，分液去除有机相，离心，取上清液，重复步骤（3）操作得到脱蛋白后的粗多糖溶液；

（4）脱蛋白后的粗多糖溶液经DEAE-纤维素52离子交换柱层析，用0.1 ~ 0.5mol/LNaCl 溶液梯度洗脱，平均流速1.0 mL/min，洗脱液用硫酸—苯酚法跟踪检测，收集主峰的洗脱液，将收集到的洗脱液浓缩，再经过DEAE-Sepharose FF阴离子交换剂，先用pH7.6的缓冲液洗脱，再用0.1~0.5mo1/LNaC1 pH7.6的缓冲液梯度洗脱，平均流速1.0 mL/min，收集主峰的洗脱液，透析，冻干得到金樱子多糖；

（5）硫酸酯化多糖衍生物的制备：50mLN,N-二甲基甲酰胺置于0~4℃冰浴中；搅拌下缓慢滴加15mL氯磺酸，控制滴加速度，使反应体系温度低于10℃，继续搅拌至得到澄清溶液即为酯化剂；称取金樱子多糖0.5g，加入15mLN,N-二甲基甲酰胺，4℃冰箱放置过夜，加入酯化剂，50℃摇床反应3h后，冷却，醇沉，离心，将沉淀溶解，再反复醇沉水溶3次，加入0.1mol/L NaOH溶液调节pH至7，浓缩，干燥，得到硫酸酯化多糖衍生物。

本发明还可以将硫酸酯化多糖衍生物用DEAE-52进行纯化，再经DEAE- Sepharose FF离子交换剂进一步纯化，洗脱峰为单一对称峰。透析，冷冻干燥，得到纯化后的硫酸酯化多糖。

二、具有抗肿瘤活性的金樱子多糖衍生物的制备方法，还包括以下步骤：

（5）羧甲基化金樱子多糖衍生物的制备：称取5g金樱子多糖加入76mL异丙醇，搅拌30min，加入质量分数为10%的NaOH溶液25mL，30℃浸泡1h；将4g氯乙酸溶于10mL异丙醇，加入到上述浸泡液中，加入质量分数为10%的NaOH溶液25mL，70℃反应2.5h后，倒掉上层醇液，将产物用水溶解，HCl中和至中性后醇沉，再加少量水溶解，反复醇沉水溶3次，浓缩，干燥，得到羧甲基化金樱子多糖衍生物。

本发明还可以将羧甲基化金樱子多糖衍生物用DEAE-52进行纯化，经DEAE- Sepharose FF离子交换剂进一步纯化，洗脱峰峰形较为对称。收集主峰多糖，透析，冷冻干燥，得到纯化羧甲基化多糖。

三、具有抗肿瘤活性的金樱子多糖衍生物的制备方法，还包括以下步骤：

（5）盐酸降解金樱子多糖衍生物的制备：将金樱子多糖与质量分数为0.6~1.0%的盐酸溶液混合，在70℃~80℃水浴中降解1~2.5h，用NaOH溶液调节pH至7.0，醇沉，离心，用水溶解沉淀，反复醇沉水溶3次，浓缩，干燥，得到盐酸降解金樱子多糖衍生物。

本发明盐酸降解金樱子多糖衍生物还可以用Sephadex G-100进行纯化，收集主峰多糖，透析，冷冻干燥，得到纯化金樱子多糖降解产物。

四、具有抗肿瘤活性的金樱子多糖衍生物的制备方法，还包括以下步骤：

（5）盐酸降解金樱子多糖衍生物的制备：将金樱子多糖与质量分数为0.6~1.0%的盐酸溶液混合，在70℃~80℃水浴中降解1~2.5h，用NaOH溶液调节pH至7.0，醇沉，离心，用水溶解沉淀，反复醇沉水溶3次，浓缩，干燥，得到盐酸降解金樱子多糖衍生物；

（6）降解-羧甲基化金樱子多糖衍生物的制备：称取5g 盐酸降解金樱子多糖衍生物，加入76mL异丙醇，搅拌30min，加入质量分数为10%的NaOH溶液25mL，30℃浸泡1h；将4g氯乙酸溶于10mL异丙醇，加入浸泡液中，加入质量分数为10%的NaOH溶液25mL，70℃反应2.5h后，倒掉上层醇液，将产物用水溶解，HCl中和至中性后，醇沉，再溶解，反复醇沉水溶3次，浓缩，干燥，得到金樱子降解多糖的羧甲基化产物。

本发明金樱子降解多糖的羧甲基化产物还可以用Sephadex G-100进行纯化，收集主峰多糖，透析，冷冻干燥，得到纯化金樱子降解多糖的羧甲基化产物。

本发明步骤（3）优选的工艺条件为：所述木瓜蛋白酶的用量为底物浓度的1%w/v，水浴温度为60℃，降解3h，pH为6.0，重复步骤（3）5次。

本发明所述脱脂是将粉碎后的金樱子果实在50℃石油醚回流1h。

本发明所述去除低聚糖是在脱脂后的金樱子果实中加入体积分数为80%的乙醇在96℃回流两次，每次2h。

本发明所述浓缩为膜浓缩，用的是截留截留分子量为1万道尔顿的超滤膜。

本发明所述pH7.6的缓冲液优选磷酸盐缓冲液。

0.1~0.5mo1/LNaC1 pH7.6的缓冲液是以不同浓度的NaC1 代替水所配的pH7.6的缓冲溶液。

所述用0.1 ~ 0.5mol/LNaCl 溶液梯度洗脱是依次用0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/LNaCl 溶液洗脱。

本发明相对于现有技术所具有的优点及有益效果

（1）本发明采用的DEAE-52脱色法对金樱子粗多糖进行脱色，不仅脱色率大于95%，而且从脱色前后的多糖含量来看，多糖纯度由60%提高到80%以上。

（2）本发明采用的酶法与Sevag法结合的脱蛋白方法效果很好，并通过实验优化了脱蛋白的方法。结果表明：最佳条件为，酶用量为底物浓度的1%，温度为60℃，pH为6.0时，水浴3h，再加入其体积1/5的氯仿-正丁醇（5:1）溶液，振荡20min，脱蛋白重复5次。

（3）本发明采用DEAE- Sepharose FF凝胶柱层析法对金樱子粗多糖进行纯化，制备金樱子多糖（RLP），通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法和凝胶色谱法鉴定RLP具有较高纯度。凝胶渗透色谱法测定RLP的重均分子量Mw为227kDa。

（4）本发明首次对金樱子多糖进行了硫酸化、羧甲基化、降解等化学结构修饰，得到硫酸化金樱子多糖（SF-RLP）、羧甲基化金樱子多糖（CM-RLP）、金樱子降解多糖（DG-RLP）以及降解多糖的羧甲基化产物（CMDG-RLP）。

（5）本发明制备得到的金樱子多糖衍生物，对卵巢癌细胞、肝癌细胞和直肠癌细胞等三种肿瘤细胞生长的抑制作用，当金樱子多糖衍生物浓度为50ug/mL时，SF-RLP、CM-RLP、DG-RLP与CM-DG-RLP对SKVO细胞生长的抑制率分别为66.4%、37.5%、79.6%和72.5%；在相同给药浓度下，该四种衍生物均能极其显著地抑制HepG2生长，其抑制率分别为55.22%，87.79%，73.2%和63.1%；SF-RLP和CMDG-RLP对LoVo细胞生长的抑制率与药物浓度呈明显剂量依赖关系，两者对LoVo细胞的IC₅₀值分别为49.32ug/mL和35.92ug/mL。

（6）本发明促进了金樱子资源的综合利用，为制备具有抗肿瘤活性的新型多糖衍生物提供了新途径，推动了金樱子多糖在食品与医药中的应用和发展。

附图说明

图1为实施例1的工艺流程；

图2 为金樱子多糖DEAE-52洗脱曲线；

图3 为金樱子多糖DEAE-Sepharose FF洗脱曲线；

图4 为Sephadex G-100洗脱曲线；

图5 为RLP的GPC色谱图；

图6为DG-RLP的GPC色谱图；

图7为金樱子多糖及其改性产物对SKVO细胞增殖的抑制率；

图8为金樱子多糖及其改性产物对HepG 2细胞增殖的抑制率；

图9为金樱子多糖及其改性产物对LoVo细胞增殖的抑制率。

具体实施方式

实施例1 金樱子多糖制备

（1）如图1先将金樱子果实粉碎；然后用石油醚于50℃回流1h脱脂；再用80%wt乙醇于96℃回流两次，每次2h，采用80℃热水浸提2h后，合并提取液、再对其进行纱布过滤和布氏漏斗抽滤；浓缩、浓缩后加入无水乙醇沉淀，再将沉淀干燥后得到金樱子粗多糖；

（2）金樱子粗多糖分别溶于10mLH₂O、0.1和0.2mol/LNaCl溶液，加入DEAE-纤维素52（填料）静态吸附30min，冲洗DEAE-纤维素52，过滤洗脱液，收集滤液即为脱色后的粗多糖溶液；检测DEAE-纤维素52在不同溶剂中吸附的脱色率，如表1所示；

（3）脱色后的粗多糖溶液加入木瓜蛋白酶，60℃水浴中降解3h，调节pH6.0，离心取上清液，加入占离心液体积1/5的氯仿-正丁醇溶液，振荡20 min，分液去除有机相，离心，取上清液，重复步骤（3）操作5次得到脱蛋白后的粗多糖溶液；所述木瓜蛋白酶与底物（底物就是脱色后的粗多糖溶液）的质量体积比为1% g/l

（4）脱蛋白后的粗多糖溶液经DEAE-纤维素52离子交换柱层析，用0.1 ~ 0.5mol/L NaCl 溶液洗脱，平均流速1.0 mL/min；洗脱液用硫酸—苯酚法跟踪检测，收集主峰的洗脱液，将收集到的洗脱液浓缩，再经过DEAE-Sepharose FF阴离子交换剂，先用pH7.6的缓冲液洗脱，再用0.1~0.5mo1/LNaC1 pH7.6的缓冲液梯度洗脱，平均流速1.0 mL/min，收集主峰的洗脱液，透析，冻干得到金樱子多糖RLP；

效果分析：

从表1中可以看出，步骤（2）采用不同溶剂的多糖溶液的脱色率均大于95%，而且从粗多糖脱色前后的多糖含量来看，脱色后的多糖含量大于脱色前的多糖含量。多糖糖基上有大量的羰基和硫酸基，易与DEAE—纤维素发生吸附。因此，能用DEAE—纤维素吸附多糖，通过洗脱条件的改变而达到对多糖的纯化和级分分离。所以DEAE-纤维素52不仅除去了金樱子粗多糖中的色素，还起到了纯化多糖的作用。

表1 DEAE-52脱色效果

金樱子粗多糖的脱蛋白

步骤（3）中粗多糖溶液加入木瓜蛋白酶，水浴中降解，离心取上清液，加入占其体积1/5的氯仿—正丁醇（5:1）溶液，振荡20 min，分液去除有机相，离心，取上清液，重复上述操作数次。

在通过木瓜蛋白酶处理后，由于绝大部分游离蛋白质及部分与多糖结合的蛋白质被水解，多糖沉淀中蛋白质的含量大大降低，仅需少量几次Sevag法，即可达到去除蛋白的要求，减少了多糖损失。而且在酶解过程中，部分与多糖结合的蛋白质分解，使蛋白质去除率提高，脱蛋白后的多糖蛋白质含量较低。由实验结果可见，酶法与Sevag法处理金樱子多糖中多糖和蛋白质损失的程度不同，基本上呈递减趋势，而脱蛋白效果主要集中在前5次，前5次蛋白脱除率达88.06%，多糖损失率为21.78%。而且多糖的损失在脱蛋白5次以后趋于平缓，因此金樱子多糖采用酶法与Sevag法脱蛋白5次为最佳。

金樱子粗多糖的凝胶柱层析纯化

步骤（4）采用DEAE-52将金樱子粗多糖进一步分离，色谱柱Ф1.6×30，称取100mg多糖溶解于H₂O中上柱，依次用0.1 ~ 0.5mol/L NaCl 溶液洗脱，平均流速1.0 mL/min，每5min收集一管，用硫酸—苯酚法490nm跟踪检测，以吸光值对洗脱体积作图，得出洗脱曲线，收集。将收集到的溶液浓缩，再经DEAE-Sepharose FF阴离子交换剂进一步纯化，先用pH7.6的缓冲液洗脱，再用0.1~0.5mo1/LNaC1 pH7.6的缓冲液梯度洗脱，平均流速1.0 mL/min，每5 min收集一管，用硫酸—苯酚法490 nm跟踪检测，以吸光值对洗脱体积作图，得出洗脱曲线，收集，透析，冻干得到金樱子多糖称为RLP(Rosa laevigata Michx Polysaccharide)。

对金樱子粗多糖用DEAE-52进行纯化，洗脱曲线如图2。在17管到29管出现一个主峰，旁边出现一个小峰，两个峰的回收率分别为71.5%和15.2%。收集主要多糖（主峰部分）。

经DEAE- Sepharose FF离子交换剂进一步纯化，洗脱曲线如图3，洗脱峰为单一对称峰，得到相对单纯的多糖。

金樱子多糖的纯度鉴定

金樱子粗多糖和精制多糖RLP用Sephadex G-100进行检测，得到洗脱曲线图4，图中可见洗脱峰为单一峰，且峰形较对称，说明该多糖为单一组分。

Sephadex G-100凝胶色谱鉴定结果表明，RLP具有较高纯度。

经Breeze GPC软件处理所得葡聚糖Dextran系列标准品的GPC标准曲线图，获得葡聚糖Dextran系列标准品的分子量和保留时间关系图。以标准葡聚糖分子量的对数logMw对洗脱体积进行回归所的葡聚糖Dextran系列标准品的GPC标准曲线图。图5为RLP的GPC色谱图，由标准曲线求得RLP的Mw为227kDa。

实施例2 金樱子硫酸化多糖的制备

（2）金樱子粗多糖分别溶于10mLH₂O，加入DEAE-纤维素52（填料）静态吸附30min，冲洗DEAE-纤维素52，过滤洗脱液，收集滤液即为脱色后的粗多糖溶液；

（5）硫酸酯化多糖衍生物的制备：50mLN,N-二甲基甲酰胺置于4℃冰浴中；搅拌下缓慢滴加15mL氯磺酸，控制滴加速度，使反应体系温度低于10℃，继续搅拌至得到澄清溶液即为酯化剂；称取金樱子多糖0.5g，加入15mLN,N-二甲基甲酰胺，4℃冰箱放置过夜，加入酯化剂，50℃摇床反应3h后，冷却，醇沉，离心，将沉淀溶解，再反复醇沉水溶3次，加入0.1mol/L NaOH溶液调节pH至7，浓缩，干燥，得到硫酸酯化多糖衍生物。

将金樱子多糖硫酸酯化产物用DEAE-52进行纯化，再经DEAE- Sepharose FF离子交换剂进一步纯化，洗脱峰为单一对称峰。透析，冷冻干燥，得到纯化后的硫酸酯化多糖，记为SF-RLP。

实施例3 金樱子羧甲基化多糖的制备

称取实施例2制得的5g金樱子多糖置于反应瓶中，加入76mL异丙醇，搅拌浸泡30min，加入10%NaOH溶液25mL，30℃浸泡1h。4g氯乙酸溶于10mL异丙醇，加入到上述浸泡液中，补加10%NaOH溶液25mL，70℃反应2.5h，反应结束后到出上层醇液，将产物用水溶解，HCl中和至中性后加入四倍体积95%乙醇沉淀多糖，再加少量水溶解，反复醇沉水溶3次，浓缩，干燥，得到产物羧甲基化多糖。

将金樱子多糖羧甲基化产物用DEAE-52进行纯化，经DEAE- Sepharose FF离子交换剂进一步纯化，洗脱峰峰形较为对称。收集主峰多糖，透析，冷冻干燥，得到纯化羧甲基化多糖，记为CM-RLP。

实施例4 金樱子降解多糖的制备

将实施例2制得的金樱子多糖与质量分数为0.6%的盐酸溶液混合，在70℃水浴中降解2.5h，降解液用2mol/LNaOH溶液调节pH至7.0，加入95%乙醇沉淀分离，用水溶解沉淀，反复醇沉水溶3次，浓缩，干燥，得到盐酸降解金樱子多糖衍生物。

将金樱子多糖盐酸降解产物用Sephadex G-100进行纯化，收集主峰多糖，透析，冷冻干燥，得到纯化金樱子多糖降解产物，记为DG-RLP。

图6为DG-RLP的GPC色谱图，由标准曲线求得DG-RLP的Mw为38KDa。由此可见，经过HCl降解，金樱子多糖的分子量由原来的227KDa降低到38KDa。

实施例5 金樱子降解-羧甲基化多糖的制备

称取5g实施例4 制得的DG-RLP置于反应瓶中，加入76mL异丙醇，搅拌浸泡30min，加入10%wtNaOH溶液25mL，30℃碱处理1h。4g氯乙酸溶于10mL异丙醇，加入到上述浸泡液中，补加10%wtNaOH溶液25mL，70℃反应2.5h，反应结束后倒出上层醇液，将产物用水溶解，HCl中和至中性后加入四倍体积的95%（体积分数）乙醇沉淀多糖，再加少量水溶解，反复醇沉水溶3次，浓缩，干燥，得到金樱子降解多糖的羧甲基化产物。

将金樱子降解多糖的羧甲基化产物用Sephadex G-100进行纯化，收集主峰多糖，透析，冷冻干燥，得到纯化金樱子降解多糖的羧甲基化产物，记为CMDG-RLP。

实施例6 金樱子多糖及其改性产物对一些肿瘤细胞增殖的抑制效果

将刚解冻的SKVO，HepG2和LoVo细胞株，在1640型培养基中增值培养，将培养瓶放置在37℃下，含5% CO₂的培养箱中，每隔24h换一次培养液，分别取对数生长期的SKVO，HepG2和LoVo细胞，以3×10⁴mL^-1的细胞浓度在96孔板上每孔接种100mL，让细胞贴壁生长24h后，药物浓度为50μg·mL^-1，40μg·mL^-1，30μg·mL^-1，20μg·mL^-1，10μg·mL^-1无血清培养基作用于细胞，对照组为无血清培养基，每孔200uL，每组浓度设四个复孔，培养48小时后，取酶标仪在570nm处测光密度值，计算抑制率。

细胞生长抑制率=

（1）金樱子多糖及其改性产物对卵巢癌（SKVO）细胞增殖的抑制效果

以浓度为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL的RLP（实施例2）、SF-RLP、CM-RLP、DG-RLP和CMDG-RLP作用于SKVO细胞，结果见图7，从图7可以看出，RLP在药物浓度10~50μg/mL时对SKVO细胞增殖抑制作用有显著差异（P<0.05），在相同浓度下，SF-RLP、CM-RLP、DG-RLP和CMDG-RLP对SKVO细胞增殖的抑制作用均高于RLP的抑制作用，具有极显著差异（P<0.01）。SF-RLP，CM-RLP，DG-RLP和CMDG-RLP对SKVO细胞的抑制效果呈明显的浓度依赖作用，当药物浓度为50μg/mL时对细胞生长的抑制作用最为显著，其抑制率分别为66.4%、37.5%、79.6%和72.5%。比较SF-RLP、CM-RLP、DG-RLP、CMDG-RLP和RLP对SKVO细胞增殖的抑制作用可以看出，在10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL各个浓度下，改性多糖与RLP对细胞的抑制作用有极显著差异（P<0.01），当药物浓度为50μg/mL时，SF-RLP、CM-RLP、DG-RLP和CMDG-RLP对SKVO细胞增殖的抑制率比RLP分别高48.1%、19.2%、61.3%和54.2%。由此可见，上述几种改性均能极显著地提高金樱子多糖对SKVO细胞增殖的抑制作用。

（2）金樱子多糖及其改性产物对肺癌（HepG2）细胞增殖的抑制效果

以浓度为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL的RLP、SF-RLP、CM-RLP、DG-RLP和CMDG-RLP作用于HepG 2细胞，结果见图8，从图8可以看出，与对照组相比，RLP在药物浓度10~50μg/mL时对HepG 2细胞增殖的抑制作用有显著差异（P<0.05），在相同浓度下，SF-RLP、CM-RLP、DG-RLP和CMDG-RLP对HepG 2细胞增殖的抑制作用均高于RLP的抑制作用，具有极显著差异（P<0.01）。SF-RLP，CM-RLP，DG-RLP和CMDG-RLP对HepG 2细胞的抑制效果呈明显的浓度依赖作用，当药物浓度为50μg/mL时对细胞生长的抑制作用最为显著，其抑制率分别为55.2%、87.8%、73.2%和63.1%。比较SF-RLP、CM-RLP、DG-RLP、CMDG-RLP和RLP对HepG 2细胞增殖的抑制作用可以看出，10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL各个浓度下改性多糖与RLP对细胞的抑制作用之间的差异极显著（P<0.01），当药物浓度为50μg/mL时，SF-RLP、CM-RLP、DG-RLP和CMDG-RLP对HepG 2细胞增殖的抑制率比RLP分别高出42.6%、75.2%、60.6%和50.5%。由此可见，上述几种改性均能极显著地提高金樱子多糖对HepG2 细胞增殖的抑制作用。

（3）金樱子多糖及其改性产物对直肠癌（LoVo）细胞增殖的抑制效果

以浓度为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL的RLP、SF-RLP、DG-RLP和CMDG-RLP作用于LoVo细胞。结果见图9，从图9可以看出，与对照组相比，RLP在药物浓度10~50μg/mL时对LoVo细胞增殖的抑制作用有显著差异（P<0.05），而且不同药物浓度之间也存在显著差异（P<0.05），在相同给药浓度下，SF-RLP、DG-RLP和CMDG-RLP对LoVo细胞增殖的抑制作用均高于RLP的抑制作用，具有极显著差异（P<0.01）。SF-RLP，和CMDG-RLP对LoVo细胞的抑制率与药物浓度具有线性关系，当药物浓度为50μg/mL时对细胞生长的抑制作用最为显著，其抑制率分别为56.8%和52.7%。比较SF-RLP、DG-RLP、CMDG-RLP和RLP对LoVo细胞增殖的抑制作用可以看出，当药物浓度较低时（10μg/mL~30μg/mL），CMDG-RLP的抑制率与RLP没有显著差异，随浓度增大而表现出极显著差异（P<0.01），SF-RLP和DG-RLP在浓度10μg/mL~50μg/mL与RLP对LoVo细胞的抑制作用之间的差异极显著（P<0.01）。当药物浓度为50μg/mL时，SF-RLP、DG-RLP和CMDG-RLP对LoVo细胞增殖的抑制率比RLP分别高出31.6%、14.0%和27.5%。由此可见，上述几种改性均能极显著地提高金樱子多糖对LoVo细胞增殖的抑制作用。

Claims

1.具有抗肿瘤活性的金樱子多糖衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.具有抗肿瘤活性的金樱子多糖衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.具有抗肿瘤活性的金樱子多糖衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.具有抗肿瘤活性的金樱子多糖衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求1-4之一所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述木瓜蛋白酶与脱色后的粗多糖溶液的质量体积比为1% g/l，水浴温度为60℃，降解3h，pH为6.0，重复步骤（3）5次。

6.根据权利要求1-4之一所述的制备方法，其特征在于，所述用0.1 ~ 0.5mol/LNaCl 溶液梯度洗脱是依次用0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/LNaCl 溶液洗脱。