CN102217794B

CN102217794B - 一种烟叶生化添加剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102217794B
Application number: CN 201110042983
Authority: CN
Inventors: 段焰青; 者为; 王明锋; 杨金奎; 朱保昆; 蒋举兴; 张克勤
Original assignee: Hongyun Honghe Tobacco Group Co Ltd
Current assignee: Hongyun Honghe Tobacco Group Co Ltd
Priority date: 2011-02-23
Filing date: 2011-02-23
Publication date: 2013-02-13
Anticipated expiration: 2031-02-23
Also published as: CN102217794A

Abstract

本发明公开了一种烟叶生化添加剂（Van-1）及其制备方法和应用，属于烟用添加剂的技术领域。本发明所使用的菌株分类命名为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)Van35；保藏编号为CGMCCNo.3411。该生化添加剂Van-1处理烟叶8个月后，能有效促进烟叶中大分子化合物含量的改变，如总糖和还原糖含量升高，总氮、烟碱、蛋白质和纤维素的含量有所下降；同时，烟叶中的致香成分的含量提高，烟叶的品质和自然醇化18～24个月的烟叶样品接近。生化添加剂Van-1有助于烟叶中化学成分之间的转化和致香成分的形成与积累，可有效地提高烟叶的醇化效果，缩短醇化时间。

Description

一种烟叶生化添加剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于烟用添加剂的技术领域，更具体地说，本发明涉及一种生化添加剂。同时，本发明还涉及所述添加剂的制备方法和在烟草工业中的应用。

背景技术

烟草是一种以吸食为目的的特殊经济作物，其使用价值取决于它的品质。香吃味是评价烟叶品质的重要指标，优质烟叶要求烟香气质纯正，香气量充足，吃味醇和，余味舒适。烟叶从种植到卷制成卷烟产品是一个复杂的***工程，期间需要经历打叶复烤、烟叶醇化等一系列步骤。其中，打叶复烤是解决收获烟叶品质上存在缺陷的基本方法，即将烟站收购的初烤把装烟（亦称原烟）运到复烤车间进行第二次烤制，将整片烟打制成一定规格的碎片烟，在打叶复烤过程中杀虫，促进青烟转黄，减轻刺激和杂气，并控制烟叶水分在11％～13％范围内，防止烟叶在仓储过程中生虫霉变。现有技术中打叶复烤后的碎片叶经过机械打包后，需要堆放在烟叶醇化仓库内，在自然条件下贮存2～3年，通过自然醇化改善烟叶的抽吸品质。这种自然醇化方法由于烟叶过于干燥，会抑制附着于烟叶表面的有益微生物的生长，所需烟叶醇化时间过长，增加了仓储成本。

虽然可以通过添加外源生物酶以缩短醇化时间，但由于外源生物酶的品种过于单一，造成香性物质的种类减少，香气自然感、层次感有所减弱。同时，这种添加外源生物酶自然醇化的生产方式，人工和酶制剂的成本较高，这些都使得现有生产方法周期过长，需要占用大量资金和库房，生产成本较高。如何克服上述问题，现有技术中尚无理想的解决办法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种新的生化添加剂。

本发明的另一目的是提供所述生化添加剂的制备方法。

本发明进一步的目的是提供所述生化添加剂在烟叶醇化中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

* 除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

A. 本发明提供了一种生化添加剂，该添加剂是通过对短小芽孢杆菌 (Bacillus pumilus) Van35的发酵产物提取。

本发明从烤烟叶面上分离到一株细菌Van35，鉴定结果表明该细菌属于短小芽孢杆菌，该菌株命名为 (Bacillus pumilus) Van35。该菌株已经保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCG）；该中心地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2009年11月5日；保藏号为CGMCC No. 3411。

短小芽孢杆菌Van35菌株的形态学和生理生化性质特征为：菌体呈杆状，革兰氏阳性，芽孢椭圆形中生或端生，不膨大，芽孢比菌体小存在于菌体中。菌落呈圆形，扁平无凸起，乳白色，有光泽，边缘不整齐。常规生理生化实验表明：ND12是好氧菌，过氧化氢酶实验，VP 实验，产H2S实验，明胶液化实验和卵磷脂酶实验曾阳性；水解淀粉实验，产NH3 实验，甲基红实验，吲哚实验，水解脂肪实验和硝酸盐还原实验呈阴性。

短小芽孢杆菌Van35的分子鉴定特征为：利用通用引物20F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1500R（5’-GGTTACCTTGTTACGA CT-3’），以短小芽孢杆菌Van35的基因组DNA作为模板扩增得到1500 bp左右的PCR产物，回收测序、校正之后得到的Van35菌株的部分16S rRNA基因序列1510 bp, 该序列已经递交国际核苷酸序列数据库（GenBank），序列索引号为：GU290547。

B.本发明提供了一种烟叶生化添加剂的制备方法，该方法采用下述步骤：

（1）将短小芽孢杆菌（B. pumilus）Van35扩大发酵培养；

将 50 mL液体种子培养基分装于250 mL三角瓶中，接种菌株Van35，于 30oC振荡 (180 r/min)培养 24 h，得到液体种子。接种8%的液体种子于装有240 mL液体种子培养基的1000 mL三角瓶中，于30oC振荡 (180 r/min)培养24 h，得到用于扩大培养的液体种子。

（2）通过过滤或离心收集发酵液；

然后，无菌操作将 8%的液体种子接种到装有60 L液态产酶培养基的100 L发酵罐中，于30oC静态培养36小时放罐。离心（8000 rpm, 20 min）收集发酵液。

（3）通过硫酸铵沉淀发酵液中的蛋白质，离心收集沉淀；

按照发酵液体积加入硫酸铵（56%，w/v），搅拌2 h，再次离心（8000 rpm, 20 min）收集沉淀

（4）透析除去硫酸铵，即得所需的生化添加剂。

把沉淀溶解在600 ml的PH7.0磷酸盐缓冲液中，透析除去硫酸铵，得到Van35发酵提取物，该提取物即为生化添加剂Van-1。

C.本发明提供了所述的生化添加剂作为烟叶醇化添加剂的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果。

（1）本发明使烟叶的醇化时间较自然醇化有了大幅度的缩短，并且烟叶品质有了明显的提高。能有效促进烟叶中大分子化合物含量的改变，例如，总糖和还原糖含量升高。而总氮、烟碱、蛋白质和纤维素的含量有所下降；同时，烟叶中的致香成分的含量提高，

（2）烟叶醇化时间的缩短有助于烟草企业节约仓储空间和时间，提高了醇化车间的利用率，有利于烟草企业的加速发展。

（3）本发明提供的生化添加剂是对传统技术的重要突破，能有效改善烟叶的醇化过程，使烟叶的品质得到了明显提高，同时，增加了烟叶的利用率。

（4）本发明工艺简单、操作性、规范性及可控性强，原料易得，成本低，便于实现大规模工业化生产，具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1是本发明制备菌株Van35发酵提取物的工艺流程图。

具体实施方式

例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

——培养基的制备

1）斜面保藏培养基 (克/升，g/v)：胰蛋白胨 10，牛肉膏3，NaCl 5，琼脂 15，用 20% Na₂CO₃调节pH 8.5，121oC灭菌 20 min；

2）液体种子培养基 (克/升，g/v)：胰蛋白胨 10，牛肉膏 3，NaCl 5，用 20% Na₂CO₃调节 pH 8.5，121oC灭菌20 min；

3）液态产酶培养基 (%)：麸皮1.5，大豆蛋白胨 1.5，干酪素1.0，CaCl₂ 0. 1% , K₂HPO₄ 0. 1 % , KH₂ PO₄ 0.125%, MgSO₄ · 7H₂O，0.05%, FeSO₄ 0.0004%, pH 8.0。121oC灭菌 20 min。

——菌株Van35发酵提取物的制备

如图1所示，主要包括种子培养、发酵、离心、硫酸铵沉淀等步骤。

具体的流程如下：先将 50 mL液体种子培养基分装于250 mL三角瓶中，接种菌株Van35，于 30oC振荡 (180 r/min)培养 24 h，得到液体种子。接种8%的液体种子于装有240 mL液体种子培养基的1000 mL三角瓶中，于30oC振荡 (180 r/min)培养24 h，得到用于扩大培养的液体种子. 然后，无菌操作将 8%的液体种子接种到装有60 L液态产酶培养基的100 L发酵罐中，于30oC静态培养36小时放罐。离心（8000 rpm, 20 min）收集发酵液，按照发酵液体积加入硫酸铵（56%，w/v），搅拌2 h，再次离心（8000 rpm, 20 min）收集沉淀，把沉淀溶解在600 ml的PH7.0磷酸盐缓冲液中，透析除去硫酸铵，得到Van35发酵提取物，该提取物即为生化添加剂Van-1。经检测生化添加剂Van-1含有多种水解酶，包括淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等多种酶。

实施例3

——产品特征及理化性质

本产品是浅棕色透明澄清液体，产品的理化性质见表1所示。

表1.生化添加剂的理化性质

实施例4

——烟叶醇化实验

配制好生化添加剂，取合适体积（5%～10%）的添加剂均匀喷洒在100g烟叶表面(控制烟叶水分含量为12-13%)，混合均匀作为处理样，在醇化车间醇化8个月。直接喷洒相同量的去离子水在100g烟叶表面（控制烟叶水分含量为12-13%）作为对照样。进行5次重复。

实施例5

生化添加剂Van-1处理烟叶8个月后，能有效促进烟叶中大分子化合物含量的改变，如总糖和还原糖含量升高，总氮、烟碱、蛋白质和纤维素的含量有所下降，同时，烟叶中的致香成分的含量提高，烟叶的品质和自然醇化18-24个月的烟叶样品接近。说明生化添加剂处理有助于烟叶中化学成分之间的转化和致香成分的形成和积累，可有效地提高烟叶的醇化效果，缩短醇化时间。

实施例6

生化添加剂Van-1的制备方法同实施例1，取合适体积（5%-10%）的添加剂均匀喷洒在100g红大B4F烟叶表面(控制烟叶水分含量为12-13%)，混合均匀作为处理样，在醇化车间醇化8个月。直接喷洒相同量的去离子水在100g烟叶表面（控制烟叶水分含量为12-13%）作为对照样。同时选择自然醇化24个月的红大B4F烟叶作为对照，检测样品的常规化学成分和致香成分，同时通过感官评吸进一步评价生化添加剂处理烟样的效果。

常规化学成分的检测结果表明：红大B4F烟叶经过生化添加剂处理8个月以后，烟叶的生物大分子化合物的含量发生了较大的改变，其中还原糖和总糖的含量发生了明显的提高，总氮、纤维素和烟碱的含量发生了下降，挥发碱和石油醚提取物总量有所下降，这些化合物的含量的变化有利于烟叶的吸食品质，同时经过生化添加剂处理的烟叶和自然醇化24月烟叶的化学成分的含量接近。此外，利用GC-MS对烟叶样品的致香成分进行检测，结果表明，红大B4F烟叶经过自然醇化或生化添加剂处理以后，烟叶的致香成分大多发生了增加，同时生化添加剂处理的烟叶样品的致香成分总量较烟叶自然醇化增加得多，说明生化添加剂处理有助于烟叶中致香成分的形成和积累。同时，添加生化添加剂醇化8个月的红大B4F烟叶的致香成分和自然醇化24个月的B3F烟叶的致香成分接近。综上，添加生化添加剂醇化8个月的B4F烟叶的化学成分接近自然醇化24个月的B3F烟叶。感官评吸结果表明，经过生化添加剂处理8个月的烟叶红大B4F的感官评吸质量比未醇化的烟叶B4F有了大幅度的提高，达到自然醇化24个月的烟叶B4F的感官品质，同时经过生化添加剂处理8个月的烟叶B4F的评吸得分与自然醇化24个月的烟叶B3F的差异不大，说明它们的感官质量接近。以上结果表明生化添加剂Van-1的应用加快了红大B4F烟叶醇化的速度，缩短了醇化周期，提高了烟叶的品质。

实施例7

生化添加剂Van-1的制备方法同实施例1，取合适体积（5%-10%）的添加剂均匀喷洒在100g烟叶MZF表面(控制烟叶水分含量为12-13%)，混合均匀作为处理样，在醇化车间醇化8个月。直接喷洒相同量的去离子水在100g烟叶表面（控制烟叶水分含量为12-13%）作为对照样。同时选择自然醇化18个月的烟叶MZF作为对照，检测样品的常规化学成分和致香成分，同时通过感官评吸进一步评价生化添加剂处理烟样的效果。

常规化学成分的检测结果表明：烟叶MZF经过生化添加剂处理8个月以后，烟叶的生物大分子化合物的含量发生了较大的改变，其中还原糖和总糖的含量发生了明显的提高，总氮、纤维素和烟碱的含量发生了下降，挥发碱和石油醚提取物总量有所下降，这些化合物的含量的变化有利于烟叶的吸食品质，同时经过生化添加剂处理的烟叶和自然醇化18月烟叶的化学成分的含量接近。此外，利用GC-MS对烟叶样品的致香成分进行检测，结果表明，烟叶MZF经过自然醇化或生化添加剂处理以后，烟叶的致香成分大多发生了增加，同时生化添加剂处理的烟叶样品的致香成分总量较烟叶自然醇化增加得多，说明生化添加剂处理有助于烟叶中致香成分的形成和积累。感官评吸结果表明，经过生化添加剂处理8个月的烟叶MZF的感官评吸质量比未醇化的烟叶MZF有了大幅度的提高，达到自然醇化18个月的烟叶MZF的感官品质。以上结果表明生化添加剂Van-1的应用加快了烟叶MZF醇化的速度，缩短了醇化周期，提高了烟叶的品质。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种烟叶生化添加剂，其特征在于，该醇化添加剂是通过对短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)Van35的发酵产物提取得到；所述的短小芽孢杆菌保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.3411；所述的发酵产物的液态培养基按质量百分数为：麸皮1.5，大豆蛋白胨1.5，干酪素1.0，CaCl₂ 0.1,K₂HPO₄ 0.1,KH₂PO₄ 0.125,MgSO₄·7H₂O，0.05,FeSO₄ 0.0004,pH 8.0；121℃灭菌20min。

2.一种权利要求1所述的烟叶生化添加剂的制备方法，其特征在于采用以下步骤：

（1）将50mL液体种子培养基分装于250mL三角瓶中，接种菌株Van35，于30℃振荡培养24h，得到液体种子；接种8%的液体种子于装有240mL液体种子培养基的1000mL三角瓶中，于30℃振荡培养24h，得到用于扩大培养的液体种子；

（2）无菌操作将8%的液体种子接种到装有60L液态产酶培养基的100L发酵罐中，于30℃静态培养36小时放罐；离心8000rpm,20min收集发酵液，按照体积重量比，发酵液中加入56%的硫酸铵，搅拌2h，再次离心8000rpm,20min收集沉淀；

（3）把沉淀溶解在600ml的pH7.0磷酸液中，析除去硫酸铵，得到Van35发酵提取物，该提取物即为所需的烟叶生化添加剂Van-1。

3.权利要求1所述的生化添加剂在烟叶醇化中的应用，其具体作法如下：取5%～10%体积的生化添加剂均匀喷洒在100g烟叶表面，控制烟叶表面，控制烟叶水分含量为12%～13%。