CN102215872B - 用于治疗癌症的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含酸性神经酰胺酶抑制剂和胆碱激酶抑制剂的组合物,以及该组合物在治疗癌症中的用途。本发明还涉及基于检测酸性神经酰胺酶水平来为癌症患者选择个体化治疗的方法。此外,本发明还涉及包含胆碱激酶抑制剂和化疗剂的组合物,以及该组合物在治疗癌症中的用途。最后,本发明还涉及包含胆碱激酶抑制剂和死亡受体配体的组合物,以及该组合物在治疗癌症中的用途。
Description
发明领域
本发明涉及治疗领域,并且更具体而言,涉及使用含有数种治疗化合物的组合物治疗癌症的领域,所述组合物与单独使用所述化合物相比表现出提高的活性。
发明背景
胆碱激酶是肯尼迪途径(Kennedy pathway)或磷脂酰胆碱(PC)合成途径的第一个酶。其作用是使用腺苷5’-三磷酸盐(ATP)作为磷酸基供体将胆碱磷酸化为磷酸胆碱(PCho)。Ras基因构成了所谓的致癌基因家族,已经对其进行了广泛研究,因为它们在25-30%的所有人类肿瘤中被激活,并且某些Ras基因在90%的所有人类肿瘤中被激活。由于Ras蛋白参与细胞增殖,终末分化和衰老的调节,所以它们在细胞内信号传递中起重要作用。不同致癌基因所介导的转化诱导高胆碱激酶活性水平,其中ras致癌基因发挥重要作用,这导致了胆碱激酶的产物PCho的细胞内水平的异常增加。其它发现也支持ChoK在人类肿瘤产生中的作用。例如,核磁共振(NMR)技术已经证实:相对于正常组织,包括***、***、脑和卵巢肿瘤在内的某些人类肿瘤组织存在高PCho水平。现已公知的是,ras是人类癌症发生中最深入研究的致癌基因之一,并且ChoK抑制已经证实为致癌基因所转化的细胞中新的并且有效的抗肿瘤策略。随后在裸鼠中体内推断了这些初步发现。
基于该资料,设计以单独或联合的方式直接影响胆碱激酶活性或磷酰胆碱所活化的酶的化合物将允许有效抗肿瘤治疗的开发。
从该角度看,对ChoK抑制剂的研究已经将密胆碱-3(HC-3)鉴定为相对有效并且具有选择性的阻断剂(Cuadrado A.,et a1.,1993,Oncogene 8:2959-2968,Jiménez B.,et al.,1995,J.Cell Biochem.57:141-149;Hernández-Alcoceba,R.et al.,1997,Oncogene,15:2289-2301)。该具有联苯基结构的胆碱同系物已被用于设计新的抗肿瘤药物。然而,由于HC-3 是有效的呼吸***麻痹剂,所以HC-3不是用于临床实践的好的候选物。基于HC-3的结构、通过在该化合物引入结构修饰,已经合成了具有改善的ChoK抑制活性和降低的毒性作用的某些衍生物。
还已经发现,来源于吡啶鎓的双季铵化对称化合物能够抑制全细胞中PCho的产生(WO98/05644)。然而,这些衍生物具有高毒性水平,这限制了其扩展的治疗应用。
对于化疗的抗性(“药物抗性”)是限制目前癌症治疗中使用的许多化学治疗的有效性的根本问题。药物抗性的发生是由于多种机制,例如增加的药物失活、降低的药物积累、药物从癌细胞流出、化疗诱导的损伤的增强修复、促存活途径的活化和细胞死亡途径的失活(Hersey P.et al.,2008,Adv Exp Med Biol.2008;615:105-26)。药物抗性可以是在开始抗肿瘤治疗前肿瘤细胞所固有的。此外,特异性药物抗性机制可以是肿瘤细胞暴露于特定治疗之后才被激活的。鉴定出对固有抗性或获得性抗性负有责任的那些分子实体可以提供对于可以用于克服该抗性的潜在分子靶标的有价值的信息。因此,以干扰赋予对于确定的肿瘤特异性治疗的药物抗性的分子组分为目的的设计策略构成了致力于增加癌症治疗功效的重要步骤。
Mori et al(Cancer Res.,2007,67:11284-11290)已经描述了ChoK抑制剂(胆碱激酶特异性siRNA)和5-氟尿嘧啶的联合使用导致对于降低乳腺癌细胞的细胞增殖/活力的协同效应。然而,该治疗依赖于使用siRNA,而siRNA在体内并未以有效方式转运至靶细胞内。此外,为此目的而设计的siRNA同时识别ChoKα和ChoKβ(Mori et al.,Cancer Res.,2007,67:11284-11290),但是仅ChoKα是肿瘤学的分子靶标,ChoKβ并不是肿瘤学的分子靶标(专利WO2006108905和共同待决的西班牙专利申请P200800416),这质疑了该策略的潜在治疗用途。
尽管如此,仍然非常需要开发提供ChoK酶的高抑制活性的化合物,以允许将其用于肿瘤治疗,同时,相对于现有技术中的化合物,所述化合物应当大大降低其毒性。
发明概述
在第一方面,本发明涉及组合物,所述组合物分开包含或合在一起地包含第一组分和第二组分,所述第一组分包含一种或多种胆碱激酶抑制剂,所述第二组分选自一种或多种酸性神经酰胺酶抑制剂、一种或多种化疗剂和一种或多种死亡受体配体。
在第二方面,本发明涉及包含本发明的组合物与药学可接受的载体或赋形剂的药物组合物,并且涉及所述药物组合物在医药中并特别是在治疗癌症中的用途。
在另一方面,本发明涉及酸性神经酰胺酶抑制剂、化疗剂或死亡受体配体在增加肿瘤细胞对于胆碱激酶抑制剂的敏感性中的用途。
在仍然另一方面,本发明涉及鉴定对ChoK抑制剂治疗具有抗性的癌症患者的方法,所述方法包括测定来自所述患者的样品中酸性神经酰胺酶的水平,其中当所述样品中酸性神经酰胺酶的水平高于参考样品时,所述患者被鉴定为对ChoK抑制剂具有抗性。
在另一方面,本发明涉及为癌症患者选择个体化治疗的方法,所述方法包括测定来自所述患者的样品中酸性神经酰胺酶的水平,其中如果所述样品中酸性神经酰胺酶的表达水平高于参考样品,则将该患者候选用ChoK抑制剂和酸性神经酰胺酶抑制剂的组合进行治疗。
在仍然另一方面,本发明涉及鉴定能够增加ChoK抑制剂在治疗癌症中的治疗效果的化合物的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)使表现出对ChoK抑制剂的抗性的肿瘤细胞与候选化合物接触;以及
(ii)测定所述细胞中酸性神经酰胺酶的水平;
其中如果用候选化合物处理后的细胞中酸性神经酰胺酶的水平低于处理前,则所述候选化合物被认为能够增加ChoK抑制剂在治疗癌症中的效果。
附图简述
图1.NSCLC患者的肿瘤原代培养物中对于MN58b处理的反应。
图2.对通过RT-qPCR的微阵列分析结果的验证。
图3.对于NSCLC中ChoK抑制的抗性机制所提出的模型。
图4.通过RT-qPCR测定的来源于人肺癌的不同细胞系中ASAH1和ChoK的水平。
图5.对ChoK抑制剂具有抗性的细胞H460中通过qRT-PCR测定的ASAH1基因表达和通过Western印迹分析测定的酸性神经酰胺酶蛋白表达。
图6.顺铂/ChoK抑制剂的联合相继治疗的协同效应。
图7.NSCLC异种移植物中顺铂/ChoK抑制剂的联合治疗。(A)MN58b/顺铂(统计学显著性;MN58b p=0.09;顺铂p=0.3;相继p=0.017;同时p=0.016),(B)NSCLC异种移植物中的联合治疗(统计学显著性;RSM-932A(932A)p=0.157;顺铂(DPP)p=0.441;相继DPP和TCd-171治疗(SEC)p=0.03);(C)以对照小鼠和用ChoK抑制剂(2mg/Kg)、顺铂(1mg/Kg)以及联合治疗组治疗的小鼠的毒性衡量的体重监测;(D)与联合治疗产生相似抗肿瘤活性的单独顺铂导致了毒性的显著增加。
图8.在标明的细胞系中肿瘤细胞对于胆碱激酶抑制剂RSM-932A(ChoKI)(A)或TRAIL(B)的敏感性。
图9.ChoKI和TRAIL联合治疗的协同作用。
图10.结肠癌细胞中MN58b和TRAIL联合治疗的协同效应。
图11.通过流式细胞仪分析所测定的结肠癌细胞中MN58b和TRAIL联合治疗的协同效应。
图12.ChoK抑制增加DR5表达。
图13.ChoKI/TRAIL联合治疗后的神经酰胺产生。
图14.结肠异种移植物中ChokI/TRAIL的联合治疗。
图15.结肠癌细胞中ChoK抑制剂和5-FU联合治疗的协同效应。
图16.通过流式细胞仪所测定的结肠癌细胞中ChoK抑制剂和5-FU联合治疗的协同效应。
图17.结肠异种移植物中ChokI/5-FU的联合治疗。
发明详述
ChoK抑制剂和酸性神经酰胺酶抑制剂的组合(本发明的第一组合物)
本发明的发明人已鉴定出对于胆碱激酶(ChoK)抑制剂具有抗性的 原代人肿瘤的存在(图1)。具体而言,本发明的实施例1描述了来源于人非小细胞肺癌组织的不同原代培养物表现出对于已知ChoK抑制剂MN58b的有差异的敏感性(图1)。出人意料的是,正如本发明的实施例2和3所示(图2),发现这种抗性是由酸性神经酰胺酶表达水平的增加所造成。ChoK的功能是将Cho磷酸化,从而产生磷酸胆碱(Pcho),磷酸胆碱(Pcho)是质膜的主要组分磷脂酰胆碱(PC)的前体(Lacal JC.,IDrugs.2001;4:419-26)。然而,细胞增殖必然需要膜,并因此必然需要PC。因此,不希望被任何理论所束缚,我们相信肿瘤细胞响应于ChoK抑制是通过备选途径的激活从而通过鞘磷脂(SM)的降解而产生PCho(图3)。然而,SM的切割不仅造成PCho的产生,还造成促凋亡的神经酰胺的产生,这导致了肿瘤细胞参与凋亡性细胞死亡。有趣的是,本文已经发现对于ChoK抑制具有抗性的那些细胞表现出增加的酸性神经酰胺酶水平,酸性神经酰胺酶是促进促凋亡的神经酰胺转变为促有丝***的鞘氨醇-1P的酶(图3)。这些结果提示酸性神经酰胺酶的过表达可以通过降低细胞内神经酰胺水平来抑制ChoK抑制所介导的细胞死亡的促进作用。因此,酸性神经酰胺酶的过表达使肿瘤细胞中ChoK抑制所触发的促凋亡信号失活。此外,产生的神经酰胺可以被转变为促有丝***的鞘氨醇-1P(图3)。
该发现提供了通过同时给予酸性神经酰胺酶抑制剂来增加对ChoK抑制剂的敏感性而实现改进的癌症治疗的可能性。事实上,本申请的实施例4证实,使用酸性神经酰胺酶抑制剂NOE处理NSCLS来源的肿瘤细胞导致了对ChoK抑制剂的增加的敏感性。此外,与单独使用抑制剂或联合使用ChoK抑制剂和碱性神经酰胺酶的特异性抑制剂相比,ChoK抑制剂MN58b或RSM-932A和酸性神经酰胺酶抑制剂D-NMAPPD的联合使用得到了提高的抗肿瘤效果(参见实施例4)。按照此方式,酸性神经酰胺酶抑制剂和ChoK抑制剂的联合给药将允许使用较低剂量的ChoK抑制剂,从而产生较小的不良副作用。
因此,在第一方面,本发明提供组合物(下文中的本发明第一组合物)所述组合物包含第一组分或第二组分、或者包含第一组分和第二组分,所述第一组分包含一种或多种胆碱激酶抑制剂,所述第二组分包含一种或多种酸性神经酰胺酶抑制剂。
术语“组合物”是指按照本发明的可选实施方案的一种或多种化合物的不同组合。优选地,所述组合物包含至少一种酸性神经酰胺酶抑制剂和至少一种ChoK抑制剂。
如本文所用的胆碱激酶是指在ATP的存在下催化胆碱的磷酸化作用而产生磷酰胆碱(PCho)的酶(EC 2.7.1.32)。示例性的按照本发明可以被抑制的胆碱激酶包括胆碱激酶α(如UniProt所限定的,人、小鼠和大鼠蛋白的登录号分别为P35790、O54804和Q01134)。
如本文所用的酸性神经酰胺酶(N-酰基鞘氨醇脱酰酶活性,EC 3.5.1.23)是负责在溶酶体中将神经酰胺降解为鞘氨醇和游离脂肪酸的脂质水解酶。细胞含有至少三种神经酰胺酶,所述三种神经酰胺酶是按照其活性和定位的最适pH进行分类(Li CM.et al.,Genomics,1999,62:223-31),分为酸性神经酰胺酶(ASAH1,NM_177924.3或Q13510)、中性神经酰胺酶(ASAH2,NM_019893或Q9NR71)和碱性神经酰胺酶(ASAH3,NM_133492,Q8TDN7或Q5QJU3)。已经也有对于第二酸性神经酰胺酶(称为酸性神经酰胺酶样蛋白或ASAHL)多肽的描述(UniProt登录号Q02083)。本发明中所使用的抑制剂为至少抑制酸性神经酰胺酶和/或酸性神经酰胺酶样蛋白的那些抑制剂,因为在对ChoK抑制剂具有抗性的细胞中,其它两种神经酰胺酶都未表现出表达的显著增加。
在某些人类癌症中,酸性神经酰胺酶活性异常表达。这种酶可被用作癌症的新靶点,并且可以参与抗癌治疗抗性(参见lan RS.,Genes Chromosomes Cancer.2000,29:137-46;Liu X.,Front Biosci.2008;13:2293-8和Morales A.,Oncogene.2007,26:905-16)。
胆碱激酶抑制剂
如本文所用的胆碱激酶抑制剂涉及能够导致ChoK活性降低的任何化合物,包括阻止ChoK基因表达从而导致ChoK mRNA或蛋白水平降低的那些化合物以及抑制ChoK导致该酶的活性降低的化合物。
在优选实施方案中,所述胆碱激酶抑制剂对于胆碱激酶α是特异性的。
可以使用测定mRNA表达水平的标准检测鉴定导致ChoK mRNA水 平降低的化合物,所述检测例如RT-PCR、RNA保护分析、Northern印迹、原位杂交、微阵列技术等。
可以使用测定蛋白表达水平的标准检测鉴定导致ChoK蛋白水平降低的化合物,所述检测例如Western印迹或Western转移、ELISA(酶联免疫吸附测定)、RIA(放射性免疫测定)、竞争性EIA(竞争性酶学免疫测定)、DAS-ELISA(双抗体夹心ELISA)、免疫细胞化学和免疫组织化学技术、基于使用包含特异性抗体的蛋白生物芯片或微阵列的技术、或基于胶体沉淀的、以诸如试纸的形式的检测。
使用测量胆碱激酶活性的标准检测来检测对于胆碱激酶生物活性的抑制能力的测定,所述分析例如基于以下的方法:如EP1710236所述,在纯化的重组胆碱激酶或富含胆碱激酶的组分的存在下,检测[14C]标记的胆碱被ATP的磷酸化作用,然后通过使用标准分析技术(例如TLC)检测磷酸化的胆碱。
如果化合物对于胆碱激酶α(ChoKα)是特异性的,则可以通过使用对于ChoKα是特异性的并且在严格条件下不会与其它ChoK异形体(例如,ChoKβ)杂交的探针检测ChoKα mRNA水平的降低或通过使用对于ChoKα是特异性的并且不会结合其它ChoK异形体(例如,ChoKβ)的抗体检测ChoKα蛋白水平的降低来鉴定这些化合物。适于ChoKα mRNA和ChoKα蛋白水平的特异性测定的试剂在WO2006108905中已有详细描述。
表1的I至XVIII中描述了可以用于本发明第一组合物的示例性的胆碱激酶抑制剂。
酸性神经酰胺酶抑制剂
如本文所用的酸性神经酰胺酶抑制剂涉及能够导致酸性神经酰胺酶活性降低的任何化合物,包括阻止酸性神经酰胺酶基因表达而导致酸性神经酰胺酶mRNA或蛋白水平降低的那些化合物以及与酸性神经酰胺酶的活性位点结合而导致该酶活性降低的化合物。
如本文所用的表述“酸性神经酰胺酶抑制剂”涉及能够导致酸性神经酰胺酶活性降低的任何化合物,包括阻止酸性神经酰胺酶基因表达而导致酸性神经酰胺酶mRNA或蛋白水平降低的那些化合物以及与酸性神经酰胺酶的活性位点结合而导致该酶活性降低的化合物。
可以使用测定mRNA表达水平的标准检测来鉴定导致酸性神经酰胺酶mRNA水平降低的化合物,所述标准检测例如RT-PCR、RNA保护分析、Northern印迹、原位杂交、微阵列技术等。
可以使用测定蛋白表达水平的标准检测来鉴定导致酸性神经酰胺酶蛋白水平降低的化合物,所述标准检测例如Western印迹或Western转移、ELISA(酶联免疫吸附测定)、RIA(放射性免疫测定)、竞争性EIA(竞争性酶免疫检测)、DAS-ELISA(双抗体夹心ELISA)、免疫细胞化学和免疫组织化学技术、基于使用包含特异性抗体的蛋白生物芯片或微阵列的技术、或基于胶体沉淀的、以诸如试纸的形式的检测。
可以通过测定使用纯化的酸性神经酰胺酶或富含酸性神经酰胺酶的组分和酸性神经酰胺酶的底物的酸性神经酰胺酶活性的标准检测来鉴定导致酸性神经酰胺酶的酶活性降低的酸性神经酰胺酶抑制剂。例如,ES2233204中所述的基于对N-(12-(4-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑)十二烷基)鞘氨醇(Cer-C12-NBD)的水解的抑制的方法。
可以在本发明第一组合物中使用的示例性的非限制性酸性神经酰胺酶抑制剂或酸性神经酰胺酶样蛋白抑制剂如表II的I至XIII项所示。
酸性神经酰胺酶特异性抑制性抗体或胆碱激酶特异性抑制性抗体
针对位于酸性神经酰胺酶或胆碱激酶中的表位的抗体可以有效地阻断这些蛋白的功能,并且因此可被用作本发明组合物中的抑制剂。如本文所用的“抑制性抗体”是指能够至少部分地抑制酸性神经酰胺酶或胆碱激酶的生物活性的抗体。
通过使用纯化的酸性神经酰胺酶或富含酸性神经酰胺酶的组分的标 准检测来测量酸性神经酰胺酶活性从而检测对于酸性神经酰胺酶生物活性的抑制能力的测定,例如ES2233204中所述的基于抗体抑制N-(12-(4-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑)十二烷基)鞘氨醇(Cer-C12-NBD)水解的方法。
使用标准检测来测量胆碱激酶的活性从而检测对于胆碱激酶生物活性的抑制能力的测定,例如如EP1710236中所述的方法,该方法基于在纯化的重组胆碱激酶或富含胆碱激酶的组分的存在下、ATP对[14C]标记的胆碱的磷酸化作用的检测,然后使用标准分析技术(例如TLC)检测磷酸化的胆碱。
对于胆碱激酶或酸性神经酰胺酶特异性的抑制性抗体或片段可容易获得或可以使用常规分子生物学技术容易地制备。例如,利用来源于例如酸性神经酰胺酶或胆碱激酶的免疫原,就可能通过使用标准方法获得抗蛋白/抗肽抗血清或单克隆抗体(参见,例如,Antibodies:A Laboratory Manual(抗体:实验手册)ed.by Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press:1988))。可以用免疫原形式的肽(例如,酸性神经酰胺酶或胆碱激酶或它们的能够引发抗体应答的抗原性片段)免疫诸如小鼠、仓鼠或兔的哺乳动物。赋予蛋白或肽免疫原性的技术是本领域公知的,包括与载体或其它技术共轭。可以在佐剂的存在下给予多肽的免疫原部分。可以通过检测血浆或血清中的抗体滴度来监测免疫的进程。可以将免疫原作为抗原,使用标准ELISA或其它免疫测定来评价抗体水平。在优选实施方案中,构成本发明组合物的一部分的抗体对于酸性神经酰胺酶或胆碱激酶(或与其同一性为至少80%、85%、90%、95%、或98%的变体)的抗原决定簇是免疫特异性的。在某些实施方案中,免疫特异性主题抗体基本上不与非脊椎动物(例如酵母)酸性神经酰胺酶或胆碱激酶相关蛋白发生交叉反应。“基本上不发生交叉反应”表示所述抗体所具有的对于非同源蛋白的结合亲和力比所述抗体对于酸性神经酰胺酶或胆碱激酶的结合亲和力低至少一个数量级、更优选地至少2个数量级以及甚至更优选地至少3个数量级。
因此,本发明的抗体能够结合胆碱激酶或酸性神经酰胺酶的表位;通常,需要至少6、8、10或12个连续氨基酸来形成表位,然而,包含非连续氨基酸的表位可能需要更多氨基酸,例如至少15、25或50个氨 基酸。术语“本发明的抗体”包括,例如多克隆抗体、单克隆抗体、抗体的Fab和单链Fv(scFv)片段、双特异性抗体、异源共轭物、人源抗体和人源化抗体。可以以多种方式制备这些抗体,包括杂交瘤培养物、细菌或哺乳动物细胞培养物中的重组表达和转基因动物中的重组表达。也可以通过从展示***中表达的序列的文库中选择序列来制备抗体,所述展示***例如丝状噬菌体、细菌、酵母或核蛋白体。对于选择特定的制备方法,文献中有很多指导,例如,Chadd and Chamow,Curr.Opin.Biotechnol.,12:188-194(2001)。制备方法的选择取决于几个因素,包括所需的抗体结构、抗体上碳水化合物部分的重要性、培养和纯化的方便性、和费用。使用标准表达技术可以产生很多不同抗体结构,包括全长抗体、诸如Fab和Fv片段的抗体片段、以及包含来自不同物种的组分的嵌合抗体。可以在细菌表达***中产生诸如Fab和Fv片段的、没有效应功能和具有有限的药代动力学活性的小型抗体片段。单链Fv片段表现出低免疫原性并且从血液中被快速清除。
本发明的抗体可以是多克隆抗体。例如,在免疫剂并优选伴有佐剂的一次或多次注射后可以在哺乳动物、例如非人哺乳动物中制备这种多克隆抗体。通常,通过一系列皮下或腹膜内注射将免疫剂和/或佐剂注射入哺乳动物中。所述免疫剂可以包括胆碱激酶或酸性神经酰胺酶、或它们的片段或融合蛋白、或表达胆碱激酶或酸性神经酰胺酶的细胞。在合适佐剂的存在下将这些蛋白、片段或制剂引入非人哺乳动物中。给予免疫原的其它形式是作为细胞表面的跨膜蛋白(例如Spiller et al.J.Immunol.Methods,224:51-60(1999)中所述的方法)。这些细胞可以是天然表达所述抗原的细胞,或在用DNA构建体转染细胞后可以获得所述抗原表达,所述DNA构建体含有编码所述抗原的DNA序列、所述抗原在细胞中充分表达所必需的DNA序列以及其它DNA序列。该方法不仅在细胞膜是抗原表达的天然位点时是可能的,而且抗原一旦在细胞中合成就被添加在抗原编码序列的信号肽引导至这些位置。如果血清含有对于不希望的表位的多克隆抗体,则可以通过免疫亲和色谱纯化该多克隆抗体。
可选地,所述抗体可以是单克隆抗体。可以利用杂交瘤制备单克隆 抗体,其中用免疫剂对小鼠、仓鼠或其它合适宿主动物进行免疫以激发产生或能够产生特异性地与所述免疫剂结合的抗体的淋巴细胞,例如Kohler and Milstein,Nature 256:495(1975)。所述免疫剂通常包括胆碱激酶、酸性神经酰胺酶、或它们的受体或片段或融合蛋白以及任选地包括载体或富集了胆碱激酶或酸性神经酰胺酶的粗蛋白制剂、或表达任意所述蛋白的细胞。在合适的佐剂的存在下将这些蛋白、片段或制剂引入非人哺乳动物中。给予免疫原的其它形式是作为细胞表面的跨膜蛋白(例如Spiller et al.J.Immunol.Methods,224:51-60(1999)中所述的方法)。这些细胞可以是在其细胞膜天然表达所述抗原的每个细胞,或在用DNA构建体转染细胞后可以获得所述抗原表达,所述DNA构建体含有编码所述抗原的DNA序列、所述抗原在细胞中充分表达所必需的DNA序列以及其它DNA序列。该方法不仅在细胞膜是抗原表达的天然位点时是可能的,而且抗原一旦在细胞中合成就被添加在抗原编码序列的信号肽引导至这些位置。可选地,可以体外免疫淋巴细胞。通常,如果需要非人哺乳动物来源,则使用脾细胞或***细胞,或如果需要人源细胞,则使用外周血淋巴细胞(“PBL”)。使用诸如聚乙二醇的合适的融合剂将淋巴细胞与永生化细胞系融合,从而制备杂交瘤细胞。通常,永生化细胞系是大鼠、小鼠、牛或人来源的骨髓瘤细胞。在合适的培养基中培养杂交瘤细胞,所述培养基优选地含有一种或多种抑制未融合的永生化细胞的生长或存活的物质。使用有限稀释法分离克隆,并且可以通过常规技术检测培养杂交瘤细胞的培养基(上清)中针对ChoK的单克隆抗体的存在,例如通过流式细胞仪或免疫沉淀或诸如RIA或ELISA的其它体外结合测定。还可以以动物内的腹水肿瘤在体内培养克隆。
优选地,通过免疫沉淀或诸如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)的体外结合测定或诸如荧光显微镜或流式细胞仪的免疫荧光技术来测定由杂交瘤细胞的克隆所产生的单克隆抗体的结合特异性。通过常规免疫球蛋白纯化步骤从培养基、腹水液或血清中适当地分离由亚克隆分泌的单克隆抗体,例如,蛋白A-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳,透析或亲和色谱。
还可以通过重组DNA方法制备单克隆抗体,例如US 4,816,567中 所述的方法。可以从胆碱激酶或酸性神经酰胺酶受体特异性杂交瘤细胞中分离编码本发明的单克隆抗体的DNA,并通过使用常规步骤进行测序,例如通过使用能够与编码鼠源抗体的重链和轻链的基因特异性地结合的寡核苷酸探针。杂交瘤细胞作为该DNA的优选来源。一旦被分离,可以将所述DNA***表达载体,然后将所述表达载体转染入宿主细胞,从而实现重组宿主细胞中单克隆抗体的合成,所述宿主细胞例如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不会以其他方式产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞。还可以修饰所述DNA,例如,通过使鼠源重链和轻链恒定结构域的编码序列被取代为同源人源序列,或通过使非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或一部分共价连接至免疫球蛋白编码序列。所述非免疫球蛋白多肽可以被取代为本发明的抗体的恒定结构域,或可以被取代为本发明抗体的一个抗原结合位点的可变结构域,从而产生嵌合二价抗体。
产生对于靶分子具有反应性的特异性抗体或抗体片段的另一方法是筛选细菌、酵母、丝状噬菌体、核糖体或核糖体亚基和其它展示***中表达的编码免疫球蛋白基因或其部分的表达文库。这些方法通常使用来自不同来源的抗体序列或抗体片段序列的大型文库,所述来源例如健康供体或患者或健康或非健康的动物。将这些序列克隆并表达在合适的***中,并且通过其对于抗原的结合亲和力进行选择。已有选择具有诸如中和、激动剂等所需性质的抗体或片段的不同方法的描述,(Fernández,Curr.Op.Biotech.,15:364-373(2004);Schmidt,Eur.J.Biochem.,268:1730-1738(2001))。在一个实施方案中,还可以利用重组手段、通过提取信使RNA、构建cDNA文库和选择编码抗体分子节段的克隆来制备具有本发明杂交瘤的特征的抗体和抗体片段。
还可以对抗体进行基因工程以改变其临床用途。很多方法利用分子生物学和遗传技术,例如利用对遗传学和免疫球蛋白结构的深入了解来构建免疫球蛋白分子的不同修饰,目的在于改进其用于临床用途或其他用途的性质。某些方法倾向于降低所述分子在其被使用的物种中的免疫原性,并且所得分子具有与该物种同源性更高的序列。各种方法已被用于获得人源mAb,这避免了健康人中伦理学不允许的行为。在其他方法 中,减小了分子量和分子大小,例如为了改善所述分子在实体瘤中的分布。其他可能性是在分子中共轭对于多于一个靶分子的结合结构域(双特异性抗体或三特异性抗体等)或将抗体或片段与具有所需功能的另一分子共轭,所述另一分子例如毒性剂、激素、生长因子、免疫调节剂(免疫抑制剂或免疫刺激剂)、细胞生长抑制剂等。一般而言,所有得到的分子几乎保留抗体的一个可变结构域,所述可变结构域给予具有抗原-抗体结合特征的高特异性和亲和力。这些构建中的一些实例为:
-嵌合抗体:
嵌合抗体是指用来自某些物种(通常为产生mAb的哺乳动物)的抗体的可变区和其它物种(所述嵌合抗体将被使用的物种)的恒定区所构建的抗体。此类构建的目的在于获得这样的抗体:具有最初的mAb、但具有较小的免疫原性并且被待治疗的个体更好地耐受、具有改善的血清半衰期并且可以被效应免疫学机制识别,即补体、细胞毒性细胞的Fc受体或其它表现出物种特异性的免疫球蛋白特异性受体。
-人源化抗体:
“人源化抗体”表示这样的抗体:其来源于非人源抗体,通常为鼠源抗体,并保留母体抗体的抗原结合性质,但是在人中免疫原性较低。可以通过各种方法实现这点,包括(a)将完整非人源可变结构域嫁接到人源恒定区上以产生嵌合抗体;(b)仅将非人源互补决定区(CDR)嫁接到人框架区和恒定区上,保留或不保留关键框架残基;和(c)移植完整非人源可变结构域,但是通过替换表面残基用人源样节段“遮掩”它们。将非人源抗体人源化的方法在本领域中已有描述。优选地,人源化抗体具有引入其中的一个或多个非人源氨基酸残基。这些非人源氨基酸残基通常被称为“输入”残基,其通常取自“输入”可变结构域。可以本质上遵照Winter及其同事的方法(Jones et al.,Nature,321:522-525(1986);Reichmann et al.,Nature,332:323-327(1988);Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988))进行人源化,通过将高变区序列取代为人源抗体的对应序列。在实践中,人源化抗体通常是人源抗体,其中某些高变区残基以及可能有某些框架区(FR)残基被来自啮齿动物抗体中相似位点的残基所取代。对于制备人源化抗体中使用的人源可变结构域的选择,包括 重链和轻链,非常重要的是降低免疫原性,而保留对于抗原的特异性和亲和力。根据所谓的“最佳配合”法,将啮齿动物抗体的可变结构域的序列针对已知人源可变结构域序列的完整文库进行筛选。然后,最接近啮齿动物序列的人源序列被接受为所述人源化抗体的人源框架区(FR)(Suns et al.,J.Immunol.,151:2296(1993);Chothia et al.,J.Mol.Biol,196:901(1987))。另一方法使用来源于特定亚群轻链或重链的全部人源抗体的一致序列的特定框架区。同一框架可以用于数种不同人源化抗体(Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992);Presta et al.,J.Immunol.,151:2623(1993))。
更重要的是,人源化的抗体保留对于抗原的高亲和力和其他所需生物学性质。为实现该目标,根据优选方法,使用母体和人源化序列的三维模型,通过母体序列和各种理论上的人源化产物的分析过程来制备人源化抗体。
-灵长动物源化抗体:
制备与人源抗体的更相似的抗体的过程中的下一步是所谓的灵长动物源化抗体,即被进行基因工程从而含有猴类(或其它灵长类)抗体、特别是食蟹猴(cynomolgus monkey)抗体的可变重链和轻链结构域,并且含有人源恒定结构域序列、优选为人源免疫球蛋白γ1或γ4恒定结构域(或PE变体)的重组抗体。此类抗体的制备描述于Newman et al.,Biotechnology,10:1455-1460(1992)、US 5658570和US 6113898中。据报道,这些抗体表现出与人源抗体的高度同源性、即85-98%的同源性,展现人源效应功能,具有降低的免疫原性,并且可以表现出对于人抗原的高亲和力。Newman,Biotechnology,10:1455-1460(1992)公开了产生重组抗体的另一高效方法。
-人源抗体:
“人源抗体”表示通过任何已知标准方法制备的、完整含有人源轻链和重链以及恒定区的抗体。
作为人源化的备选方案,可以产生人源抗体。例如,现已可以获得在没有内源性免疫球蛋白产生的情况下通过免疫能够产生人源抗体的完整组分的转基因动物(例如,小鼠)。例如,已有报道,嵌合和种系突变 小鼠中抗体重链连接区PH)基因的纯合缺失导致了内源性抗体产生的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到这种种系突变小鼠中会导致免疫后人源抗体的产生。参见,例如,Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993);Jakobovits et al.,Nature,362:255-258(1993)。
可选地,噬菌体展示技术(McCafferty et al.,Nature 348:552-553(1990))可以用于从来自供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因全部组分体外产生人源抗体和抗体片段。根据该技术,将抗体V结构域基因框内克隆至诸如M13或fd的丝状噬菌体的主要或次要包被蛋白基因,并展示为噬菌体颗粒表面上的功能抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝,基于抗体的功能性质的选择还导致编码表现那些性质的抗体的基因的选择。因此,噬菌体模拟B细胞的某些性质。可以以各种形式进行噬菌体展示;关于它们的综述,可参见,例如,Johnson,Kevin S.和Chiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology 3:564-571(1993)。
还可以通过体外活化的B细胞或SCID小鼠产生人源抗体,所述SCID小鼠的免疫***用人源细胞进行了重建。
一旦获得人源抗体,可以分离它的编码DNA序列,将其克隆并引入合适的表达***,即优选地来自哺乳动物的细胞系,所述细胞系随后表达并释放至可以从中分离抗体的培养基中。
-抗体片段:
抗体片段是抗体的片段,例如,Fab、F(ab’)2、Fab’和scFv。已经开发了各种产生抗体片段的技术。通常,通过完整抗体的蛋白水解消化获得这些片段,但是最近可以通过重组宿主细胞直接产生这些片段。在其它实施方案中,所选的抗体是单链Fv(scFv)片段,另外,所述单链Fv(scFv)片段可以是单特异性的或双特异性的。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生2个相同的称为“Fab”片段的抗原结合片段和一个残余“Fc”片段,每个“Fab”片段具有单一抗原结合位点,从所述“Fc”片段的名称可容易地知道其具有成结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有2个抗原结合位点的F(ab’)2片段并仍能够交联抗原。
“Fv”是最小抗体片段,其含有完整抗原识别和抗原结合位点。该区 由一条重链和一条轻链可变结构域紧密非共价相联的二聚体组成。这样的构型使得每个可变结构域的3个高变区相互作用,从而形成二聚体表面上的抗原结合位点。6个高变区共同地赋予抗体抗原结合特异性。然而,即使单一可变结构域(或仅包含3个抗原特异性高变区的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力,但是亲和力要低于完整结合位点。
Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的不同在于在重链CH1结构域的羧基末端增加了数个残基,所述残基包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。在本文中,恒定结构域的半胱氨酸残基携带至少一个自由巯基的Fab’被指定为Fab’-SH。F(ab’)2抗体片段在最初产生时为Fab’片段对,所述Fab’片段在它们间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域,其中这些结构域存在于单一多肽链中。优选地,Fv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽连接物,所述多肽连接物使scFv能形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述,参见在单克隆抗体药理学中的Pluckthun(Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies),vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,N.Y.,pp.269-315(1994)。
术语“双链抗体”是指具有2个抗原结合位点的小的抗体片段,该片段包含在同一多肽链(VH-VL)中相连接的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。通过使用过短而不允许同一链上的2个结构域进行配对的连接物,迫使所述结构域与另一链的互补结构域进行配对,并产生2个抗原结合位点。双链抗体详细描述于例如EP 404,097;WO 93/11161;和Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中。
本发明中所包括的结合ChoK的抗体功能性片段保留至少一种该片段所来自的全长抗体的结合功能和/或调节功能。优选的功能性片段保留对应全长抗体的抗原结合功能(例如,结合哺乳动物ChoK的能力)。特别优选的功能性片段保留抑制一种或多种哺乳动物ChoK的特征性功能的能力,例如结合活性、信号传导活性和/或细胞应答的刺激。例如,在一个实施方案中,功能性片段能抑制ChoK与一种或多种ChoK的配体的相互作用和/或能抑制一种或多种受体介导的功能。
-双特异性抗体:
双特异性抗体是具有对于至少2种不同表位的结合特异性的抗体。示例性的双特异性抗体可以与2种不同的B细胞表面标志物表位结合。其它此类抗体可以结合第一B细胞标志物并且还可以结合第二B细胞表面标志物。可选地,抗B细胞标志物结合臂可以与结合白细胞上触发分子的臂结合,所述触发分子例如T细胞受体分子(例如CD2或CD3),或者抗B细胞标志物结合臂可以与IgG的Fc受体(FcyR)结合,所述IgG的Fc受体例如FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyRIII(CD 16),这样可以将细胞防御机制集中到B细胞。双特异性抗体还可以用于将细胞毒性剂定位到B细胞。这些抗体具有B细胞标志物结合臂和结合细胞毒性剂(例如皂草素、抗干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒素A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。双特异性抗体可以被制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab)2双特异性抗体)。
制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的常规制备是基于2个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达,其中所述2个链具有不同的特异性(Millstein et al.,Nature,305:537-539(1983))。因为免疫球蛋白重和轻链发生随机配合,所以这些杂交瘤(细胞杂交瘤)产生10种不同抗体分子的可能的混合物,其中仅有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和色谱步骤完成的正确分子的纯化十分繁琐,并且收率低。相似的方法公开于WO 93/08829和Traunecker et al.,EMBO J,10:3655-3659(1991)中。
根据不同的方法,将具有所需结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。所述融合优选是与包含至少部分的铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定结构域。优选地,使含有轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CHI)存在于至少一个融合中。将编码免疫球蛋白重链融合的DNA并且如果需要的话将编码免疫球蛋白轻链的DNA***分别的表达载体,并共转染入合适的宿主生物体。当构建中使用的3个多肽链的不同比例能提供最佳收率时,这为调整实施方案中3个多肽片段的共同比例提供了很好的灵活性。然而,当至少2个多肽链相同比例的表达能得到高收率时或当比例不是特 别重要时,也可以将2个或所有3个多肽链的编码序列***一个表达载体中。
双特异性抗体包括交联抗体或“异源共轭物”抗体。例如,所述异源共轭物中的一个抗体可以与抗生物素蛋白偶联,另一个抗体可以与生物素偶联。例如,此类抗体已被计划用于使免疫***细胞靶向于不想要的细胞。可以使用任何方便的交联方法制备异源共轭物抗体。合适的交联剂是本领域公知的,并且公开于US 4,676,980,其中还公开了很多交联技术。
从抗体片段产生双特异性抗体的技术在文献中也已有描述。例如,可以使用化学连接制备双特异性抗体。
酸性神经酰胺酶或胆碱激酶特异性RNA干扰(RNAi)
在另一实施方案中,构成本发明组合物一部分的酸性神经酰胺酶或胆碱激酶抑制剂是RNAi,RNAi能够阻止酸性神经酰胺酶和/或胆碱激酶或酸性神经酰胺酶和/或胆碱激酶功能所必需的任何组分基因的表达。RNAi是序列特异性转录后基因抑制的过程,其可以发生在真核细胞中。通常,该过程涉及双链RNA(dsRNA)诱导的特定序列mRNA的降解,所述双链RNA与所述特定序列是同源的。例如,对应于特定单链mRNA(ss mRNA)序列的长dsRNA的表达会使该信息不稳定,从而“干扰”相应基因的表达。因此,任何选定的基因可以通过引入对应于该基因mRNA的全部或重要部分的dsRNA而被抑制。发现当长dsRNA表达时,其首先被核糖核酸酶III加工为长度为21-22个碱基对的较短dsRNA寡核苷酸。因此,可以通过引入或表达相对较短的同源dsRNA来实现RNAi。实际上,如下文所述,使用相对较短的同源dsRNA可以具有一定优势。
用于实现RNAi的双链寡核苷酸的长度优选少于30个碱基对,并且更优选地,包含约25、24、23、22、21、20、19、18或17个核糖核酸碱基对。任选地,本发明的dsRNA寡核苷酸可以包括3’悬突末端。示例性的2个核苷酸的3’悬突可以由任意类型的核糖核苷酸残基组成,并且甚至可以由2’-脱氧胸苷残基组成,这降低了RNA合成的成本并且可以增强siRNA在细胞培养基和所转染的细胞中的核酸酶抗性(参见 Elbashir et al.,Nature 411:494-8,2001)。在本发明的某些实施方案中也可以使用具有50、75、100或甚至500个碱基对或更多碱基对的较长的dsRNA。示例性的用于实现RNAi的dsRNA浓度为约0.05nM、0.1nM、0.5nM、1.0nM、1.5nM、25nM或100nM,但是根据所处理的细胞的性质、基因靶标和本领域技术人员容易理解的其它因素,也可以使用其它浓度。示例性的dsRNA可以是化学合成的或使用合适的表达载体在体外或体内产生的。示例性的合成RNA包括使用本领域已知的方法化学合成的21个核苷酸的RNA(例如,Expedite RNA亚磷酰胺和胸苷亚磷酰胺(Proligo,Germany)。合成寡核苷酸优选地使用本领域已知的方法进行脱保护和凝胶纯化(参见,例如,Elbashir et al.,Genes Dev.15:188-200,2001)。较长的RNA可以转录自本领域已知的启动子,例如T7RNA聚合酶启动子。置于体外启动子下游的两个可能方向的单一RNA靶标能转录所述靶标的两条链,从而产生所需靶序列的dsRNA寡核苷酸。任何上述RNA种类应被设计为包括靶核酸中表示的核酸序列的一部分,例如,在严格条件和/或生理条件下与编码人源酸性神经酰胺酶或人源ChoK的多核苷酸杂交的核酸。
在设计寡核苷酸中所使用的特异性序列可以是包含在靶标所表达的基因信息中的核苷酸的任何连续序列。本领域已知的程序和算法可以用于选择合适的靶序列。此外,可以如下选择最佳序列:使用设计用于预测具体单链核酸序列的二级结构的程序,并允许选择那些可能出现于折叠的mRNA的暴露的单链区的序列。用于设计合适的寡核苷酸的方法和组合物可见于,例如,美国专利第6,251,588号,通过引用将其并入本文。信使RNA(mRNA)通常被认为是直链分子,其在核糖核苷酸序列中含有指导蛋白合成的信息,然而研究发现存在与大部分mRNA中的多种二级和三级结构。RNA中的二级结构单元通常由同一RNA分子的不同区之间的Watson-Crick型相互作用形成。重要的二级结构单元包括分子内双链区、发夹环、双链体RNA中的膨出和内部环。当二级结构单元彼此接触或与单链区接触时形成三级结构单元,从而产生更复杂的三维结构。很多研究人员测定了大量RNA双链体结构的结合能并且推导出一套可用于预测RNA的二级结构的法则(参见,例如,Jaeger et al.,Proc.Natl. Acad.Sci.USA 86:7706,1989;和Turner et al.,Annu.Rev.Biophys.Biophys.Chem.17:167,1988)。所述法则可用于鉴定RNA结构单元,并且特别是用于鉴定可以代表能够被沉默RNAi、核酶或反义技术靶向于的mRNA的优选节段的单链RNA区。因此,可以鉴定mRNA靶标的优选节段,用于设计诱导RNAi的dsRNA寡核苷酸以及设计本发明的合适的核酶和锤头状核酶组合物。
数种不同类型的分子已有效用于RNAi技术。小干扰RNA(siRNA)有时被称为短干扰RNA或短沉默RNA,它是一类长度为20-25个核苷酸的双链RNA分子,其在生物学中发挥多种作用。最值得注意的是,siRNA参与RNA干扰(RNAi)途径,其中siRNA干扰特定基因的表达。siRNA除了在RNAi途径中发挥功能之外,还作用于RNAi相关途径,例如,作为抗病毒机制或基因组染色体结构的成形。合成的siRNA已证实能够诱导哺乳动物细胞中的RNAi。该发现引起将siRNA/RNAi用于生物医药研究和药物开发的热潮。
微小RNA(miRNA)是相关类别的基因调节小RNA,长度通常为21-23nt。其通常不同于siRNA,原因在于微小RNA是从单链RNA前体加工而来,并且与mRNA靶标仅表现出部分互补。最初的研究表明,miRNA对基因表达的调节是转录后在细胞质中的处理小体(P-Bodies)在翻译抑制水平上的调节。然而,miRNA也可以与siRNA相似地引导mRNA切割。这通常是对植物而言,在植物靶位点通常与miRNA高度互补。植物mRNA中的靶位点可见于5’UTR、开放读码框和3’UTR,而在动物中,主要靶标是3’UTR。miRNA首先转录为初级microRNA(pri-miRNA)的一部分。然后,由Drosha在Pasha/DGCR8(=微加工体复合物)的辅助下将pri-miRNA加工为前miRNA(pre-miRNA)。然后,由输出蛋白-5(exportin-5)将ca.75nt前miRNA输出到胞浆,在胞浆中再被Dicer切为21-23nt siRNA样分子。某些情况下,在pri-miRNA上可以发现多个miRNA。
短发夹RNA(shRNA)是另一种可用于实现RNAi的RNA。短发夹RNA是形成可用于沉默基因表达的紧密发夹形转弯的RNA序列。shRNA由RNA聚合酶III转录。
目前,短干扰RNA(siRNA)和短发夹RNA(shRNA)被广泛用于沉默各种基因,从而沉默所述基因所发挥的功能。由于通过使用多种资源得到的已有的shRNA和siRNA基因沉默构建体文库的发展,现已能更容易地利用RNAi沉默具体基因。例如,由shRNA相关信息的数据库和相关网站构成的RNAi Codex已被发展为公众获取shRNA资源的门户并且可访问http://codex.cshl.org。RNAi Codex目前提供来自Hannon-Elledge shRNA文库的数据并允许使用生物学研究人员熟悉的基因名称来获取能沉默感兴趣的基因的shRNA构建体的信息。其被设计为提供使用者贡献的对于每个构建体的评注和出版物,但是必须是这些数据已经公开的情况下。Olson et al.(Nucleic Acids Res.34(数据库期号):D153-D157,2006,通过引用并入本文)提供了关于RNAi Codex的特征的详细描述并解释了该工具的使用。所有这些信息可用于帮助设计靶向于酸性神经酰胺酶、胆碱激酶或其他目的蛋白的不同的siRNA或shRNA。
酸性神经酰胺酶或胆碱激酶特异性核酶
设计用于催化切割靶mRNA转录物的核酶分子也可用于阻止酸性神经酰胺酶和/或胆碱激酶mRNA的翻译。因此,在另一实施方案中,本发明组合物包含特异性地定向于酸性神经酰胺酶和/或胆碱激酶mRNA的核酶。核酶是能够催化RNA的特异性切割的酶RNA分子。(关于综述,参见Current Biology 4:469-471,1994)。核酶作用的机制涉及核酶分子与互补靶RNA的序列特异性杂交,然后发生核苷酸内切割。核酶分子的组合物优选包括与靶mRNA互补的一个或多个序列和负责mRNA切割的公知催化序列或功能等同序列(参见,例如,美国专利第5,093,246号,通过引用将其整体并入本文)。
虽然在位点特异性识别序列切割mRNA的核酶可以用于破坏靶mRNA,但是优选使用锤头状核酶。锤头状核酶在与靶mRNA形成互补碱基对的侧翼区所指示的位置切割mRNA。优选地,靶mRNA具有以下两个碱基的序列:5’-UG-3’。锤头状核酶的构建和制备是本领域公知的并且更全面地描述于Haseloff and Gerlach,Nature 334:585-591,1988;并且可参见PCT专利申请第WO89/05852号,通过引用将以上文献的内容 并入本文。锤头状核酶序列可以嵌入诸如转移RNA(tRNA)的稳定RNA以增加体内切割效率(Perriman et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:6175-79,1995;de Feyter,and Gaudron,Methods in Molecular Biology(分子生物学方法),Vol.74,Chapter 43,“Expressing Ribozymes in Plants(植物中核酶表达),”Edited by Turner,P.C,Humana Press Inc.,Totowa,N.J.)。具体而言,RNA聚合酶III介导的tRNA融合核酶的表达是本领域公知的(参见,Kawasaki et al.,Nature 393:284-9,1998;Kuwabara et al.,Nature Biotechnol.16:961-5,1998;和Kuwabara et al.,Mol.Cell.2:617-27,1998;Koseki et al.,J Virol 73:1868-77,1999;Kuwabara et al.,Proc Natl Acad Sci USA 96:1886-91,1999;Tanabe et al.,Nature 406:473-4,2000)。通常,给定靶CDNA序列中存在多个潜在锤头状核酶切割位点。优选地,对核酶进行基因工程,使得切割识别位点的位置在靶mRNA的5’末端附近,从而增加效率并且最小化非功能性mRNA转录物的细胞内积累。此外,使用位于编码诸如靶标的长和短的形式的靶标的C末端氨基酸结构域不同部分的靶序列中的任何切割识别位点可允许所述靶标的一种或另一种形式的选择性靶定,并且因此具有对于靶基因产物的一种形式的选择性作用。
基因靶向核酶必须含有与两个区互补的杂交区,所述两个区中的每一个的长度为靶mRNA的至少5个和优选地具有6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸,所述靶mRNA例如酸性神经酰胺酶或胆碱激酶基因中所表示的序列的mRNA。此外,核酶具有高度特异性核糖核酸内切酶活性,其自动催化地切割靶有义mRNA。本发明涉及与编码诸如治疗药物靶候选基因的靶基因的有义mRNA杂交的核酶,从而与所述有义mRNA杂交并将其切割,使得所述有义mRNA不再能被翻译而合成功能性多肽产物。
本发明组合物中使用的核酶还包括RNA核糖核酸内切酶(下文中为“Cech型核酶”),例如天然存在于嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)中的一种RNA核糖核酸内切酶(称为IVS或L-19 IVS RNA)并且其已被Thomas Cech及合作者详细描述(Zaug et al.,Science 224:574-578,1984;Zaug et al.,Science 231:470-475,1986;Zaug et al.,Nature 324:429-433, 1986;University Patents Inc.的公布的第WO88/04300号国际专利申请;Been,et al.,Cell 47:207-216,1986)。Cech型核酶具有8个碱基对的活性位点,其与靶RNA序列杂交,然后发生靶RNA的切割。本发明包括靶向于存在于靶基因或核酸序列中的8个碱基对的活性位点序列的那些Cech型核酶。
核酶可以由修饰的寡核苷酸构成(例如,为了改进的稳定性、靶向性等)并且应当被体内递送到表达靶基因的细胞。递送的优选方法涉及使用在强组成型pol III或pol II启动子的控制下“编码”所述核酶的DNA构建体,使得转染的细胞可产生足够量的核酶,从而破坏内源靶信息并抑制翻译。因为与反义分子不同,核酶是催化性的,所以需要较低的细胞内浓度就可发挥功效。
在某些实施方案中,可以通过首先鉴定足以引起有效RNAi抑制的序列部分来设计核酶。然后,可以将相同序列部分合并入核酶。在本发明的该方面,核酶或RNAi的基因靶向部分为基本相同的序列,所述序列为靶核酸的至少5个和优选地6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多连续核苷酸,所述靶核酸例如人源酸性神经酰胺酶或胆碱激酶序列中任何一个的核酸。在长的靶RNA链中,很多靶位点不能被核酶接近,这是因为它们隐藏在二级或三级结构中(Birikh et al.,Eur J Biochem 245:1-16,1997)。为了克服靶RNA可及性的问题,计算机生成的对于二级结构的预测被通常用于鉴定最可能是单链的或具有“开放”构型的靶标(参见Jaeger et al.,Methods Enzymol 183:281-306,1989)。其它方法利用***性方法来预测包含接近大量候选杂交寡核苷酸分子的二级结构(参见Milner et al.,Nat Biotechnol 15:537-41,1997;和Patzel and Sczakiel,Nat Biotechnol 16:64-8,1998)。此外,美国专利第6,251,588号描述了评价寡核苷酸探针序列从而预测与靶核酸序列杂交的可能性的方法,将该专利的内容并入本文。本发明的方法提供在设计本发明的RNAi寡核苷酸和核酶中使用该方法来选择靶mRNA序列的被预测为单链的优选节段并进一步用于相同或基本同一的靶mRNA序列的条件性应用,所述优选节段优选地包含靶mRNA的约10-20个连续核苷酸。
酸性神经酰胺酶或胆碱激酶特异性反义核酸
本发明的另一方面涉及使用分离的“反义”核酸来抑制表达,例如通过抑制酸性神经酰胺酶和/或胆碱激酶核酸的转录和/或翻译来抑制表达。反义核酸可以通过常规碱基对互补性与潜在药物靶标结合,或者例如在与DNA双链体结合的情况下,反义核酸可以通过双螺旋的大沟中的特异性相互作用与潜在药物靶标结合。通常,这些方法是指本领域中通常使用的技术范围,并且包括依赖于与寡核苷酸序列的特异性结合的任何方法。
例如,本发明的反义构建体可以作为表达质粒进行递送,所述表达质粒当在细胞中转录时,产生与编码ChoK多肽或酸性神经酰胺酶多肽的细胞mRNA的至少特有部分互补的RNA。可选地,反义构建体是寡核苷酸探针,所述探针是离体制备的,并且当被引入细胞时能通过与靶核酸的mRNA和/或基因组序列杂交来引起表达抑制。该寡核苷酸探针优选为能抵抗诸如核酸外切酶和/或核酸内切酶的内源核酸酶的修饰的寡核苷酸,并因此在体内是稳定的。用作反义寡核苷酸的示例性的核酸分子是DNA的氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和甲基磷酸酯类似物(也可参见美国专利第5,176,996号、第5,264,564号和第5,256,775号)。此外,构建在反义治疗中有用的寡聚物的一般方法可参见综述,例如,Van der Krol et al.,BioTechniques 6:958-976,1988;和Stein et al.,Cancer Res 48:2659-2668,1988。
关于反义DNA,优选来源于翻译起始位点的寡脱氧核糖核苷酸,所述翻译起始位点例如在靶基因的-10和+10区之间。反义方法包括设计与编码靶多肽的mRNA互补的寡核苷酸(DNA或RNA)。反义寡核苷酸会与mRNA转录物结合并阻止翻译。尽管优选绝对互补,但这并不是必需的。对于双链反义核酸而言,可以测试双链体DNA的单链或可以分析三链体形成。杂交的能力取决于互补程度和反义核酸长度二者。通常,杂交核酸越长,其可能含有更多的与RNA的碱基错配并仍能形成稳定的双链体(或三链体,视情况而定)。本领域技术人员通过使用标准步骤来确定杂交复合物的熔点能够确保可接受的错配程度。
与mRNA的5’末端互补的寡核苷酸应当最有效地发挥抑制翻译的作用,所述5’末端例如直至并包括AUG起始密码子的5’非翻译序列。然而,与mRNA的3’非翻译序列互补的序列最近被证实也能有效抑制mRNA的翻译(Wagner,Nature 372:333,1994)。因此,与基因的5’或3’非翻译、非编码区互补的寡核苷酸可用于反义方法来抑制该mRNA的翻译。与mRNA的5’非翻译区互补的寡核苷酸应当包括AUG起始密码子的互补物。与mRNA编码区互补的反义寡核苷酸是效率较低的翻译抑制剂,但是也可以用于本发明。无论反义核酸被设计为与mRNA的5’、3’或编码区杂交,反义核酸的长度都应为至少6个核苷酸,优选长度少于约100个核苷酸,并且更优选少于于50、25、17或10个核苷酸。
优选地,首先进行体外研究来量化反义寡核苷酸抑制基因表达的能力。优选地,这些研究利用能在寡核苷酸的反义基因抑制和非特异性生物效应之间区分的对照。还优选地,这些研究将靶RNA或蛋白的水平与内部对照RNA或蛋白的水平进行比较。可以将使用反义寡核苷酸获得的结果与使用对照寡核苷酸获得的结果进行比较。优选地,对照寡核苷酸与测试寡核苷酸具有大致相同的长度,并且寡核苷酸的核苷酸序列与反义序列的差别不多于阻止与靶序列特异性杂交所必需的差别。
反义寡核苷酸可以是DNA或RNA或其嵌合混合物或衍生物或修饰的形式,可以是单链的或双链的。可以在碱基部分、糖部分或磷酸主链修饰寡核苷酸,例如,为了改进分子的稳定性、杂交等。寡核苷酸可以包括其它附加基团,例如肽(例如,为了靶向于宿主细胞受体)或便于转运跨过细胞膜(参见,例如,Letsinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:6553-6556,1989;Lemaitre et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.84:648-652,1987;PCT公开第WO88/09810号)或血脑屏障(参见,例如,PCT公开第WO89/10134号)的试剂,杂交触发的切割剂(参见,例如,Krol et al.,BioTechniques 6:958-976,1988)或***剂(参见,例如,Zon,Pharm.Res.5:539-549,1988)。为了这个目的,寡核苷酸可以与另一分子共轭,所述另一份子例如肽、杂交触发交联剂、转运剂、杂交触发切割剂等。
反义寡核苷酸可以包含至少一个修饰的碱基部分,所述修饰的碱基部分选自,但不限于,5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧 啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基三乙基(carboxyhydroxytiethyl))尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q苷、肌苷、N6-异戊稀腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q苷、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫-N6-异戊稀腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q苷、2-巯基胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2,6-二氨基嘌呤。
反义寡核苷酸还可以包含至少一个修饰的糖部分,所述修饰的糖部分选自,但不限于,***糖、2-氟***糖、木酮糖和己糖。反义寡核苷酸还可以含有中性肽样主链。此类分子被称为肽核酸(PNA)-寡聚物并描述于,例如Perry-O’Keefe et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:14670,1996和Eglom et al.,Nature 365:566,1993。PNA寡聚物的一个优势在于:由于DNA的中性主链,PNA寡聚物具有基本不依赖于介质的离子强度而与互补DNA结合的能力。在另一实施方案中,反义寡核苷酸包含至少一个修饰的磷酸酯主链,所述磷酸主链选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代磷酰胺酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、烷基磷酸三酯和甲酰基(formacetal)、或以上的类似物。
在另一实施方案中,反义寡核苷酸是α-异头寡核苷酸。α-异头寡核苷酸与互补RNA形成特异性双链杂交体,其中与通常的反平行方向不同,链彼此平行(Gautier et al.,Nucl.Acids Res.15:6625-6641,1987)。寡核苷酸是2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue et al.,Nucl.Acids Res.15:6131-6148,1987)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue et al.,FEBS Lett.215:327-330,1987)。
虽然可以使用与靶mRNA序列编码区互补的反义核苷酸,但是也可以使用与转录的非翻译区互补的那些反义核苷酸。
在某些情况下,难以实现反义的细胞内浓度足以抑制内源mRNA的 翻译。因此优选的方法利用重组DNA构建体,其中反义寡核苷酸受强pol III或pol II启动子的控制。使用这样的构建体来转染靶细胞会实现足够量的单链RNA的转录,所述单链RNA会与内源潜在药物靶转录物形成互补碱基对,并从而阻止翻译。例如,可以引入载体,使得所述载体被细胞摄取并指导反义RNA的转录。这样的载体可以仍然是游离型的或变为染色体整合的,只要其可以被转录而产生所需的反义RNA。可以通过本领域标准的重组DNA技术方法构建此类载体。载体可以是用于在哺乳动物细胞中复制和表达的质粒、病毒或本领域已知的其他载体。编码反义RNA的序列的表达可以通过在哺乳动物中有效的、优选在人细胞中有效的本领域已知的任何启动子。这些启动子可以是诱导型的或组成型的。这些启动子包括但不限于:SV40早期启动子区(Bernoist and Chambon,Nature 290:304-310,1981)、劳斯肉瘤病毒的3’长末端重复中包含的启动子(Yamamoto et al.,Cell 22:787-797,1980)、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1441-1445,1981)、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster et al,Nature 296:39-42,1982)等。可以将任何类型的质粒、粘粒、YAC或病毒载体用于制备可以被直接引入组织部位的重组DNA构建体。
可选地,可以通过靶向于与基因的调节区(即启动子和/或增强子)互补的脱氧核糖核苷酸序列来形成三螺旋结构从而降低靶基因表达,所述三螺旋结构阻止体内靶细胞内基因的转录(通常参见,Helene,Anticancer Drug Des.6(6):569-84,1991;Helene et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,660:27-36,1992;和Maher,Bioassays 14(12):807-15,1992)。
在用于抑制转录的三螺旋形成中使用的核酸分子优选为单链的,并且由脱氧核糖核苷酸组成。这些寡核苷酸的碱基组成应当通过Hoogsteen碱基配对法则促进三螺旋形成,其通常需要相当大段的嘌呤或嘧啶存在于双链体的一条链上。核苷酸序列可以是基于嘧啶的,这会导致TAT和CGC三联体跨过得到的三螺旋的三条相关链。富含嘧啶的分子以与双链体单链平行的方向提供与该双链体单链富含嘌呤区的碱基互补性。此外,可以选择富含嘌呤的核酸分子,例如,含有一段G残基的核酸分子。这些分子会与富含GC对的DNA双链体形成三螺旋,其中大部分的嘌呤 残基位于所靶向的双链体的单链上,这导致CGC三联体跨过三链体中的三条链。
可选地,通过产生所谓的“Z字型(switchback)”核酸分子可以增加能成为三螺旋形成靶标的潜在的靶序列。Z字型分子是以变换5’-3’、3’-5’的方式合成,这使得它们首先与双链体的一条链碱基配对,然后与另一条链碱基配对,这使得不再必须有相当大段的嘌呤或嘧啶存在于双链体的一条链上。
在某些实施方案中,反义寡核苷酸吗啉代反义。吗啉代是合成的分子,它是重新设计天然核酸结构的产物。通常长度为25个碱基,它们通过标准核酸碱基配对与RNA互补序列结合。从结构上说,吗啉代和DNA的区别是:尽管吗啉代具有标准核酸碱基,那些碱基与吗啉环结合而不是与脱氧核糖环结合,并且那些碱基是通过磷二酰胺基连接而不是通过磷酸酯连接。用不带电的磷二酰胺基替代阴离子磷酸酯消除了通常生理pH范围内的离子化,所以生物体或细胞中的吗啉代是不带电的分子。吗啉代不是嵌合寡聚物;吗啉代的整个主链由这些修饰的亚基构成。吗啉代最常被用作单链寡聚物,但是吗啉代链和互补DNA链的异双链可以与阳离子细胞溶质递送试剂联合使用。
与很多反义结构种类(例如,硫代磷酸酯)不同,吗啉代不降解其靶RNA分子,而是通过“空间阻断”发挥作用,其与RNA中的靶序列结合并简单地干扰可能与该RNA相互作用的分子。吗啉代寡聚物通常被用于研究胚胎中特异mRNA转录物的作用,所述胚胎例如产生吗啉代突变体胚胎的斑马鱼、非洲爪蟾(African clawed frog)(非洲蟾蜍(Xenopus))、鸡和海胆的卵或胚胎。在伴随合适细胞溶质递送***的情况下,吗啉代在细胞培养物中是有效的。
通过与信使RNA(mRNA)的5’非翻译区结合,吗啉代可以干扰核糖体起始复合物从5’帽前进至起始密码子。这阻止了所靶向的转录物的编码区的翻译(被称为“抑制”基因表达)。吗啉代提供了便捷的手段来蛋白抑制表达和了解该抑制如何改变细胞或生物体。某些吗啉代能有效地抑制表达,使得在先前存在的蛋白被降解后,通过Western印迹无法检测到所靶向的蛋白。
吗啉代还可以干扰pre-mRNA加工步骤,通常是通过阻止指导剪接的snRNP复合物在pre-RNA的链上的内含子边界与其靶标结合。阻止U1(位于供***点)或U2/U5(位于多嘧啶部分和接受***点)的结合可以造成改动的剪接,这通常会导致外显子被排除在成熟mRNA之外。靶向于某些剪接靶标导致了包含内含子,而隐藏剪接位点的激活可以导致部分包含或排除。还可以阻断U11/U12 snRNP的靶标。通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)可以方便地检测剪接修饰,并且RT-PCR产物的凝胶电泳后可观察到条带迁移。
吗啉代还被用于阻断miRNA活性、核酶活性、内含子剪接沉默子和剪接增强子。吗啉代抑制U2和U12 snRNP的功能。靶向于蛋白编码区内的“光滑(slippery)”mRNA序列的吗啉代可以诱导翻译移码。吗啉代对于该类靶标的活性提示吗啉代可被用作阻断蛋白或核酸与mRNA相互作用的多用途工具。
酸性神经酰胺酶或胆碱激酶特异性DNA酶
本发明的另一方面涉及组合物,其中酸性神经酰胺酶抑制剂和/或胆碱激酶抑制剂是DNA酶。DNA酶合并了反义和核酶技术的部分机制特征。设计DNA酶,使得它们与反义寡核苷酸很相似地识别具体靶核酸序列,而与核酶很相似地催化性地和特异性地切割靶核酸。
目前有两种基本类型的DNA酶,并且这两种DNA酶都是由Santoro和Joyce鉴定的(参见,例如,美国专利第6,110,462号)。10-23 DNA酶包含连接两个臂的环状结构。所述两个臂通过识别具体靶核酸序列而提供特异性,而所述环状结构在生理条件下提供催化功能。
简言之,为了设计特异性地识别和切割靶核酸的理想的DNA酶,本领域技术人员必须首先鉴定特有的靶序列。使用与对于反义寡核苷酸所列出的相同的方法可以实现这点。优选地,所述特有的或基本上的序列是富含G/C的约18-22个核苷酸。高G/C含量有助于确保DNA酶和靶序列之间较强的相互作用。
当合成DNA酶时,将酶靶向于信使的特异性反义识别序列是分开的,使得其包含DNA酶的两条臂,并且DNA酶环位于两条特异性臂之 间。
制备和给予DNA酶的方法可见于,例如,美国专利第6,110,462号。相似地,如上文详述,体外或体内递送DNA核酶的方法包括递送RNA核酶的方法。此外,本领域技术人员应当意识到,与反义寡核苷酸相似,可以任选地修饰DNA酶以增进稳定性和对降解的抗性。
可以通过本领域已知的合成DNA和RNA分子的任何方法来制备本发明的反义RNA和DNA、核酶、RNAi和三螺旋分子。这些方法包括本领域公知的化学合成寡脱氧核糖核苷酸和寡核糖核苷酸的技术,例如,固相亚磷酰胺化学合成。可选地,可以通过编码反义RNA分子的DNA序列的体外和体内转录产生RNA分子。该DNA序列可以被合并入多种载体中,所述载体合并了合适的RNA聚合酶启动子,例如T7或SP6聚合酶启动子。可选地,可以将根据所使用的启动子以组成型或诱导型方式合成反义RNA的反义cDNA构建体稳定引入细胞系。此外,作为增加细胞内稳定性和半衰期的手段,可以引入对于核酸分子的各种公知的修饰。可能的修饰包括但不限于,向分子的5’和/或3’端添加核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的侧翼序列或在寡脱氧核糖核苷酸主链中使用硫代磷酸酯或2’O-甲基而不使用磷酸二酯酶连接。
ChoK抑制剂和酸性神经酰胺酶抑制剂的优选的组合包括MN58b(结构提供在表1的第II行中)与NOE(结构提供在表2的第6行中)、RSM-932A(结构提供在表1的第I行中)与NOE、MN58b与D-NMAPPD(结构提供在表2的第VIII行中)和RSM-932A与D-NMAPPD。
ChoK抑制剂和化疗剂的组合(本发明第二组合物)
本发明的发明人出乎意料地发现:对ChoK抑制剂MN58b治疗的抗性与对于诸如顺铂、泰素、长春瑞滨或吉西他滨的常规化疗剂的抗性不相关。在对ChoK抑制剂具有抗性的肿瘤(参见实施例1)以及在通过在ChoK抑制剂的存在下的重复的生长循环而选择的建立的肿瘤细胞系(参见本发明实施例6)中都观察到这点。不希望被任何理论所限制,认为ChoK抑制剂和顺铂之间非交叉的抗性是由于两种药物通过不同的机制发挥作用。无论是在体外和体内异种移植物模型中测试时(参见本发明实 施例7),ChoK抑制剂和顺铂的组合,与使用单独化合物进行治疗相比,都导致了肿瘤细胞的生长抑制中的协同效应(参见本发明实施例7),这支持了上述假设。此外,本发明的发明人还观察到:当在不同结肠癌细胞系中测试时,胆碱激酶抑制剂和5-氟尿嘧啶的联合使用导致了协同抗肿瘤效应(参见实施例9)。
因此,在另一方面,本发明涉及组合物(下文中本发明第二组合物),其包含第一组分或第二组分、或者包含第一组分和第二组分,所述第一组分包含一种或多种ChoK抑制剂,所述第二组分包含一种或多种化疗剂。
术语“组合物”是指按照本发明的可选实施方案进行不同组合的一种或多种化合物。优选地,所述组合物包含至少一种ChoK抑制剂和至少一种烷化剂。
适于在本发明组合物中使用的ChoK抑制剂包括先前表1中所示的任何ChoK抑制剂,正如构成本发明第一组合物的一部分。在优选实施方案中,所述ChoK抑制剂是ChoKα的特异性抑制剂。
本文所用的术语“化疗剂”是指抑制癌细胞的增殖、生长、寿命或转移活性的化学试剂,并且包括但不限于,DNA烷化药物、抗代谢物、有丝***抑制剂、蒽环类抗生素、拓扑异构酶I和II抑制剂、激素治疗和靶向治疗,所述靶向治疗例如EGFR抑制剂西妥昔单抗、吉非替尼或蛋白酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼。在优选实施方案中,所述化疗剂是烷化剂,并且更具体而言是DNA烷化剂或抗代谢物。
本文所用的表达“烷化剂”涉及能够向快速***的细胞的遗传物质添加烷基残基,从而导致复制逮捕和细胞死亡的化合物。这类试剂包括基于铂的化合物、氮芥、亚硝基脲、乙撑亚胺衍生物、烷基磺酸盐和三氮烯,所述三氮烯包括但不限于,双氯乙基甲胺、环磷酰胺(CytoxanTM)、美法仑(L-沙可来新)、依托泊苷、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、司莫司汀(甲基-CCNU)、链脲霉素、氯脲霉素、尿嘧啶氮芥、恩比兴、异磷酰胺、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、三亚胺嗪、三乙烯硫代磷胺、白消安、丙卡巴肼、达卡巴嗪和替莫唑胺。
在优选实施方案中,所述烷化剂是基于铂的化合物。可以在本发明 中使用的示例性的基于铂的化合物包括但不限于,顺铂,碳铂,异丙铂,四铂,奥沙利铂,JM118,JM149,JM216,JM335,反铂,顺式、反式、顺式-Pt(NH3)(C6H11NH2)(OOCC3H7)2Cl,奈达铂,丙二酸-1,2-二氨基环己烷铂(II),5-磺基水杨酸-反式-(1,2-二氨基环己烷)铂(II)(SSP),聚-[(反式-1,2-二氨基环己烷)铂]-羧基直链淀粉(POLY-PLAT)和4-羟基-磺酰基苯基乙酸酯(反式-1,2-二氨基环己烷)铂(II)(SAP)。
本文所用的术语“抗代谢物”在广义上涉及由于与对活生物体重要的代谢物(例如维生素、辅酶、氨基酸和糖)具有结构上或功能上的相似性而干扰正常代谢作用的物质和抑制电子转移***从而阻止产生富有能量的中间物的物质。具有抗肿瘤活性的抗代谢物的实例包括但不限于,叶酸类似物(例如,甲氨蝶呤(methotrexate)(甲氨蝶呤(amethopterin)))、二甲叶酸、依达曲沙、甲氨蝶呤、诺拉曲塞、培美曲塞、吡曲克辛、蝶罗呤、雷替曲塞、曲美沙特;嘧啶类似物(例如,氟尿嘧啶(5-氟尿嘧啶;5-FU(R))、氟尿嘧啶脱氧核苷(floxuridine)(氟尿嘧啶脱氧核苷(fluorodeoxyuridine);FudR)、去氧氟尿苷和阿糖胞苷(cytarabine)(阿糖胞苷(cytosine arabinoside)));嘌呤类似物(例如,巯基嘌呤(6-巯基嘌呤;6-MP)、硫鸟嘌呤(6-硫鸟嘌呤;TG)和喷司他丁(2’-脱氧助间型霉素))。
优选的组合包括但不限于,MN58b与顺铂、RSM-932A与顺铂、MN58b与5-氟尿嘧啶和RSM-932A与5-氟尿嘧啶。
ChoK抑制剂和死亡受体配体的组合(本发明第三组合物)
本发明的发明人已经证实:用死亡受体配体和ChoK抑制剂的组合处理肿瘤细胞,与单独用死亡受体配体或ChoK抑制剂处理相比,导致了增加的细胞增殖抑制。例如,如本发明实施例8所示,用胆碱激酶抑制剂RSM-932A(ChoKI)和TRAIL的组合处理结肠癌细胞,与单独使用每种化合物处理相同的细胞相比,导致了增加的细胞毒性。此外,本发明实施例8证实:ChoK抑制剂MN58b和TRAIL的联合使用导致了肿瘤异种移植物模型中肿瘤生长的抑制,该抑制高于单独使用每种化合物时所观察到的抑制。
因此,在另一方面,本发明涉及组合物,其包含第一组分或第二组 分,或者包含第一组分和第二组分,所述第一组分包含一种或多种ChoK抑制剂,所述第二组分是一种或多种死亡受体配体。
适于在本发明组合物中使用的ChoK抑制剂包括先前表1所示的任何ChoK抑制剂,正如构成本发明第一组合物的一部分。在优选实施方案中,所述ChoK抑制剂是ChoKα的特异性抑制剂。
适于在本发明组合物中使用的死亡受体配体包括NGF、CD40L、CD137L/4-1BBL、TNF-αCD134L/OX40L、CD27L/CD70、FasL/CD95、CD30L、TNF-β/LT-α、LT-β和TRAIL。在优选实施方案中,TNF家族成员是TRAIL、TRAIL的功能等同衍生物或TRAIL的小模拟化合物。TRAIL(TNF相关凋亡诱导配体)还称为“Apo-2配体”、“Apo-2L”、“Apo2L”、“Apo2L/TRAIL”和“Apo-2配体/TRAIL”,TRAIL是能够诱导表达TRAIL同族受体的细胞中凋亡的分子。数年前,TRAIL被鉴定为细胞因子的TNF家族的成员(Pitti et al.,1996,J.Biol.Chem.,271:12687-12690和美国专利第6,284,236号)。全长天然序列人源TRAIL多肽长度为281个氨基酸,是具有如SEQ ID NO:7所示的序列的II型跨膜蛋白(UniProt登录号P50591)。可溶形式的TRAIL的晶体学研究表现出与TNF和其他相关蛋白的结构相似的同三聚体结构。但是,与其它TNF家族成员不同,发现TRAIL具有特有的结构特征,该特征为3个半胱氨酸残基(位于同三聚体中每个亚基的位置230)共同与锌原子配位,并且锌结合对于三聚体稳定性和生物活性是重要的。本发明考虑到使用3种不同TRAIL异形体(TRAILα、TRAILβ和TRAILγ)中的任意一种或其组合。
功能等同TRAIL变体包括:诸如WO08088582和US6284236中所述的可溶性TRAIL异形体或US2002128438中所述的TRAIL片段95-281,114-281;Bremer et al(Neoplasia,2004,6:636-45)所述的scFv:sTRAIL融合;US2002061525中所述的备选剪接形式的TRAIL;WO04101608中所述的TRAIL-受体结合肽;具有对于促凋亡受体的增加的特异性的TRAIL变体,例如WO07063301中所述的19IL、199V、201R、213W、215D和/或193S TRAIL突变体或如WO04001009A中所述的通过对于受体的噬菌体展示选择的变体;针对TRAIL-同族受体TRAIL-R1 (DR4)和TRAIL-R2(DR5)的拮抗抗体,例如马帕木单抗(mapatumumab)、来沙木单抗(exatumumab)、WO07128231中所述的抗体或WO02094880中所述的抗体、WO06017961中所述的单克隆抗体AD5-10、WO05056605中所述的TRAIL-特异性串联双链抗体和三链抗体、WO9937684中所述的嵌合抗DR4抗体、WO03038043中所述的拮抗性抗DR5抗体、WO02085946中所述的双特异性抗TRAIL受体抗体、WO9832856中所述的抗DR4特异性抗体、Park,K.J et al(Cancer Res.,2007,67:7327-7334)所述的抗DR2ScFV;WO08025516和WO04014951中所述的三聚体TRAIL融合蛋白;WO07102690中所述的十二聚体TRAIL变体;WO07145457中所述的聚乙二醇化的TRAIL;包含编码TRAIL的多核苷酸的DNA载体,例如US2006153809、WO04087930、US2005031593中所述的那些载体。
具有促凋亡作用的小分子TRAIL模拟物包括WO2008094319中所述的化合物。
优选的组合包括但不限于,RSM-932A与人源TRAIL的胞外区(氨基酸95-281)和MN58b与人源TRAIL的胞外区(氨基酸95-281)。
本发明的药物制剂
构成本发明第一、第二和第三组合物一部分的化合物不仅包括这样的化合物,还包括所述化合物的药学上可接受的盐、溶剂化物、前药。术语“药学上可接受的盐、溶剂化物、前药”是指被给予接受体后能够(直接或间接)提供本文中所述化合物的任何药学上的盐、酯、溶剂化物或任何其它化合物。然而,应当注意到,药学上不可接受的盐也在本发明的范围内,因为它们可用于制备药学上可接受的盐。可以通过本领域已知的方法进行盐、前药和衍生物的制备。
例如,通过常规化学方法从含有碱性或酸性残基的初始化合物合成本文中提供的化合物的药学上可接受的盐。例如,通常通过使化合物的自由酸或碱形式与化学计量的水或有机溶剂或两者的混合物中合适的碱或酸进行反应制备这些盐。通常优选非水性介质,例如DMSO(二甲亚砜)、醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。酸加成盐的实例包括无机酸 加成盐和有机酸加成盐,所述无机酸加成盐例如氯化物、溴化物、碘化物、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐,所述有机酸加成盐例如乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、扁桃酸盐、甲烷磺酸盐和对甲苯磺酸盐。碱加成盐的实例包括无机盐和有机碱盐,所述无机盐例如钠盐、钾盐、溴化物、钙盐、铵盐、镁盐、铝盐和锂盐,所述有机碱盐例如乙二胺盐、乙醇胺盐、N,N-二烯基乙醇胺盐、三乙醇胺盐、葡萄糖胺盐和碱性氨基酸盐。
特别优选的衍生物或前药为当被给予患者时能增加本发明化合物的生物利用度(例如,使口服给予的化合物更容易被血液吸收)或能增强初始物种相关的生物部位(例如,脑或淋巴***)中初始化合物的释放的那些化合物。
本发明还提供组合物,其中至少一种化合物是前药。术语“前药”以其最宽泛的意义使用,并且包括在体内转化为本发明化合物的那些衍生物。这些衍生物对于本领域技术人员显而易见的,并且根据分子中存在的官能团,可以包括但不限于本发明化合物的以下衍生物:酯、氨基酸酯、磷酸酯、金属盐、磺酸酯、氨基甲酸酯和酰胺。产生给定活性化合物的前药的方法的实例是本领域技术人员已知的,并且可见于例如Krogsgaard-Larsen et al.“Textbook of Drug design and Discovery(药物设计和发现)”Taylor & Francis(2002年4月)。
本发明化合物可以是游离化合物或溶剂化物的晶体形式,并且意图将以上二者包括在本发明的范围内。溶剂化方法是本领域公知的。合适的溶剂化物是药学上可接受的溶剂化物。在具体实施方案中,所述溶剂化物是水合物。形成本发明组合物的化合物根据C上存在的手性中心可以包括对映体,或根据多重键的存在(例如,Z,E)可以包括异构体。单独的异构体、对映体或非对映异构体和它们的混合物包括在本发明的范围内。
为本发明不同化合物所选择的不同取代基提供显著影响log P值一系列因素。因此,可以建立作为氢键供体和分子内或分子间连接的羟基,即使在酚类的情况下。羰基或羧基的存在产生分子内质子接受基团。卤素的存在产生非常不足的碳并且大大改动了生物学性质。氨基产生分子 上良好的亲核基团,并且在大多数情况下显著改变其极性和极化性;另外的烷基和/或芳基的存在增加分子的亲油性。
在另一方面,本发明提供包含本发明第一、第二或第三组合物,它们的药学上可接受的盐,衍生物,前药,溶剂化物或立体异构体以及用于对患者进行给药的药学可接受的载体,佐剂或介质的药物组合物。如本文所用的短语“药学可接受的载体”表示参与将主题试剂从机体的一个器官或部分携带或运送至机体的另一器官或部分的药学上可接受的材料、组合物或介质,例如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料。每种载体必须是“可接受的”,其意思是与制剂的其它成分是相容的。可以作为药学可接受的载体的物质的某些实例包括:(1)糖类,例如乳糖、葡萄糖和蔗糖;(2)淀粉,例如玉米淀粉和马铃薯淀粉;(3)纤维素及其衍生物,例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和纤维素乙酸酯;(4)粉末状黄蓍胶;(5)麦芽;(6)明胶;(7)滑石;(8)赋形剂,例如可可脂和栓剂蜡;(9)油,例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油;(10)二醇,例如丙二醇;(11)多元醇,例如丙三醇、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇硬脂酸酯(solutol)和聚乙二醇;(12)酯,例如油酸乙酯和月桂酸乙酯;(13)琼脂;(14)缓冲剂,例如氢氧化镁和氢氧化铝;(15)藻酸;(16)无热原水;(17)等渗盐水;(18)林格液;(19)乙醇;(20)磷酸盐缓冲液;和(21)药物制剂中使用的其它无毒性相容物质,例如DMSO(二甲亚砜)及其衍生物。
可以通过任何合适的给药途径给予药物组合物,例如口服途径、局部途径、直肠途径或肠胃外途径(包括皮下途径、腹膜内途径、皮内途径、肌肉内途径和静脉内途径)。
适于口服给药的药物形式包括任何固体组合物(片剂、锭剂、胶囊剂、颗粒剂等)或液体组合物(溶液、悬液、乳液、糖浆等),并且可以含有本领域已知的常规赋形剂,例如结合剂,例如糖浆、***胶、明胶、山梨醇、黄蓍胶或聚乙烯吡咯酮;填料,例如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇或甘氨酸;用于制备片剂的润滑剂,例如硬脂酸镁;崩解剂,例如淀粉、聚乙烯吡咯酮、淀粉乙醇酸钠或微晶纤维素;或药学上可接受的润湿剂,例如月桂基硫酸钠。
可以通过混合、填充或制备片剂的常规方法来制备固体口服组合物。可以使用重复的混合操作、通过使用大量填充剂将活性成分分布于整个组合物中。这些操作是本领域中常规的操作。可以通过例如湿法制粒或干法制粒的方法来制备片剂,并且可以按照常规制药实践中公知的方法任选地对片剂进行包被,特别是用肠衣进行包被。
药物组合物还可以用于肠胃外给药,例如合适的单位药物形式的无菌溶液、悬液或冻干产物。可以使用合适的赋形剂,例如膨胀剂、缓冲剂或表面活性剂。可以使用常用方法制备所述制剂,例如西班牙药典和美国药典以及相似参考文献中描述或引用的方法。
可以通过任何合适的方法给予本发明中使用的化合物或组合物,例如静脉内输注、口服制剂以及腹膜内给药和静脉内给药。尽管如此,优选的给药途径取决于患者的疾病状态。由于对于患者来讲的舒适性和待治疗疾病的慢性特征,因此优选口服给药。
对于本发明组合物在治疗中的应用,其优选为药学上可接受的形式或基本上纯的形式,即除了药学上可接受的赋形剂之外并且不包括在正常剂量水平被认为是具有毒性的材料,本发明组合物具有药学上可接受的纯度水平。酸性神经酰胺酶抑制剂或胆碱激酶抑制剂的纯度水平优选大于50%、更优选大于70%、更优选大于90%。在优选实施方案中,所述纯度水平大于95%。
本发明组合物中酸性神经酰胺酶抑制剂、化疗剂或死亡受体配体和胆碱激酶抑制剂的治疗有效量通常取决于待治疗的个体、所述个体所患疾病的严重程度、所选择的给药形式等因素。基于该原因,本发明中所述的剂量必须视为是对本领域技术人员的指导,并且本领域技术人员需要根据前述变量调整剂量。尽管如此,酸性神经酰胺酶抑制剂可以每天给药一次或多次,例如每天给药1、2、3或4次,每天给药总量通常为1-200mg/kg体重/天,优选1-10mg/kg体重/天。按照相同方式,胆碱激酶抑制剂可以每天给药一次或多次,例如每天给药1、2、3或4次,每天给药总量通常为1-200mg/kg体重/天,优选1-10mg/kg体重/天。
可以将本发明的组合物配制为单一制剂,或可选地,可以将本发明的组合物提供为用于同时给药、合并给药、分别给药或相继给药的产品。
本发明中所述的组合物、它们药学上可接受的盐、前药和/或溶剂化物、以及含有以上物质的药物组合物可以与其它另外的药物共同使用以提供联合治疗。所述另外的药物可以构成相同药物组合物的一部分,或可选地,以单独的组合物的形式提供所述另外的药物,以用于将其与包含酸性神经酰胺酶抑制剂和胆碱激酶抑制剂或它们的药学上可接受的前药、溶剂化物或盐的药物组合物同时给药或不同时给药。其它药物可以构成相同组合物的一部分,或以单独的组合物的形式提供所述其它药物,以用于将其同时给药或不同时给药。
本发明组合物可以与本领域已知的其它化疗剂联合给药,例如:
-抗代谢剂,例如叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂,包括但不限于,阿糖胞苷(cytarabine)(CYTOSAR-U)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿嘧啶脱氧核苷(FudR)、6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤(6-MP)、喷司他丁、甲氨蝶呤、10-炔丙基-5,8-双去氮叶酸酯(PDDF,CB3717)、5,8-双去氮四氢叶酸(DDATHF)、亚叶酸、磷酸氟达拉滨、喷司他丁和吉西他滨。
-合适的天然产物及其衍生物,(例如,长春花生物碱、抗肿瘤抗生素、酶、淋巴因子和表鬼臼毒素),包括但不限于,Ara-C、紫杉醇(泰素(k)、多西紫杉醇(泰索帝)、脱氧助间型霉素、丝裂霉素-C,L-天门冬氨酰胺酶、咪唑嘌呤;布喹那;生物碱,例如长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛等;鬼臼毒素,例如依托泊苷、替尼泊苷等;抗生素,例如蒽环类抗生素、盐酸柔红霉素(柔红霉素(daunomycin)、柔红霉素(rubidomycin)、柔红霉素(cerubidine))、伊达比星、多柔比星、表柔比星和吗啉代衍生物等;吩噁嗪酮双环肽,例如更生霉素;碱性糖肽,例如博来霉素;蒽醌苷,例如光辉霉素(plicamycin)(光辉霉素(mithramycin));蒽二酮,例如米托蒽醌;吖兵叮并吡咯并吲哚二酮(azirinopyrrolo indoledione),例如丝裂霉素;大环免疫抑制剂,例如环孢霉素、FK-506(他克莫司,普乐可复)、雷帕霉素等。其它抗增殖细胞毒性剂为诺维本、CPT-11、阿那曲唑、来曲唑、卡培他滨、雷洛昔芬、环磷酰胺、异磷酰胺和屈洛昔芬。
-具有抗增殖活性的微管干扰剂也适合使用,并且包括但不限于, 别秋水仙碱(allocolchicine)(NSC 406042)、软海绵素B(NSC 609395)、秋水仙碱(NSC 757)、秋水仙碱衍生物(例如,NSC 33410)、多拉司他汀10(NSC 376128)、美登素(NSC 153858)、根霉素(NSC 332598)、紫杉醇(泰素)、T ol衍生物、多西紫杉醇(泰索帝)、硫代秋水仙碱(NSC 361792)、三苄基半胱氨酸、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、天然和合成埃博霉素,所述埃博霉素包括但不限于,埃博霉素A、埃博霉素B、盘皮海绵内酯(discodermolide);雌莫司汀、诺考达唑等。
-酪氨酸激酶抑制剂,例如吉非替尼、伊马替尼、索拉非尼、达沙替尼和埃罗替尼。
-拓扑异构酶II抑制剂,包括但不限于,表鬼臼毒素,例如托泊替康、伊立替康、依托泊苷和替尼泊苷。
-蒽环类抗生素(例如柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌)。
-单克隆抗体,例如西妥昔单抗、贝伐珠单抗、利妥昔单抗、阿仑单抗和曲妥珠单抗。
此外,对于本发明第一和第三组合物而言,组合物可另外包含烷化剂。适于在本发明第一和第三组合物中使用的烷化剂包括基于铂的化合物,例如碳铂、顺铂、奈达铂、奥沙利铂、四硝酸三铂、沙铂及以上的组合;烷基磺酸盐,例如白消安、乙撑亚胺和甲基密胺,例如六甲基密胺(hexamethylmelamine)、六甲密胺(altretamine)或塞替派、氮芥(nitrogenmustard),例如环磷酰胺、双氯乙基甲胺或氮芥、乌拉莫司汀或尿嘧啶氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥或异磷酰胺,亚硝基脲,例如卡莫司汀或链脲菌素、三氮烯例如达卡巴嗪和咪唑四嗪,例如替莫唑胺。
此外,对于本发明第一和第二组合物而言,组合物还可以包含死亡受体配体。优选地,所述死亡受体配体选自NGF、CD40L、CD137L/4-1BBL、TNF-αCD134L/OX40L、CD27L/CD70、FasL/CD95、CD30L、TNF-β/LT-α、LT-β和TRAIL。在优选实施方案中,TNF家族成员是TRAIL、TRAIL的功能等同衍生物或TRAIL的小模拟化合物。TRAIL(TNF相关凋亡诱导配体)还称为“Apo-2配体”、“Apo-2L”、“Apo2L”、“Apo2L/TRAIL”和“Apo-2配体/TRAIL”,其是能够在表达 TRAIL同族受体的细胞中诱导凋亡的分子。数年前,TRAIL被鉴定为细胞因子的TNF家族的成员(Pitti et al.,1996,J.Biol.Chem.,271:12687-12690和美国专利第6,284,236号)。全长天然序列人源TRAIL多肽长度为281个氨基酸,是II型跨膜蛋白。可溶形式的TRAIL的晶体学研究表现出与TNF和其他相关蛋白的结构相似的同三聚体结构。但是,与其它TNF家族成员不同,发现TRAIL具有特有的结构特征,该特征为3个半胱氨酸残基(位于同三聚体中每个亚基的位置230)共同与锌原子配位,并且锌结合对于三聚体稳定性和生物活性是重要的。本发明考虑到使用3种不同TRAIL异形体(TRAILα、TRAILβ和TRAILγ)中的任意一种或其组合。
功能等同TRAIL变体包括:诸如WO08088582和US6284236中所述的可溶性TRAIL异形体或US2002128438中所述的TRAIL片段95-281,114-281;Bremer et al(Neoplasia,2004,6:636-45)所述的scFv:sTRAIL融合;US2002061525中所述的备选剪接形式的TRAIL;WO04101608中所述的TRAIL-受体结合肽;具有对于促凋亡受体的增加的特异性的TRAIL变体,例如WO07063301中所述的19IL、199V、201R、213W、215D和/或193S TRAIL突变体或如WO04001009A中所述的通过对于受体的噬菌体展示选择的变体;针对TRAIL-同族受体TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2(DR5)的拮抗抗体,例如马帕木单抗、来沙木单抗、WO07128231中所述的抗体或WO02094880中所述的抗体、WO06017961中所述的单克隆抗体AD5-10、WO05056605中所述的TRAIL-特异性串联双链抗体和三链抗体、WO9937684中所述的嵌合抗DR4抗体、WO03038043中所述的拮抗性抗DR5抗体、WO02085946中所述的双特异性抗TRAIL受体抗体、WO9832856中所述的抗DR4特异性抗体、Park,K.J et al(Cancer Res.,2007,67:7327-7334)所述的抗-DR2ScFV;WO08025516和WO04014951中所述的三聚体TRAIL融合蛋白;WO07102690中所述的十二聚体TRAIL变体;WO07145457中所述的聚乙二醇化的TRAIL;包含编码TRAIL的多核苷酸的DNA载体,例如US2006153809、WO04087930、US2005031593中所述的那些载体。
具有促凋亡作用的小分子TRAIL模拟物包括WO2008094319中所 述的化合物。
本发明组合物的治疗用途
鉴于本发明组合物在抑制肿瘤细胞生长中的协同效应,可以将它们用于医药。因此,在另一方面,本发明涉及本发明组合物在医药中的用途。
另一方面,本发明涉及治疗癌症的方法,所述方法包括给予患者包含以下的组合物:(i)酸性神经酰胺酶抑制剂和胆碱激酶抑制剂,(ii)胆碱激酶抑制剂和化疗剂或(iii)胆碱激酶抑制剂和死亡受体配体。可选地,本发明涉及包含(i)酸性神经酰胺酶抑制剂和胆碱激酶抑制剂,(ii)胆碱激酶抑制剂和化疗剂或(iii)胆碱激酶抑制剂和死亡受体配体的组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。可选地,本发明涉及用于治疗癌症的组合物,其包含(i)酸性神经酰胺酶抑制剂和胆碱激酶抑制剂,(ii)胆碱激酶抑制剂和化疗剂或(iii)胆碱激酶抑制剂和死亡受体配体。
本发明还考虑到给予任何本发明的药物组合物,所述药物组合物包括如上文所述的其它抗肿瘤剂。优选地,所述癌症选自:重链病、白血病(例如,急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性粒-单核细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、幼年粒-单核细胞性白血病等)、转移灶、赘生物、肿瘤(例如,听神经瘤、腺癌、肾上腺皮质癌、***癌、血管肉瘤、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、支气管癌、腹膜癌、***、软骨肉瘤、脊索瘤、绒毛膜癌、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、囊腺癌、胚胎性癌、子宫内膜癌、内皮肉瘤、室管膜细胞瘤、上皮癌、食道癌、尤文氏瘤、纤维肉瘤、胃肠癌、生殖泌尿道癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、头癌、成血管细胞瘤、肝细胞瘤、霍奇金病、肾癌、平滑肌肉瘤、脂肉瘤、肝癌、肺癌、***内皮肉瘤、***肉瘤、淋巴瘤、恶性高钙血症、恶性胰腺胰岛瘤、髓样癌、髓母细胞瘤、黑色素瘤、脑脊膜瘤、间皮瘤、颈癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、少突神经胶质瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、***状腺癌、***状癌、***癌、松果体瘤、恶性前皮肤病变、原发性脑瘤、原发性巨球蛋白血症、原发性血 小板增多症、***癌、直肠癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮脂腺癌、***瘤、小细胞肺癌、鳞状细胞癌、胃癌、滑膜瘤、汗腺癌、睾丸瘤、甲状腺癌、子宫癌、外阴癌和维尔姆斯氏瘤),或特征为不受控制的细胞生长的任何疾病或病症。
在优选实施方案中,所述癌症是肺癌。如本文所用的“肺癌”涉及侵袭肺组织中存在的一种或多种细胞的任何瘤性变化。可以使用本发明组合物进行治疗的示例性的非限制性的肺癌类型包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌、包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌和间皮瘤。在更优选的实施方案中,所述肺癌是非小细胞肺癌。
在另一优选实施方案中,所述癌症是结肠癌或结肠直肠癌。如本文所用的术语“结肠直肠癌”包括任何类型的结肠、直肠和阑尾肿瘤,并且指早期和晚期腺瘤和癌症以及遗传性、家族性或散发性癌症。遗传性CRC包括涉及存在息肉的那些综合征,例如错构息肉病综合征和最熟知的家族性腺瘤性息肉病(FAP),遗传性CRC还包括非息肉病综合征,例如遗传性非息肉病结肠直肠癌(HNPCC)或Lynch综合征I。本发明允许在结肠直肠癌的不同阶段对其进行诊断,例如,按照Dukes分类的A期、B期、C1期、C2期和D期,按照Astler-Coller分类的A期、B1期、B2期、B3期、C1期、C2期、C3期和D期,按照TNM***的TX期、T0期、Tis期、T1期、T2期、T3期、NX期、N0期、N1期、N2期、MX期、M0期和M1期,以及按照AJCC(美国癌症联合委员会)分类的0期、I期、II期、III期和IV期。
可以将本发明的组合物配制为单一制剂,或可选地,可以将本发明的组合物提供为用于同时给药、合并给药、分别给药或相继给药的产品。
利用酸性神经酰胺酶抑制剂、化疗剂或死亡受体配体使肿瘤细胞对ChoK抑制剂的治疗敏感化
本发明的发明人还观察到:当事先或同时用酸性神经酰胺酶抑制剂(参见本发明实施例6)、化疗剂(参见实施例7和9)或死亡受体配体(参见实施例8)处理细胞时,对胆碱激酶抑制剂的反应被增强。
因此,在另一方面,本发明涉及增加肿瘤细胞对胆碱激酶抑制剂的 敏感性的方法,包括用酸性神经酰胺酶抑制剂、化疗剂或死亡受体配体处理所述肿瘤细胞。在仍然另一方面,本发明涉及使用酸性神经酰胺酶抑制剂、化疗剂或死亡受体配体来增加肿瘤细胞对胆碱激酶抑制剂的敏感性。
本文所用的术语“敏感性”是指细胞对于给定胆碱激酶抑制剂的反应,并且通常按照造成肿瘤细胞生长的50%抑制的胆碱激酶抑制剂的最小剂量来确定“敏感性”。因此,酸性神经酰胺酶抑制剂、化疗剂或死亡受体配体增加敏感性或降低实现50%生长抑制所需的最小剂量来发挥作用。
可以通过在给予ChoK抑制剂的同时、之后或之前用酸性神经酰胺酶抑制剂、化疗剂或死亡受体配体处理细胞来实现肿瘤细胞对ChoK抑制剂治疗的敏感化作用。可以用于增加肿瘤细胞对ChoK抑制剂的敏感性的酸性神经酰胺酶抑制剂、化疗剂和死亡受体配体可以是上文所述构成本发明组合物一部分的任何化合物。此外,可以用于处理被用酸性神经酰胺酶抑制剂或死亡受体配体敏感化的细胞的ChoK抑制剂基本上是上文所述作为本发明组合物的组分的任何抑制剂。
鉴定表现出对ChoK抑制剂的抗性的癌症患者的方法
此外,本发明发明人的发现提供了通过测定患者的样品中酸性神经酰胺酶水平来鉴定可能表现出对ChoK抑制剂治疗的抗性的癌症患者的可能性。如果酸性神经酰胺酶水平相对于参考样品升高,则表明该患者可能表现出对ChoK抑制剂的抗性,因为响应于ChoK抑制而产生的促凋亡神经酰胺酶会被水解,产生具有促有丝***作用的鞘氨醇。相反,如果酸性神经酰胺酶水平相对于参考样品的水平降低或至少未升高,则表明该患者会有效响应于ChoK抑制剂治疗。
因此,在另一方面,本发明涉及鉴定对ChoK抑制剂治疗具有抗性的癌症患者的方法(下文中本发明第一方法),包括测定来自所述患者的样品中酸性神经酰胺酶的水平,其中当所述样品中酸性神经酰胺酶水平高于参考样品时,该患者被鉴定为对ChoK抑制剂具有抗性。
为了实施本发明第一方法,从研究中的个体获得样品。本文所用的 术语“样品”涉及可以从患者获得的任何样品。本方法可以应用于来自患者的任何类型的生物样品,例如活组织检查样品、组织、细胞或液体(血清、唾液、***、痰、脑脊液(CSF)、眼泪、粘液、汗、乳、大脑提取物等)。在具体实施方案中,所述样品是组织样品或其部分,优选为肿瘤组织样品或其部分。可以通过常规方法获得所述样品,例如利用相关医学领域技术人员公知的方法所进行的活组织检查。从活组织检查获取样品的方法包括团块粗分或显微切割或其它本领域已知的细胞分离方法。肿瘤细胞还可以获自细针抽吸细胞学。为了简化样品的保存和处理,可以将这些样品进行***固定和石蜡包埋,或通过将这些样品浸入允许快速冷冻的非常低温的介质中首先冷冻,然后包埋在诸如OCT-化合物的可低温凝固的介质中。
如果可以获得来自患者的样品,本发明第一方法包括测定酸性神经酰胺酶的水平。本领域技术人员应当理解,可以通过以下测定“酸性神经酰胺酶的水平”:测定编码酸性神经酰胺酶的mRNA水平、测定酸性神经酰胺酶的水平或测定酸性神经酰胺酶的酶活性。
如果通过测定酸性神经酰胺酶的mRNA表达水平来确定“表达水平”,可以以通过物理上或机械上的方式处理生物样品来破坏组织或细胞结构,从而将细胞内组分释放到水性溶液或有机溶液中以制备用于后续分析的核酸。利用本领域技术人员已知的方法和可商购的产品从样品中提取核酸。然后,通过本领域的任何常规方法从冷冻或新鲜样品中提取RNA,例如,Sambrook,J.,et al.,2001.Molecular cloning:a Laboratory Manual(分子克隆:实验手册),第三版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.,Vol.1-3。优选地,在提取过程中注意避免RNA降解。
在具体实施方案中,使用获自***固定的、石蜡包埋的组织样品的mRNA来测定表达水平。可以从首先脱石蜡的存档病理学样品或活组织检查样品中分离mRNA。示例性的脱石蜡方法包括用诸如二甲苯的有机溶剂洗涤石蜡化的样品。可以用低级醇的水性溶液使脱石蜡的样品再水化。合适的低级醇包括,例如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇。例如,可以利用逐渐降低浓度的低级醇溶液的连续洗涤使脱石蜡的样品再水化。可选地,将样品同时脱石蜡和再水化。然后,裂解样品并从样品中提取 RNA。
尽管所有基因表达分析技术(RT-PCR、SAGE或TaqMan)都适用于实施本发明的以上方面,但是通常通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测定基因mRNA表达水平。在具体实施方案中,通过定量PCR测定酸性神经酰胺酶mRNA的表达水平,优选通过实时PCR。可以在个体样品或组织微阵列中进行检测。
为了将不同样品中mRNA表达的值标准化,可以将测试样品中目的mRNA的表达水平与对照RNA的表达进行比较。本文所用的“对照RNA”涉及这样的RNA,其在肿瘤细胞中的表达水平相对于其在非肿瘤发生细胞中的表达水平没有改变或仅改变有限量。优选地,对照RNA是对应于管家基因的mRNA,所述管家基因为mRNA编码组成型地表达并实行细胞功能的蛋白。用于本发明的优选的管家基因包括β-2-微球蛋白、泛素,18-S核糖体蛋白、亲环蛋白、GAPDH和肌动蛋白。在优选实施方案中,对照RNA是β-肌动蛋白mRNA。在一个实施方案中,按照比较Ct法、使用β-肌动蛋白作为内部对照并使用商购RNA对照作为校准物来计算相对基因表达定量。按照公式2-(ΔCt样品-ΔCt校准物)确定最终结果,其中通过从管家基因的值减去靶基因的CT值确定校准物和样品的ΔCT值。
一旦测定了酸性神经酰胺酶mRNA的mRNA表达水平,本发明第一方法包括将该表达水平与参考样品中的表达水平进行比较。本文所用的“参考样品”应理解为具有酸性神经酰胺酶mRNA的参考水平的样品。例如,参考样品可以是获自与所研究的肿瘤患者相似但是对ChoK抑制剂没有抗性的患者的肿瘤样品。可选地,参考样品可以是来源于数位患有所研究的相同类型肿瘤的患者的肿瘤组织样品混合物。可选地,还可以测定肿瘤样品集合的mRNA表达水平,并确定所有个体值的中间值。然后,将得到的中间值作为参考来确定在所研究的样品中获得的mRNA表达值是否应当视为增加。
由于个体间存在差异(例如年龄、种族等相关方面),所以建立mRNA水平的绝对参考值是非常难的(如果不是实际上无法实现的话)。因此,在具体实施方案中,通过利用常规方法计算百分比值来确定用于“升高 的”或“降低的”酸性神经酰胺酶mRNA水平的参考值,所述常规方法包括测试从正常个体(即未诊断为NSCLC的人)分离的一组样品的酸性神经酰胺酶mRNA的表达水平。优选地,“升高的”水平可以被指定为酸性神经酰胺酶mRNA的表达水平等于或超出50%正常群体的样品,例如,包括表达水平等于或超出60%正常群体、等于或超出70%正常群体、等于或超出80%正常群体、等于或超出90%正常群体以及等于或超出95%正常群体。
可选地,在另一具体实施方案中,可以通过测定酸性神经酰胺酶的蛋白水平来确定酸性神经酰胺酶的水平。可以通过诸如ELISA、Western印迹或免疫荧光的免疫学技术进行蛋白表达水平的测定。Western印迹是基于以下来检测蛋白的:先通过变性条件下的凝胶电泳进行分离,固定在膜上,通常是硝酸纤维素膜,与特异性抗体孵育,以及显影***(例如化学发光)。通过免疫荧光的分析需要使用用于表达分析的靶蛋白的特异性抗体。ELISA是基于使用抗原或用酶标记的抗体,使得靶抗原和标记的抗体之间形成的结合物导致形成具有酶学活性的复合物。因为组分之一(抗原或标记的抗体)是固定在支持物上的,所以抗体-抗原复合物被固定在该支持物上,并因此可以通过添加底物来检测该抗体-抗原复合物,所述底物被酶转化为可通过例如分光光度计或荧光计检测的产物。
可选地,可以通过构建包含装配的患者样品的组织微阵列(TMA)并通过免疫组织化学技术测定蛋白的表达水平来进行酸性神经酰胺酶蛋白表达水平的测定。免疫染色强度可以由两名不同的病理学专业人员进行评估,并且为了保持方法的可重复性,可以使用一致且明确的界限标准进行评分。通过同时再评估可以解决差异。简言之,考虑到肿瘤细胞中的表达和对于每种标志物的具体界限,免疫染色结果可以记录为阴性表达(0)与阳性表达,以及低表达(1+)、中度表达(2+)和高表达(3+)。作为通用标准,选择界限是为了便于可重复性并且在可能的情况下转换生物事件。
当使用免疫学方法时,可以将已知能以高亲和力结合靶蛋白的任何抗体或试剂用于检测靶蛋白的量。尽管如此,优选使用抗体,例如多克隆血清、杂交瘤上清或单克隆抗体、抗体片段、Fv、Fab、Fab’y F(ab’)2、 ScFv、双链抗体、三链抗体、四链抗体和人源化抗体。
无论酸性神经酰胺酶水平是通过测定mRNA表达水平还是通过测定蛋白水平而确定的,所获得的值需要与参考样品的值进行比较。参考样品可以对应于通过将来自多名健康患者的相同量混合而得到的样品。一旦建立该参考样品值,来自患者的肿瘤组织中该标志物的表达水平可以与该中间值进行比较,并从而被指定为“低”水平、“正常”水平或“高”水平。参考水平来源的样品的集合优选地由与患者年龄相同的健康人组成。在任何情况下,其可以含有不同数目的样品。在更优选的实施方案中,样品是脑活组织检查样品。优选地,所述集合应当足以提供准确的参考水平。优选地,用于产生参考值的样品数多于10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500个样品。
在具体实施方案中,与参考值相比,高于参考值的至少1.1倍、1.5倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或甚至更多倍的表达增加被认为是“高”表达。在具体实施方案中,与参考值相比,低于参考值的至少0.9倍、0.75倍、0.2倍、0.1倍、0.05倍、0.025倍、0.02倍、0.01倍、0.005倍或更低的表达降低被认为是“低”表达。
另一方面,可以通过构建包含装配的个体样品的组织微阵列(TMA)并通过本领域公知的免疫组织化学技术测定蛋白的表达水平来进行蛋白表达水平的测定。
在另一实施方案中,通过测定所研究的样品中酸性神经酰胺酶的活性进行酸性神经酰胺酶水平的测定。测定酸性神经酰胺酶的酶活性的方法是本领域技术人员公知的并在上文已有详细描述。
为癌症患者选择个体化治疗的方法
本发明的发明人所提供的结果允许基于来自患者的样品中酸性神经酰胺酶的表达水平来鉴定将要表现出对ChoK抑制剂治疗的抗性的那些癌症患者。因此,在另一方面,本发明涉及为癌症患者选择个体化治疗的方法(下文中本发明第二方法),包括测定来自所述患者的样品中酸性神经酰胺酶的水平,其中如果所述样品中酸性神经酰胺酶的表达水平高 于参考样品,则患者适于用ChoK抑制剂或ChoK抑制剂和酸性神经酰胺酶抑制剂的组合进行治疗。
本发明第二方法的步骤与本发明第一方法所述基本相同,并且包括测定来自患者的样品(优选为肿瘤样品)中酸性神经酰胺酶的水平,其中可以使用上述任何方法通过测定mRNA水平、蛋白水平或酸性神经酰胺酶活性来测定所述水平。
一旦测定了酸性神经酰胺酶水平并且与参考样品进行了比较,高于参考样品的酸性神经酰胺酶水平指示该患者适于用ChoK抑制剂和酸性神经酰胺酶抑制剂的组合进行治疗。
在优选实施方案中,所述癌症是非小细胞肺癌。
鉴定增加ChoK抑制剂的治疗效果的化合物的方法
本发明的发明人已经发现:表现出对ChoK抑制剂增加的抗性的肿瘤细胞具有升高的酸性神经酰胺酶水平。因此,通过测定响应于给定化合物的酸性神经酰胺酶增加的水平,就可以确定该化合物是否能够降低对ChoK抑制剂的抗性,即增加这些化合物的治疗效果。
因此,在另一方面,本发明涉及鉴定能够增加ChoK抑制剂在治疗癌症中的治疗效果的化合物的方法(下文中本发明第三方法),包括以下步骤:
(i)使表现出对ChoK抑制剂的抗性的肿瘤细胞与候选化合物接触;以及
(ii)测定所述细胞中酸性神经酰胺酶的水平;
其中如果用候选化合物处理后的细胞中酸性神经酰胺酶的水平低于处理前,则所述候选化合物被认为能够增加ChoK抑制剂在治疗癌症中的效果。
本发明第三方法包括的第一步骤包括使表现出对ChoK抑制剂的抗性的肿瘤细胞与候选化合物接触。应当理解,可以在非人的动物体内进行所述接触步骤,或可以在表现出对ChoK抑制剂的抗性的细胞培养物上体外进行所述接触步骤,所述非人动物含有由对ChoK抑制剂具有抗性的细胞形成的肿瘤。
当在体外实施本发明第三方法时,需要对ChoK抑制剂具有抗性的肿瘤细胞的细胞培养物。可以从之前基于对ChoK抑制剂的抗性进行选择的肿瘤细胞、之前进行过一轮或多轮逐渐增加浓度的ChoK抑制剂的选择的肿瘤细胞、过表达ChoK的细胞或组成性表达ChoK的特异性siRNA的细胞获得培养物。如果通过一轮或多轮逐渐增加浓度的ChoK抑制剂的选择来选择细胞,前面段落中提及的任何ChoK抑制剂可适用于该目的。
一旦建立对ChoK抑制剂具有抗性的细胞培养,使该培养物与将要测定对增加ChoK抑制剂治疗效果的作用的候选化合物接触。根据本发明,使细胞与候选化合物“接触”包括使候选化合物进入表达DNA构建体的细胞的任何可能方式。因此,如果候选化合物是低分子量的分子,将所述分子添加至培养基就足够了。如果候选化合物是高分子量的分子(例如,诸如核酸或蛋白的生物聚合物),必须提供能够使该分子进入细胞内部的方法。如果候选分子是核酸,可以使用任何本领域已知的方法(磷酸钙、DEAE-葡聚糖、凝聚胺、电穿孔、显微注射、脂质体介导的融合、脂转染、逆转录病毒感染和基因枪转染)应用常规转染手段。如果候选化合物是蛋白,可以使细胞与蛋白直接接触或与编码其的核酸接触,所述核酸与允许它在处于细胞内部时进行转录/翻译的元件相连。可选地,可以使细胞与所研究的蛋白的变体接触,所述蛋白已用可以促进该蛋白转移入细胞内部的肽进行修饰,所述肽例如来源于HIV-1 TAT蛋白的Tat肽、来自黑腹果蝇(D.melanogaster)的触角足同源域蛋白的第三螺旋、单纯疱疹病毒的VP22蛋白和精氨酸寡聚物(Lindgren,A.et al.,2000,Trends Pharmacol.Sci,21:99-103,Schwarze,S.R.et al.,2000,Trends Pharmacol.Sci.,21:45-48,Lundberg,M et al.,2003,Mol.Therapy 8:143-150和Snyder,E.L.and Dowdy,S.F.,2004,Pharm.Res.21:389-393)。
优选地,待测试的化合物不是分离的,而是构成来源于天然来源的有一定复杂程度的混合物的一部分或构成化合物文库的一部分。可以按照本发明方法进行检测的化合物文库的实例包括但不限于,肽文库,包括肽和肽类似物的文库,所述肽类似物包括D-氨基酸或包含非肽键的肽;核酸文库,包括具有硫代磷酸酯型非磷酸二酯键的核酸或肽核酸的 文库;抗体文库;碳水化合物文库;低分子量化合物文库,优选为有机分子;肽模拟物文库等。如果使用低分子量有机化合物文库,可以预先选择文库,使得其包括可以容易进入细胞内部的化合物。因此可以基于某些参数选择化合物,例如大小、亲油性、亲水性、形成氢键的能力。
或者,待检测的化合物可以构成获自天然来源的提取物的一部分。所述天然来源可以是来自任何环境的动物、植物来源,包括但不限于土壤、空气、海洋生物等的提取物。
在第二步骤中,本发明方法包括测定用候选化合物处理的细胞的酸性神经酰胺酶水平。可以按照上文所述,通过使用上文所述的任何生物化学方法测定细胞提取物中的mRNA水平、蛋白水平或酸性神经酰胺酶活性以进行酸性神经酰胺酶水平的测定。导致酸性神经酰胺酶水平降低的那些化合物将被选择为用于增加肿瘤细胞对ChoK抑制剂的反应的候选化合物。
如果候选化合物构成有一定复杂程度的混合物的一部分,本发明还包括将所述混合物进行分级的一个或数个步骤(iii),和将本发明方法的步骤(i)、(ii)和(iii)重复可变次数直至分离出混合物中负责转录促进活性的化合物。将存在于混合物中的化合物进行分级的方法包括层析法(薄层层析、气相色谱、凝胶分子排除层析、亲和层析)、结晶化、蒸馏、过滤、沉淀、升华、萃取、蒸发、离心、质谱、吸附等。
在另一实施方案中,在癌症动物模型中体内进行本发明的筛选方法,通过植入表现出对ChoK抑制剂的抗性的非人动物肿瘤细胞来获得所述癌症动物模型。可以使用任何上文所述的方法获得细胞。对ChoK抑制剂具有抗性的细胞可以被植入任何物种的任何非人动物,优选为哺乳动物,并且更优选为灵长类动物(猴、狒狒、黑猩猩等)、啮齿动物(小鼠、大鼠、兔、几内亚猪、仓鼠等)或猪。为了促便于肿瘤细胞的植入,动物可以是免疫缺陷的动物。可以被植入接受体生物的肿瘤细胞包括循环肿瘤细胞、肿瘤干细胞、来源于永生化循环肿瘤细胞的细胞系、微转移肿瘤细胞、来源于永生化微转移肿瘤细胞的细胞系、来源于永生化的已被从实体瘤中纯化的肿瘤细胞的细胞系、来自实体瘤的原代肿瘤细胞、从实体瘤中切除的新鲜肿瘤碎片、原代肿瘤细胞、来源于已被从临床转移 中纯化的永生化细胞的细胞系(即PC3细胞系)和以上的任意组合。
一旦获得携带由对ChoK抑制剂具有抗性的细胞形成的肿瘤的动物模型,本方法的第一步骤包括使所述肿瘤细胞与候选化合物接触。通过在适于化合物接近肿瘤细胞的条件下向动物给予候选化合物进行所述接触步骤。可以通过任何合适的途径给予测试化合物,包括,例如口服给药、经皮给药、静脉内给药、输注给药、肌肉内给药等。
一旦肿瘤与候选化合物接触,按照上文所述测定所述肿瘤细胞中酸性神经酰胺酶的表达水平,即通过测定酸性神经酰胺酶mRNA水平、酸性神经酰胺酶蛋白水平或酸性神经酰胺酶活性。
本发明第三方法包括将用候选化合物处理后肿瘤细胞中酸性神经酰胺酶的水平与治疗前所观察到的水平进行比较。在本文中,当酸性神经酰胺酶表现出至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少100%(即无法检测到酸性神经酰胺酶水平)的降低时,认为酸性神经酰胺酶降低了。即,酸性神经酰胺酶的水平是可检测的。
现在通过以下方法和实施例详细描述本发明,这些方法和实施例应当视为仅是举例说明,而不是限制本发明的范围。
实施例
材料和方法
患者
将来自84名随机选择的患者的肺癌组织样本用于分析,这些患者在2001-2004年间进行过NSCLC的手术切除并且由位于马德里La Paz医院的医学肿瘤部门(The Medical Oncology division)进行跟访。未给予这些患者辅助治疗。该研究由医院的伦理审查委员会批准,并且从所有患者获得了书面形式的知情同意书。
NSCLC肿瘤的原代培养物
将从NSCLC患者切除的组织进行解离(细胞解离组织筛破碎试剂盒CD1,SIGMA),并且将获得的细胞接种于24孔板中(BD,Falcon,Bioscience,San Jose,CA,USA)。用渐增浓度(0、0.5、1、5、10和20μM)的cDDP、泰素、长春瑞滨、吉西他滨和MN58b处理细胞10天,所述细胞培养于补充了10%胎牛血清(FBS,Life Technologies,Grand Island,NY)的DMEN:F12HAM(Ref:D8437,SIGMA)中。按照之前所述的结晶紫法(Rodríguez-González,A.et al.,Oncogene,22:8803-8812)将每孔中最终不变的群体进行定量。
化合物
MN58b已在WO9805644中进行过描述,并且对应于1,4-(4-4’-双-((4-(二甲基胺)吡啶鎓-1-基)甲基)二苯基)二溴丁烷。RSM-932A已在美国专利申请US2007185170中进行过描述,并且对应于1,1’(二苯基-4,4’-二基亚甲基)双[4-(4-氯-N-甲基苯胺基-)喹啉鎓]二溴化物。NOE已由Sugita et al(Biochim.Biphys.Acta,1975,398:125-131)进行过描述,并且对应于N-油酰乙醇胺(NOE)。D-NMAPPD对应于3-乙氧基-1-(2-甲基氨基乙基)-3-苯基-吲哚-2-酮(CAS 35922-06-6),并且已经由Raisova,M.,et al.(FEBS Lett.,2002,516:47-52)和Selzner,M.et al.(Cancer Res.,2001,61:1233-1240)进行过描述。TRAIL之前已有描述,并且对应于人源TRAIL的细胞外结构域(氨基酸95-281)。
RNA分离和基因表达分析
使用RNeasy迷你试剂盒(QIAGEN,Hilden,Germany)按照厂商的使用说明,从选择的活组织检查样品分离RNA用于微阵列和QT-PCR。按照Affymetrix基因芯片表达分析技术手册进行样品制备和阵列杂交。在国家生物技术中心(National Center of Biotechnology)(马德里,西班牙)的基因组学楼(Genomic Facility)中,按照www.affymetrix.com(Affymetrix,Santa Clara,CA)所述进行与Affymetrix U133plus2基因芯片(54,614探针设置,代表47,000个转录物)的杂交、染色、洗涤和扫描步骤。信号对数比值估计转录物变化的幅度和方向。使用以2为底的对数,因此1.0 的信号对数比值表示转录物水平增加2倍,-1.0表示降低2倍。0的信号对数比值表示无变化。
通过使用Ingenuity通路软件(IPA,Ingenuity Systems,www.ingenuity.com)按照生物进程将基因分类。将在抵抗和敏感之间差异性调节的基因覆盖在从Ingenuity通路知识库中所含信息发展而来的全局分子网络上。然后,基于连接性,运算生成差异性表达基因的网络,最终产生的网络是基因间分子关系的图形表示。出版的参考文献、书籍或权威信息储存在Ingenuity通路知识库(Sorensen G,BMC Genomics,2008,9:114;Kim SY et al.,Stat.Methods Med.Res.,2006,15:3-20),其支持所有描述的连接。
微阵列分析的实时定量PCR验证
使用大容量cDNA库试剂盒(Applied Biosystems)将1μg RNA用于产生cDNA,使用ABI PRISM 7700序列检测仪(Applied Biosystems)一式三份进行实时定量PCR。GAPDH和18S核糖体mRNA作为内部对照扩增。扩增用探针来自Applied Biosystems的Taqman基因表达检测(ASAH1:HS00602774_M1 Taqman探针,ASAH2:HS00184096_M1 Taqman探针和ASAH3:HS00370322_M1 Taqman探针,DUT:HS00798995_S1 Taqman探针,TYMS:HS00426591_M1 Taqman探针,UPP1:HS00427695_M1 Taqman探针,RRM2:HS00357247_G1 Taqman探针)。2-ΔΔCt法(Livak KJ.,Methods.2001;25:402-8)被用于计算每个基因的相对表达。
细胞培养和对ChoK抑制剂具有抗性的细胞系的产生
本研究中使用的所有细胞系都保持在温度(37℃)、湿度(95%)和CO2(5%)的标准条件下。人原代支气管上皮细胞NHBE(BEC)(Cambrex,CC-2541)生长在BEGM(支气管上皮细胞生长培养基)BulletKit(Cambrex,CC-3170)中。人原代乳腺上皮细胞HMEC(Clonetics,CC-2551)生长在补充了bullet kit(Clonetics,CC-3150)的MEBM培养基中。非小肺癌上皮细胞H460与H1299和小细胞肺癌上皮细胞系H510与H82保持在补充了10%胎牛血清(FBS)(Life Technologies,Grand Island,NY) 的RPMI中。
通过长时间持续暴露于渐增浓度的每种药物产生对MN58b和RSM-932A具有抗性的细胞系(分别鉴定为MN58R和RSM-932A-R)。不存在化合物的细胞系平行对照(H460储备)也同时保持培养。
细胞增殖测定
将细胞以6000细胞/孔的密度接种于96孔板(BD,Falcon,Bioscience,San Jose,CA,USA),并在标准条件下孵育24小时。然后,用不同浓度的ChoK抑制剂(每浓度一式四份)处理细胞并保持72小时。通过MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)法进行每孔中剩余细胞数的定量。在VersaMax微板酶标仪(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)上595nm处读取吸光度。对于酸性神经酰胺酶抑制剂的敏感化作用,在ChoK抑制剂处理之前,用对应于IC50的NOE预先处理细胞4小时。NOE(N-油酰乙醇胺)获自Calbiochem(La Jolla,CA,USA)。
异种移植物和体内肿瘤生长抑制测定
在即将接种前,将指定细胞在DMEM中重悬(106细胞/0.1ml),并皮下注射入nu/nu免疫抑制小鼠。在按照西班牙政府部门指导的标准实验室条件下饲养小鼠。当肿瘤达到0.1cm3的平均体积时,将小鼠随机分为对照组和治疗组。按照以下指定方案通过腹腔注射进行抗肿瘤剂(对于对照小鼠为介质)的治疗。通过测量大径(D)和小径(d)每周三次监测肿瘤,肿瘤体积按照V=(D*d2)/2来计算。使用SPSS软件v.13.0计算肿瘤生长显著改变的统计学分析。
使用膜联蛋白V进行的凋亡检测
通过流式细胞仪、使用Aposcreen膜联蛋白V凋亡试剂盒(Southern Biotech)按照厂商说明分析细胞死亡。在6孔板中以4×105细胞/孔接种细胞。24小时后,用指定化合物处理细胞。用冷PBS冲洗细胞2次,去除PBS后,将细胞在冷1×结合缓冲液中重悬至1×106-1×107细胞/mL的浓 度。将100μl的这些细胞收集在流式细胞仪管中,加入10μl膜联蛋白V。轻微漩涡振荡后,将管在冰上避光孵育15分钟。无需洗涤,将380μl1×结合缓冲液添加至每个样品,然后添加10μl碘化丙叮。立即用流式细胞仪分析细胞。
通过FACS进行的细胞周期分析
使用Beckton Dickinson FACs SCAN对固定于70%乙醇并用4μg/mL碘化丙叮染色的细胞(1×106)进行细胞周期分析。使用Cell Quest分析程序(Becton Dickinson)和FlowJo软件分析细胞计数数据。
细胞内神经酰胺水平的测定
将细胞以1×105细胞/孔接种在6孔板中,并且用[14C]-丝氨酸标记脂质2天。未更换标记的培养基处理细胞24小时。然后,提取脂质,并通过TLC、使用之前描述的方法(van Echten-Deckert,G.2000)Sphingolipid extraction and analysis by thin-layer chromatography(通过薄层层析的鞘脂提取和分析).Methods Enzymol,312,64-79)进行分析。脂质提取前,将细胞保持在-20℃。将细胞收获在甲醇中,并且以氯仿-甲醇-水的60∶30∶6(v/v/v)的最终比例提取脂质。于37℃、N2流下、在浓缩仪中干燥有机相。将样品在氯仿-甲醇(1∶1 v/v)中重悬,并施加在TLC板上。使用氯仿-甲醇-2M铵(60∶45∶4,v/v/v)的溶剂混合物分离脂质。通过Instantimager(Pakard,Meriden,CT,USA)进行定量。
LC-MS神经酰胺和二氢神经酰胺分析
以8×105细胞/p100板的密度接种细胞。24小时后,用指定化合物处理细胞。然后,用PBS洗涤细胞,并通过短暂胰酶作用收集细胞。将小份细胞用于蛋白测定。制备并分析鞘脂提取物,所述提取物用内部标准(N-十二烷酰鞘氨醇、N-十二烷酰葡糖基鞘氨醇和N-十二烷酰鞘氨醇磷酰胆碱,每种0.5nmol)确证。由Waters Aquity UPLC***连接Waters LCT Premier正交加速飞行时间质谱(Waters,Millford,MA)构成的液相色谱-质谱以正离子电喷雾电离模式运行。获取50-1500Da的全扫描谱,将单独的谱相加以产生每0.2s的数据点。使用通过LockSpray干扰的独 立参考喷雾来保持质量的准确性和可重复性。分析柱为100mm×2.1mm id,1.7μm C8 Acquity UPLC BEH(Waters)。两个流动相为A相:MeOH/H2O/HCOOH(74∶25∶1 v/v/v);B相:MeOH/HCOOH(99/1 v/v),A相和B相都还含有5mM甲酸铵。设定梯度程序-0.0分钟,80%B;3分钟,90%B;6分钟,90%B;15分钟,99%B;18分钟,99%B;20分钟,80%B。流速为0.3mL min-1。柱保持在30℃。使用每种化合物提取的离子层析谱,使用50mDa窗进行定量。通过标准混合物上样来测定线形动态范围。化合物的阳性鉴定是基于与标准(±2%)相比的误差<5ppm的准确的质量测量及其LC保留时间。
通过Western印迹测定蛋白表达
使用每种相应的抗体进行等量细胞裂解物(30μg)的Western印迹分析。通过在10%SDS-PAGE凝胶上进行电泳解析蛋白,并转移至硝酸纤维素。将印迹在配制在T-TBS中的5%无脂干燥乳中封闭2小时。使用获自BD Transduction Laboratories的单克隆抗体(1∶250)(Ref.6123012)进行ASAH1的测定。作为上样对照,检测印迹的α-微管蛋白(Sigma T9026)。使用抗半胱天冬酶-3和抗PARP的抗体(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)进行半胱天冬酶-3和PARP的测定。
联合指数测定
将如上文所述的MTT生长测定用于评价顺铂与ChoK抑制剂的联合。过夜孵育后,添加不同浓度的顺铂并孵育3小时。然后,添加渐增浓度的ChoK抑制剂孵育40小时,然后,将细胞在新鲜培养基中再培养24小时。使用Chou Talalay的等效线图解联合指数方法(Chou TC.et al.,Trends Pharmacol Sci,1983,4:450-4)在协同作用、加成作用或拮抗作用的方面分析联合测定的结果。从已有描述(Chou TC.et al.,同上)建立CI的范围。联合指数(CI)<1表明两种试剂间的协同相互作用,CI=1表明加成相互作用,CI>1表明两种试剂间的拮抗作用。协同效应被认为是CI<1.0的相互作用。以一式四份进行所有实验。
统计学分析
使用标准Pearson卡方统计确定事件发生率的关联。所有报道的P值均是双侧的。统计学显著性被定义为P<0.05。使用SPSS软件版本13.0(Inc,Chicago,Illinois)进行统计学分析。
实施例1
NSCLC患者中对MN58b的ChoK抑制的固有药物抗性
为了鉴定对MN58b的ChoK特异性抑制的药物抗性的假定机制,我们在来自马德里(西班牙)La Paz医院的84名非小细胞肺癌(NSCLC)患者中进行了临床前研究。为此,建立了来自这些患者切除的肿瘤的原代培养物并培养10天,其中用最高至20μM的渐增浓度的ChoK特异性抑制剂MN58b处理细胞,20μM代表从人肺肿瘤产生的数种肿瘤来源的细胞系的IC50的7-50倍(参见表6)。如图1所示,观察到对于该处理的不同反应。一方面,39个样品(46,4%)的一组对MN58b为完全抵抗,因为几乎100%的细胞在第10天在最大药物浓度下仍然存活。另一方面,另外的45个肿瘤(53,6%)对于MN58b的抗增殖效应是敏感的。其中,15个样品的一组被认为是对MN58b高度敏感的(33,3%),因为在第10天即使在低药物浓度下细胞活力仍被完全废除。最后,30个样品的一组(66,7%)被认为是对MN58b部分敏感的,在治疗结束时仍有约50%的细胞存活。
此外,还用NSCLC中使用的常规治疗(Belani CP,Lung Cancer.2005,50 Suppl 2:S3-8)处理这些患者的肿瘤的原代培养物。因此,用顺铂处理这些患者的62个样品的细胞活力,用泰素处理相同的62个样品,还用吉西他滨处理这些样品中的52个,用长春瑞滨处理39个。如表3所示,发现MN58b在这些条件下是最有效的抗癌药物,因为55,5%对药物是敏感的,然后是具有50%肿瘤响应的顺铂。
表3.NSLCL肿瘤对某些化疗剂的抗性的发生率。
此外,进行了不同药物间抗性相关性的统计学分析。对顺铂的抗性与对泰素、长春瑞滨和吉西他滨的抗性显著相关。当分析对泰素的抗性时也观察到相似的结果。此外,对长春瑞滨的抗性与对顺铂和泰素抗性相关,并且对吉西他滨的抗性与对泰素的抗性相关。然而,反应与对任何其它化疗剂的抗性不相关的唯一药物是MN58b(表4)。
表4.NSCLC患者的肿瘤中对化疗剂的抗性之间的相关性
*0.05的统计学显著性(双侧)
**0.01的统计学显著性(双侧)
这些结果提示不响应于任何这些抗肿瘤治疗的NSCLC患者可以有效响应于基于ChoK抑制的治疗,因为其抗性机制不同于研究的其它4中药物的抗性机制。另一方面,这些结果还提示存在对于ChoK抑制的特定化学抗性***。
实施例2
NSCLC中对ChoK抑制的药物抗性机制的鉴定
为了研究对ChoK抑制具有固有抗性的肿瘤与对ChoK抑制敏感的肿瘤的基因差异,我们分析了代表性NSCLC患者的肿瘤的转录特征。我们使用Affymetrix基因芯片人基因组HG-U133 plus 2微阵列来比较5名对MN58b具有抗性的肿瘤患者的一组与5名对该治疗高度敏感的肿 瘤患者的另一组。该微阵列平台包含54.614探针设定,代表47.000个转录物。考虑到-2≤倍数变化≥2(-1≤信号比≥1),与应答者相比,抗性肿瘤样品中912个合格的转录物表现出显著差异性调节。为了说明差异性表达基因的生物学显著性,使用Ingenuity通路分析(IPA,Ingenuity***)(Sorensen G.,BMC Genomics.2008,9:114)进行基因本体分析。
进一步研究了发现被调节的那些基因之间的相互作用,并且发现32个软件指定的评分超过20的应答者中差异性调节的网络,这表明这些基因在输入数据集中的关联和它们之间良好的连接性。顶端通路(Top pathway)表明参与这些网络的基因的主要功能与细胞周期、细胞死亡、癌症、免疫应答、直脂质代谢和药物代谢有关。
为了避免由于微阵列中存在的大量转录物而产生的假阳性率,我们使用了称为“B”的第二统计学分析,其允许进一步过滤在整个实验中差异性表达具有统计学显著性的基因(Kim SY.,Stat Methods Med Res.,2006,15:3-20)。在该实验中,使用人样品使得该分析是高度限制性的,发现50个基因达到标准(B>0)。18个基因在两种分析中是一致的(2倍差异性表达并且B>0),其中4个在被认为是对MN58b具有抗性的样品中过表达,14个下调。在这些基因中,根据这两种分析,酸性神经酰胺酶(ASAH1)在抗性样品中显著上调。
实施例3
对MN58b具有抗性的肿瘤NSCLC细胞系中酸性神经酰胺酶的表达
如上所述,酸性神经酰胺酶(ASAH1)是参与脂质代谢的酶,发现其在对MN58b具有抗性的那些肿瘤中按照任何选择标准都是显著过表达的。
通过微阵列详细研究了MN58b NSCLC抗性细胞系中不同神经酰胺酶的行为。如表5所示,对MN58b具有抗性的NSCLC肿瘤中被调节的神经酰胺酶仅为酸性神经酰胺酶。此外,我们观察到,尽管按照B统计不是显著的模式,似乎与酸性神经酰胺酶具有相同的位置和功能的称为酸性神经酰胺酶样蛋白的鉴定出的酶在抗性样品中也是上调的(表5)。
表5.微阵列分析测定的不同神经酰胺酶的基因表达特征。
基因表达的中间值。微阵列中存在的不同探针或数据。
NC:无差异性改变。*统计学显著性。
为了证实微阵列分析中所观察到的改变与ASAH1基因表达的真实改变相对应,进行了使用对于该基因特异性的taqman探针的实时定量PCR(Applied Biosystems检测Hs00602774_m1),并且也对作为阴性对照的中性和碱性神经酰胺酶(分别的Applied Biosystems检测Hs00184096_m1和Hs00370322_m1)进行了实时定量PCR。为此,用于微阵列分析的抗性肿瘤和应答肿瘤的5个样品以及每种情况的新的一批5个其他的患者样品被用于该分析。实时PCR发现:ASAH1在抗性肿瘤中是差异性表达的,ASAH2或ASAH3却不是这样,这证实了微阵列分析中获得的结果(图2)。这些结果证实酸性神经酰胺酶在对ChoK抑制具有抗性的肿瘤患者中是特异性上调的,并且酸性神经酰胺酶是对ChoK抑制的抗性机制所提出的模型的基础(图3)。因此,特异性抑制剂(ChoKI)对ChoK活性的抑制导致PCho水平降低。作为结果,产生PCho的备选途径被激活,主要在于鞘磷脂酶(SMLase)的增加的活性。该酶产生PCho和神经酰胺。后一代谢物是细胞死亡的强诱导剂。如果负责将神经酰胺转化为鞘氨醇的酶的活性增加,则可以产生对ChoKI作用的抗性。该酶是酸性神经酰胺酶(ASAH1)(图3)。
实施例4
对酸性神经酰胺酶的抑制使NSCLC细胞对ChoK抑制剂敏感化
首先,研究了4个人肺肿瘤细胞系(H460和H1299作为NSCLC细胞系;H510和H82作为SCLC)中ASAH1的水平。如图4所示,SCLC来源的细胞系表现出的酸性神经酰胺酶水平相似于老化的对照BEC细胞中所发现的水平,但大大低于NSCLC细胞中所发现的水平。有趣的是,这些SCLC细胞系还表现出最高的胆碱激酶α水平,并且与NSCLC细胞相比,对ChoK抑制的敏感性要高得多(表6),这提示低水平的酸性神经酰胺酶可能是SCLC细胞对ChoK抑制剂非常高的反应的至少部分原因。
表6.不同人肺癌来源的细胞系对Chok抑制的敏感性。
细胞系 | IC50 48h | IC50 72h | IC50 144h |
原代BEC | 40.5±6.2 | 18.3±4.8 | 4.2±0.8 |
原代HMEC | 44.7±4.95 | 20.9±2.7 | 3.4±0.13 |
H1299 | 10.3±2.5(4) | 2.7±0.7(8) | 0.9±0.1(4) |
H460 | 7.03±2.03(6) | 2.6±0.8(8) | 1.1±0.1(3) |
H510 | 1.1±0.1(41) | 0.4±0.05(53) | 0.1±0.03(27) |
H82 | 1.9±0.2(24) | 0.8±0.04(27) | 0.27±0.01(12) |
因此,破坏酸性神经酰胺酶水平可以允许ChoK抑制剂在这些细胞中具有更好的作用。为了证实该假设,我们使用了先前已被表征过的酸性神经酰胺酶抑制剂N-油酰乙醇胺(NOE)(Grijalvo S.,Chem Phys Lipids.2006;144:69-84)来研究抑制酸性神经酰胺酶是否能使肿瘤细胞系对ChoK抑制剂敏感化。为此,用NOE预先处理H460细胞3小时以抑制酸性神经酰胺酶。然后,用渐增浓度的ChoKα抑制剂MN58b和RSM-932A处理细胞,并且测定了总细胞群体中50%受到影响时的浓度(IC50)。如表7所述,用酸性神经酰胺酶抑制剂NOE预先处理H460细胞使细胞对ChoKα抑制敏感化。这些结果符合我们关于增加的酸性神经酰胺酶水平可能赋予对ChoK抑制的药物抗性的假设。
表7.用NOE抑制酸性神经酰胺酶使人NSCLC细胞对ChoK抑制敏感化(对MN58b产生4,7倍;对RSM-932A产生3,2倍)。
H460 | NOE | MN58b | NOE+MN58b | RSM-932A | NOE+RSM-932A |
IC5072h | 32,5μM | 0,28μM | 0,06μM | 1,11μM | 0,35μM |
为了证实这些结果,我们使用另一已知酸性神经酰胺酶抑制剂 CAY10466(CAY)(D-NMAPPD(1R,2R)-B13;10006305 Cayman Chemical)(表2中第VIII项)和作为阴性对照的碱性神经酰胺酶抑制剂D-赤式-MAPP(DMP)(10165 Cayman Chemical)进行了另外的实验。用这些化合物预先处理H460细胞3小时以抑制神经酰胺酶。然后,用渐增浓度的ChoKα抑制剂MN58b和RSM-932A处理细胞,并且测定了总细胞群体中50%受到影响时的浓度(IC50)。如表8所示,用酸性神经酰胺酶抑制剂D-NMAPPD预先处理H460细胞使细胞对ChoKα抑制敏感化,而D-赤式-MAPP无此作用。这些结果符合我们关于增加的酸性神经酰胺酶水平可能赋予对ChoK抑制的药物抗性的假设。此外,ChoK抑制剂和酸性神经酰胺酶抑制剂的联合使用提供更强的抗癌活性。
表8.与用碱性神经酰胺酶特异性抑制剂D-赤式-MAPP(DMP)抑制碱性神经酰胺酶相比,用酸性神经酰胺酶特异性抑制剂CAY10466(CAY)抑制酸性神经酰胺酶使人NSCLC细胞对ChoK抑制敏感化(对MN58b产生4,3倍;对RSM-932A产生5倍)。
实施例5
对ChoK抑制剂具有抗性的NSLC细胞的产生
为了进一步研究对ChoK抑制的抗性机制以及酸性神经酰胺酶在该效应中的作用,我们使用人NSCLC来源的H460细胞系进行一系列体外实验。按照MN58b和第二代ChoKα抑制剂RSM-932A的轻度渐增的剂量周期将该细胞系保持培养9个月,我们建立了具有对这些ChoKα抑制剂的获得性抗性的新细胞系。还通过将H460保持培养相同的时间而不 进行处理建立了对照细胞系(H460储备)。因此,所建立的对MN58b(H460 MN58R)具有抗性的和对RSM-932A(H460 RSM-932A-R)具有抗性的细胞在正常H460细胞或对照H460储备细胞受到明显影响的浓度下不会受到影响。因此,在这些抗性细胞中用MN58b和RSM-932A抑制50%的细胞增殖所需的浓度(IC50)显著高于对照细胞中所观察到的IC50(表9)。此外,我们发现两种ChoK抑制剂之间的强交叉抗性,预计是由于这两种抗肿瘤药物作用的相似机制(表9)。
表9.具有对ChoK抑制剂的获得性抗性的产生的H460细胞系对ChoK抑制剂和顺铂的敏感性
为了证实对响应于ChoKα抑制剂的死亡的耐受性是否是由于酸性神经酰胺酶水平的增加,我们进行了QT-PCR和Western印迹分析来测定这些细胞中该酶的水平。与之前的结果一致,与对照H460储备细胞相比,在对ChoK抑制具有抗性的细胞中基因表达和蛋白水平是过表达的(图5)。
实施例6
ChoK抑制剂和顺铂之间的非交叉抗性
如上文所述,在来自NSCLC患者的肿瘤原代培养物中进行的对不同化疗剂的反应者的相关性统计学分析表明:对MN58b的抗性与对任何其它受试抗癌药物的抗性不相关(表4)。为了证实获自患者样品的数据和确定对ChoK抑制的抗性机制与对NSCLC治疗中常规使用的其它抗肿瘤药物的抗性无关,我们分析了顺铂在建立的对ChoK抑制具有抗性的细胞中的抗增殖作用。如表10所示,H460 MN58R和H460 RSM-932AR对顺铂的抗增殖作用比母体H460细胞更敏感。这些结果提 示对ChoK抑制的抗性的获得经历可能是与酸性神经酰胺酶过表达相关的特定机制,并不会干扰诸如顺铂的其它抗癌药的作用机制。
表10.对ChoK抑制剂具有抗性的细胞比母体人NSCLC细胞对顺铂更敏感。
IC50(ug/mL) | |
细胞系 | 顺铂 |
H460 | 5 |
H460储备 | 4,5 |
H460 MN58R | 2(0,4) |
H460 RSM-932AR | 1,5(0,3) |
实施例7
NSCLC中顺铂和ChoK抑制剂的联合治疗的有效性
上文所示结果提示ChoK抑制剂可被用作不响应于顺铂的NSCLC患者的抗肿瘤剂,并且反之亦然。然后,分析了ChoK抑制剂和用顺铂进行的常规基于铂的治疗的联合治疗的潜在效应。使用MTT测定、在NSCLC细胞系H460中评价了顺铂加ChoK抑制剂MN58b和RSM-932A对细胞活力的影响。进行了相继处理,其中给予顺铂3小时,然后给予ChoK抑制剂40小时。使用Chou Talalay的等效线图解联合指数法(Chou et al.,同上)分析结果。如图6所示,在H460细胞中,在顺铂与MN58b或RSM-932A ChoK抑制剂之间都观察到强的协同(CIs<0.5)生长抑制(分别为CI=0.1和CI=0.4),这表明这两种治疗的联合可以在控制NSCLC肿瘤生长中产生显著的优势。
为了证实这两种治疗的联合可以在控制NSCLC肿瘤生长中得到显著的优势,进行了使用NSCLC异种移植物的体内实验。根据体外实验的发现,进行了体内相继治疗,其中第一周给予顺铂(一周两次),然后是两周的ChoK抑制剂治疗(一周三次)。还包括在三周中同时进行MN58b和顺铂治疗的另外一组。如图7所示,在H460异种移植物中,在顺铂和MN58b(图7A)或RSM-932A(TCD-717)(图7B)ChoK抑制剂之间都观察到强的协同生长抑制,但没有增加的毒性(图7C),这表明这两种治疗的联合可以在控制NSCLC肿瘤生长中产生显著的优势。
应当注意到,如果单独使用顺铂获得与使用联合方案相同比例的抗肿瘤活性,顺铂的浓度需要变为4倍,并且观察到诸如体重丢失的毒性临床指征(图7D)。因此,顺铂和ChoK抑制剂的相继联合治疗导致了强的抗肿瘤效应,同时将毒性降低至微弱的水平,所述水平与使用降低2倍的化疗剂浓度时所获的水平相似。
实施例8
胆碱激酶抑制剂和TRAIL在结肠癌来源的细胞系中协作诱导细胞死亡
为了研究RSM-932A和TRAIL的抗肿瘤活性是否遵照相似或不同的作用机制,测试了胆碱激酶抑制剂(ChoKI)和TRAIL的组合在肿瘤细胞的细胞毒性中的协作效应。为此,使用了5种结肠癌来源的细胞系:DLD-1、HT-29、HCT-116、SW620和SW480。
为此,在处理前24小时,将细胞以1×104细胞/孔的密度接种于96多孔板。用不同浓度的RSM-932A(ChoKI)或TRAIL处理细胞不同时间,并使用MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑]比色测定将细胞增殖进行定量。
结果表明:对ChoKI的敏感性在所有分析的细胞系中非常相似(图8A)。然而,对TRAIL的敏感性对于所有细胞系也非常相似,除了SW620,SW620对TRAIL处理几乎是抵抗的(图8B)。然后,用TRAIL处理已经用ChoKI预先处理2小时而足以达到对胆碱激酶的有效抑制的相同细胞系,持续24小时。当单独用ChoKI或TRAIL处理DLD-1细胞时,按照观察到的细胞死亡的百分比测定,细胞毒性分别为53%和12%。当联合两种药物时,毒性增加至75%细胞死亡(图9A)。在HT-29细胞中,ChoKI和TRAIL诱导的细胞毒性分别为48%和18%,而联合时细胞毒性增加至81%(图9B)。在对TRAIL具有抗性的SW620细胞中,ChoKI细胞毒性为9%,而联合时细胞毒性增加至41%(图9C)。通过Western印迹分析证实了该结果,因为当TRAIL和胆碱激酶抑制剂联合时,还存在PARP降解或半胱天冬酶3活化的增加(图9D)。
使用Chou Talalay的等效线图解联合指数法(Chou et al.,同上)分析在 本实施例中指定为ChoKI的RSM-932A(TCD-717)和TRAIL之间的协作结果。如图10所示,在这些化合物之间观察到强的协同(CIs<0.5)生长抑制(对于DLD-1CI=0.19,对于HT-29CI=0.12,对于SW620CI=0.085),这表明这两种治疗的联合可以在控制结肠肿瘤生长中产生显著的优势。在DLD-1和SW620细胞中使用ChoK抑制剂MN58b验证了这些结果,获得了相似结果(分别为CI=0.10和CI=1.15)(图10)。
还通过流式细胞仪分析体外观察到的协同作用,其中使用膜联蛋白V和IP染色来区分凋亡和坏死或晚期凋亡。用MN58b处理7小时后,DLD-1细胞的凋亡仅有少量增加,因为MN58需要多于7小时来诱导肿瘤细胞死亡。当单独用TRAIL处理DLD-1细胞时,存在35%的凋亡。在联合时,肿瘤细胞死亡增加至50%。当用RSM-932A(TCD-717)和TRAIL联合处理DLD-1时,肿瘤细胞死亡增加55%,但主要是坏死或晚期凋亡群体,因为RSM-932A(TCD-717)具有快于MN58的作用。在对TRAIL具有抗性的SW620中,当与MN58联合时凋亡群体也增加至35%。当TRAIL与RSM-932A(TCD-717)联合时,处理7小时后坏死或晚期凋亡群体增加,并且存在59%的总细胞死亡(图11),这证实了结肠癌细胞中TRAIL和ChoK抑制剂联合的协同效应。
TRAIL是肿瘤坏死因子(TNF)超家族的成员,并且可以通过刺激死亡受体DR4(TNFRSF10A或TRAIL-R1)和DR5(TNFRSF10B或TRAIL-R2)的外部途径诱导凋亡。为了确定TRAIL和ChoK抑制剂联合处理的功效的,通过定量PCR分析了用MN58b、TRAIL或其同时联合处理的DLD-1和SW620细胞系中DR5和DR4的水平。对于DR4水平,未发现显著改变,但是MN58b处理增加DR5水平,导致了SW620细胞系中增加2倍并且DLD-1细胞系中增加1.6倍(图12),这可以解释在ChoK抑制剂和TRAIL之间观察到的协同效应的作用机制。
MN58b和TRAIL已被描述为能增加细胞内神经酰胺水平。为了研究该***中的神经酰胺生成,在用MN58或TRAIL处理DLD-1细胞前,用[14C]-丝氨酸标记细胞内脂质48小时。提取后,通过薄层层析分析脂质并进行定量。如图13中所示,当MN58b和TRAIL同时联合时,神经酰胺水平增加3倍。此外,之前已有的描述是,SW620对TRAIL的 抗性与神经酰胺信号转导的缺陷相关,并可以由外源神经酰胺克服。因此,处理后SW620中C16-神经酰胺未增加。为了研究ChoK抑制是否与产生C16-神经酰胺相关,通过液相色谱和质谱分析了神经酰胺种类,当MN58b和TRAIL联合时获得了C16-神经酰胺增加50%(图13)。
最后,还使用裸小鼠中的异种移植物模型进行了体内联合治疗。当肿瘤达到0.15cm3的体积时,开始同时联合治疗。每组包括10只小鼠。星期一、星期三和星期五用MN58b(2mg/kg)治疗小鼠,星期二和星期四用20mg/kg TRAIL治疗小鼠。如图14所示,治疗三周后,在DLD-1和SW620异种移植物中分别获得68%和75%的肿瘤生长抑制,这证实了体外实验中所观察到的强协同作用。
实施例9
胆碱激酶抑制剂和5-FU协作诱导结肠癌来源的细胞系中的细胞死亡
此外,还分析了ChoK抑制剂和结肠癌中基于5-氟尿嘧啶(5-FU)的常规治疗的联合治疗的潜在效应。使用MTT测定、在DLD-1、SW620和HT-29细胞中评价了5-FU加ChoK抑制剂MN58b和RSM-932A(TCD-717)对细胞活力的影响。最佳联合选择被鉴定为同时治疗或如下的相继治疗:短的给予ChoK抑制剂的时间(9-24小时),然后是较长的给予5-FU的时间(48-72小时)。使用Chou Talalay的等效线图解联合指数法(Chou et al.,同上)分析了结果。如图15所示,在所有分析的人结肠癌细胞中,在5-FU和MN58b或RSM-932A ChoK抑制剂之间都观察到对生长抑制的协同效应,这表明这两种处理的联合可以在控制结肠肿瘤生长中产生显著的优势。
还通过流式细胞仪分析验证了这些结果。如图16所示,细胞周期分析不仅说明即使使用低浓度的这些试剂联合治疗也导致细胞死亡的显著增加,而且还说明ChoK抑制剂表现出在细胞周期的G0/G1期中的作用,按照已有报道,5-FU通过影响细胞周期的G2/M期发挥其作用。这些结果为以下提供了证据:当进行为了使细胞对5-FU抗增殖效应敏感化的联合治疗时,需要用ChoK抑制剂预先治疗。
为了进一步研究ChoKI使5-FU抗肿瘤效应敏感化的机制,使用affymetrix技术、进行了用MN58b和RSM-932A处理不同时间的H460细胞中5-FU-代谢通路的基因表达分析。如表11所示,该通路的某些基因受到ChoK抑制剂显著且共同的影响,这提示ChoK抑制剂的预先处理改变了增强5-FU效应的酶的表达。
表11.通过affymetrix基因表达检测测定的用ChoK抑制剂处理的H460细胞中5-FU代谢通路的基因表达分析。
因为H460是NSCLC来源的细胞,使用QT-PCR技术在3种不同结肠来源的癌细胞中证实了这些结果,这是为了确定5-FU诱导细胞死亡增强的该机制是否是细胞依赖性的,以及该通路基因表达水平的改变是否可以解释结肠癌***中发现的ChoKI敏感化作用。如表12所示,该通路在所有分析的癌细胞中发生了相似程度的显著改变,这提示对5-FU代谢的改变可能是该联合治疗的作用机制。
表12.DLD-1、HT29和SW62结肠癌细胞中,用ChoK抑制剂RSM-932A(932A)和MN58b(MN58b)处理后的5-FU代谢通路基因(DUT:脱氧尿苷三磷酸酶;RRM:核糖核苷酸还原酶;TYM:胸苷酸合成酶;UPP:尿苷磷酸化酶1)表达改变的PT-PCR验证。DR(下调);UR(上调)
DLD-1 | DUT | RRM | TYM | UPP |
932A | DR | DR | DR | UR |
MN58b | DR | UR |
HT29 | DUT | RRM | TYM | UPP |
932A | DR | DR | DR | UR |
MN58b | DR | DR | DR |
SW62 | DUT | RRM | TYM | UPP |
932A | DR | DR | DR | UR |
MN58b | DR | DR | UR |
最后,为了证实这两种治疗的联合可以在控制NSCLC肿瘤生长中产生显著的优势,进行了使用两种不同结肠异种移植物的体内实验。根据体外实验的发现,在体内进行了同时治疗或如下的相继治疗:第一周给予ChoK抑制剂MN58b或RSM-932A(一周三次),然后是两周体内5-FU治疗(一周两次)。如图17所示,使用DLD-1和SW620异种移植物时都观察到5-FU和ChoK抑制剂之间的强的协同生长抑制,这提示这两种治疗的联合可以在控制结肠肿瘤生长中产生显著的优势。
Claims (9)
1.组合物,其分开包含或合在一起地包含第一组分和第二组分,所述第一组分包含一种或多种特异性针对胆碱激酶α异形体的胆碱激酶抑制剂,其中所述胆碱激酶抑制剂选自以下的表1中的I和II的化合物,并且所述第二组分选自(i)一种或多种酸性神经酰胺酶抑制剂,其中所述酸性神经酰胺酶抑制剂选自以下的表2中的VI和VIII的化合物;(ii)一种或多种化疗剂,其中所述化疗剂选自顺铂和5-氟尿嘧啶;和(iii)一种或多种死亡受体配体,其中所述死亡受体配体为TRAIL,
2.药物组合物,其包含权利要求1所述的组合物和药学可接受的载体或赋形剂。
3.用于医药的权利要求1所述的组合物。
4.用于治疗癌症的权利要求1所述的组合物。
5.如权利要求4所述的组合物,其中所述癌症是非小细胞肺癌或结肠癌。
6.特异性针对胆碱激酶α异形体的ChoK抑制剂和酸性神经酰胺酶抑制剂的组合在制备用于治疗对ChoK抑制剂治疗具有抗性的癌症患者的药物中的用途,其中来自所述患者的样品中酸性神经酰胺酶的水平高于参考样品,其中所述癌症是非小细胞肺癌或结肠癌,其中所述胆碱激酶抑制剂选自以下的表1中的I和II的化合物,所述酸性神经酰胺酶抑制剂选自以下的表2中的VI和VIII的化合物,
7.如权利要求6所述的用途,其中所述样品是肿瘤样品。
8.第一组分和第二组分在制备治疗癌症的药物组合物中的用途,所述第一组分包含一种或多种特异性针对胆碱激酶α异形体的胆碱激酶抑制剂,其中所述胆碱激酶抑制剂选自以下的表1中的I和II的化合物,并且所述第二组分选自(i)一种或多种酸性神经酰胺酶抑制剂,其中所述酸性神经酰胺酶抑制剂选自以下的表2中的VI和VIII的化合物;(ii)一种或多种化疗剂,其中所述化疗剂选自顺铂和5-氟尿嘧啶;和(iii)一种或多种死亡受体配体,其中所述死亡受体配体为TRAIL,
9.如权利要求8所述的用途,其中所述癌症是非小细胞肺癌或结肠癌。
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