CN102213702A - 液质联用检测贝肉中腹泻性贝毒的方法 - Google Patents

Abstract

针对现有液质联用技术检测DSP存在样品前处理复杂、工作量大、成本高、耗时多的问题。研究了贝样中DSP的快速提取流程，应用液质联用技术中的UPLC/Q-TOFMS检测，并将其用于市售海产贝类的实际检测，以期为有毒赤潮研究和食品安全检验提供高效、准确的检测技术。

Description

液质联用检测贝肉中腹泻性贝毒的方法

技术领域

本发明涉及液质谱联用技术，具体来说，涉及液质联用技术(UPLC-MS)检测贝肉中腹泻性贝毒。

背景技术

在世界很多国家都爆发过有害的赤潮，海洋贝类可在体内富集赤潮藻毒素并通过食物链对人和动物产生危害。广泛调查显示，中国双壳贝类已经受到了赤潮藻毒素的污染，其中腹泻性贝毒(DSP)存在比较普遍。DSP是由有毒赤潮藻类鳍藻属Dinophysis和原甲藻属Prorocentrum中部分藻种产生的一类脂溶性天然化合物，其主要成分为软海绵酸(okadaic acid，OA)及鳍藻毒素DTX1。OA、DTX1是肿瘤促进因子，具有遗传毒性，可导致DNA加合物的形成。如果贝肝脏内OA和DTX1的含量分别超过2μg/g和1.8μg/g，就不宜食用。欧盟对OA、DTX1采用的食品安全限量标准分别是20μg/100g、16μg/100g贝类鲜肉。因此，建立快速、准确的DSP检测技术对食品安全和赤潮监测都具有十分重要的意义。

常用的DSP检测方法有小鼠生物法、ELISA、免疫金标、HPLC法等。生物法和免疫法不稳定，常伴有假阳性、假阴性结果。OA、DTX1没有紫外吸收，单纯HPLC检测样品需经繁琐的衍生过程，检测时间长，误差大。

液-质联用技术可确证分析藻类和贝类中的各种生物毒素，但对样品前处理要求高，前处理繁琐且耗时长是液质联用检测的缺陷。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，克服现有液质联用技术检测DSP中的OA和DTX1是样品前处理复杂、耗时长的缺陷，应用超高效液相色谱四级杆飞行时间质谱(UPLC/Q-TOFMS)快速检测OA和DTX1，并将其用于市售海产贝类的检测，以期为有毒赤潮研究和食品安全检验提供快捷、高效的检测技术。

本发明所要解决的技术问题在于，液质联用快速检测贝肉中腹泻性贝毒的方法，包括如下步骤：

(1)贝类样品的制备：将贝样匀浆，加入75-85％甲醇水溶液，混匀振荡后，4℃离心，上清液加入正己烷萃取后，合并甲醇相，加入含乙酸的水，用三氯甲烷重复萃取，最后通入N₂蒸干去掉有机相；

残渣用甲醇再溶解定容，高速离心或过滤膜，待UPLC/MS检测；

(2)UPLC/Q-TOFMS分析：ESI^-模式，选择离子化后的OA、DTX1的分子离子[M-H]^-作为前体离子进行T0FMS扫描、测定；

①色谱条件

超高效液相色谱仪：UPLC Acquity BEH

色谱柱：2.1mm×100mm，1.7μm；

流动相：A相为含甲酸的水，B相为含甲酸的乙腈；

梯度洗脱：采用A∶B从0min的85∶15到25min的1∶99；

流速：0.2～0.5mL/min；

柱温：35～40℃；

进样量：20μL；

②质谱条件

离子源：ESI^-电离源，

喷雾电压：2～2.6kV，

雾化气流量：500～800L/h，

去溶剂温度：300～350℃，

离子源温度：100～150℃，

碰撞能量：3～4eV；

扫描时间0.3s，扫描间隔时间：0.02s，扫描范围m/z 50-1500；选取亮氨酸脑啡呔用于外标校正。

(3)OA和DTX1标准曲线的制作，求出回归方程和相关系数，结果显示：OA和DTX1的标准曲线分别为y＝0.2504x-0.978，R²＝0.999；y＝0.2417x-0.557，R²＝0.998，其中，x为峰面积，y为浓度，根据标准曲线以确定被检查贝类中OA和DTX1的含量。

为了使实验数据更加精确，所述的步骤还包括回收率实验。

优选地，所述的步骤(1)贝类样品的制备中，将贝样匀浆，加入75-85％甲醇水溶液，漩涡混匀1-3min，超声振荡1-3min，5000r/min，4℃离心5min；上清液加入正己烷，漩涡混匀，静置分层弃去上层正己烷，合并甲醇相，加入含0.2％乙酸的水，用三氯甲烷重复提取，合并下层的三氯甲烷相，用旋转蒸发仪通入N₂蒸干去掉有机相；

残渣用甲醇再溶解定容，高速离心10000r/min，10min，待UPLC/MS检测。

优选地，所述的步骤(1)中，残渣用甲醇再溶解后定容，过滤膜；待UPLC/MS检测。

本发明具有以下优点：

1、应用范围广。赤潮爆发季节贝类中的腹泻性贝毒(DSP)的存在比较普遍，不论是保障食品安全还是赤潮监测都需要针对DSP的快速、准确的检测方法。因此本研究具有重要应用价值。

2、液-质联用可准确分析藻类、贝类中的生物毒素，及时有效地监测毒素的污染情况。应用UPLC/Q-TOFMS检测DSP中的OA和DTX1有如下优势：与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度要高数倍。Q-TOF MS兼具高灵敏度、高分辨率的特点，可以在极低的浓度下作全谱扫描、提供精确质量，能对微量腹泻性贝毒OA、DTX1进行鉴别和测定。

3、样本预处理快，相对于传统的液质联用检测，单个样本预处理时间节省0.5-1h。经比较选择贝肉样，提取流程经简化，再比消化腺样本节省提取时间约1h。

4、仪器自动进样，适于大批量生物样品的筛查。

5、UPLC/Q-TOFMS可以对样本中的其它未知毒素进行鉴定。

具体实施方式

为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合实施例对本发明作进一步阐述。

在液质联用快速检测贝肉中腹泻性贝毒的应用中，首先根据实施示例中样本快速前处理流程提取DSP，研究UPLC/Q-TOFMS对DSP粗体液的分析检测效果；针对贝肌肉样和消化腺样，再研究比较碱水解处理对染毒文蛤消化腺样本和肌肉样本中OA和DTX1含量的影响。结果表明，UPLC/Q-TOFMS能检测分析快速提取样本中的DSP，碱水解后染毒文蛤消化腺中OA和DTX1的含量相对于水解前剧烈增加，肌肉中毒素含量略有增加。鉴于水解过程耗时长(约1h/样本)，为简化预处理，决定选择肌肉样本，不经水解，可实现贝样的快速前处理。

实施例：

1.称取2g已匀浆人工投喂染毒的文蛤肌肉样品于10ml离心管中，加入3mL 80％甲醇水溶液。漩涡混匀1min，超声振荡1min，4℃离心(5000r/min，5min)。上清液移入另一干净离心管，残渣再按上述方法提取一次。合并上清液，加入5mL正己烷，漩涡混匀，静置分层弃去上层正己烷，重复一次，合并甲醇相，加入1ml水(含0.2％乙酸)，用6ml三氯甲烷重复提取两次，合并下层的三氯甲烷相，用旋转蒸发仪通入N₂蒸干去掉有机相，残渣用HPLC级甲醇再溶解，并定容至1ml(相当与2g肌肉/ml)。高速离心(10000r/min，10min)或过0.22μm滤膜，待UPLC/MS检测。

2.UPLC/Q-TOFMS分析：电喷雾负离子模式，选择离子化后的OA、DTX1的分子离子[M-H]-作为前体离子进行T0FMS扫描、测定。色谱条件：UPLC Acquity BEH色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)；

流动相：A相为含0.1％甲酸的水，B相为含0.1％甲酸的乙腈；流速：0.4mL/min；采用A∶B从0min(85∶15)到25min(1∶99)的梯度程序洗脱；柱温：40℃，自动进样量20μL。

质谱条件：超高效液相色谱仪：UPLC Acquity BEH，ESI电离源，负离子方式检测时喷雾电压为2.6kV，雾化气流量700L/h，去溶剂温度350℃，离子源温度100℃。碰撞能量为4eV。扫描时间0.3s，扫描间隔时间：0.02s。扫描范围m/z 50-1500。选取200mg/L亮氨酸脑啡呔用于外标(Lock Spray)校正，流速0.05mL/min。

3.标准曲线的制备：分别取OA和DTX1标准母液，用无毒文蛤肌肉样的基体加标配成0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50μg/mL的OA和DTX1标准溶液系列。以LC-MS测得的提取离子的峰面积为横坐标，相应的浓度为纵坐标，作标准曲线，求出回归方程和相关系数。结果表明，OA和DTX1的标准曲线分别为y＝0.2504x-0.978，R²＝0.999；y＝0.2417x-0.557，R²＝0.998(x为峰面积，y为浓度)。

4.回收率实验：精密称取无毒的贝肌肉样品2g，定量加入标准品，使添加量相当于0.2μg/g、0.4μg/g、0.8μg/g，测定加样回收率。回收率＝样品实测浓度/样品理论浓度×100％。结果OA的回收率为101.58％-107.14％，平均回收率103.51％，DTX1的回收率为98.06％-103.93％，平均回收率100.20％。对OA和DTX1基体加标溶液(0.2μg/g)进行6次重复进样分析，测得峰面积，分别计算其相对标准偏差(RSD)。OA和DTX1的RSD分别为4.30％、4.00％。相对标准偏差均在5％以内，符合定量分析的要求。根据信噪比S/N＝10，计算最低定量限浓度。当OA、DTX1浓度达2μg/L时，20μL上样，此时OA和DTX1基体加标样品的检出限均为40pg(相当于2×10^-3μg/100g贝类鲜肉)，远低于人们对OA、DTX1的控制标准(EU/SANCO，2001：20μg/100g，16μg/100g贝类鲜肉)，能够满足食品安全检测需要。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (10)

1.液质联用快速检测贝肉中腹泻性贝毒的方法，包括如下步骤：

(1)贝类样品的制备：将贝样匀浆，加入75-85％甲醇水溶液，混匀振荡后，4℃离心，上清液加入正己烷萃取后，合并甲醇相，加入含乙酸的水，用三氯甲烷重复萃取，最后通入N2蒸干去掉有机相；

残渣用甲醇再溶解定容，高速离心或过滤膜，待UPLC/MS检测；

(2)UPLC/Q-TOFMS分析：ESI-模式，选择离子化后的OA、DTX1的分子离子[M-H]-作为前体离子进行T0FMS扫描、测定；

(3)OA和DTX1标准曲线的制作，求出回归方程和相关系数，结果显示：OA和DTX1的标准曲线分别为y＝0.2504x-0.978，R2＝0.999；y＝0.2417x-0.557，R2＝0.998，其中，x为峰面积，y为浓度，根据标准曲线以确定被检查贝类中OA和DTX1的含量。

2.如权利要求1所述的液质联用检测贝肉中腹泻性贝毒的方法，其特征在于，所述步骤(2)的色谱条件为：

超高效液相色谱仪：UPLC Acquity BEH

色谱柱：2.1mm×100mm，1.7μm；

流动相：A相为含甲酸的水，B相为含甲酸的乙腈；

梯度洗脱：采用A∶B从0min的85∶15到25min的1∶99；

流速：0.2～0.5mL/min；

柱温：35～40℃。

3.如权利要求1所述的液质联用检测贝肉中腹泻性贝毒的方法，其特征在于，所述步骤(2)的质谱条件为：

离子源：ESI-电离源，

喷雾电压：2～2.6kV，

雾化气流量：500～800L/h，

去溶剂温度：300～350℃，

离子源温度：100～150℃，

碰撞能量：3～4eV。

4.如权利要求3所述的液质联用检测贝肉中腹泻性贝毒的方法，其特征在于，所述步骤(2)的质谱条件中，扫描时间0.3s，扫描间隔时间：0.02s，扫描范围m/z 50-1500；选取亮氨酸脑啡呔用于外标校正。

5.如权利要求1所述的液质联用检测贝肉中腹泻性贝毒的方法，其特征在于，所述步骤(2)UPLC/Q-TOFMS分析的色谱条件，其中，A相为含0.1％甲酸的水，B相为含0.1％甲酸的乙腈。

6.如权利要求1所述的液质联用检测贝肉中腹泻性贝毒的方法，其特征在于，所述步骤(2)UPLC/Q-TOFMS分析的色谱条件，其中，流速为0.4mL/min；柱温：40℃，自动进样量20μL。

7.如权利要求1所述的液质联用检测贝肉中腹泻性贝毒的方法，其特征在于，所述步骤(2)UPLC/Q-TOFMS分析的质谱条件，其中，负离子方式检测时喷雾电压为2.6kV，雾化气流量700L/h，去溶剂温度350℃，离子源温度100℃；碰撞能量为4eV。

8.如权利要求1所述的液质联用检测贝肉中腹泻性贝毒的方法，其特征在于，所述的步骤(1)贝类样品的制备中，将贝样匀浆，加入75-85％甲醇水溶液，混匀1-3min，振荡1-3min，离心；上清液加入正己烷，漩涡混匀，静置分层弃去上层正己烷，合并甲醇相，加入酸性水，用三氯甲烷重复提取，合并下层的三氯甲烷相，用旋转蒸发仪通入N₂蒸干去掉有机相；

所述高速离心转速为10000r/min，时间为10min。

9.如权利要求7所述的液质联用检测贝肉中腹泻性贝毒的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，残渣用甲醇再溶解后定容，过滤膜；待UPLC/MS检测。

10.如权利要求1所述的液质联用检测贝肉中腹泻性贝毒的方法，其特征在于，所述的步骤还包括回收率实验。