CN102212476B - 微生物菌剂的清洁高效生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物菌剂的清洁高效生产方法。在液体发酵培养基中加入吸附性载体，如活性炭、沸石、麦饭石、海泡石、活性土、硅藻土、蒙脱石、凹土或其他一切人造多孔性吸附材料中的一种或多种，与培养基一起高温灭菌，冷却到适宜的温度后，接入菌种，按菌株的适宜繁殖条件进行发酵，发酵完成后，活菌体及代谢产物被吸附在载体上，静止后很快沉淀，收集沉淀物进行干燥或将沉淀物制粒后干燥。收集发酵产物后的上清液经消毒后可以做为中水使用，或者用来配制培养基，循环使用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物菌剂的清洁高效生产方法，属于发酵工程领域。
背景技术
微生物菌剂是指以一种或多种微生物菌株经过一系列发酵及后加工工艺而得到的微生物活菌及其代谢产物。其剂型有液体、粉状或颗粒。主要发酵方法为固体发酵和液体发酵。主要用途有：用作药品、饲料添加剂、农作物杀虫剂，用于农作物防病增产、生态环境保护和污染防治。其中环保微生物菌剂广泛用于养殖水体改良、生活垃圾处理、畜禽粪便无害化处理、工业、生活污水脱氮除磷和COD的降解等。
众所周知，由于固体发酵很难实行自动化，所以劳动强度大，生产效率低，产物很难避免感染杂菌。液体发酵是指营养基质悬浮或溶解在水中的发酵方式，易于自动化和大规模生产，生产效率高，生产流程可以标准化控制，产品质量稳定，可以生产不含杂菌的医药级微生物菌剂。采用液体发酵微生物菌剂是目前行业发展的大趋势。但是，液体发酵后的产物如以水剂做为产品形态，存在着产品保质期短、包装和运输费用高等问题。目前一般是将发酵液经一系列工艺处理后，得到粉剂的产品。主要工艺有：1、离心法：用高速离心机将菌体离下后，加入载体混匀后干燥粉碎。此工艺的缺点是不但会对菌体造成损伤，代谢产物如酶等活性物质也无法同时获取。2、沉淀法：发酵液加絮凝剂或调节pH值利用等电点沉淀法沉淀菌体，菌体沉淀后，去上清液，菌泥加入载体混匀后干燥粉碎。此工艺的缺点是易引起杂菌污染，并且如果添加絮凝剂，会使菌粉中残留絮凝剂形成污染，菌剂的使用范围受限。等电点沉淀法上清液残留的菌体和代谢物较多。3、过滤法：微孔滤膜过滤是近几年新发展起来的一种微生物细胞收集方法，用微孔滤膜过滤后，收集菌泥，菌泥加入载体混匀后干燥粉碎。此工艺的缺点是处理成本高，滤膜易堵塞，影响处理效率。并且代谢产物同样不能有效收集。4、喷雾干燥：发酵液直接喷雾干燥，得到菌粉。此工艺的缺点是能耗特别大，菌活性低。除喷雾干燥外，其他工艺还都存在产物提取后的废水处理困难的问题。
本公司的发明专利：生物活性蒙脱石粉的制备方法及其作为动物饲料添加剂的应用(专利申请号：201110042591.5)涉及到液体发酵产物的提取方法的优化，但只针对用于饲料添加的产品，吸附剂也仅限于蒙脱石粉。
公开号为CN101554204A，名称为一种发酵乳酸杆菌制剂的发明专利中，应用矿物载体沸石粉提高乳酸菌的生物活性，但是属于发酵后加入。
以多孔、微孔材料做为活性污泥载体处理污水，目前应用较多，如《水工业工程设计手册》(聂梅生，1999年9月，P644-653。)中提及将活性炭作为微生物载体，利用其优异的吸附性能，使轻度污染废水中的有机物质进行富集浓缩以达到微生物生长代谢的基质件件，通过自然驯化形成微生物体系。但将活性炭、沸石等用于微生物菌剂的发酵生产，提高培养基质的利用率，在国内文献中还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于改进现有液体发酵工艺产物提取难度大，能耗高的问题；本发明的目的还在于降低发酵废水中有机物的含量，降低发酵废水处理费用，或者获取产物后，直接回用于产品的发酵生产，使发酵废水零排放；本发明的目的还在于通过加入矿物载体，提高培养基质的利用率，提高单位体积发酵液的菌含量；本发明的目的还在于所获得产品不但含有微生物活菌体，还有细菌素、酶等代谢产物，提高产品的使用价值。
利用本发明的工艺生产微生物制剂，具有以下优点：
1、单位体积内菌含量提高30％以上，产物得率高。
2、菌体和代谢产物吸附到载体上，形成团粒，可快速自然沉淀。
3、培养基的营养物质利用率高，上清液废水有机物含量降低70％以上。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
1、制作种子液。种子液的制取采用常规的逐级扩大培养，种子液的量为发酵培养基体积的1-10％。
所述菌种包括细菌和酵母菌，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、粘乳产碱杆菌、裂腈无色杆菌、杀鲑气单胞菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、啤酒酵母等，包括但不限于以上举例菌种。
2、发酵***空消。按常规方法对空气过滤***和发酵罐进行高温消毒。
3、配制发酵培养基，培养基的成分根据菌种的不同，包括但不限于以下成分中的一种或多种，如蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸膏、玉米浆、硫酸铵、氯化铵、硝酸钾、尿素、淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖、水苏糖、糖蜜、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、醋酸钠、柠檬酸钠、柠檬酸铵、硫酸亚铁、硫酸锰、硼酸、钼酸钠、硫酸锌、硫酸铜等。
按培养基体积的0.01-1％加入消泡剂。
培养基的pH根据菌种的最佳生长条件，加以确定。
发酵培养基的量占发酵罐容积的65-75％。
4、培养基中加入吸附性载体，根据载体的不同，每升液体培养基加入1-700克，吸附性载体包括但不限于下面举例中的一种或多种。如活性炭、沸石、麦饭石、海泡石、活性土、硅藻土、蒙脱石、凹土或其他一切人造多孔并具生物亲和性的吸附材料。优选活性炭、沸石、蒙脱石、活性土做为吸附性载体。
所述载体需预先处理成微粉，其粒度小于1000um，优选粒度小于10um的载体。
所述载体优选几种物质的组合物，包括但不限于以下组成成分和重量比：活性炭1-10％，沸石粉5-70％，蒙脱石粉0.5-10％，硅藻土1-10％，活性土10-40％。
所述蒙脱石，优选医药级蒙脱石生产药用、饲料添加用益生菌。
5、物料的消毒，按常规方法对培养基进行高温消毒，消毒过程中，搅拌转速为150-300r/min。
6、接种并发酵。当培养基温度降至30-45℃时，接入菌种。根据菌种不同，确定最佳培养条件。如果是好氧菌，发酵条件一般为：发酵前期每分钟通气量为培养基体积的0.1-0.5倍，发酵发酵后期每分钟通气量为培养基体积的0.5-1.5倍。搅拌转速为150-300rpm，罐内压力维持在0.03-0.05MPa之间，培养温度为20-40℃，培养时间为20-50小时。发酵液的pH值根据菌种最适值进行确定。如果是厌氧菌，发酵条件一般为：通入除菌二氧化碳或氮气，维持罐内压力在0.03-0.05MPa之间，搅拌转速为150-300rpm，培养温度为20-40℃，培养时间为20-60小时。
7、加工发酵产物。发酵完成后，停止搅拌，维持罐内压力在0.03-0.05MPa之间，发酵液温度降至4-10℃，在罐内静止沉淀。或将发酵液导入到无菌储液罐内，维持罐内压力在0.03-0.05MPa之间，发酵液温度降至4-10℃，在储液罐内静止沉淀。沉淀6-36小时后，去上清液，沉淀物直接加载体混匀后干燥或制粒后干燥，或在离心机内1000-3000rpm离心后，离心物加载体混匀后干燥或制粒后干燥。所述载体包括但不限于白炭黑、玉米淀粉、沸石粉、硅藻土。所述干燥方法包括但不限于真空干燥、真空冷冻干燥、沸腾干燥或流化床干燥。干燥温度不高于65℃。
8、发酵废水的处理。除发酵产物的上清液，COD含量小于200mg/L，SS小于30mg/L，氨氮(以氮计)小于15mg/L，总磷(以P计)小于3mg/L。将上清液进一步处理后，通臭氧消毒，可以做为中水，加以利用，也可以用来配制发酵培养基，循环使用。
所述要进一步处理的上清液，是指上清液COD含量大于20mg/L，SS大于10mg/L，氨氮(以氮计)大于5mg/L，总磷(以P计)大于1mg/L。低于此标准的上清液可以直接用臭氧消毒后利用。
具体实施方式
实施例1
发酵培养基中添加粒度小于10um的复合载体发酵枯草芽孢杆菌
具体步骤为：
(1)4℃保存的冻干菌种或-80℃保存的液体菌种进行活化。将枯草芽孢杆菌ACCC10619在事前准备好的LB(蛋白胨10克/升，酵母浸粉5克/升，氯化钠5克/升)固体培养皿上划线，然后放置于设定为37℃的生化培养箱中培养18小时。
(2)一级种子液的制备。从活化的培养皿上挑取典型均一的单菌落接种到事先准备好的LB液体无菌培养基里，然后置于恒温振荡培养器里，设定温度为37℃，转速为150rpm，培养18小时。获得一级种子液。
(3)二级种子液的制备。首先将制作种子液的发酵***的空气过滤器、空气管道和发酵罐用蒸汽进行灭菌，然后将事先配制的种子培养基(LB培养基，另外按0.1毫升/升的量加入消泡剂)导入发酵罐，用蒸气将培养基灭菌，待冷却至40℃时，将步骤2)制作的一级种子液按培养基体积的3％接入发酵罐。发酵条件为：温度37℃，转速为120rpm，发酵前期每分钟通气量为培养基体积的0.1-0.5倍，发酵发酵后期每分钟通气量为培养基体积的0.5-1.5倍。罐内压力维持在0.03MPa左右，培养18小时。
(4)发酵生产。
①将生产用发酵***的空气过滤器、空气管道和发酵罐用蒸汽进行灭菌。
②配制发酵培养基，培养基配方为：蛋白胨15克/升，酵母浸粉5克/升，玉米淀粉7克/升(需先糊化)，磷酸二氢钾(KH2PO4·H2O)0.3克/升，硫酸锰(MnSO4·H2O)0.02克/升，消泡剂0.1毫升/升。培养基的量为发酵罐容积的65％。
③将发酵培养基导入发酵罐，并按每升培养基450克的量加入粒度小于10um的复合载体，载体组成为(重量比)：沸石粉70％，活性炭5％，活性土20％，硅藻土5％。开动搅动电机，转速为260rpm，通蒸汽进行灭菌。
④将灭菌后的培养基冷却至40℃，按培养基量的5％接入二级种子液，发酵条件为：通入精度为0.01um高效空气除菌过滤器过滤的除菌空气，发酵前期每分钟通气量为培养基体积的0.1-0.5倍，发酵发酵后期每分钟通气量为培养基体积的0.5-1.5倍。罐内压力维持在0.05MPa，搅动转速为260rpm，培养温度为37℃，培养时间为48小时。
(5)加工发酵产物。发酵完成后，罐压保持0.03MPa，将发酵液的温度快速降至10℃，再静止12小时，去上清液，取沉淀物离心，离心温度控制在4℃，离心转速为2000rpm，离心后的物料按重量比1∶0.3的量加入白炭黑，用混合机搅拌匀均，35℃沸腾干燥，干燥后水份含量要低于8％。干燥物用粉碎机粉至过80目筛后，制得枯草芽孢杆菌菌粉。经测定，每克菌粉所含活菌的量大于2×109CFU。(6)处理发酵上清液。经测定，上清液中COD含量为21mg/L，SS为9mg/L，氨氮(以氮计)为4.7mg/L，总磷(以P计)为0.9mg/L。将上清液通臭氧消毒后，可以做为中水，加以利用，也可以用来配制发酵培养基，循环使用。
实施例2
发酵培养基中添加粒度小于50um的复合载体发酵地衣芽孢杆菌
具体步骤为：
(1)4℃保存的冻干菌种或-80℃保存的液体菌种进行活化。将地衣芽孢杆菌CICC23584在事前准备好的LB固体培养皿上划线，然后放置于设定为35℃的生化培养箱中培养24小时。
(2)一级种子液的制备。从活化的培养皿上挑取典型均一的单菌落接种到事先准备好的LB液体无菌培养基里，然后置于恒温振荡培养器里，设定温度为32℃，转速为150rpm，培养22小时。获得一级种子液。
(3)二级种子液的制备。首先将制作种子液的发酵***的空气过滤器、空气管道和发酵罐用蒸汽进行灭菌，然后将事先配制的种子培养基(LB培养基，另外按0.1毫升/升的量加入消泡剂)导入发酵罐，用蒸气将培养基灭菌，待冷却至40℃时，将步骤2)制作的一级种子液按培养基体积的7％接入发酵罐。发酵条件为：温度37℃，转速为120rpm，发酵前期每分钟通气量为培养基体积的0.1-0.5倍，发酵发酵后期每分钟通气量为培养基体积的0.5-1.5倍。罐内压力维持在0.03MPa左右，培养18小时。
(4)发酵生产。
a、将生产用发酵***的空气过滤器、空气管道和发酵罐用蒸汽进行灭菌。
b、配制发酵培养基，培养基配方为：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，丙酸钠3.0g/L，磷酸二氢钾(KH2PO4·H2O)0.5g/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.2g/L，硫酸锰(MnSO4·H2O)0.005g/L，消泡剂0.1毫升/升，pH水为自来水，。培养基的量为发酵罐容积的70％。
c、将发酵培养基导入发酵罐，并按每升培养基470克的量加入粒度小于50um的复合载体，载体组成为(重量比)：沸石粉35％，活性炭25％，蒙脱石20％，硅藻土20％。开动搅动电机，转速为270rpm，通蒸汽进行灭菌。
d、将灭菌后的培养基冷却至40℃，按培养基量的0.8％接入二级种子液，发酵条件为：通入精度为0.01um高效空气除菌过滤器过滤的除菌空气，发酵前期每分钟通气量为培养基体积的0.1-0.5倍，发酵发酵后期每分钟通气量为培养基体积的0.5-1.5倍。罐内压力维持在0.05MPa，搅动转速为260rpm，培养温度为35℃，培养时间为56小时。
(5)加工发酵产物。发酵完成后，罐压保持0.03MPa，将发酵液的温度快速降至10℃，再静止12小时，去上清液，取沉淀物离心，离心温度控制在4℃，离心转速为2000rpm，离心后的物料按重量比1∶0.3的量加入白炭黑，用混合机搅拌匀均，35℃沸腾干燥，干燥后水份含量要低于8％。干燥物用粉碎机粉至过80目筛后，制得地衣芽孢杆菌菌粉。经测定，每克菌粉所含活菌的量大于1×109CFU。
(6)处理发酵上清液。经测定，上清液中COD含量为37mg/L，SS为12mg/L，氨氮(以氮计)为4.1mg/L，总磷(以P计)为0.7mg/L。将上清液通臭氧消毒后，可以做为中水，加以利用，也可以用来配制发酵培养基，循环使用。
实施例3
发酵培养基中添加粒度小于50um的沸石粉发酵施氏假单胞菌
具体步骤为：
(1)4℃保存的冻干菌种或-80℃保存的液体菌种进行活化。将施氏假单胞菌CICC23621在事前准备好的LB固体培养皿上划线，然后放置于设定为30℃的生化培养箱中培养24小时。
(2)一级种子液的制备。从活化的培养皿上挑取典型均一的单菌落接种到事先准备好的LB液体无菌培养基里，然后置于恒温振荡培养器里，设定温度为30℃，转速为150rpm，培养22小时。获得一级种子液。
(3)二级种子液的制备。首先将制作种子液的发酵***的空气过滤器、空气管道和发酵罐用蒸汽进行灭菌，然后将事先配制的种子培养基(LB培养基，另外按0.1毫升/升的量加入消泡剂)导入发酵罐，用蒸气将培养基灭菌，待冷却至40℃时，将步骤2)制作的一级种子液按培养基体积的5％接入发酵罐。发酵条件为：温度30℃，转速为120rpm，发酵前期每分钟通气量为培养基体积的0.1-0.5倍，发酵发酵后期每分钟通气量为培养基体积的0.5-1.5倍，罐内压力维持在0.03MPa左右，培养18小时。
(4)发酵生产。
a、将生产用发酵***的空气过滤器、空气管道和发酵罐用蒸汽进行灭菌。
b、配制发酵培养基，培养基配方为：蛋白胨10.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，磷酸二氢钾(KH2PO4·H2O)0.5g/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.2g/L，消泡剂0.1毫升/升，pH水为自来水，。培养基的量为发酵罐容积的70％。
c、将发酵培养基导入发酵罐，并按每升培养基500克的量加入粒度小于50um的沸石粉，开动搅动电机，转速为230rpm，通蒸汽进行灭菌。
d、将灭菌后的培养基冷却至35℃，按培养基量的1.5％接入二级种子液，发酵条件为：通入精度为0.01um高效空气除菌过滤器过滤的除菌空气，发酵前期每分钟通气量为培养基体积的0.1-0.5倍，发酵发酵后期每分钟通气量为培养基体积的0.5-1.5倍，罐内压力维持在0.05MPa，搅动转速为260rpm，培养温度为35℃，培养时间为56小时。
(5)加工发酵产物。发酵完成后，罐压保持0.03MPa，将发酵液的温度快速降至10℃，再静止12小时，去上清液，取沉淀物离心，离心温度控制在4℃，离心转速为2000rpm，离心后的物料按重量比1∶2的量加入玉米淀粉，用混合机搅拌匀均，35℃沸腾干燥，干燥后水份含量要低于8％。干燥物用粉碎机粉至过80目筛后，制得地施氏假单胞菌菌粉。经测定，每克菌粉所含活菌的量大于2×108CFU。
(6)处理发酵上清液。经测定，上清液中COD含量为23mg/L，SS为7mg/L，氨氮(以氮计)为4.1mg/L，总磷(以P计)为0.7mg/L。将上清液通臭氧消毒后，可以做为中水，加以利用，也可以用来配制发酵培养基，循环使用。
实施例4
发酵培养基中添加复合载体发酵植物乳杆菌
具体步骤为：
(1)、4℃保存的冻干菌种或-80℃保存的液体菌种进行活化。将植物乳杆菌CGMCC 1.19在事前准备好的MRS固体培养皿上划线，然后放置于设定为35℃的生化培养箱中培养24小时。
(2)、一级种子液的制备。从活化的培养皿上挑取典型均一的单菌落接种到事先准备好的MRS液体无菌培养基里，然后置于恒温振荡培养器里，设定温度为32℃，转速为150rpm，培养22小时。获得一级种子液。
(3)、二级种子液的制备。首先将制作种子液的发酵***的空气过滤器、空气管道和发酵罐用蒸汽进行灭菌，然后将事先配制的种子培养基(MRS培养基，另外按0.1毫升/升的量加入消泡剂)导入发酵罐，用蒸气将培养基灭菌，待冷却至40℃时，将步骤2)制作的一级种子液按培养基体积的5％接入发酵罐。发酵条件为：温度30℃，转速为120rpm，过入无菌二氧化碳气体，罐内压力维持在0.03MPa左右，培养22小时。
(4)、发酵生产。
a、将生产用发酵***的空气过滤器、空气管道和发酵罐用蒸汽进行灭菌。
b、配制发酵培养基，培养基配方为：大豆蛋白胨5.0g/L，牛肉膏5.0g/L，酵母粉2.0g/L，葡萄糖5.0g/L，无水乙酸钠5.0g/L，柠檬酸氢二铵[(NH4)2HC6H5O7]0.5g/L，Tween 80 1.0g/L，磷酸二氢钾(KH2PO4·H2O)0.5g/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.2g/L，硫酸锰(MnSO4·H2O)0.05g/L，碳酸钙(CaCO3)5.0g/L，消泡剂0.1毫升/升，pH为6.8，水为自来水。培养基的量为发酵罐容积的75％。
c、将发酵培养基导入发酵罐，并按每升培养基370克的量加入粒度小于1um的复合载体，载体组成为(重量比)：沸石粉65％，活性炭5％，蒙脱石5％，硅藻土5％，麦饭石20。开动搅动电机，转速为270rpm，通蒸汽进行灭菌。
d、将灭菌后的培养基冷却至35℃，按培养基量的2％接入二级种子液，发酵条件为：通入精度为0.01um高效空气除菌过滤器过滤的除菌二氧化碳，罐内压力维持在0.05MPa，搅动转速为260rpm，培养温度为30℃，培养时间为48小时。
(5)加工发酵产物发酵完成后，罐压保持0.03MPa，将发酵液的温度快速降至10℃，再静止24小时，去上清液，取沉淀物离心，离心温度控制在4℃，离心转速为2000rpm，离心后的物料按重量比1∶0.3∶0.1的量加入白炭黑和乳糖，拌匀均，40℃真空干燥，干燥后水份含量要低于8％。干燥物用粉碎机粉至过80目筛后，制得本发明所述的植物乳杆菌菌粉。经测定，每克菌粉所含益生菌的量大于5×109CFU。
(6)处理发酵上清液。经测定，上清液中COD含量为27mg/L，SS为11mg/L，氨氮(以氮计)为3mg/L，总磷(以P计)为0.2mg/L。将上清液通臭氧消毒后，可以做为中水，加以利用，也可以用来配制发酵培养基，循环使用。
Claims (2)
1.一种微生物菌剂的生产方法，其特征在于：在液体发酵培养基中加入吸附性载体，载体组成为(重量比)：沸石粉65％，活性炭5％，蒙脱石5％，硅藻土5％，麦饭石20％，载体需预先处理成微粉，其粒度小于10μm，然后与培养基一起高温灭菌，灭菌后将培养基温度冷却至30-45℃，接入菌种，按菌株的适宜繁殖条件进行发酵，发酵完成后，活菌体及代谢产物被吸附在载体上，静止后很快沉淀，收集沉淀物进行干燥或将沉淀物制粒后干燥。
2.如权利要求1所述的微生物菌剂的生产方法，其特征在于所述菌种为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、粘乳产碱杆菌、裂腈无色杆菌、植物乳杆菌、或嗜酸乳杆菌。
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