CN102206675A - 一种提高动物体内多不饱和脂肪酸含量的新型载体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高动物体内多不饱和脂肪酸含量的新型载体，此表达载体能够同时转录并表达ω-3脂肪酸脱氢酶和Δ12脂肪酸脱氢酶，其序列包含基因序列Sequnence NO.1和Sequnence NO.2。此外在sFat和Fat2基因之间还加入了增强子SP163及IRES序列，所述载体可以同时高效表达两种脱氢酶。本发明还将所述载体转染至CHO细胞中，经过抗生素筛选，得到了高表达sFat和Fat2基因的稳定细胞株，其基因表达量是未转染细胞表达量的105倍以上。本发明还公开了利用所述载体，培养高含量ω-3多不饱和脂肪酸的子代动物的具体方法。本发明为生产出富含ω-3多不饱和脂肪酸的动物性产品，改善肉制品或奶制品品质而生产转基因家畜奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型表达载体的构建。具体而言，从线虫Caenorhabditis elegans克隆了基因sFat-1和Fat-2序列，并进行了密码子优化。本发明构建了高表达载体pcDNA3.1-sFat-SP163-IRES-Fat2，可以应用于提高动物体内ω-3多不饱和脂肪酸的含量。
背景技术
多不饱和脂肪酸(PUFAs)是指十六碳以上并含有两个以上双键的脂肪酸，ω-3PUFAs和ω-6PUFAs是其中最重要的两种类型。α-亚麻酸(α-linolenic acid，αLA)、廿碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)、廿二碳五烯酸(docosapentaenoic acid，DPA)、廿二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)均属于ω-3PUFAs；而亚油酸(linoleic acid，LA)、γ-亚麻酸(γ-lenolenic acid，γ-LA)、花生四烯酸(arochidonic acid，AA)等属于ω-6PUFAs。越来越多的研究证明[Chen W X，Chen D G，Cheng X F，etc.Effects ofω-3Polyunsaturated Fatty Acids And Taurine on Rat Brain Development.Acta Nutrimenta Sinica，1998，20(4)：25-30.]，PUFAs具有广泛的生物学功能，它们参与细胞膜的构成并作为许多细胞应答过程中的信号分子，与人类的多种疾病的发生紧密相关，其适宜的含量对于人类及其他哺乳动物的正常发育和保持良好的健康状况极其重要。
ω-3多不饱和脂肪酸是细胞构成的重要成分，哺乳动物体内维持一定量的ω-3PUFAs可以起到预防心血管疾病、神经退行性疾病甚至癌症的作用。随着人们对n-3多不饱和脂肪酸认识的增加，对富含这一成分的食品需求也大大增加。但哺乳动物由于缺乏ω-3脂肪酸脱氢酶而自身不能合成ω-3PUFAs，只能从食物中补充。Fat-1基因广泛存在于真菌、植物和一些低等动物中，它可以通过产生出ω-3脂肪酸脱氢酶将多不饱和脂肪酸从ω-6转化为ω-3形式而发挥功能。研究人员已经在转基因动物，如：小鼠、猪等，表达了fat-1基因，为研究ω-3PUFAs功能提供了高效、准确的医学、营养学动物模型。sFat-1基因与fat-1基因作用相类似，也能转录为ω-3脂肪酸脱氢酶。
研究发现花生四烯酸、廿二碳五烯酸以及廿二碳六烯酸在中枢神经***(CNS)的结构性脂(structural lipids)中高浓度地存在，故而这些PUFAs被认为是大脑、视网膜和神经***发育所必需的，在婴幼儿营养中不可缺少，ω-3PUFAs的不足会导致视觉敏感性和学习能力降低。ω-3和ω-6PUFAs在代谢上和功能上有着明显的区分：ω-6PUFAs如花生四烯酸的过量会引起前凝血反应(prothombotic)等生理效应，并导致炎症和心血管等疾病；相反，ω-3PUFAs如廿碳五烯酸、廿二碳六烯酸已经被证实能够预防和治疗心血管疾病、关节炎、癌症等多种疾病，因此，ω-3PUFAs的重要性更为突出。
ω-3脂肪酸去饱和酶基因是ω-3PUFAs合成的关键基因，它们利用ω-6PUFAs为底物，在脂肪酸碳链甲基端第三个碳催化生成一个不饱和键(烯键)，从而合成相应的ω-3PUFAs。1997年，Spychalla等人克隆了来源于线虫(Caenorhabditis elegans)的ω-3去饱和酶基因Fat-1[Spychalla J P，Kinney A J，Browse J.Identification of an animalω-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94(4)：1142～1147.]，在哺乳动物细胞中发现Fat-1蛋白能催化以ω-6PUFAs为底物产生ω-3PUFAs。2004年，首例转fat-1基因的哺乳动物诞生，这些转fat-1基因小鼠各组织中相应的n-3PUFAs含量增加，n-6/n-3比值也明显下降。这种富含n-3PUFAs的转基因小鼠[Kang J X，Wang J，Wu L，et al.Transgenic mice：fat-1mice convert n-6 to n-3 fatty acids.Nature，2004，427：504]，为进一步研究n-3PUFAs的作用、机制以及许多与之相关的疾病研究提供了良好的动物模型，也为改善人类食谱提供了一个良好的思路。转基因小鼠的脂肪酸检测显示，sFat-1基因除能完全发挥其ω-3去饱和酶作用外，还能产生更多的长链廿碳五烯酸和廿二碳六烯酸。
高等动物的长链PUFAs是由一系列定位于膜上的脱氢酶和延长酶催化亚油酸和亚麻酸合成的。然而，他们却缺少合成长链PUFAs前体物亚油酸和亚麻酸所必需的脱氢酶；而且，ω-3和ω-6脂肪酸在高等动物体内是无法相互转化的。因此，高等动物必须从食物中获取这些脂肪酸PUFAs：特定的种子植物(LA、GLA、ALA)和海洋鱼类(AA、EPA和DHA)以及一些哺乳动物。自然界中ω-6PUFAs含量丰富而ω-3PUFAs含量极少，导致动物体中ω-6PUFAs摄入过多而ω-3PUFAs摄入严重不足，使ω-6/ω-3之比高达16以上，根据相关的研究，ω-6和ω-3PUFAs的比例应该在1∶1为适宜，所以人体通常处于ω-3PUFAs供应不足的状态。ω-3脂肪酸脱氢酶基因可以催化ω-6脂肪酸转化为ω-3脂肪酸，因而ω-3脂肪酸脱氢酶基因的表达研究已成为利用基因工程生产PUFAs的热点。然而ω-3脂肪酸脱氢酶存在于大多数植物及少数低等动物体内，哺乳动物和人类体内不存在。植物中ω-3脂肪酸脱氢酶虽然种类繁多但还没有被利用到动物研究中，动物上由于膜结合蛋白分离及纯化的困难，已确定的动物ω-3脂肪酸脱氢酶也非常有限。目前，虽然ω-3脂肪酸脱氢酶基因的研究在催化和调节机制方面已取得很大进展，但对于生物体如何感受、传递信息，如何诱导和调控基因表达等还不是很清楚。
生物体的脂类代谢可以利用基础原料合成机体所需的脂肪酸(脂肪酸合成)；或将脂肪酸分解得到一些小的成分(脂肪酸分解)；还能把脂肪酸从一种形式变成另外一种形式(脂肪酸转换)，机体正是通过这种方式来调节脂肪酸的比例，以满足自身需要，研究表明Fat-2基因能在体内生产Δ12脂肪酸脱氢酶，此酶催化油酸(18:1n-9)在Δ12位上脱氢生成亚油酸(18:2n-6)。ω-3脂肪酸脱氢酶具有脂肪酸转换功能，能将脂肪酸碳链上特定位置的碳碳单键氧化成双键，形成不饱和脂肪酸或更高级的多不饱和脂肪酸。因此，要想改善哺乳动物体内ω-6和ω-3PUFAs比例、提高哺乳动物体内ω-3PUFAs的含量，除了摄入具有较高ω-3PUFAs含量的食物，还可以考虑将ω-3脂肪酸脱氢酶基因通过转基因方法导入动物体内，使其自身能够把过多的ω-6PUFAs转化为ω-3PUFAs，从根本上解决问题。
亚油酸、亚麻酸是哺乳动物体内的必需脂肪酸，但哺乳动物由于缺乏Δ12和ω-3脂肪酸脱氢酶而自身不能合成，只能从食物中摄取。Δ12和ω-3脂肪酸脱氢酶存在于真菌、植物和一些低等动物中。由于自然界中ω-6PUFAs含量丰富而ω-3PUFAs含量极少，导致动物体中ω-6PUFAs摄入过多而ω-3PUFAs摄入严重不足。为此解决ω-6PUFAs与ω-3PUFAs在动物体内的不平衡问题，具有重要的意义。本发明设计了一种真核表达载体，此表达载体能够同时转录并表达ω-3脂肪酸脱氢酶和Δ12脂肪酸脱氢酶，Δ12脂肪酸脱氢酶能增加细胞内亚油酸的含量，ω-3脂肪酸脱氢酶能将亚油酸和其他ω-6PUFAs转化为ω-3PUFAs，从而更好地增加动物体内ω-3PUFAs的含量，改善ω-6/ω-3的比值，进而生成对人体有益的富含ω-3PUFAs的动物产品。本发明为改善肉制品或奶制品品质而生产转基因家畜奠定基础，生产出富含ω-3PUFAs的动物性产品(肉、奶)为改善人类食谱提供一个良好的途径。
发明内容
本发明构建了一种提高动物体内多不饱和脂肪酸含量的新型载体，所述载体包含ω-3脂肪酸脱氢酶基因sFat、Δ12脂肪酸脱氢酶基因Fat2、增强子SP163和IRES序列。它们的基因序列分别为Sequnence NO.1、Sequnence NO.2、Sequnence NO.3和Sequnence NO.4。
本发明构建的载体所含的Sequnence NO.1序列，是通过对线虫Caenorhabditis elegans的sFat-1基因(ω-3脂肪酸去饱和酶基因)进行密码子优化得到。经密码子优化得到的sFat基因能够更好的在真核生物中表达。
本发明的载体被转染至CHO细胞中，经过抗生素G418的筛选，得到了同时高表达sFat和Fat2基因的稳定细胞株。得到的稳定细胞株其sFat和Fat2基因的表达量是未转染细胞表达量的105倍以上。
本发明的载体在真核细胞中同时表达ω-3脂肪酸脱氢酶和Δ12脂肪酸脱氢酶，提高了细胞和动物ω-3多不饱和脂肪酸的含量。因为所述载体同时转录并表达ω-3脂肪酸脱氢酶和Δ12脂肪酸脱氢酶，Δ12脂肪酸脱氢酶能增加细胞内亚油酸的含量，ω-3脂肪酸脱氢酶能将亚油酸和其他ω-6PUFAs转化为ω-3PUFAs，从而更好地增加了细胞和动物体内ω-3PUFAs的含量。
利用本发明的载体建立了一种提高子代动物体内ω-3多不饱和脂肪酸含量方法，包括：
1)制备真核表达载体pcDNA3.1-sFat-SP163-IRES-Fat2；
2)将真核表达载体pcDNA3.1-sFat-SP163-IRES-Fat2、脂质体与台酚蓝混合制备转染液；
3)采用微创手术，将上述转染液用分多点注射入动物两侧的睾丸中再与雌性动物交配；
4)通过PCR技术，用sFat和Fat2基因的特异性引物，检测子代动物sFat和Fat2基因的表达。通过Southern印迹检测排除假阳性。利用实时定量PCR的方法检测阳性动物目的基因的表达。
本发明所述方法可以应用于培养富含ω-3多不饱和脂肪酸的动物新品种。
附图说明
图1pEASY-Blunt-Simple-sFat-1和pcDNA3.1的KpnI/NotI双酶切电泳图。
1：pcDNA3.1，KpnI、Not I酶切；2：1Kb marker；3：DL2000marker；4：pEASY-Blunt-Simple-sFat-1KpnI、NotI酶切。
图2
和pcDNA3.1(+)-sFat-SP163的NotI/XbaI双酶切电泳图。
NotI、XbaI酶切；2：1Kb marker；3：pcDNA3.1(+)-sFat-SP163，NotI、XbaI酶切。
图3pcDNA3.1(+)-sFat-SP163图谱。
图4pcDNA3.1-sFat-SP163-IRES-Fat2载体结构图。
图5瞬时转染三种质粒目的基因表达水平。实体柱代表sFat-1表达水平，网格柱代表Fat-2表达水平。A组转染pcDNA3.1质粒，B组转染pcDNA3.1-sFat1-SP163质粒，C组转染pcDNA3.1-sFat-SP163-IRES-Fat2质粒。
实施例一真核表达载体的构建与功能评价
一.研究方法
1.载体构建
1)对sFat-1和Fat-2序列的基因全序列进行分析，检查基因内部是否含有复杂二级结构和重复序列。根据序列的具体情况设计合成方案，先进行单链oligo的设计及合成，利用PCR将合成的oligo拼接成完整的基因。
2)将合成好的sFat-1基因装入pEASY-Blunt Simple载体并转化至感受态细胞Trans1-T1 Phage Resistant Cell，测序验证重组克隆中基因序列是否与要求相符。
3)用KpnI/NotI双酶切全基因合成的含目的片段的载体得到1398bp的目的片段，pcDNA3.1载体通过KpnI/NotI双酶切得到5.4Kbp的线性化载体序列。
4)切胶回收目的大小的DNA片段，应用T4DNA ligase室温连接2h。
5)将连接产物转化至感受态细胞，测序验证重组克隆中基因序列是否与要求相符，得到载体pcDNA3.1(+)-sFat-SP163。
6)1∶1000接菌，过夜摇菌。Man-PureLink HiPure Plasmid Filter Purification Kits提取质粒DNA，-20℃保存。
7)将合成好的Fat-2基因装入
载体，并转化至感受态细胞Top10感受态细胞，测序验证重组克隆中基因序列是否与要求相符。
8)用NotI/XbaI双酶切pcDNA3.1(+)-sFat-SP163得到约6740bp的片段，用NotI/XbaI双酶切全基因合成的含目的片段的载体得到约1750bp的片段。
9)切胶回收目的大小的DNA片段，应用T4DNA ligase室温连接2h。
10)将连接产物转化至感受态细胞，测序验证重组克隆中基因序列是否与要求相符。
11)1∶1000接菌，过夜摇菌。Man-PureLink HiPure Plasmid Filter Purification Kits提取质粒DNA，所得的质粒-20℃保存。
2.CHO细胞瞬转质粒及表达检测
1)培养CHO细胞至对数生长期；
2)用Invitrogen公司lipofectamine2000转染pcDNA3.1-sFat1-SP163质粒，qPCR检测目的基因sFat1表达；同时转染pcDNA3.1-sFat-SP163-IRES-Fat2质粒，qPCR检测sFat和Fat2。
3.细胞抗生素最佳筛选剂量实验(Kill Curves)
1)将生长状态良好，处于对数生长期的细胞，按照密度比1∶10接种到24孔板中。细胞铺板24小时后，可以加入抗生素进行筛选。
2)根据抗生素的剂量范围和相关靶细胞的筛选信息设定合适的筛选剂量梯度，每个梯度设置两个复孔。
3)持续观察并记录细胞的生长情况，每三天换一次培养基，加入抗生素继续筛选。
4)靶细胞抗生素最佳筛选剂量为可在3天内导致大量的细胞死亡，并在二周内杀死所有细胞的浓度。
4.三个混合稳定细胞系筛选(pcDNA3.1-sFat1-SP163，pcDNA3.1-sFat-SP163-IRES-Fat2和阴性对照pcDNA3.1空载体)
1)用高纯度质粒试剂盒，制备第一阶段构建的质粒；
2)培养CHO细胞至生长旺盛阶段；
3)质粒转染，换液；
4)加G418筛选3周，混合带抗性细胞，扩增至足够量用于检测，同时冻存部分细胞；
5)qPCR检测混合细胞目的基因mRNA。
二.结果
1.测序验证结果：
将全合成的sFat-1基因测序，其序列见Sequnence NO.1，测序结果显示与线虫Caenorhabditis elegans的Fat-1基因密码子优化后的序列完全一致。
将合成的IRES-Fat2基因测序，其序列见Sequnence NO.2，测序结果显示与所提供的序列完全一致。
2.酶切结果：
将合成好的序列完全正确的sFat-1基因从pEASY-Blunt Simple-sFat-1载体上用KpnI/NotI双切，同时用KpnI/NotI双切pcDNA3.1载体，分别得到1398bp的目的片段和5.4Kbp的线性化载体，电泳结果见图1。
将合成好的序列完全正确的Fat-2基因从
载体上用NotI/XbaI双切，同时用NotI/XbaI双切pcDNA3.1(+)-sFat-SP163，分别得到1750bp的目的片段和6740bp的线性化载体，电泳结果见图2。
3.pcDNA3.1(+)-sFat-SP163图谱、pcDNA3.1-sFat-SP163-IRES-Fat2载体结构图见图3和图4。
4.目的基因表达效果评价
1)瞬时转染目的基因表达效果评价
pcDNA3.1、pcDNA3.1-sFat1-SP163质粒及pcDNA3.1-sFat-SP163-IRES-Fat2质粒瞬时转染CHO细胞，转染48小时后收集样品qPCR检测目的基因的表达情况，目的基因表达含量均有大幅提升，其中：
转染pcDNA3.1-sFat1-SP163质粒细胞sFat1基因表达提升31000.4倍；
转染pcDNA3.1-sFat-SP163-IRES-Fat2质粒细胞sFat1基因表达提升21668.8倍；
转染pcDNA3.1-sFat-SP163-IRES-Fat2质粒细胞Fat2基因表达提升25064.1倍。
结果见图5
2)CHO-K1加药后情况：
加入药物培养基后，各梯度细胞均出现死亡，加药后4天药物浓度为600ug/ml的细胞基本全部死亡(2个复孔情况相同)；使用加药培养基培养2周左右，G418终浓度为400ug/ml的细胞全部死亡，药物终浓度为200ug/ml的细胞尚有存活，故选择400ug/ml为筛选浓度。
3)混合稳定细胞系目的基因表达效果评价
pcDNA3.1、pcDNA3.1-sFat1-SP163质粒及pcDNA3.1-sFat-SP163-IRES-Fat2质粒稳定转染CHO细胞中，目的基因表达水平均得到显著提高，提高倍数均在105以上。
实施列二睾丸注射法建立高表达ω-3多不饱和脂肪酸转基因绵羊的研究
首先制备能够同时表达ω-3脂肪酸脱氢酶和Δ12脂肪酸脱氢酶的真核表达载体pcDNA3.1-sFat-SP163-IRES-Fat2，然后将此真核表达载体与脂质体和台酚蓝混合，制备成转染液。接着采用微创手术，将上述转染液用分多点注射入羊两侧的睾丸中再与雌***配。最后通过PCR技术，用sFat和Fat2基因的特异性引物检测子代动物sFat和Fat2基因的表达。通过Southern印迹检测排除假阳性。利用实时定量PCR的方法检测阳性动物目的基因的表达。
初步的实验结果显示注射组阳性后代其ω-3脂肪酸脱氢酶和Δ12脂肪酸脱氢酶的表达量显著高于未注射组的动物。
Claims (4)
1.一种提高动物体内多不饱和脂肪酸含量的新型载体，其特征在于，所述载体包含基因序列Sequnence NO.1、Sequnence NO.2、Sequnence NO.3和Sequnence NO.4。
2.根据权利要求1所述的一种提高动物体内多不饱和脂肪酸含量的新型载体，其特征在于，所述载体在真核细胞中同时表达ω-3脂肪酸脱氢酶和Δ12脂肪酸脱氢酶。
3.一种提高子代动物体内ω-3多不饱和脂肪酸含量的方法，包括：
1)制备真核表达载体pcDNA3.1-sFat-SP163-IRES-Fat2；
2)将真核表达载体pcDNA3.1-sFat-SP163-IRES-Fat2、脂质体与台酚蓝混合制备转染液；
3)采用微创手术，将上述转染液用分多点注射入动物两侧的睾丸中再与雌性动物交配；
4)通过PCR技术，用sFat和Fat2基因的特异性引物，检测子代动物sFat和Fat2基因的表达；
5)通过Southern印迹检测排除假阳性，利用实时定量PCR的方法检测阳性动物目的基因的表达。
4.根据权利要求3所述的一种提高子代动物体内ω-3多不饱和脂肪酸含量的方法，其特征在于，所述方法可以应用于培养富含ω-3多不饱和脂肪酸的动物新品种。
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