CN102206243A

CN102206243A - 熊果酸-NF-kappaB抑制剂在医学上的用途

Info

Publication number: CN102206243A
Application number: CN201110081675XA
Authority: CN
Inventors: 周平; 刘勇; 薛承彪
Original assignee: Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2011-04-01
Filing date: 2011-04-01
Publication date: 2011-10-05

Abstract

熊果酸-NF-kappaB抑制剂在医学上的用途，本发明涉及一种NF-kappaB抑制剂作为免疫调节剂医药和科研领域的应用。作为免疫调节剂，用于制备免疫抑制剂类药物，在治疗减低移植后排斥反应以及移植免疫耐受诱导和维持方面的应用。作为免疫调节剂，用于作为抗炎药物，在治疗多种慢性炎症性疾病上的应用。作为免疫调节剂，用于制备自身免疫治疗药物，在治疗多种自身免疫性疾病上的应用。作为免疫调节剂，用于制备缺血再灌注损伤保护剂，在治疗缺血再灌注损伤类疾病上的应用。作为免疫调节剂，用于制备内毒素血症和脓毒血症防治药物，用于内毒素血症和脓毒血症防治上的应用。

Description

熊果酸-NF-kappaB抑制剂在医学上的用途

技术领域

本发明涉及一种NF-kappaB抑制剂作为免疫调节剂医药和科研领域的应用，尤其是在抗移植排斥、抗自身免疫疾病、抗缺血再灌注损伤和抗慢性炎症反应、抗内毒素血症等方面的用途。

背景技术

在本发明提出之前，本领域的医学专家十分清楚，对机体免疫***的抑制性调控是治疗多种疾病的关键，如治疗器官移植后排斥反应、自身免疫性疾病、慢性炎症性疾病、缺血再灌注损伤等。而对免疫***的调控可以从多方面入手的，而天然免疫反应作为近期研究的热点，是一个极佳的达成免疫抑制的方向。

机体免疫反应分为天然免疫和获得性免疫。其中，后者因为其特异性极强的识别功能和高效的反应效果一直以来被当作移植免疫的主要研究对象和干预标靶。传统免疫反应被认为是由获得性免疫***的第一和第二刺激信号激活NF-kappaB，激活的NF-kappaB进入细胞核，启动转录，细胞合成和分泌各种炎性细胞因子，引发随后的一系列免疫反应。目前的抗排斥药物都是作用在获得性免疫***上的。天然免疫一直被认为是机体的天然保护屏障，主要是抗击病毒细菌感染、外来生物入侵等，但最近几年大量的研究发现天然免疫***在移植免疫、自身免疫性疾病和缺血损伤等方面发挥着极其重要的作用。既然各种通路汇总的关节点在于NF-kappaB，因此对NF-kappaB信号的抑制就可能阻止由其调控的一系列免疫反应，从而达到治疗各种免疫相关疾病的目的。

目前全世界成千上万的研究报告验证了此分子信号的重要性及阻断其后能达成的治疗效果，但都没有找到一种能对其进行抑制的药物，而其它的对NF-kappaB信号的干涉途径如基因敲除、干扰RNA等方法不能临床应用。

本发明设计人在TLR/MyD88/NF-kappaB方面所作的一系列前期研究，验证了NF-kappaB在移植免疫中起着重要作用，并通过对NF-kappaB基因敲除小鼠的研究证实阻断NF-kappaB能够诱导和维持移植免疫耐受，而且通过这种转基因小鼠作缺血再灌注损伤可以观察到明显的保护作用。在后期的相关研究中，本发明设计人通过反复筛选获得了一种NF-kappaB抑制剂：一种三萜类化合物，能抑制多重致瘤因子导致的肿瘤细胞NF-kappaB活化。进一步的研究表明，熊果酸能抑制TCR促发的NF-kappaB核转位和T细胞活化。单用熊果酸可显著延长同种异体小鼠心脏移植存活时间，联合供者特异性输血(第0天)能诱导供者特异性小鼠心脏移植耐受，而这种耐受的形成主要与同种T细胞清除相关。同时，由于其对缺血再灌注损伤中活性氧族生成的抑制，协同NF-kappaB下游信号阻断而至炎性因子释放减少保护缺血再灌注损伤。

发明内容

本发明的目的在利用一种三萜类化合物作为NF-kappaB抑制剂，利用其对天然免疫中TLR/MYD88/NF-kappaB通路的末端关节点NF-kappaB的阻断作用达到一系列医疗作用，从而治疗多种免疫相关性疾病。

实现本发明的具体技术方案的基础在于，本发明首先提出将此三萜类化合物作为抗移植排斥、抗自身免疫疾病、抗缺血再灌注损伤和抗慢性炎症反应、抗内毒素血症等方面等应用，是利用其对天然免疫中NF-kappaB的活性的抑制作用。

炎症刺激因子与TLR结合后，TLR的胞内TIR区与MyD88的羧基端结合，通过TRAF-6激活NF-kappaB抑制物的激酶(inhibitor of NF-kappaB Kinases，IKKs)复合物。IkappaB在Ikks复合物的作用下磷酸化，磷酸化的IkappaB被泛素连接酶复合物识别发生泛素化而降解。IkappaB的降解使NF-kappaB从静息状态下受IkappaB结合处于的抑制状态得以解除，NF-kappaB转入细胞核中诱导特定基因的表达，启动细胞因子如IL-1、IL-6、IL-8、IL-12等，辅助共刺激分子CD80和CD86等基因的转录。因此熊果酸通过抑制NF-kappaBp65磷酸化及核转位而阻断炎性反应，因而在相关的炎症及免疫疾病治疗方面有重要作用。

活性氧族(ROS)在缺血再灌注损伤过程的早期中期都起非常关键的作用，它由组织细胞缺氧产生，又导致其进一步损伤，加重组织细胞的坏死、凋亡。本发明设计人小鼠肾脏缺血再灌注损伤模型，用熊果酸手术前后处理发现其能有效地抑制缺血再灌注过程中ROS的产生，从而起到保护缺血再灌注损伤的良好效果。故此类NF-kappaB抑制剂熊果酸可用于防止如心梗后缺血再灌注损伤、断肢再植后缺血再灌注损伤、移植物术后的缺血再灌注损伤、器官保存液、细胞保存液等。

本发明所述的NF-kappaB抑制剂熊果酸分子结构如下：

本发明NF-kappaB抑制剂熊果酸分子小，结构稳定，可穿透细胞膜，并可同时在体内外应用。

本发明一种三萜类化合物作为NF-kappaB抑制剂熊果酸，在制备免疫调节类药物上的应用。

本发明一种三萜类化合物作为NF-kappaB抑制剂熊果酸，作为免疫调节剂，在治疗减低移植后排斥反应以及移植免疫耐受诱导和维持方面的应用。

本发明一种三萜类化合物作为NF-kappaB抑制剂熊果酸，作为免疫调节剂，在治疗多种慢性炎症性疾病上的应用。例如慢性炎症性肠病、哮喘等。

本发明一种三萜类化合物作为NF-kappaB抑制剂熊果酸，作为免疫调节剂，在治疗多种自身免疫性疾病上的应用。例如I型糖尿病、多发性硬化症、红斑狼疮等。

本发明一种三萜类化合物作为NF-kappaB抑制剂熊果酸，作为免疫调节剂，在治疗缺血再灌注损伤类疾病上的应用。例如预防和治疗心梗后缺血再灌注损伤、断肢再植后缺血再灌注损伤、移植物术后的缺血再灌注损伤以及器官保存液、细胞保存液的制作等。

本发明一种三萜类化合物作为NF-kappaB抑制剂熊果酸，作为免疫调节剂，在治疗脓毒血症和内毒素血症方面的应用。

本发明的优越性在于，将一种三萜类化合物熊果酸作为NF-kappaB抑制剂应用在实验中，充分证实了该在用于移植后抗排斥和诱导免疫耐受、抗自身免疫疾病、抗缺血再灌注损伤和抗慢性炎症反应、抗内毒素血症等方面具有明显的效果。将是一种有效的免疫抑制剂、或移植耐受诱导剂、或移植耐受维持剂和免疫调节剂。该三萜类化合物能够抑制多重致瘤因子导致的肿瘤细胞NF-kappaB活化，抑制TCR促发的NF-kappaB核转位和T细胞活化，从而起到治疗减低移植后排斥反应以及移植免疫耐受诱导和维持的作用。通过抑制NF-kappaB的活性及下游炎性因子的表达，同时抑制缺血再灌注损伤类疾病中关键活性氧族的生成而导致的损伤，可见，通过NF-kappaB途径阻断可以明显起到对缺血再灌注损伤的保护作用，故此类NF-kappaB抑制剂熊果酸可用于防止如心梗后缺血再灌注损伤、断肢再植后缺血再灌注损伤、移植物术后的缺血再灌注损伤、器官保存液、细胞保存液等许多方面起到重要作用。T细胞NF-kappaBp65核转位、活化已被证明为多种自身免疫性疾病如自身免疫性心肌病、实验自身免疫性葡萄炎、I型糖尿病、多发性硬化症、红斑狼疮等发病的关键步骤之一。体外实验结果表明熊果酸通过抑制NF-kappaB通路能有效减少移植物内炎症因子水平，说明其与炎症因子的产生密切相关，故可能成为各类炎症治疗的有效手段。

附图说明

图1熊果酸剂量依赖性抑制T细胞NF-kappaBp65核转位

图2熊果酸下调T细胞IL-2分泌

图3熊果酸抑制CD3、CD28单抗促发的T细胞活化

图4熊果酸显著延长小鼠心脏移植物存活时间

图5熊果酸减少小鼠心脏移植物中淋巴细胞浸润

图6熊果酸影对小鼠心脏移植物内炎性因子的作用

图7熊果酸联合供者淋巴细胞输注诱导小鼠心脏移植物长期存活

图8熊果酸联合供者淋巴细胞输注诱导小鼠移植耐受

图9熊果酸联合供者淋巴细胞输注处理小鼠脾脏细胞呈现供者抗原特异性低反应

图10熊果酸联合供者淋巴细胞输注对小鼠脾脏CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺细胞百分比无显著影响

图11过继输注实验

图12小鼠肾缺血再灌注损伤肌酐尿素氮水平

图13小鼠肾缺血再灌注损伤生存曲线图

图14熊果酸抑制NF-kappaBp65活性图

图15熊果酸抑制缺血再灌注损伤ROS生成图

图16肾脏缺血再灌注损伤后24小时炎性因子(IL-1，IL-6，TNF-α相对水平)

附图1熊果酸剂量依赖性抑制T细胞NF-kappaBp65核转位。分组分别为：未刺激组，单抗刺激组，单抗刺激+5μM熊果酸组，单抗刺激+10μM熊果酸组，单抗刺激+25μM熊果酸组。

附图2熊果酸剂量依赖性抑制T细胞IL-2分泌。分组为：未刺激组，单抗刺激组，单抗刺激+5μM熊果酸组，单抗刺激+10μM熊果酸组，单抗刺激+25μM熊果酸组。

附图3熊果酸抑制T细胞活化。分组为：未刺激组，单抗刺激组，单抗刺激+25μM熊果酸组。

附图4熊果酸延缓小鼠心脏移植物排斥。分组为：溶剂对照组(0.5％羧甲基纤维素钠)，10mg/(kg.day)熊果酸，20mg/(kg.day)的熊果酸，30mg/(kg.day)的熊果酸。

附图5熊果酸减轻小鼠心脏移植物中淋巴细胞浸润。分组为：溶剂对照组(0.5％羧甲基纤维素钠)和熊果酸组。

附图6熊果酸对小鼠心脏移植物内IFN-γmRNA和IL-4mRNA的影响。分组为：溶剂对照组和熊果酸组。

附图7为小鼠抑制心生存曲线。熊果酸联合合供者淋巴细胞输注诱导小鼠心脏移植物长期存活。分组为：空白对照组，溶剂对照组，DST组，熊果酸组和熊果酸联合DST组。

附图8为二次心脏移植生存曲线图。受体为熊果酸联合DST诱导的心脏移植长期存活小鼠(LTS)，供体分别为BALB/c和C3H，

附图9为IFN-γELISPOT结果图。长期存活小鼠脾脏细胞对供者抗原呈现低反应性，而对三方抗原(C3H)反应正常。

附图10为Treg流式结果图。熊果酸联合DST并不上调小鼠脾脏内CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞百分比。此外，长期存活小鼠(LTS)脾脏细胞中CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞百分比也无上调。

附图11为过继输注后小鼠移植心存活曲线。

附图12小鼠肾缺血再灌注损伤肌酐尿素氮水平。分组：CMC组；熊果酸组；NF-kappaBKO组。

附图13为小鼠肾缺血再灌注损伤生存曲线图。分组：对照组；CMC溶媒组；熊果酸组；NF-kappaBKO组。各组实验小鼠8-9只。

附图14为熊果酸抑制NF-kappaBp65活性图。

附图15为熊果酸抑制缺血再灌注损伤ROS生成图。分组：未处理组；缺血组；熊果酸组，NF-kappaBKO组。

附图16为肾脏缺血再灌注损伤后24小时炎性因子IL-1，IL-6，TNF-α相对水平。

其中，按附图16(a)肾IRI24小时IL-1相对水平，图16(b)肾IRI24小时IL-6相对水平，图16(c)肾IRI24小时TNF-α相对水平。

具体实施方法

应用实例1：熊果酸用于治疗自身免疫性疾病。

1)熊果酸对T细胞NF-kappaBp65核转位的影响

实验分五组，分别为：未刺激组，单抗刺激组，单抗刺激+5μM熊果酸组，单抗刺激+10μM熊果酸组，单抗刺激+25μM熊果酸组。具体实施方法如下：

无菌条件分离C57BL/6小鼠双侧腹股沟、大血管旁及肠系膜***。800目滤网过滤为单细胞悬液，PE-CD3单抗标记细胞，流式细胞仪无菌分选CD3+细胞即为T细胞。分离获取的T细胞以2×10⁶/孔种于已铺好CD3单抗(2μg/mL)96孔培养板。加入CD28单抗，终浓度为1μg/mL。37℃，5％CO2孵育。实验组行熊果酸干预时，先将T细胞同5μM、10μM或25μM的熊果酸孵育2小时，再与CD3、CD28单抗孵育。24小时后，提取核蛋白，NF-kappaBTransFactor测定p65核转位。

未刺激组：单存T细胞培养。

单抗刺激组：T细胞培养体系中加入CD3单抗和CD28单抗。

单抗刺激+5μM熊果酸组：T细胞培养体系中加入CD3单抗，CD28单抗和5μM熊果酸。

单抗刺激+10μM熊果酸组：T细胞培养体系中加入CD3单抗，CD28单抗和10μM熊果酸。

单抗刺激+25μM熊果酸组：T细胞培养体系中加入CD3单抗，CD28单抗和25μM熊果酸。

实验结果见附图1所示。结果显示功能性CD3、CD28单抗可活化p65，促使其向核内转位。熊果酸能抑制这种状态下的p65核转位，且呈现剂量依赖性。

自身免疫疾病的发生过程包括T，B细胞等免疫细胞的识别，增殖和分泌到最后的组织细胞杀伤，因此熊果酸通过抑制T细胞NF-kappaBp65核转位，抑制其信号的下游传递而起到抑制其进一步的激活与增殖杀伤，因此能有效地防止自身免疫性疾病的发生。

应用实施例2：熊果酸用于治疗慢性炎症性疾病。

1)熊果酸对T细胞IL-2分泌的影响

实验分为5组：未刺激组，单抗刺激组，单抗刺激+5μM熊果酸组，单抗刺激+10μ M熊果酸组，单抗刺激+25μM熊果酸组。具体实施方法如下：

无菌条件分离C57BL/6小鼠双侧腹股沟、大血管旁及肠系膜***。800目滤网过滤为单细胞悬液，PE-CD3单抗标记细胞，流式细胞仪无菌分选CD3+细胞即为T细胞。分离获取的T细胞以2×10⁶/孔种于已铺好CD3单抗(2μg/mL)96孔培养板。加入CD28单抗，终浓度为1μg/mL。37℃，5％CO2孵育。实验组行熊果酸干预时，先将T细胞同5μM、10μM或25μM的熊果酸孵育2小时，再与CD3、CD28单抗孵育。48小时后，收集细胞上清，ELISA测定其中IL-2含量。

实验结果见附图2所示。结果显示熊果酸可剂量依赖性抑制T细胞IL-2分泌。

慢性炎症的过程包括变质、渗出、增生。其中典型的炎性细胞有嗜中性粒细胞，巨噬细胞，淋巴细胞如T，B细胞等。可以看出，熊果酸通过抑制炎性细胞的分泌，炎性因子的释放从而起到了治疗慢性炎症的作用。

应用实施例3：熊果酸用于治疗内毒素血症以及脓毒血症。

1)熊果酸对T细胞活化的影响

实验分为3组：未刺激组，单抗刺激组，单抗刺激+25μM熊果酸组，具体实施方法如下：

无菌条件分离C57BL/6小鼠双侧腹股沟、大血管旁及肠系膜***。800目滤网过滤为单细胞悬液，PE-CD3单抗标记细胞，流式细胞仪无菌分选CD3+细胞即为T细胞。分离获取的T细胞以2×10⁶/孔种于已铺好CD3单抗(2μg/mL)96孔培养板。加入CD28单抗，终浓度为1μg/mL。37℃，5％CO2孵育。实验组行熊果酸干预时，先将T细胞同25μM的熊果酸孵育2小时，再与CD3、CD28单抗孵育。48小时后，收集细胞，流式细胞仪检测CD25⁺，CD69⁺细胞百分比。

实验结果见附图3。功能性CD3、CD28单抗与T细胞共孵育48小时后，T细胞表面CD25、CD69分子分别由3.14％和7.32％上升到74.4％和50.9％。而25μM的熊果酸则可使CD25下调92.4％，至5.65％(p＜0.05，VS单抗刺激组)，CD69下调89.3％，至5.44％(p＜0.05，VS单抗刺激组)。

以上实验结果说明，熊果酸在体外可抑制CD3/CD28单抗刺激促发的小鼠T细胞NF-kappaB核转位、T细胞活化。而T细胞的活化在内毒素血症和脓毒血症的病理过程中起到关键的作用，因此熊果酸能够有效地减轻内毒素血症和脓毒血症的发生。

应用实例4：熊果酸用于移植后抗排斥反应和诱导移植免疫耐受。

体内单独应用熊果酸对同种异体小鼠心脏移植物存活的影响。

1)熊果酸对小鼠心脏移植物存活时间的影响

具体实施方法如下：采用C57BL/6(B6，H2b)到BALB/c(H2d)的腹部异位心脏移植模型，供心主动脉、肺动脉分别与受鼠腹主动脉、下腔静脉吻合。术后每日扪诊移植心搏动情况，心脏停跳定义为整个心脏完全停止搏动，并通过解剖确认。熊果酸以0.5％羧甲基纤维素钠混悬。实验组分别灌胃给予10mg/(kg.day)、30mg/(kg.day)的熊果酸。对照组每日给予相同剂量0.5％羧甲基纤维素钠。

实验结果见附图4。对照组移植心平均存活时间(mean survival time，MST)为7.4±0.3天。10mg/(kg.day)的熊果酸可将移植心MST延长至23.8±1.3天(p＜0.05，VS对照组，n＝5)。加大熊果酸剂量，移植心存活时间进一步延长，30mg/(kg.day)的熊果酸使小鼠移植心MST延至68.5±2.8天(n＝5)。

2)熊果酸对小鼠心脏移植物细胞浸润的作用

具体实施方法如下：术后7天切取移植心。甲醛固定标本常规方法行HE染色。免疫组化采用冰冻切片染色CD4⁺和CD8⁺细胞，高倍镜下随机选取5个视野计数阳性细胞数。分组为：溶剂对照组(0.5％羧甲基纤维素钠)，熊果酸组。

实验结果见附图5。术后7天移植心HE染色见熊果酸组(n＝10)排斥明显轻于对照组(n＝5)，免疫组化显示熊果酸组CD4+T细胞及CD8+T细胞浸润数量明显少于对照组(图3)。

3)熊果酸对小鼠心脏移植物中炎性因子的影响

具体实施方法如下：TRIzol提取术后7天移植心总RNA，逆转录为cDNA。Rotor Gene 3000行定量PCR。引物如下：GAPDH：正向引物为5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′，逆向引物为5′-TTCAGCTCTGGGATGACCTT-3′；IFN-γ：正向引物为5′-AAGTGGCATAGATGTGGAAGAAAA-3′，逆向引物为5′-CTGGACCTGTGGGTTGTTGAC-3′；IL-4：正向引物为5′-ACTTGAGAGAGATCATCGGCA-3′，逆向引物为5′-AGCTCCATGAGAACACTAGAGTT-3′。以上基因扩增条件均为：95℃10秒，50℃15秒，72℃30秒，共40个循环。

实验结果见附图6。熊果酸能下调移植物内IFN-γmRNA，而对IL-4mRNA无显著影响。

以上实验结果表明体内应用熊果酸能显著延缓同种异体移植心排斥时间，这与熊果酸抑制T细胞活化，下调Th1反应相关。但是，大剂量的熊果酸并不能获得移植物的长期存活，其原因可能有以下两个原因：①熊果酸对NF-kappaB的效应是抑制而非完全封闭。②熊果酸对NF-kappaB的抑制效应是全身性的，不具有细胞特异性。这提示若想通过熊果酸达到小鼠移植耐受，可能需要另外辅以其它免疫干预手段。

2.熊果酸联合供者淋巴细胞输注(DST)诱导小鼠心脏移植耐受

1)熊果酸联合DST诱导小鼠心脏移植物长期存活

实验分5组，分别为空白对照组，溶剂对照组，DST组，熊果酸组和熊果酸联合DST组。

具体实施方法如下：

采用C57BL/6(B6，H2b)到BALB/c(H2d)的腹部异位心脏移植模型，供心主动脉、肺动脉分别与

受鼠腹主动脉、下腔静脉吻合。术后每日扪诊移植心搏动情况，心脏停跳定义为整个心脏完全停止搏动，并通过解剖确认。空白对照组仅行心脏移植；溶剂对照组自术前1天到术后14天30mg/(kg.day)的羧甲基纤维素钠灌胃；DST组在手术当天自眼球后输入1×107BALB/c脾脏细胞；熊果酸组自手术前1天至术后14天每天给予30mg/(kg.day)的熊果酸灌胃；熊果酸联合DST组在手术当天输注1×107BALB/c脾脏细胞，并自手术前1天至术后14天每天给予30mg/(kg.day)的熊果酸灌胃。

实验结果见附图7。空白对照组移植心平均存活时间(mean survival time，MST)为7.4±0.3天；溶剂对照组的MST为7.8±05天；DST组MST为8±0.7天；熊果酸组MST为36.8±0.6天。而熊果酸联合DST组84.6％的移植心存活超过150天。

2)熊果酸联合DST诱导供者特异性的移植耐受

对长期存活的小鼠(1ong term survival，LTS)行第二次心脏移植，观察二次移植心存活时间。并提取LTS脾脏细胞，与供者及三房脾脏细胞性混合淋巴细胞培养，ELISPOT检测IFN-γ水平。具体实施方法如下：

(1)二次心脏移植：受体为LTS，供体分别为BALB/c和C3H，行颈部心脏移植。术后每日扪诊移植心搏动情况，心脏停跳定义为整个心脏完全停止搏动，并通过解剖确认。

(2)ELISPOT：提取野生型C57BL/6，刚排斥BALB/c心脏的C57BL/6，LTS，以及野生型C57BL/6脾脏细胞作为反应细胞。野生型C57BL/6，野生型C57BL/6及C3H小鼠脾脏细胞用丝裂霉素处理后作为刺激细胞。共同孵育48小时，加入生物素标记抗体孵育2小时，然后加入过氧化物酶反应45分钟，AEC底物加入反应4分钟。采用ImmunoSpotAnalyzer计数斑点。

实验结果见附图8和附图9。附图8显示LTS持久不排斥二次供者来源的心脏移植物，而迅速排斥第三方的心脏移植物。附图9显示LTS脾脏细胞对供者抗原呈现低反应性，而对三方抗原(C3H)反应正常。

3)熊果酸联合DST诱导供者特异性的移植耐受机制的探讨

(1)检测各种处理方案以及长期存活小鼠(LTS)脾脏细胞中CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺细胞百分比。术后。具体方法如下：

i.分离各组小鼠脾脏淋巴细胞。

ii.每管流式管中加入100ul细胞，同时加入CD4和CD25抗体，4℃孵育30分钟。

iii.洗涤细胞后，加入固定液，4℃孵育30分钟。

iv.破膜液洗涤细胞后，加入Foxp3抗体，，4℃孵育30分钟。

v.上流式检测。

(2)过继性输注实验

共采用5种输注方案：给基因背景为C57BL/6的小鼠移植BALB/c来源的心脏，25天后，

①1×10⁷B6脾脏细胞输注给RAG^-/-小鼠；

②1×10⁷LTS脾脏细胞输注给RAG^-/-小鼠；

③1×10⁷B6和1×10⁷LTS脾脏细胞输注给RAG^-/-小鼠；

④1×10⁷LTS刚排斥BALB/c心脏的B6小鼠脾脏细胞给RAG^-/-小鼠；

⑤1×10⁷LTS刚排斥BALB/c心脏的B6小鼠脾脏细胞给LTS。

观察受体移植心存活情况。

实验结果见附图10和附图11。附图10显示熊果酸联合DST并不上调小鼠脾脏内CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞百分比。此外，长期存活小鼠(LTS)脾脏细胞中CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞百分比也无上调。附图11显示LTS小鼠脾脏细胞不具有足够的控制野生型B6细胞同种异体排斥反应的调节能力。

以上实验结果表明熊果酸联合DST可以诱导供者特异性的移植耐受，而调节机制在这种耐受中似乎并不占有主导地位。供者反应性T细胞清除可能是次模型种耐受建立和维持的主要机制。

应用实例5：熊果酸保护肾脏缺血再灌注损伤。

1)熊果酸降低肾脏缺血再灌注损伤死亡率，降低血尿素氮、肌酐水平

动物实验部分：1.分组：普通C57bl/6组(Contro1)，CMC溶媒组，MYD88KO组， TJ-M2010组各组8只做缺血再灌注处理：麻醉，血管夹阻断左侧肾脏，置温箱31°，80min后开放并切除右侧肾脏，关腹。24小时取血用于BUN，Cr检测。

2.TJ-M2010组和CMC组，术前1天和手术当天分别腹腔注射溶于0.5％CMC的TJ-M2010，150mg/kg/d；CMC组：0.5％CMC溶液，200μl。

3.观察小鼠生存时间，做生存曲线。血标本送病理科做BUN，Cr检测。

4.结果显示熊果酸显著提高小鼠肾脏IRI后生存率，而且对肾功能有很好的保护效果

2)熊果酸保护肾脏缺血再灌注损伤机制探讨：

3)抑制ROS生成，抑制NF-kappaB活性及下游炎性因子水平。

A.ROS检测：

1.5mg/ml组织匀浆(用预冷的Locke’s buffer PH7.4)，滤网过滤，冰上操作，12000gX10min

2.反应液1ml(0.2ml匀浆上清液+10ul DCFH-DA+0.8ml Locke’s buffer)室温孵育15min+30min左右

3.酶标仪检测荧光。激发：484nm，检测：530nm。

4.数据分析用DCFH-DA不加匀浆液做背景荧光校正，通过DCF标准曲线定量B.NF-kappaB活性检测：24小时取IRI肾脏标本(冰上操作)，提取核蛋白，EMSA检测NF-kappaB活性。

下游炎性因子水平real-time检测：

1.24h取阻断60min的IRI肾脏，trizol法提取总RNA

2.逆转录：小心混匀，短暂离心，42℃水浴60min，70℃ 5min终止反应

3.上机做Real-time PCR，得到OD值，计算炎性因子(IL-1，IL-6，TNF-α)相对水平。

结果见附图16(a)，16(b)，16(c)，可见熊果酸治疗组明显降低肾脏IRI后炎性因子(IL-1，IL-6，TNF-α)水平。

由以上实验可见NF-kappaB途径阻断可以明显起到对缺血再灌注损伤的保护作用，故NF-kappaB抑制剂可用于防止如心梗后缺血再灌注损伤、断肢再植后缺血再灌注损伤、移植物术后的缺血再灌注损伤、器官保存液、细胞保存液等许多方面起到重要作用。

Claims

1.一种NF-kappaB抑制剂熊果酸，其分子结构式：

其特征在于：将NF-kappaB抑制剂作为免疫调节剂熊果酸，在医疗上的应用。

2.按权利要求1所述一种NF-kappaB抑制剂熊果酸其特征在于：作为免疫调节剂，用于制备免疫抑制剂类药物，在治疗减低移植后排斥反应以及移植免疫耐受诱导和维持方面的应用。

3.按权利要求1所述一种NF-kappaB抑制剂熊果酸其特征在于：作为免疫调节剂，用于作为抗炎药物，在治疗多种慢性炎症性疾病上的应用。

4.按权利要求1所述一种NF-kappaB抑制剂熊果酸其特征在于：作为免疫调节剂，用于制备自身免疫治疗药物，在治疗多种自身免疫性疾病上的应用。

5.按权利要求1所述一种NF-kappaB抑制剂熊果酸其特征在于：作为免疫调节剂，用于制备缺血再灌注损伤保护剂，在治疗缺血再灌注损伤类疾病上的应用。

6.按权利要求1所述一种NF-kappaB抑制剂熊果酸其特征在于：作为免疫调节剂，用于制备内毒素血症和脓毒血症防治药物，用于内毒素血症和脓毒血症防治上的应用。