CN102206235A - 可溶于水体系的磷光铱配合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明可溶于水体系的磷光铱配合物及其制备方法属于化学/生物传感器技术领域，具体涉及一类基于铱配合物的水溶性半胱氨酸和高半胱氨酸磷光探针的制备方法及其在细胞标记、成像领域中的应用。该类配合物材料利用C^N配体中醛基与半胱氨酸和高半胱氨酸的氨基和巯基发生环化反应生成噻唑环，导致铱配合物的磷光发射增强；利用含季铵盐，磷酸盐，磺酸盐，羧酸盐的N^N配体实现水溶性，从而实现在水溶液中对半胱氨酸和高半胱氨酸的检测。

Description

可溶于水体系的磷光铱配合物及其制备方法

技术领域

本发明属于化学/生物传感器技术领域，具体涉及一类基于铱配合物的水溶性半胱氨酸和高半胱氨酸磷光探针的制备方法及其在细胞标记、成像领域中的应用。

背景技术

含巯基的氨基酸如半胱氨酸和高半胱氨酸(图1)对维持人体生理平衡起着关键的作用。例如，半胱氨酸和高半胱氨酸对细胞与生物体内组织器官的生长是必不可少的。半胱氨酸的缺乏会造成严重的人体健康问题，如生长缓慢、头发脱色、皮肤损伤、肌肉和脂肪损失以及肝脏损害等。而缺乏高半胱氨酸更加危险，它能导致老年痴呆症、心血管疾病与骨质疏松症等疾病。所以，检测半胱氨酸与高半胱氨酸意义重大。

半胱氨酸和高半胱氨酸的分子结构

在现有的检测生物硫醇的技术中，荧光化学传感器因其简便与通用性而得到广泛应用。相比有机荧光，具有d⁶、d⁸和d¹⁰电子结构的磷光重金属配合物具有优异的光物理性质，如大的斯托克斯位移可以很容易区分激发和发射峰，能使用可见光进行激发，长的发射寿命有利于使用时间分辨技术有效地与背景荧光信号区分开以提高检测的信噪比和灵敏度等。

然而，大多数的金属配合物磷光探针仅限于检测有机溶液中的半胱氨酸和高半胱氨酸。到目前为止，仅少数探针能通过荧光共焦显微镜检测细胞中的半胱氨酸和高半胱氨酸。其关键问题在于目前所报道的金属配合物磷光探针的水溶性不好，要实现细胞中检测半胱氨酸和高半胱氨酸，水和有机溶剂，如二甲基亚砜的混合溶剂是成像实验必需的，而有机溶剂对细胞具有毒性。因此，有必要发展全新的、完全水溶的金属配合物半胱氨酸和高半胱氨酸磷光探针以及活细胞磷光探针。

发明内容

技术问题：本发明的目的在于提供一类可溶于水体系的磷光铱配合物，给出它们的制备方法，并提出这类配合物在检测半胱氨酸和高半胱氨酸及其在细胞标记、成像中的应用。利用紫外-可见吸收光谱、荧光发射光谱检测配合物对半胱氨酸和高半胱氨酸的响应性能。

技术方案：本发明的可溶于水体系的磷光铱配合物具有如下结构式：

其中，

BF₄ ^-、Cl^-或Br^-，R分别代表：

其中，

Br^-或I^-，Z＝H或Na。制备方法路线如下：

具体是将4-(2-吡啶基)-苯甲醛与IrCl₃·3H₂O在2-乙氧基乙醇和水的混合比为3∶1/v∶v的溶剂中回流反应24小时，得到的二氯桥中间体与邻菲咯啉衍生物，在二氯甲烷与甲醇的混合比为2∶1/v∶v的溶剂中回流4小时，然后加入需要交换的离子盐室温搅拌1小时后，旋出溶剂，将得的固体用柱层析方法分离，即得到所述铱配合物。

有益效果：通过核磁共振(NMR)、色质联机(GCMS)、基质辅助激光解析时间飞行质谱(MALDI-TOF-MS)等表征铱配合物材料及中间体的结构，利用紫外吸收光谱、荧光发射光谱检测半胱氨酸和高半胱氨酸的加入对光物理性质，以及对能量传递过程的影响。

本发明C^N配体中醛基与半胱氨酸和高半胱氨酸的氨基和巯基发生环化反应生成噻唑环，导致铱配合物的磷光发射增强；利用含季铵盐，磷酸盐，磺酸盐，羧酸盐的N^N配体实现水溶性，从而实现在水体系中对半胱氨酸和高半胱氨酸的检测。

附图说明

图1.本发明中合成的配合物对半胱氨酸及高半胱氨酸的紫外-可见光谱变化图。图1a为半胱氨酸，图1b为高半胱氨酸。

图2.本发明中合成的配合物对半胱氨酸及高半胱氨酸的荧光发射光谱变化图。图2a为半胱氨酸，图2b为高半胱氨酸。

图3.本发明中合成的配合物的选择性测试。

具体实施方式

本发明提出用于在水体系中检测半胱氨酸和高半胱氨酸的磷光铱配合物，其具体结构式为：

其中，BF₄ ^-、Cl^-或Br^-，R可分别代表：

其中，Br^-或I^-，Z＝H或Na。

本发明提出的水溶性磷光铱配合物其制合成路线如下：

具体是将4-(2-吡啶基)-苯甲醛与IrCl₃·3H₂O在2-乙氧基乙醇和水的混和溶剂(3∶1/v∶v)中回流反应24小时，得到的二氯桥中间体与邻菲咯啉衍生物在二氯甲烷与甲醇的混合溶剂(2∶1/v∶v)中回流4小时，然后加入需要交换的离子盐室温搅拌1小时后，旋出溶剂，将得的固体用柱层析方法分离，即得到所述铱配合物。

具有水溶性磷光铱配合物的应用为：半胱氨酸和高半胱氨酸的检测、细胞标记和成像。

为了更好地理解本发明专利的内容，下面通过具体的实例来进一步说明本发明的技术方案。具体包括合成、性质测定、滴定实验。但这些实施例并不限制本发明。

实施例1、水溶性铱配合物的制备：

化合物1：5-硝基-1，10-邻菲咯啉的制备

在圆底烧瓶中加入5g 1，10-邻菲咯啉水合物，加入30mL浓硫酸溶解，然后逐滴加入15mL发烟硝酸，加热溶液使其温度保持在160-170℃，反应回流2小时。反应完毕，使其冷却至室温，之后将溶液倾倒入冰水中。加入浓度为10％的氢氧化钠溶液把pH调为3。析出的黄色沉淀为产物，抽滤，用清水洗并在真空中干燥。得5g(88％)淡黄色固体。GC-MS(EI-m/z)：225(M⁺)

化合物2：5-氨基-1，10-邻菲咯啉的制备

将1.889g 5-硝基-1，10-邻菲咯啉溶解在150mL无水乙醇中，加入0.378g 5％Pd/C催化剂，在氮气保护下加热到70℃，然后逐滴加入150mL无水乙醇与1.3g水合肼混合液，回流反应5h。反应完成后，让其冷却至室温，趁热过滤掉Pd/C催化剂，用乙醇洗涤数次。将滤液蒸去大部分乙醇，冷却，析出黄色固体，抽滤，干燥，用乙醇重结晶，得黄色针状固体(1.42g，76％)。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)9.21(d，1H)，8.95(d，1H)，8.28(d，1H)，7.99(d，1H)，7.66(dd，1H)，7.52(dd，1H)，6.9(s，1H)，4.3(s，2H).

化合物3：N^N配体(cpa)的制备

将0.3g 5-氨基-1，10-邻菲咯啉溶解在55mL无水四氢呋喃中，加入0.22mL三乙胺，在氮气保护下搅拌30min。然后将混合液降至0℃，逐滴加入5mL四氢呋喃与0.22mL氯乙酰氯的混合液，室温搅拌过夜。反应完成后，用5％碳酸氢钠水溶液清洗，收集有机层，旋干，用水和***清洗，得棕色固体(0.241g；59％)。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)9.26(d，1H)，9.18(d，1H)，8.95(s，1H)，8.38(s，1H)，8.33(d，1H)，8.26(d，1H)，7.72-7.75(dd，1H)，7.66-7.69(dd，1H)，4.43(s，2H).

化合物4：4-(2-吡啶基)-苯甲醛二氯桥的制备

称取IrCl₃·3H₂O(1mmol)和4-(2-吡啶基)-苯甲醛(2.5mmol)加入到三口烧瓶中，在双排管上抽真空-充氮气-抽真空，循环三次，最后用氮气保护反应体系。将2-乙氧基乙醇和水的混合物(3∶1/v∶v)用注射器注入到反应体系中，搅拌，并将反应体系升温至110℃，反应时间为24小时左右，反应过程中有沉淀生成。将反应体系冷却至室温，然后将沉淀过滤，并用水、乙醇洗，得到固体产物，即。产率：68％

化合物5：铱配合物[Ir(bpa)₂cpa]⁺PF₆ ^-的制备

称取铱二氯桥化合物121mg和N^N配体(cpa)68mg加入到双颈瓶中，再加入15mL CH₂Cl₂和甲醇的混合溶剂(2∶1/v∶v)，磁搅拌下回流。4小时后，降至室温，加入5倍当量的六氟磷酸钾(KPF₆)，继续搅拌约1小时后，减压旋蒸除去溶剂，将所得固体混合物再溶于约10mL的CH₂Cl₂中，将不溶物过滤除去，滤液减压旋蒸除去溶剂后所得固体用柱层析(二氯甲烷/丙酮)分离得到纯品。产率：69％¹H NMR(400MHz，CDCl₃)9.76(d，2H)，9.24(s，1H)，8.80(d，1H)，8.52-8.55(d，2H)，8.23(d，1H)，8.19(d，1H)，8.04-8.09(dd，2H)，7.84-7.91(m，4H)，7.74-7.77(dd，1H)，7.58-7.61(t，2H)，7.43-7.46(t，2H)，7.11-7.13(t，1H)，7.11-7.13(t，1H)，7.05-7.07(t，1H)，6.80-6.83(d，2H)，4.40(d，2H).

化合物6：铱配合物[Ir(bpa)₂pto]PF₆ ^-的制备在N₂保护条件下，将1当量的铱配合物溶于二甲基甲酰胺溶液中，滴加10当量三乙胺，升温至110℃回流搅拌反应3小时；冷却至室温后，旋出二甲基甲酰胺溶液，将旋得的固体溶于少量二氯甲烷后用柱层析方法分离，旋除展开剂并真空干燥，即得到水溶性铱配合物。产率：37％¹H NMR(400MHz，CDCl₃)9.76(s，2H)，8.75(s，1H)，8.55(d，1H)，8.19(d，1H)，8.06-8.09(t，3H)，7.84-7.91(m，5H)，7.68-7.72(dd，1H)，7.58-7.60(m，2H)，7.42(d，1H)，7.38(d，1H)，7.03-7.07(t，2H)，7.02-7.10(m，2H)，6.81-6.84(dd，2H)，3.66-3.72(dd，6H)，1.46-1.49(t，9H).m/e 893.7(M-PF₆).

实施例2：配合物对半胱氨酸和高半胱氨酸响应的紫外-可见光谱测试：配置20μM的配合物溶液(纯水作溶剂)，移取2mL配合物溶液于荧光比色皿中，逐渐滴加入0-200eq纯水作溶剂的半胱氨酸和高半胱氨酸溶液，直至达到平衡(即光谱不再明显变化)，分别测得不加和滴加不同含量的半胱氨酸和高半胱氨酸的紫外-可见发光谱图，如图1。测试数据表明：随着半胱氨酸和高半胱氨酸的加入，320nm与430nm附近的吸收峰下降。

实施例3：配合物对半胱氨酸和高半胱氨酸响应的荧光发射光谱测试：配置20μM的配合物溶液(纯水作溶剂)，移取2mL配合物溶液于荧光比色皿中，逐渐滴加入0-200eq纯水作溶剂的半胱氨酸和高半胱氨酸溶液，直至达到平衡(即光谱不再明显变化)，分别测得不加和滴加不同含量的半胱氨酸和高半胱氨酸的荧光发射光谱图，如图2。测试数据表明：随着半胱氨酸和高半胱氨酸的加入，发射强度逐渐增大。

实施例4：选择性实验：配置20μM的配合物溶液(纯水作溶剂)，移取2mL配合物溶液于荧光比色皿中，分别加入200eq纯水作溶剂的不同氨基酸，达到平衡后测试，如图3。测试数据表明：该类配合物对除半胱氨酸和高半胱氨酸外的其它氨基酸无响应。

实施例5：活细胞成像实验：

将铱配合物配制成10mmol的溶液，移取20uL溶液到2000uL PBS缓冲溶液中使其浓度稀释至10μM。取2mL溶液孵育细胞30分钟后用PBS缓冲液清洗细胞3-5次，用405nm波长激发细胞共聚焦成像，Z扫描。测试数据表明：水溶性铱配合物具有良好的细胞穿透性，分布在细胞质区域。

Claims (2)

1.一种可溶于水体系的磷光铱配合物，其特征在于该铱配合物具有如下结构式：

其中，

BF₄ ^-、Cl^-或Br^-，R分别代表：

其中，

Br^-或I^-，Z＝H或Na。

2.一种如权利要求1所述的可溶于水体系的磷光铱配合物的制备方法，其特征在于制备方法路线如下：

具体是将4-(2-吡啶基)-苯甲醛与IrCl₃·3H₂O在2-乙氧基乙醇和水的混合比为3∶1/v∶v的溶剂中回流反应24小时，得到的二氯桥中间体与邻菲咯啉衍生物，在二氯甲烷与甲醇的混合比为2∶1/v∶v的溶剂中回流4小时，然后加入需要交换的离子盐室温搅拌1小时后，旋出溶剂，将得的固体用柱层析方法分离，即得到所述铱配合物。

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