CN102204933B - 一种抗肿瘤生物制品的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗肿瘤生物制品的制备方法，将鸡胚接种新城疫病毒之后，收取尿囊液，经过超滤浓缩后，再进行纯化，最后进行裂解处理即得；所述抗肿瘤生物制品的制备方法，使病毒液的血凝效价明显提高，大大提高了新城疫病毒的纯度，减少病毒中卵清蛋白等杂蛋白，减少了病毒对人体的副作用，提高了NDV病毒的抗肿瘤作用，具有非常重要的应用价值和经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种抗肿瘤生物制品的制备方法。
背景技术
新城疫病毒(NDV)在人类肿瘤性疾病生物防控中具有较高的研究和应用价值。到目前为止，用新城疫病毒治疗的肿瘤包括全身多种恶性肿瘤，其中小鼠的有艾氏腹水癌(Ehrlich)、腹水型肝癌(H22)、肉瘤S180(腹水型及皮下实体瘤)、***、小鼠肥大细胞瘤(P815)、白血病(P388)、骨髓瘤等；人类肿瘤有消化道肿瘤(包括胃癌、结、直肠癌等)、恶性黑色素瘤、肾细胞癌、神经纤维瘤、纤维肉瘤、鼻咽癌、***癌、膀胱移行细胞癌、乳腺癌、头颈部肿瘤、肝癌等。新城疫病毒的抗肿瘤作用机制的研究较多，综合考虑有如下几个方面：1.新城疫病毒对肿瘤细胞的直接、特异性杀伤作用。它能吸附于肿瘤细胞膜上，使肿瘤细胞膜通透性增加，并在肿瘤细胞质中选择性的复制而不依赖于细胞的增殖，引起细胞与细胞的融合及多核体的形成，最终导致肿瘤细胞裂解并死亡，同时可降低肿瘤细胞的成瘤性及转移能力，对于机体内潜藏的少量癌细胞具有杀灭作用。2.新城疫病毒的非特异性免疫刺激作用。NDV感染肿瘤细胞后，诱导机体产生的细胞因子、趋化因子和其它基因产物达12种以上，其中包括IFNα、β，TNFα，单核细胞集落刺激因子、RANTES、NFkB等。这些产物的生物学意义在于干扰病毒复制的同时诱导细胞进入凋亡程序，使感染不能持续，这在NDV免疫***的作用中是非常重要的。其中NDV诱导的干扰素(IFNs)能够加强免疫细胞的识别和杀伤功能，活化NK细胞、巨噬细胞及致敏T淋巴细胞，促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用，同时，在抗肿瘤CTL的应答方面也具有重要的作用。3.新城疫病毒可诱导肿瘤细胞凋亡。
然而，随着新城疫病毒感染剂量过大，瘤组织或瘤体内的病毒含量过高，病毒的毒副作用可能也会增加，机体免疫***的负荷也会相应增加，使病毒感染的肿瘤细胞不能被有效的排除而影响疗效。因此，通过改善抗肿瘤生物制品的制备方法，提高新城疫病毒纯度，减少病毒中卵清蛋白等杂蛋白，以便减少病毒用量及对人体的副作用，从而提高NDV病毒的抗肿瘤作用，具有非常重要的应用价值和经济价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种抗肿瘤生物制品的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种抗肿瘤生物制品的制备方法，将鸡胚接种新城疫病毒之后，收取尿囊液，经过超滤浓缩后，再进行纯化，最后进行裂解处理，具体步骤为：
(1)病毒接种：
画出气室和接种部位，在无菌条件下将鸡胚在接种部位打个小孔，取新城疫病毒液0.2ml注入鸡胚内并用石蜡封口，于37℃培养96～130小时；
(2)收获尿囊液：
在无菌条件下对步骤(1)培养后的鸡胚进行消毒后敲碎蛋壳，扒开囊膜后用无菌吸管吸取尿囊液，将收获完的尿囊液进行收集、测效价；
(3)超滤浓缩：
在无菌环境下通过超滤***对步骤(2)的尿囊液超滤浓缩，其中超滤膜包截留分子量为300Kd；
(4)纯化：
在无菌条件下将步骤(3)中浓缩后的尿囊液打入层析柱中进行纯化；
(5)裂解：
在无菌条件下收集步骤(4)中纯化后的尿囊液，每100ml尿囊液中加入1ml裂解剂Trition-100，振摇1～2小时，室温裂解4小时，即得。
优选的，抗肿瘤生物制品的制备方法，所述步骤(1)中注入新城疫病毒液前的鸡胚是9～11日龄的鸡胚。
优选的，抗肿瘤生物制品的制备方法，所述步骤(1)中注入新城疫病毒液前的鸡胚是选择受精鸡蛋放37℃～40℃孵化9天左右，检出除去死胚和寡蛋后得到的。
优选的，抗肿瘤生物制品的制备方法，所述步骤(1)中注入新城疫病毒液后的鸡胚培养时间为96小时。
优选的，抗肿瘤生物制品的制备方法，所述步骤(4)中层析柱通过凝胶层析对尿囊液过滤纯化。
优选的，抗肿瘤生物制品的制备方法，所述步骤(5)中尿囊液中裂解病毒用生理盐水调节血凝效价为1∶640。
本发明的有益效果是：
上述抗肿瘤生物制品的制备方法，使病毒液的血凝效价明显降低，大大提高了新城疫病毒的纯度，减少病毒中卵清蛋白等杂蛋白，减少了病毒对人体的副作用，提高了NDV病毒的抗肿瘤作用，具有非常重要的应用价值和经济价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
实施例1
一、鸡胚选择：
选择受精鸡蛋放38℃孵化9天左右，检出除去死胚和寡蛋；
二、病毒接种：
1、新城疫病毒接种的前一天画出气室和接种部位；
2、次日在无菌条件下将鸡胚在接种部位打个小孔；
3、用1ml注射器吸取新城疫病毒的病毒液0.2ml，注入鸡胚内并用石蜡封口；
4、于37℃培养96小时；
三、收获尿囊液：
1、在无菌条件下对培养四天的鸡胚进行消毒；
2、用无菌的大镊子敲碎蛋壳，用无菌的小镊子扒开囊膜，用无菌吸管吸取尿囊液；
3、将收获完的尿囊液收集到一个瓶子里，测效价；
四、超滤浓缩：
在无菌环境下通过超滤***对尿囊液超滤浓缩至原来的5倍，其中超滤膜包截留分子量为300Kd，膜包0.1m2；
五、纯化：
将浓缩后的尿囊液拿进无菌室，在无菌条件下将尿囊液打入层析柱中，层析柱通过凝胶层析对尿囊液过滤纯化。
六、裂解：
将纯化后的尿囊液在无菌条件下按照每100ml尿囊液加入1ml裂解剂Trition-100，振摇1小时，室温裂解4小时后将裂解病毒用生理盐水调节血凝效价为1∶640。
实施例2
一、鸡胚选择：
选择受精鸡蛋放37孵化9天左右，检出除去死胚和寡蛋；
二、病毒接种：
1、新城疫病毒接种的前一天画出气室和接种部位；
2、次日在无菌条件下将鸡胚在接种部位打个小孔；
3、用1ml注射器吸取新城疫病毒的病毒液0.2ml，注入鸡胚内并用石蜡封口；
4、于37℃培养130小时；
三、收获尿囊液：
1、在无菌条件下对培养四天的鸡胚进行消毒；
2、用无菌的大镊子敲碎蛋壳，用无菌的小镊子扒开囊膜，用无菌吸管吸取尿囊液；
3、将收获完的尿囊液收集到一个瓶子里，测效价；
四、超滤浓缩：
在无菌环境下通过超滤***对尿囊液超滤浓缩至原来的5倍，其中超滤膜包截留分子量为300Kd，膜包0.1m2；
五、纯化：
将浓缩后的尿囊液拿进无菌室，在无菌条件下将尿囊液打入层析柱中，层析柱通过凝胶层析对尿囊液过滤纯化。
六、裂解：
将纯化后的尿囊液在无菌条件下按照每100ml尿囊液加入1ml裂解剂Trition-100，振摇1小时，室温裂解4小时后将裂解病毒用生理盐水调节血凝效价为1∶640。
实施例3
一、鸡胚选择：
选择受精鸡蛋放40℃孵化9天左右，检出除去死胚和寡蛋；
二、病毒接种：
1、新城疫病毒接种的前一天画出气室和接种部位；
2、次日在无菌条件下将鸡胚在接种部位打个小孔；
3、用1ml注射器吸取新城疫病毒的病毒液0.2ml，注入鸡胚内并用石蜡封口；
4、于37℃培养130小时；
三、收获尿囊液：
1、在无菌条件下对培养四天的鸡胚进行消毒；
2、用无菌的大镊子敲碎蛋壳，用无菌的小镊子扒开囊膜，用无菌吸管吸取尿囊液；
3、将收获完的尿囊液收集到一个瓶子里，测效价；
四、超滤浓缩：
在无菌环境下通过超滤***对尿囊液超滤浓缩至原来的5倍，其中超滤膜包截留分子量为300Kd，膜包0.1m2；
五、纯化：
将浓缩后的尿囊液拿进无菌室，在无菌条件下将尿囊液打入层析柱中，层析柱通过凝胶层析对尿囊液过滤纯化。
六、裂解：
将纯化后的尿囊液在无菌条件下按照每100ml尿囊液加入1ml裂解剂Trition-100，振摇1小时，室温裂解4小时后将裂解病毒用生理盐水调节血凝效价为1∶640。
实施例4
一、鸡胚选择：
选择受精鸡蛋放39℃孵化10天左右，检出除去死胚和寡蛋；
二、病毒接种：
1、新城疫病毒接种的前一天画出气室和接种部位；
2、次日在无菌条件下将鸡胚在接种部位打个小孔；
3、用1ml注射器吸取新城疫病毒的病毒液0.2ml，注入鸡胚内并用石蜡封口；
4、于37℃培养115小时；
三、收获尿囊液：
1、在无菌条件下对培养四天的鸡胚进行消毒；
2、用无菌的大镊子敲碎蛋壳，用无菌的小镊子扒开囊膜，用无菌吸管吸取尿囊液；
3、将收获完的尿囊液收集到一个瓶子里，测效价；
四、超滤浓缩：
在无菌环境下通过超滤***对尿囊液超滤浓缩至原来的5倍，其中超滤膜包截留分子量为300Kd，膜包0.1m2；
五、纯化：
将浓缩后的尿囊液拿进无菌室，在无菌条件下将尿囊液打入层析柱中，层析柱通过凝胶层析对尿囊液过滤纯化。
六、裂解：
将纯化后的尿囊液在无菌条件下按照每100ml尿囊液加入1ml裂解剂Trition-100，振摇1小时，室温裂解4小时后将裂解病毒用生理盐水调节血凝效价为1∶640。
实施例5
一、鸡胚选择：
选择受精鸡蛋放38℃孵化10天左右，检出除去死胚和寡蛋；
二、病毒接种：
1、新城疫病毒接种的前一天画出气室和接种部位；
2、次日在无菌条件下将鸡胚在接种部位打个小孔；
3、用1ml注射器吸取新城疫病毒的病毒液0.2ml，注入鸡胚内并用石蜡封口；
4、于37℃培养130小时；
三、收获尿囊液：
1、在无菌条件下对培养四天的鸡胚进行消毒；
2、用无菌的大镊子敲碎蛋壳，用无菌的小镊子扒开囊膜，用无菌吸管吸取尿囊液；
3、将收获完的尿囊液收集到一个瓶子里，测效价；
四、超滤浓缩：
在无菌环境下通过超滤***对尿囊液超滤浓缩至原来的5倍，其中超滤膜包截留分子量为300Kd，膜包0.1m2；
五、纯化：
将浓缩后的尿囊液拿进无菌室，在无菌条件下将尿囊液打入层析柱中，层析柱通过凝胶层析对尿囊液过滤纯化。
六、裂解：
将纯化后的尿囊液在无菌条件下按照每100ml尿囊液加入1ml裂解剂Trition-100，振摇1.5小时，室温裂解4小时后将裂解病毒用生理盐水调节血凝效价为1∶640。
实施例6
一、鸡胚选择：
选择受精鸡蛋放40℃孵化9天左右，检出除去死胚和寡蛋；
二、病毒接种：
1、新城疫病毒接种的前一天画出气室和接种部位；
2、次日在无菌条件下将鸡胚在接种部位打个小孔；
3、用1ml注射器吸取新城疫病毒的病毒液0.2ml，注入鸡胚内并用石蜡封口；
4、于37℃培养105小时；
三、收获尿囊液：
1、在无菌条件下对培养四天的鸡胚进行消毒；
2、用无菌的大镊子敲碎蛋壳，用无菌的小镊子扒开囊膜，用无菌吸管吸取尿囊液；
3、将收获完的尿囊液收集到一个瓶子里，测效价；
四、超滤浓缩：
在无菌环境下通过超滤***对尿囊液超滤浓缩至原来的7倍，其中超滤膜包截留分子量为300Kd，膜包0.1m2；
五、纯化：
将浓缩后的尿囊液拿进无菌室，在无菌条件下将尿囊液打入层析柱中，层析柱通过凝胶层析对尿囊液过滤纯化。
六、裂解：
将纯化后的尿囊液在无菌条件下按照每100ml尿囊液加入1ml裂解剂Trition-100，振摇1小时，室温裂解4小时后将裂解病毒用生理盐水调节血凝效价为1∶640。
实施例7
一、鸡胚选择：
选择受精鸡蛋放38.4℃孵化9天左右，检出除去死胚和寡蛋；
二、病毒接种：
1、新城疫病毒接种的前一天画出气室和接种部位；
2、次日在无菌条件下将鸡胚在接种部位打个小孔；
3、用1ml注射器吸取新城疫病毒的病毒液0.2ml，注入鸡胚内并用石蜡封口；
4、于37℃培养115小时；
三、收获尿囊液：
1、在无菌条件下对培养四天的鸡胚进行消毒；
2、用无菌的大镊子敲碎蛋壳，用无菌的小镊子扒开囊膜，用无菌吸管吸取尿囊液；
3、将收获完的尿囊液收集到一个瓶子里，测效价；
四、超滤浓缩：
在无菌环境下通过超滤***对尿囊液超滤浓缩至原来的10倍，其中超滤膜包截留分子量为300Kd，膜包0.1m2；
五、纯化：
将浓缩后的尿囊液拿进无菌室，在无菌条件下将尿囊液打入层析柱中，层析柱通过凝胶层析对尿囊液过滤纯化。
六、裂解：
将纯化后的尿囊液在无菌条件下按照每100ml尿囊液加入1ml裂解剂Trition-100，振摇2小时，室温裂解4小时。
实施例8
应用小白鼠做抗肿瘤实验，试验共分为3组，每组8只小鼠，小鼠腋下接种S180肉瘤细胞，制作鼠源肉瘤模型。各试验药物均瘤内注射，每只0.1毫升，每天一次，用药疗程为7天，试验结果见表1。
表1
| 组别 | 药品 | 小鼠(只) | 用药方案 | 用药次数 | 抑瘤率(％) |
| 1 | 生理盐水 | 8 | 1次/天 | 7次 | |
| 2 | 环磷酰胺 | 8 | 1次/天 | 7次 | 90.1 |
| 3※ | 实施例1所述制品 | 8 | 1次/天 | 7次 | 88.5 |
实施例9
应用实施例2所述制品进行临床***的疗效检测(％)，检测结果见表2。
表2
其中：n：数量；CR：完全缓解；PR：部分缓解；SD：病情稳定，无进展；PD：病情恶化。CR+PR：临床缓解率
实施例10
将实施例7中裂解前后尿囊液中的裂解病毒用等体积的生理盐水调节血凝效价，结果见表3。
表3
上述参照实施例对该一种抗肿瘤生物制品的制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种抗肿瘤生物制品的制备方法，其特征在于：将鸡胚接种新城疫病毒之后，收取尿囊液，经过超滤浓缩后，再进行纯化，最后进行裂解处理，具体步骤为：
（1）病毒接种：
画出气室和接种部位，在无菌条件下将鸡胚在接种部位打个小孔，取新城疫病毒液0.2ml注入鸡胚内并用石蜡封口，于37℃培养96～130小时；
（2）收获尿囊液：
在无菌条件下对步骤（1）培养后的鸡胚进行消毒后敲碎蛋壳，扒开囊膜后用无菌吸管吸取尿囊液，将收获完的尿囊液进行收集、测效价；
（3）超滤浓缩：
在无菌环境下通过超滤***对步骤（2）的尿囊液超滤浓缩，其中超滤膜包截留分子量为300Kd；
（4）纯化：
在无菌条件下将步骤（3）中浓缩后的尿囊液打入凝胶层析柱中进行纯化；
（5）裂解：
在无菌条件下收集步骤（4）中纯化后的尿囊液，每100ml尿囊液中加入1ml裂解剂Trition-100，振摇1～2小时，室温裂解4小时，即得。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤生物制品的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中注入新城疫病毒液前的鸡胚是9～11日龄的鸡胚。
3.根据权利要求1或2所述的抗肿瘤生物制品的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中注入新城疫病毒液前的鸡胚是选择受精鸡蛋放37℃～40℃孵化9天，检出除去死胚和寡蛋后得到的。
4.根据权利要求1所述的抗肿瘤生物制品的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中注入新城疫病毒液后的鸡胚培养时间为96小时。
5.根据权利要求1所述的抗肿瘤生物制品的制备方法，其特征在于：所述步骤（5）中尿囊液中裂解病毒用生理盐水调节血凝效价为1∶640。
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