CN102191313A - 冠状动脉粥样硬化预防检测芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种冠状动脉粥样硬化预防检测芯片，包括固相载体和探针，所述探针与待测冠状动脉粥样硬化相关基因的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交。所述待测冠状动脉粥样硬化相关基因至少包括一种或两种以上的下述基因：ALOX5AP、HFE、ITGA2、LAMA4、MMP13、PON1、SDC2、SDC4、THBS2和VCAM1。此外，本发明还公开了上述冠状动脉粥样硬化预防检测芯片的制备方法。通过本发明的芯片检测，可以预测罹患冠状动脉粥样硬化(冠心病)的风险，并进行风险评估。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种生物芯片，尤其涉及一种冠状动脉粥样硬化预防检测芯片。
背景技术
一、冠状动脉粥样硬化研究背景介绍：
动脉粥样硬化是一种常见的进行性动脉疾病，病变主要累及中等大小的肌层动脉，动脉内膜脂质沉积，平滑肌细胞增生，形成局限性斑块，可使动脉壁***，严重时斑块破裂导致血栓、栓塞、出血，受累管腔部分或完全闭塞，临床表现为动脉粥样硬化血管并发症的发生，老年患者中最常见和最严重的血管并发症是冠心病(不稳定性心绞痛和心肌梗塞)和脑卒中。
动脉粥样硬化病变的发生和发展主要经历了四个循序渐进的病理过程：
1.脂质浸润前期内膜改变：内皮损伤。
2.脂质条纹：泡沫细胞、T淋巴细胞聚集，平滑肌细胞增生。
3.纤维斑块：平滑肌纤维化，形成纤维帽。
4.复合病变：斑块钙化、破裂、溃疡，中膜病变。
动脉粥样硬化的病因及发病机制十分复杂，是动脉壁的细胞、细胞外基质、血液成分(特别是单核细胞、血小板和LDL(低密度脂蛋白))、局部血流动力学、环境及遗传因素之间一系列复杂作用的结果，因而病因并非是单一因素的。动脉粥样硬化作为多基因疾病，发病原因不仅涉及到多个作用不同的基因，而且还涉及到基因-基因、基因-环境的相互作用。现在关于动脉粥样硬化发病机理的学说有很多，如渗入脂质学说、血管内膜损伤学说、炎症反应学说、氧化-抗氧化学说及血栓形成学说。所有这些学说都涉及到不同的生物通路，但是现在还没有一种学说能够在遗传学和分子生物学上得到完整的解释。
多年来，基于对动脉粥样硬化致病危险因素的长期研究，科学家们针对这些危险因素开展了大量的工作。目前为止，已经发现了血管紧张素I转化酶(ACE)和亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)的某些***、缺失和突变可能使动脉粥样硬化和冠心病致病的潜在危险因素。前者是血压调节中发挥重要功能的酶类之一，后者是一种与半胱氨酸代谢有关的酶。另外，德国科学家最近证实，AT1受体的表达水平与血管受损过程紧密联系：ACE抑制剂会减少AT1受体的激活，从而改善血管功能不良、有效的抑制动脉粥样硬化的发生和发展。但长期以来，国内外研究较多地集中于脂质代谢通路中相关基因的突变及表达，如：副氧酶、脂蛋白脂肪酶、肝脂肪酶等。在对内源性一氧化氮合成酶(eNOS)的研究中，现在已有一些研究工作表明eNOS与动脉粥样硬化的紧密关联。另有美国科学家提出了炎症机制在动脉粥样硬化的形成中的作用，并在小鼠试验中得到了一定的证实。
近年来，单核苷酸多态性(SNP)和单倍型(haplotype)概念在多基因疾病研究中的广泛运用，为在分子水平上研究动脉粥样硬化的发生和发展的机制开辟了全新的思路。同时，高通量、低成本的SNP检测手段的不断出现也为SNP大规模快速分型提供了可能。日本科学家利用大规模的病例-对照研究对9万多个相关基因SNPs进行了关联分析，发现了一个50KB的单倍型区域与心肌梗塞密切相关，其中包括LTA(lymphotoxin-α)，NFKBIL1和BAT1等的多个SNP位点。在另一研究中，虽然P-选择素(P-selectin)中S290N和N562D各自与心肌梗塞都没有独立相关性，但它们构成的单倍型却与心肌梗塞显著相关。此外，SNP的存在与否以及等位基因频率存在人种及地域的差异，这就提示我们多基因疾病遗传异质性的存在，即同一疾病或性状在不同的人群中可能是不同的遗传因素造成的。在对凝血因子V基因的研究中，中国人群中未能发现国外报道的与白人女性心肌梗塞发病具有相关性的VLeiden突变，却发现了一个新的SNP-G/A1628(Arg485Lys)突变与APCR及冠心病相关，凝血因子V基因可能是中国人群动脉粥样硬化的一个易感基因。另外，不同人群中SNP及其单倍型的类型和频率存在的这种差异可能与不同人群对药物及环境因素的反应性不同密切相关。
在过去的50多年来，大规模的流行病学调查和遗传研究已经对冠状动脉粥样硬化这一复杂疾病做了一系列的研究，发现了一些易感基因与动脉粥样硬化相关，例如ABCA1、CYBA、ApoE、LDLR等。更多的与动脉粥样硬化相关继续在发现和验证中。
二、基因简介：
1、ALOX5AP(rs4468448)
ALOX5AP基因位于染色体13q12区域，编码了5-脂肪氧化酶，是白三烯合成所需的蛋白质。白三烯是花生四烯酸在不同类型的炎症反应中的代谢产物，这些炎症反应，包括哮喘，关节炎和牛皮癣。这种蛋白质定位于质膜上，对其功能的抑制剂阻碍了5-脂肪氧化酶从细胞质移动至细胞膜，从而抑制5-脂肪氧化酶激活。
白三烯合成需要5-脂肪氧化酶。ALOX5锚定于膜表面。结合花生四烯酸，可以在将花生四烯酸转移至5-脂肪氧化酶过程中发挥的重要作用，如果绑定MK-886，这种化合物会阻止白三烯合成。
2、HFE(rs6918586)
HFE染色体定位于6p21.3，由HFE编码的蛋白质是一种类似于MHC族I型蛋白的膜蛋白，并与beta2微球蛋白相关。这种蛋白质的功能主要是通过调控转铁蛋白受体与转铁蛋白的相互作用来调节铁的吸收。铁储存紊乱，遗传性血色素沉着，是一种隐性遗传性疾病，就是由于这一基因的缺陷所导致的。该基因已经报道的剪接变体至少有9个。其他变异也被发现，但其全长的性质尚未确定。
3、ITGA2(rs2287950、rs3212556、rs1445941)
ITGA2(integrin，alpha 2)编码整合素α2链，该基因定位于5q23-q31。整合素是由α(120～185kD)和β(90～110kD)两个亚单位形成的异二聚体。迄今已发现16种α亚单位和9种β亚单位。它们按不同的组合构成20余种整合素。α2亚单位与β1亚单位形成的异二聚体，形成表达在血小板上的糖蛋白Ia/IIa。整合素是一类十分重要的蛋白质受体，大多为亲异性细胞粘附分子，其作用依赖于Ca2+，介导细胞与细胞间的相互作用及细胞与细胞外基质间的相互作用，α链部分决定了它的配体特异性。绝大多数动植物细胞均表达整合素。整合素的多样性是通过改变一些整合素mRNA的剪切来完成的。
整合素不同于其他的细胞表面受体，因为它结合配体的亲和力都很低，在细胞表面表达的浓度很高。整合素仅仅可以通过在局部特定的位置利用最少数量的整合素来结合配体，这被叫做焦点接触或hemidesmosomes。所以当整合素广泛的分布在细胞表面的时候，并不存在粘附现象。但是当整合素在一定区域聚集的时候，即焦点接触，它们原本的较弱的亲和力在细胞表面的这个点得到了增强，这样就使细胞具有足够的粘附能力固定在细胞外基质上面。这是一种非常好的状态，因为细胞可以通过这种方式松散地结合在大量的基质分子上面，但是当打破这种焦点接触失去附着力之后，细胞仍然有机会进入外环境。如果受体被很强的结合在配体上，细胞就可能别牢固地结合在基质上，从而失去迁移的能力。
4、LAMA4(rs3777947、rs1016825)
LAMA4(laminin，alpha 4)定位于6q21，该基因编码层粘连蛋白A4。层粘连蛋白是一个细胞外基质糖蛋白家族，是基质膜中主要的非胶原组成。该蛋白涉及到多种生物过程，包括细胞粘附、分化、迁移、信号传导等。层粘连蛋白由3个不同的链组成(层粘连蛋白α、β、γ)，他们形成三个短臂构成的十字结构，每一个层粘连蛋白链都是一个不同基因编码的多结构域蛋白质。
5、MMP13(rs10502009)
MMP13编码了基质金属蛋白酶13，基因定位于11q22.3，是基质金属蛋白酶(MMP)蛋白质家族的成员。基质金属蛋白酶蛋白质家族涉及在正常生理过程中降解细胞外基质，如胚胎发育，繁殖，组织重塑，此外在疾病过程中也同样发挥作用，如关节炎和肿瘤转移。大多数基质金属蛋白酶在被分泌时是无活性的蛋白前体，被胞外蛋白酶切割激活后发挥作用。MMP13基因编码的蛋白质，切割II型胶原比I型和III型胶原更为有效。它可能参与了骨关节炎中关节软骨关节炎相关的病理生理变化。
6、PON1(rs854560、rs705378、rs854563、rs3917490)
PON1(paraoxonase 1)是抗氧化酶***的重要成员之一，染色体定位于7q21.3，编码二乙基对硝基苯磷酸酯酶，是PON基因家族中的重要成员。二乙基对硝基苯磷酸酯酶可以水解paroxon产生对硝基苯酚。HDL广泛的分布于各种组织液中，HDL能够接受并解除脂质过氧化物的毒性，起到保护细胞膜的作用，同时可以保护LDL免受氧化变异的影响。PON1在血清中专门位于HDL上，它可以水解有机磷酸盐底物(如磷酸二乙基对硝基苯基酯)，这点是HDL具备代谢脂质过氧化物和避免其在LDL上累积作用最为可能的解释。PON1基因敲除小鼠实验提示PON1可能对动脉粥样硬化有潜在的保护作用。PON1可以加速磷脂过氧化物和血小板活化因子的降解，血小板活化因子乙酰水解酶活性可以独立的预测冠心病。PON1在粥样硬化进展过程中动脉管壁中的免疫反应性增强，最近研究表明在人类冠状动脉粥样硬化斑块中PON1有在细胞外水解脂质过氧化物的作用。
7、SDC2(rs2437770)
由SDC2基因编码的蛋白质是一种跨膜(I型)硫酸乙酰肝素蛋白多糖，染色体定位于8q22-23，是体蛋白聚糖蛋白家族成员。体蛋白聚糖可以调控细胞结合、细胞信号、组织和细胞骨架。在体蛋白聚糖-2蛋白(SDC2)的功能，作为一个不可分割的膜蛋白和细胞增殖，细胞迁移的重要参与者，细胞通过其受体与细胞外基质间发生相互作用。目前在几个不同类型的肿瘤检测中发现体蛋白聚糖-2表达发生了改变。
8、SDC4(rs1981429)
SDC4染色体定位于20q12，由这种基因编码的蛋白质是一种跨膜(I型)的硫酸乙酰肝素蛋白多糖，可以作为一个在细胞内信号受体。编码的蛋白质可以成为二聚体，是一个体蛋白聚糖蛋白家族的成员。
9、THBS2(rs9283851、rs9379341、rs11758161)
THBS2编码的凝血酶2属于凝血酶家族，染色体定位于6q27。这是一个二硫键相连同源三聚体糖蛋白，介导细胞与细胞和细胞与基质间的相互作用。这种蛋白质已被证明作为一个肿瘤生长和血管生成的抑制剂。小鼠研究表明，这种蛋白质可以调节***的细胞表面性质，并涉及到细胞粘附和迁移。
10、VCAM1(rs3176876)
VCAM1(vascular cell adhesion molecule 1)基因定位于1p32-p31，该基因编码的内皮细胞粘附分子I是一种细胞表面糖蛋白，它可以被细胞因子活化的内皮激活表达，属于Ig超家族的成员。VCAM1参与细胞与细胞之间及细胞与细胞外基质之间相互作用，介导白细胞与内皮细胞粘附和信号转导，在动脉粥样硬化中发挥了极为关键的作用。正常的动脉内皮可以抵御白细胞的粘附作用，但是当内皮细胞被炎症反应激活之后，VCAM1就会在内皮细胞表面大量表达，与单核细胞、T淋巴细胞结合，介导它们进入内皮层。存在高脂血症时，修饰型的脂蛋白颗粒在动脉内膜累积，诱导了VCAM1的在内皮上的大量表达，从而激发了炎症反应，形成早期的动脉粥样斑块。另外，一氧化氮水平也会抑制VCAM1的表达。VCAM1突变动物实验证明VCAM1表达的减少降低了粥样硬化斑块形成的风险。
目前有关冠状动脉粥样硬化的免疫学诊断产品及PCR产品单一标志物检测灵敏度和特异性存在不能兼顾的缺点，鉴于目前检测冠状动脉粥样硬化的传统方法效果不佳，有必要利用基因芯片技术开发一种检测冠状动脉粥样硬化的基因芯片，从而能够在冠状动脉粥样硬化发生发展早期即进行有效诊断，以提高治愈率降低死亡率。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种冠状动脉粥样硬化预防检测芯片，利用该特定的基因芯片检测，对冠状动脉粥样硬化(冠心病)预测和预警，并进行风险评估。为此，本发明还提供该冠状动脉粥样硬化预防检测芯片的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
在本发明的一个方面，提供了一种冠状动脉粥样硬化预防检测芯片，包括固相载体和探针，所述探针与待测冠状动脉粥样硬化相关基因的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交。
所述待测冠状动脉粥样硬化相关基因至少包括一种或两种以上的下述基因：ALOX5AP、HFE、ITGA2、LAMA4、MMP13、PON1、SDC2、SDC4、THBS2和VCAM1。
所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其衍生物。所述探针的长度没有限制，只要能完成与目的核苷酸序列特异性结合。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过40个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以20-30个碱基对之间的为最佳。所述探针的自身互补序列最好少于6个碱基对，以免影响杂交效率。
本发明冠状动脉粥样硬化预防检测芯片的探针为DNA，至少选自下述一种或两种以上的探针：
(1)与待测ALOX5AP基因杂交的探针，其选自(a)SEQ ID NO：1所示序列，(b)SEQID NO：1所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQID NO：1所示序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(2)与待测HFE基因杂交的探针，其选自(a)SEQ ID NO：2所示序列，(b)SEQ IDNO：2所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：2所示序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(3)与待测ITGA2基因杂交的探针，其选自(a)SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：5所示序列，(b)SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：5所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ IDNO：3～SEQ ID NO：5所示序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(4)与待测LAMA4基因杂交的探针，其选自(a)SEQ ID NO：6～SEQ ID NO：7所示序列，(b)SEQ ID NO：6～SEQ ID NO：7所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ IDNO：6～SEQ ID NO：7所示序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(5)与待测MMP13基因杂交的探针，其选自(a)SEQ ID NO：8所示序列，(b)SEQ IDNO：8所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：8所示序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(6)与待测PON1基因杂交的探针，其选自(a)SEQ ID NO：9～SEQ ID NO：12所示序列，(b)SEQ ID NO：9～SEQ ID NO：12所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ IDNO：9～SEQ ID NO：12所示序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(7)与待测SDC2基因杂交的探针，其选自(a)SEQ ID NO：13所示序列，(b)SEQ IDNO：13所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：13所示序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(8)与待测SDC4基因杂交的探针，其选自(a)SEQ ID NO：14所示序列，(b)SEQ IDNO：14所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：14所示序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(9)与待测THBS2基因杂交的探针，其选自(a)SEQ ID NO：15～SEQ ID NO：17所示序列，(b)SEQ ID NO：15～SEQ ID NO：17所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：15～SEQ ID NO：17所示序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(10)与待测VCAM1基因杂交的探针，其选自(a)SEQ ID NO：18所示序列，(b)SEQID NO：18所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：18所示序列中每条序列有至少70％同源性的序列。
优选的，本发明冠状动脉粥样硬化预防检测芯片的探针选自SEQ ID NO：1～SEQ IDNO：18所示的序列。
所述探针序列可包含1-10个错配碱基，较佳地，可包含1-5个错配碱基，更佳地，可包含1-2个错配碱基。
本发明检测芯片还包括至少一种对照探针，所述对照探针选自：阴性对照探针、阳性对照探针、杂交对照探针和固定化对照探针。
所述探针可通过连接臂固定于固相载体上。连接臂可以为探针形成双链的部分提供一个自由的空间以减少空间位阻，有助于杂交反应的进行[Afanassiev V，HanemannV，Wolfl S.Nucleic Acids Res.2000，28：e66；USA Patent No.5556752]。连接臂越长，杂交效率越高。典型的连接臂包括15～30个功能基团长度。连接臂可以选用适当形式的功能基团，如Poly T(A、C或G)、C原子或聚乙烯乙二醇与Poly T(A、C或G)的嵌合体、聚乙醇、聚酷、聚氨、聚硫酸酷和其组合物。
所述探针或连接臂通过连接分子固定于固相载体上。探针固定到载体上可以通过C-C键实现，例如，聚三氟氯乙烯表面；或更好的用硅氧烷键(玻璃或二氧化硅作支持物时使用)。硅氧烷键键合可以通过支持物和连接分子的三氯甲硅烷基或三烷氧基甲硅烷基等基团反应完成。氨基烷基硅烷、轻基烷基硅烷、2一轻乙基一氨丙基三乙氧基硅烷、轻乙基一氨丙基三乙氧基硅烷或轻丙基三乙氧基硅烷都是很有用的表面吸附基团。
所述探针可以被修饰，修饰方法可以是5’-NH2修饰、5’-SH修饰、5’-Poly T(A、C或G)修饰、5’-生物素修饰、3’-NH2修饰、3’-SH修饰、3’-Poly T(A、C或G)修饰和3’-生物素修饰等。
所述探针可以有一条或几条，甚至全部都是经过标记的，所述标记包括荧光素标记、生物素标记、放射性元素标记、酶标记和荧光共振能量转移标记。
本发明中所述固相载体可选用领域周知的载体，只要所述载体与所述反应物相容，不会影响检测结果即可。优选的，本发明所述固相载体选材为玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜和高分子材料中的一种或它们的任意组合。
在本发明的另一方面，还提供一种上述冠状动脉粥样硬化预防检测芯片的制备方法，包括如下步骤：
(1)抽提待测冠状动脉粥样硬化相关基因的核酸；
(2)设计多重PCR引物及SNP特异性探针，PCR引物具有SEQ ID NO：19-SEQ IDNO：54所示序列，SNP特异性探针具有SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：18所示序列；
(3)PCR扩增反应，该反应所用的引物具有SEQID NO：19-SEQ ID NO：54所示序列的核苷酸链或其互补链；
(4)PCR产物纯化；
(5)针对SNP位点的特异性探针延伸反应；
(6)芯片特异性杂交。
本发明的冠状动脉粥样硬化预防检测芯片可以有效预测对象罹患冠心病的风险，以及相对低风险人群的风险度。弥补了目前免疫学诊断产品及PCR产品单一标志物检测灵敏度和特异性不能兼顾的缺点，有利于大范围的普查和筛查，从而在冠状动脉粥样硬化发生发展早期即进行有效诊断，以提高治愈率降低死亡率，具有良好的临床应用前景。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述条件，或按制造厂商所建议的条件。
实施例1芯片的制备
1.样品基因组DNA制备：
(1)从样品抗凝外周血中利用Qiagen FlexiGene DNA Kit(基因组DNA纯化试剂盒)(51206)(该试剂盒购自Qiagen公司)抽提基因组DNA(目的基因为：ALOX5AP、HFE、ITGA2、LAMA4、MMP13、PON1、SDC2、SDC4、THBS2和VCAM1)。
(2)将样品DNA进行定量，并稀释到10ng/μl，保证DNA浓度均一。
2.设计PCR(聚合酶链反应)所用引物及探针序列：
针对18个SNP位点利用www.autoprimer.com设计多重PCR(聚合酶链反应)引物与SNP特异性探针。
3.目的位点的扩增：
A.将PCR(聚合酶链反应)引物(SEQ ID NO：19-SEQ ID NO：54)稀释至终浓度为10μM。
B.制备PCR Master Mix(聚合酶链反应混合反应液)(供384个样品分型使用)：
| Primer pool(10μM each)(引物混合液) | 45 |
| dNTP(10mM each)(脱氧核苷酸) | 20 |
| 10XPCR Buffer(15mM MgCl2)(反应缓冲液) | 225 |
| MgCl2(25mM Stock)(氯化镁) | 315 |
| HotStar Taq(5U/μL)(热启动DNA聚合酶) | 45 |
| ddH2O(双蒸水) | 700 |
| Total(总体积) | 1350 |
C.每孔加入稀释好的基因组DNA 2μL。
D.1000rpm离心后，在PCR仪上运行下面的程序：
4.PCR(聚合酶链反应)产物纯化：
A.按照下表中的体系，配制纯化试剂(单位μL)：(供384个样品分型使用)
| Exo I(外切酶I) | 45 |
| SAP buffer(虾碱性磷酸酶反应缓冲液) | 135 |
| SAP(1U/μL)(虾碱性磷酸酶) | 450 |
| ddH2O(双蒸水) | 720 |
| Total(总体积) | 1350 |
B.将PCR反应后的384板1000rpm离心，再加入刚刚配置好的纯化试剂，每孔3μL。
C.重新用封板膜封上PCR板，并且1000rpm离心。
D.将离心好的384板放在PCR仪上，运行下表所示的程序，对PCR(聚合酶链反应)的产物进行纯化：
| 步骤 | 温度 | 时间 |
| 1 | 37℃ | 30min. |
| 2 | 96℃ | 10min |
| 3 | 4℃ | ∞ |
5.针对SNP(单核苷酸多态性)位点的特异性探针(SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：18)延伸：
A.将PCR(聚合酶链反应)引物稀释至终浓度为10μM。
B.按照下表所示的体系配置位点特异性引物延伸反应混合物(单位)
| Extension Dilution Buffer(延伸方应缓冲液) | 1692.5 |
| Extension Primer Mix(延伸引物混合液) | 13.5 |
| 20X Extension Mix(延伸反应液) | 90 |
| ddH2O(双蒸水) | 1336.5 |
| DNA polymerase(DNA聚合酶) | 9.4 |
| Total(总体积) | 3150 |
C.将解冻后的PCR板1000rpm离心，向每个孔中加入7μL配置好的引物延伸反应混合物。
D.将离心好的384板放在PCR仪上，运行下表所示的程序进行延伸反应：
6.芯片特异性杂交，洗板：
使用单核苷酸多态性特异杂交芯片(SNPware 48-Plex Tag Array Plate，BeckmanCoulter，USA)，该芯片上已经预杂交了特异性的地址序列。
A.按照下表所示的体积，用双蒸水将20X SNPware Wash Buffer 1(杂交洗涤缓冲液1)稀释到终浓度为1X(单位μL)：
| 20X Wash Buffer 1(洗涤缓冲液) | 1000 |
| ddH2O(双蒸水) | 19000 |
| Total(总体积) | 20000 |
B.每次吸取10μL1X SNPware Wash Buffer 1(杂交洗涤缓冲液1)，加入到单核苷酸多态性特异杂交芯片的每个孔中。
C.将杂交板(即单核苷酸多态性特异杂交芯片)翻过来放在无尘纸上，一起放在离心机的托盘内进行离心，使杂交板上每个孔中的清洗液全部脱离。保证离心速度不大于100RCF，以免损坏杂交板，每次离心一分钟。然后重复步骤B，一共清洗3次。
D.根据下表所示配制杂交溶液(单位μL)：
| Hybridization Solution(杂交液) | 14175 |
| Hybridization Additive(杂交添加剂) | 825 |
| Total(总体积) | 15000 |
E.向PCR板每孔中加入8μL上述杂交溶液，在离心机上稍稍离心使其混合均匀。取出10μL加入到杂交板上对应的孔内。
F.将加入混合液的杂交板放入一个密封的盒子中，放在温箱中孵育。最后在盒子里面的杂交板下放几张润湿的纸巾，以防止孔内的液体在温箱中蒸干。温箱温度设为42℃，孵育时间为2小时(+/-15分钟)。
G.按照下表所示的体积，用双蒸水将64X SNPware Wash Buffer 2(杂交洗涤缓冲液2)稀释到终浓度为1X(单位μL)：
| 20X Wash Buffer 2(洗涤缓冲液) | 312 |
| ddH2O(双蒸水) | 19688 |
| Total(总体积) | 20000 |
H.杂交完成以后，再次清洗杂交板，每次吸取10μL1X SNPware Wash Buffer 2(杂交洗涤缓冲液2)，加入到杂交板上的每个孔中。
I.将杂交板翻过来放在无尘纸上，一起放在离心机的托盘内进行离心，使杂交板上每个孔中的清洗液全部脱离。保证离心速度不大于100RCF，以免损坏杂交板，每次离心一分钟。然后重复步骤b，一共清洗3次。
J.清洗完毕以后，立即在扫描仪上读取数据，进行结果分析，不能超过24小时。
7.芯片扫描和结果读取：
使用单核苷酸多态性分型分析***(GenomeLab SNPstream GenotypingSysytem，Beckman Coulter，USA)进行蓝绿两色荧光扫描。获得不同等位基因的荧光强度读数，对其读数进行校正聚类，从而获得不同个体的单核苷酸多态性分型结果。
实施例2采用本发明芯片检测罹患冠状动脉粥样硬化(冠心病)风险增加实例
统计方法：将芯片检测结果得到的基因数据进行卡方检验，并计算得到风险的增加数值。通过该芯片检测，可以预测对象罹患冠心病的风险，以及相对低风险人群的风险度。
1.ALOX5AP(rs4468448)
我们在1319个冠状动脉粥样硬化病例和1041个正常对照中发现：
| TT | TC | CC | |
| case | 67 | 426 | 826 |
| control | 33 | 320 | 688 |
经过卡方检验，得到等位基因P＝0.023，基因型P＝0.037。带有T等位基因型的个体(TT+TC)相对CC纯合个体具有最大风险OR＝1.64。
2.HFE(rs6918586)
我们在1319个冠状动脉粥样硬化病例和1045个正常对照中发现：
| TT | TC | CC | |
| case | 932 | 361 | 26 |
| control | 728 | 276 | 41 |
经过卡方检验，得到基因型P＝0.018。TT纯合个体相对CC纯合个体具有最大风险OR＝2.00。
3.ITGA2(rs2287950)
我们在1303个冠状动脉粥样硬化病例和1049个正常对照中发现：
| TT | TC | CC | |
| case | 49 | 439 | 815 |
| control | 63 | 347 | 639 |
经过卡方检验，得到基因型P＝0.041。带有C等位基因型的个体(CC+TC)相对TT纯合个体具有最大风险OR＝1.64。
4.ITGA2(rs3212556)
我们在1286个冠状动脉粥样硬化病例和1039个正常对照中发现：
| TT | TA | AA | |
| case | 45 | 429 | 812 |
| control | 77 | 362 | 600 |
经过卡方检验，得到等位基因P＝0.000169576，基因型P＝0.0000499283。带有A等位基因型的个体(AA+TA)相对TT纯合个体具有最大风险OR＝2.21。
5.ITGA2(rs1445941)
我们在1286个冠状动脉粥样硬化病例和1035个正常对照中发现：
| TT | TG | GG | |
| case | 987 | 283 | 16 |
| control | 770 | 238 | 27 |
经过卡方检验，得到基因型P＝0.041。TT纯合个体相对GG纯合个体具有最大风险OR＝2.17。
6.LAMA4(rs3777947)
我们在1299个冠状动脉粥样硬化病例和1036个正常对照中发现：
| AA | AG | GG | |
| case | 542 | 575 | 182 |
| control | 446 | 482 | 108 |
经过卡方检验，得到基因型P＝0.032。GG纯合个体相对AA纯合个体具有最大风险OR＝2.17。
7.LAMA4(rs1016825)
我们在1298个冠状动脉粥样硬化病例和1045个正常对照中发现：
| TT | TC | CC | |
| case | 199 | 595 | 504 |
| control | 123 | 511 | 411 |
经过卡方检验，得到基因型P＝0.038。带有T等位基因型的个体(TT+TC)相对CC纯合个体具有最大风险OR＝1.37。
8.MMP13(rs10502009)
我们在1303个冠状动脉粥样硬化病例和1030个正常对照中发现：
| AA | AG | GG | |
| case | 1045 | 240 | 18 |
| control | 765 | 245 | 20 |
经过卡方检验，得到等位基因P＝0.001，基因型P＝0.003。带有A等位基因型的个体(AA+AG)相对GG纯合个体具有最大风险OR＝1.41。
9.PON1(rs854560)
我们在1319个冠状动脉粥样硬化病例和1041个正常对照中发现：
| AA | AT | TT | |
| case | 1253 | 64 | 1 |
| control | 962 | 81 | 1 |
经过卡方检验，得到等位基因P＝0.004，基因型P＝0.0006。AA纯合个体相对带有T等位基因型的个体(TT+AT)具有最大风险OR＝1.64。
10.PON1(rs705378)
我们在1320个冠状动脉粥样硬化病例和1044个正常对照中发现：
| TT | TG | GG | |
| case | 1 | 65 | 1254 |
| control | 1 | 80 | 963 |
经过卡方检验，得到等位基因P＝0.007，基因型P＝0.010。GG纯合个体相对带有T等位基因型的个体(TT+GT)具有最大风险OR＝1.60。
11.PON1(rs854563)
我们在1305个冠状动脉粥样硬化病例和1040个正常对照中发现：
| AA | AG | GG | |
| case | 1 | 64 | 1240 |
| control | 1 | 92 | 947 |
经过卡方检验，得到等位基因P＝0.0002，基因型P＝0.0002。GG纯合个体相对带有A等位基因型的个体(AA+AG)具有最大风险OR＝1.87。
12.PON1(rs3917490)
我们在1306个冠状动脉粥样硬化病例和1033个正常对照中发现：
| AA | AG | GG | |
| case | 1229 | 76 | 1 |
| control | 949 | 83 | 1 |
经过卡方检验，得到等位基因P＝0.044，基因型P＝0.059。AA纯合个体相对带有G等位基因型的个体(GG+AG)具有最大风险OR＝1.41。
13.SDC2(rs2437770)
我们在1320个冠状动脉粥样硬化病例和1045个正常对照中发现：
| AA | AG | GG | |
| case | 75 | 562 | 683 |
| control | 89 | 371 | 585 |
经过卡方检验，得到基因型P＝0.0003。带有G等位基因型的个体(GG+AG)相对AA纯合个体具有最大风险OR＝1.55。
14.SDC4(rs1981429)
我们在1320个冠状动脉粥样硬化病例和1047个正常对照中发现：
| AA | AC | CC | |
| case | 1123 | 188 | 9 |
| control | 854 | 186 | 7 |
经过卡方检验，得到等位基因P＝0.037。AA纯合个体相对带有C等位基因型的个体(CC+AC)具有最大风险OR＝1.29。
15.THBS2(rs9283851)
我们在1311个冠状动脉粥样硬化病例和1044个正常对照中发现：
| CC | TC | TT | |
| case | 11 | 255 | 1045 |
| control | 8 | 150 | 886 |
经过卡方检验，得到等位基因P＝0.0025，基因型P＝0.004。带有C等位基因型的个体(CC+TC)相对TT纯合个体具有最大风险OR＝1.43。
16.THBS2(rs9379341)
我们在1319个冠状动脉粥样硬化病例和1043个正常对照中发现：
| TT | TC | CC | |
| case | 586 | 565 | 168 |
| control | 482 | 462 | 99 |
经过卡方检验，得到基因型P＝0.046。CC纯合个体相对TT纯合个体具有最大风险OR＝1.40。
17.THBS2(rs11758161)
我们在1320个冠状动脉粥样硬化病例和1044个正常对照中发现：
| TT | TC | CC | |
| case | 72 | 449 | 799 |
| control | 28 | 375 | 641 |
经过卡方检验，得到基因型P＝0.003。带有T等位基因型的个体(TT+TC)相对CC纯合个体具有最大风险OR＝2.08。
18.VCAM1(rs3176876)
我们在1316个冠状动脉粥样硬化病例和1046个正常对照中发现：
| AA | AG | GG | |
| case | 504 | 608 | 204 |
| control | 432 | 490 | 124 |
经过卡方检验，得到等位基因P＝0.020，基因型P＝0.030。GG纯合个体相对AA纯合个体具有最大风险OR＝1.41。
序列表
<110>上海人类基因组研究中心
<120>冠状动脉粥样硬化预防检测芯片
<130>NP-10-14048
<160>54
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
atacctacca cgctacagcc tttcagagcc ttcaaagctc aggga 45
<210>2
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
agcaagacca cctagaccag aatataaaac aaatgcttac ctaat 45
<210>3
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
tccagaatag acaacagacg ttggagactt gacttaacaa gatgc 45
<210>4
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
agacttctac gcaagcactg tgtgttagtg atgcagtcac aaatt 45
<210>5
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
acaactcacg caagtaccat atagtagaca atcagtactt gttag 45
<210>6
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
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ttgaagacag taatatttaa ccgatg 26
Claims (6)
1.一种冠状动脉粥样硬化预防检测芯片，包括固相载体和探针，其特征在于，所述探针与待测冠状动脉粥样硬化相关基因的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交。
2.如权利要求1所述的冠状动脉粥样硬化预防检测芯片，其特征在于，所述待测冠状动脉粥样硬化相关基因至少包括一种或两种以上的下述基因：ALOX5AP、HFE、ITGA2、LAMA4、MMP13、PON1、SDC2、SDC4、THBS2和VCAM1。
3.如权利要求1或2所述的冠状动脉粥样硬化预防检测芯片，其特征在于，所述探针为DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其衍生物。
4.如权利要求3所述的冠状动脉粥样硬化预防检测芯片，其特征在于，所述探针为DNA，至少选自下述一种或两种以上的探针：
(1)与待测ALOX5AP基因杂交的探针，其选自(a)SEQID NO：1所示序列，(b)SEQID NO：1所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：1所示序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(2)与待测HFE基因杂交的探针，其选自(a)SEQ ID NO：2所示序列，(b)SEQ IDNO：2所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：2所示序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(3)与待测ITGA2基因杂交的探针，其选自(a)SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：5所示序列，(b)SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：5所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ IDNO：3～SEQ ID NO：5所示序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(4)与待测LAMA4基因杂交的探针，其选自(a)SEQ ID NO：6～SEQ ID NO：7所示序列，(b)SEQ ID NO：6～SEQ ID NO：7所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ IDNO：6～SEQ ID NO：7所示序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(5)与待测MMP13基因杂交的探针，其选自(a)SEQ ID NO：8所示序列，(b)SEQ IDNO：8所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：8所示序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(6)与待测PON1基因杂交的探针，其选自(a)SEQ ID NO：9～SEQ ID NO：12所示序列，(b)SEQID NO：9～SEQ ID NO：12所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ IDNO：9～SEQ ID NO：12所示序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(7)与待测SDC2基因杂交的探针，其选自(a)SEQ ID NO：13所示序列，(b)SEQ IDNO：13所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：13所示序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(8)与待测SDC4基因杂交的探针，其选自(a)SEQ ID NO：14所示序列，(b)SEQ IDNO：14所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：14所示序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(9)与待测THBS2基因杂交的探针，其选自(a)SEQ ID NO：15～SEQ ID NO：17所示序列，(b)SEQ ID NO：15～SEQ ID NO：17所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：15～SEQ ID NO：17所示序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(10)与待测VCAM1基因杂交的探针，其选自(a)SEQ ID NO：18所示序列，(b)SEQID NO：18所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：18所示序列中每条序列有至少70％同源性的序列。
5.如权利要求4所述的冠状动脉粥样硬化预防检测芯片，其特征在于，所述探针选自SEQ ID NO：1～SEQID NO：18所示的序列。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的冠状动脉粥样硬化预防检测芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)抽提待测冠状动脉粥样硬化相关基因的核酸；
(2)设计多重PCR引物及SNP特异性探针，PCR引物具有SEQ ID NO：19-SEQ IDNO：54所示序列，SNP特异性探针具有SEQID NO：1-SEQ ID NO：18所示序列；
(3)PCR扩增反应，该反应所用的引物具有SEQID NO：19-SEQID NO：54所示序列的核苷酸链或其互补链；
(4)PCR产物纯化；
(5)针对SNP位点的特异性探针延伸反应；
(6)芯片特异性杂交。
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Applications Claiming Priority (1)
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| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102191313B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104568798A (zh) * | 2015-01-26 | 2015-04-29 | 中国药科大学 | 一种动脉粥样硬化抑制剂筛选方法的建立 |
| CN105331682A (zh) * | 2015-09-24 | 2016-02-17 | 郑州市职业病防治院 | 人PON1基因rs854560位点多态性检测方法及试剂盒 |
-
2010
- 2010-03-18 CN CN201010127870.7A patent/CN102191313B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 《Curr Opin Cardiol》 20050530 Qing Wang et al. "Molecular genetics of coronary artery disease" 第20卷, 第3期 * |
| QING WANG ET AL.: ""Molecular genetics of coronary artery disease"", 《CURR OPIN CARDIOL》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104568798A (zh) * | 2015-01-26 | 2015-04-29 | 中国药科大学 | 一种动脉粥样硬化抑制剂筛选方法的建立 |
| CN105331682A (zh) * | 2015-09-24 | 2016-02-17 | 郑州市职业病防治院 | 人PON1基因rs854560位点多态性检测方法及试剂盒 |
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