CN102190688A - 一种制备寡聚半乳糖醛酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种制备寡聚半乳糖醛酸的方法，该方法包括以下步骤：1)果胶酸的制备；2)以果胶酸为底物通过酶解制备果胶寡糖混合物；3)寡聚半乳糖醛酸的制备。本发明提供了一种成本低廉，简单易行同时又能保证寡聚半乳糖醛酸纯度的从果胶寡糖混合物中制备寡聚半乳糖醛酸的方法。

Description

一种制备寡聚半乳糖醛酸的方法

技术领域

本发明涉及一种寡聚半乳糖醛酸的制备方法，尤其涉及一种采用强碱性阴离子交换树脂为填料，以梯度洗脱的方式分离果胶寡糖混合物得到聚合度为2～5的寡聚半乳糖醛酸的方法。

背景技术

果胶寡糖是指果胶经化学法或酶法降解得到的一类由2～20个单糖单元组成的低聚糖。近年来研究表明，果胶寡糖，尤其是寡聚半乳糖醛酸具有多种生物活性，可以作为植物防御反应的诱导因子，诱导植物的抗性反应；可用作双歧杆菌增殖因子，高效、专一的促进双歧杆菌生长，改善菌群结构；另外，在控制棉花黄萎病、苹果花叶病、辣椒病毒病等方面效果显著。

寡糖的分离和纯化是寡糖结构与活性研究至关重要的环节。从酶法或化学法降解后的果胶寡糖混合物中分离制备纯度高的单体果胶寡糖对于研究果胶结构及这些寡糖在植物体中所产生的生物活性的的机理有重要的意义。但是由于果胶多糖自身在组成、连接、衍生化、微观不均一性等方面的高度复杂性及其检测上的困难，使得果胶寡糖混合物的分离工作一度进展缓慢。因此，选择合适的方法对混合糖链进行分离，是一项很有意义的工作。

各种分析技术如薄层色谱，毛细管电泳，高效液相色谱等都应用于分离寡聚半乳糖醛酸。高效液相色谱方法如离子对反相色谱，离子交换色谱，空间排阻色谱等均有文献报道，Thibault(Thibault，J-F.J.Chromatogr.1980.)等通过聚丙烯酰胺凝胶色谱分离得到聚合度达到9的寡聚半乳糖醛酸，Jin and west(Jin，D.F.；West，C.A.Plant Physiol.1984.)通过DEAE Sephadex A-25离子交换色谱柱分离得到寡聚半乳糖醛酸的聚合度达到了11。上述分析型色谱柱得到的分离量仅为μg级。Arland等(Arland T.Hotchkiss Jr，Carbohydrate Research.2001.)采用制备型的CarboPacPA1色谱柱，通过脉冲安培检测器检测分离得到了可达mg级的聚合度为2～20的寡聚半乳糖醛酸。该方法一次上样量少，得到的各个聚合度的寡聚半乳糖醛酸为0.1～0.6mg。国内关于寡聚半乳糖醛酸的分离鲜有报道。

但是上述方法在制备和分离果胶寡糖过程中需要特殊的果胶酶，价格较高的离子交换色谱柱或者制备型高效液相色谱，分离成本高，一次制备量少，分离量低，以上这些分离方法不能经济的制备和分离果胶寡糖。

发明内容

为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种成本低廉，简单易行同时又能保证寡聚半乳糖醛酸纯度的从果胶寡糖混合物中制备寡聚半乳糖醛酸的方法。

本发明的技术解决方案是：本发明提供了一种制备寡聚半乳糖醛酸的方法，其特殊之处在于：所述制备寡聚半乳糖醛酸的方法包括以下步骤：

1)果胶酸的制备；

2)以果胶酸为底物通过酶解制备果胶寡糖混合物；

3)寡聚半乳糖醛酸的制备，其具体实现方式是：

3.1)将强碱性阴离子交换树脂采用碱-酸-碱处理，依次用1～2M氢氧化钠溶液、盐酸溶液、氢氧化钠溶液浸泡活化1h，水洗至中性后装柱，再用甲酸或乙酸溶液洗至pH小于1.5使树脂转为HCOO^-或CH₃COO^-型，水洗至中性，装柱，得到强碱性阴离子交换树脂柱，备用；

3.2)将步骤2)所得到的果胶寡糖混合物调pH值为6～8，将样品上样至通过步骤3.1)处理得到的强碱性阴离子交换树脂柱；

3.3)用蒸馏水洗脱除去过载的样品和未被树脂交换的杂质；

3.4)用pH 6～7的0.1M～2M甲酸铵或乙酸铵缓冲液进行连续梯度洗脱；

3.5)TLC跟踪监测，收集聚合度相同的组分后减压浓缩，经阳离子交换树脂除盐，冷冻干燥，得到半乳糖醛酸和聚合度为2～5的寡聚半乳糖醛酸单体。

上述步骤1)的具体实现方式是：

1.1)将果胶多糖以1％～2％的质量浓度溶于0.5～1M NaOH的50％乙醇溶液中，冰浴搅拌反应5～8h后在0～5℃放置8～12h后抽滤；

1.2)将步骤1.1)抽滤后所得到的沉淀加入上述反应1/2～1/4体积的50％乙醇溶液中，在20～30℃用HCl将pH值调至1～2，保持pH＜2.0继续搅拌30min～2h，抽滤得沉淀；

1.3)在步骤1.2)中得到的沉淀中加入上述同样体积含1％HCl的50％乙醇溶液，室温下搅拌30min～2h抽滤得沉淀，用50％乙醇溶液洗涤沉淀至中性，抽滤得沉淀；

1.4)将步骤1.3)所得到的沉淀复溶于水，冷冻干燥得果胶酸。

上述步骤2)的具体实现方式是：

2.1)将步骤1)所制果胶酸以1％～2％的质量浓度溶于pH4～5的醋酸钠缓冲液中；

2.2)加入果胶酶液，使果胶酶的最终浓度达到0.025～0.1mg/ml；

2.3)将步骤2.2)所得到的溶液在40℃中水浴反应10min～4h后，沸水浴中5～10min使果胶酶失活，浓缩，离心取上清，得果胶寡糖混合物。

上述强碱性阴离子交换树脂是Dowex1或Dowex2。

本发明的优点是：本发明以强碱性阴离子交换树脂为填料，用甲酸铵或乙酸铵缓冲液通过梯度洗脱分离得到得到聚合度为2～5的高纯度寡聚半乳糖醛酸单体。本发明所述的制备寡聚半乳糖醛酸的方法可以得到高纯度的寡聚半乳糖醛酸，与目前报道所采用的分离方法相比分离成本低，可扩大制备量，操作简单易行，并可达到很好的分离效果，在分离完成后，树脂通过再生可重复使用。

附图说明

图1为本发明实施例3中分离出的半乳糖醛酸和聚合度为2～5寡聚半乳糖醛酸的TLC图；

图2为本发明实施例3中分离后的半乳糖醛酸的MS图；

图3为本发明实施例3中分离后的寡聚半乳糖醛酸二糖的MS图；

图4为本发明实施例3中分离后的寡聚半乳糖醛酸三糖的MS图；

图5为本发明实施例3中分离后的寡聚半乳糖醛酸四糖的MS图；

图6为本发明实施例3中分离后的寡聚半乳糖醛酸五糖的MS图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本方法做进一步的说明：

本发明提供了一种制备寡聚半乳糖醛酸的方法，包括以下步骤：

1)果胶酸的制备：

首先按照现有的提取技术提取果胶多糖，比如可以是从苹果皮或柑橘中提取苹果果胶多糖，即：新鲜的苹果皮洗净后，加热至90℃保持10～15min，使酶失活，纱布过滤后并用50℃左右的温水漂洗几次至水为无色。将处理好的苹果皮粉碎后，在料液比为1∶20的条件下用HCl调pH值为1.5～2.0左右，在85℃下萃取1.5h。趁热过滤并用温水洗涤滤液2～3次，得果胶提取液，离心取上清并浓缩。经Savage法除蛋白，醇沉，透析，冷冻干燥得淡黄色苹果果胶多糖。当然，果胶酸的制备可以采用本发明所提供的方法，也可以采用其他方式获得。

下面按照本发明的方法继续进行实验。

3g苹果果胶多糖以1％的质量分数溶于300ml 1M溶有NaOH的50％乙醇溶液中，冰浴搅拌反应5h后，在0℃放置12h后抽滤，所得沉淀加入100ml的50％乙醇溶液中，室温下用3M HCl将pH值调至1.5，保持pH＜2.0继续搅拌30min，抽滤得沉淀，在沉淀中100ml含1％HCl的50％乙醇溶液，室温下搅拌30min，抽滤得沉淀，用50％乙醇溶液洗涤沉淀至中性，抽滤，得到的沉淀复溶于水，冷冻干燥得2.15g果胶酸，得率为71.6％。

2)以果胶酸为底物通过酶解制备果胶寡糖混合物：

将1g果胶酸以1％的质量分数溶于pH4.5的醋酸钠缓冲液中，加入果胶酶(Pectinase from Aspergillus niger，Fluka)，使果胶酶的最终浓度达到0.05mg/ml，40℃水浴反应60min后，100℃水浴中煮5～10min使果胶酶失活，浓缩，离心取上清，得果胶寡糖混合物。果胶寡糖混合物可以采用本发明所提供的方法，也可以采用其他方式获得。

3)寡聚半乳糖醛酸的制备：

处理好的强碱性阴离子交换树脂(Dowex 1X4-400，Sigma)装入玻璃柱(2.1cm×24cm)，将500mg果胶寡糖混合物调pH至6，上样至阴离子交换柱，首先用蒸馏水洗脱除去未被离子交换树脂交换的杂质，然后用pH6的0.1～1M甲酸铵缓冲液进行梯度洗脱。5～8min/管，每管收集6～8ml，洗脱过程中TLC跟踪监测，收集聚合度相同的组分后减压浓缩，经阳离子交换树脂(Dowex 50WX8-200)除盐，冷冻干燥，得到半乳糖醛酸和聚合度为2～5的寡聚半乳糖醛酸单体，分别为32mg、24mg、49mg、43mg、37mg，将所得的寡聚半乳糖醛酸取少量复溶于水，进行TLC及ESI-MS检测。

经强碱性阴离子交换柱分离后的半乳糖醛酸和聚合度为2～5的寡聚半乳糖醛酸经TLC检测的结果如图1所示。以果胶寡糖混合物为标准，从TLC板上可清晰的看到分离后的五种糖，分离效果较好。

分离后的各个聚合度的寡聚半乳糖醛酸通过ESI-MS进行进一步的检测得到的图谱如图2～6所示，由于分离过程中洗脱液NH₄ ⁺的引入，在正离子模式下，寡聚半乳糖醛酸以[M+NH₄]⁺、[2M+NH₄]⁺或[M+Na]⁺、[M+Na]⁺形式存在，每种寡聚半乳糖醛酸的纯度可达92％以上。

Claims (4)

1.一种制备寡聚半乳糖醛酸的方法，其特征在于：所述制备寡聚半乳糖醛酸的方法包括以下步骤：

1)果胶酸的制备；

2)以果胶酸为底物通过酶解制备果胶寡糖混合物；

3)寡聚半乳糖醛酸的制备，其具体实现方式是：

3.1)将强碱性阴离子交换树脂采用碱-酸-碱处理，依次用1～2M氢氧化钠溶液、盐酸溶液、氢氧化钠溶液浸泡活化1h，水洗至中性后装柱，再用甲酸或乙酸溶液洗至pH小于1.5使树脂转为HCOO^-或CH₃COO^-型，水洗至中性，装柱，得到强碱性阴离子交换树脂柱，备用；

3.2)将步骤2)所得到的果胶寡糖混合物调pH值为6～8，将样品上样至通过步骤3.1)处理得到的强碱性阴离子交换树脂柱；

3.3)用蒸馏水洗脱除去过载的样品和未被树脂交换的杂质；

3.4)用pH 6～7的0.1M～2M甲酸铵或乙酸铵缓冲液进行连续梯度洗脱；

3.5)TLC跟踪监测，收集聚合度相同的组分后减压浓缩，除盐，冷冻干燥，得到半乳糖醛酸和聚合度为2～5的寡聚半乳糖醛酸单体。

2.根据权利要求1所述的制备寡聚半乳糖醛酸的方法，其特征在于：所述步骤1)的具体实现方式是：

1.1)将果胶多糖以1％～2％的质量浓度溶于0.5～1MNaOH的50％乙醇溶液中，冰浴搅拌反应5～8h后在0～5℃放置8～12h后抽滤；

1.2)将步骤1.1)抽滤后所得到的沉淀加入上述反应1/2～1/4体积的50％乙醇溶液中，在20～30℃用HCl将pH值调至1～2，保持pH＜2.0继续搅拌30min～2h，抽滤得沉淀；

1.3)在步骤1.2)中得到的沉淀中加入上述反应1/2～1/4体积含1％HCl的50％乙醇溶液，室温下搅拌30min～2h抽滤得沉淀，用50％乙醇溶液洗涤沉淀至中性，抽滤得沉淀；

1.4)将步骤1.3)所得到的沉淀复溶于水，冷冻干燥得果胶酸。

3.根据权利要求2所述的制备寡聚半乳糖醛酸的方法，其特征在于：所述步骤2)的具体实现方式是：

2.1)将步骤1)所制果胶酸以1％～2％的质量浓度溶于pH 4～5的醋酸钠缓冲液中；

2.2)加入果胶酶液，使果胶酶的最终浓度达到0.025～0.1mg/ml；

2.3)将步骤2.2)所得到的溶液在40℃中水浴反应10min～4h后，沸水浴中5～10min使果胶酶失活，浓缩，离心取上清，得果胶寡糖混合物。

4.根据权利要求1或2或3所述的制备寡聚半乳糖醛酸的方法，其特征在于：所述强碱性阴离子交换树脂是Dowex1或Dowex2。

Images