CN102183647A - 一种乙型肝炎病毒表面抗原的检测试剂及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乙型肝炎表面抗原HBsAg的检测试剂及其检测HBsAg的方法，所述的检测试剂是以水溶性A3B型金属卟啉标记乙肝病毒表面抗体HBsAb得到的的金属卟啉标记HBsAb；本发明的有益效果主要体现在：(1)A3B型金属卟啉配合物和HBsAb耦合后易将游离的金属卟啉分子与耦合物分离，得到高纯度的标记抗体，降低化学发光免疫检测HBsAg时的非特异吸附本底信号，大大提高检测灵敏度；(2)本发明方法简便、快速，易实现自动化，不仅具有免疫反应的特异性、化学发光反应的高灵敏性，还具有化学标记物的稳定性；(3)本发明为乙型肝炎病毒表面抗原的快速、准确检测和乙肝病毒的预防与治疗提供了新的手段。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种乙型肝炎表面抗原HBsAg的检测试剂及其检测HBsAg的方法，特别涉及一种水溶性A3B型金属卟啉标记乙型肝炎表面抗体HBsAb作为HBsAg的检测试剂及其检测HBsAg的方法。
(二)背景技术
乙型肝炎(乙肝)病毒感染是一个全球性的问题，并且严重威胁到人类的健康，乙肝病毒是引起急慢性肝炎、肝硬化和原发性肝细胞癌的重要致病因素。乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)一直是乙肝病毒感染的检测中最为重要的标记物，是乙肝的早期诊断指标之一。目前国内最常用的HBsAg测定方法有胶体金免疫层析法(GICA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)：前者具有快速方便的优点，更适用于医疗卫生单位和血站、出入境检验检疫部门用于HBsAg的现场初筛，以节约时间和降低成本，但不适合日常门诊住院患者的检测，更不适合血站实验室内HBsAg的检查，因为其在低浓度时常发生漏检；后者测定HBsAg常用的是双抗体夹心法，该法分为一步法和二分法：一步法简单、方便、快速，灵敏度较高，特异性较好，但在临床实践中常会出现一些假阳性或假阴性结果，以及时阴时阳现象，给诊断带来严重的影响；两步法虽然灵敏度没有一步法高，检测速度也没一步法快，但是其反应却更为稳定，重复性也更好，两步法更适用于医院住院、门诊患者和献血员的血清HBsAg检测，是目前医院和血站实验室的最佳选择。ELISA试剂具有灵敏度高、成本低、可大规模操作等优点，是目前免疫市场的主流，但其高分子量所带来的非特异吸附本底信号会降低其特异检测的灵敏度，同时还具有标记率低、稳定性差、与生物分子耦合方法复杂、纯化困难等缺点。
卟啉类化合物是生物体系中广泛存在的一类多种酶活性中心，其在生物体系中具有重要的生物功能，如氧化还原、电子传递，光合成及烃氧化等。卟啉类化合物对光具有高稳定性，对可见光的高消光系数及独特的激发态特性，使它们成为光电化学应用中的首选材料。
1982年，Ikarlyama等以氯化血红素代替辣根过氧化酶(HR)，用碳二亚胺法将其标记在人体血清白蛋白(HSA)上，结合固体酶免疫分析技术，对HSA的化学发光免疫测试进行了初步探讨。他们这一开创性的研究，为金属卟啉在酶免疫分析中的应用奠定了基础。1984年，Hara等将铁卟啉配合物标记于HSA抗体上用于检测HSA，并将这一体系应用于分析化学中，该体系是构建在流动注射分析设备上的，不利于应用到医学诊断及环境监测等。1992年，Adam等对铁卟啉和锰卟啉的催化机理进行的研究，并与辣根过氧化酶的催化发光效应进行了比较。1993年和1994年，Motsenbocker等用光敏剂和金属卟啉标记抗体进行免疫检测。在国内，慈云祥、孙淑声等课题组对于金属卟啉催化剂替代辣根过氧化酶催化化学发光反应也进行了一些探索。目前，没有将金属卟啉配合物作为标记物检测HBsAg的研究及报道。
本发明结合ELISA技术，首次提出采用水溶性A3B型金属卟啉配合物作为标记物构建化学发光免疫检测HBsAg的方法，该方法集合了化学发光免疫检测及酶标方法的优点，克服了酶标方法高非特异吸附本底信号及低标记率的缺陷，简便、快速，易实现自动化，不仅具有免疫反应的特异性、化学发光反应的高灵敏性，而且还具有化学标记物的稳定性。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种水溶性A3B型金属卟啉标记乙型肝炎表面抗体HBsAb检测HBsAg的方法，该方法集合了化学发光免疫检测及酶标方法的优点，克服了酶标方法高非特异吸附本底信号及低标记率的缺陷。
本发明采用的技术方案是：
一种乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的检测试剂，所述的检测试剂是以水溶性A3B型金属卟啉标记乙肝病毒表面抗体HBsAb得到的的金属卟啉标记HBsAb，所述的水溶性A3B型金属卟啉如式(I)所示：
式(I)中R为
n为0～6的自然数。
所述的式(I)中n优选为0。
所述乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的检测试剂按如下方法制得：将N-羟基琥珀酰亚胺加入浓度为5mg/mL的水溶性A3B型金属卟啉水溶液中，在10～30℃下搅拌10～30min，然后加入含有HBsAb的水溶液，继续在10～30℃下搅拌3～5h，反应产物在0～10℃下离心分离两次，合并上清液并用硫酸铵进行盐析，将盐析后的沉淀用pH 7.0～7.5的磷酸盐缓冲液透析1～3h，至透过液为无色，冷冻干燥，从而分离出金属卟啉标记的HBsAb，即为乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的检测试剂，所述的含有HBsAb的水溶液中HBsAb的质量以N-羟基琥珀酰亚胺质量计为0.1～0.5mg/mg，所述的含有HBsAb的水溶液的浓度为0.1～0.5mg/mL。
所述的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的检测试剂检测HBsAg的方法为：
(1)将HBsAb包被于固相载体上，制成包被HBsAb的微孔板，所述固相载体为96聚苯乙烯微孔板；
(2)取步骤(1)制得的包被HBsAb的微孔板，分别加入HBsAg标准品和待检测的HBsAg样品，经过4℃放置过夜或37℃孵育30～60min，使待测样品和标准品中的HBsAg分别与HBsAb结合，洗涤，除去未结合的HBsAg，得到结合HBsAg标准抗原的微孔板和结合HBsAg待测抗原的微孔板；
(3)加标记抗体：将金属卟啉标记HbsAb，即乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的检测试剂用磷酸缓冲液配制成的浓度为1.0～5.0μg/mL检测试剂溶液，将步骤(2)得到的结合HBsAg标准抗原的微孔板和结合HBsAg待测抗原的微孔板中分别加入体积为200μL所述的金属卟啉标记HBsAb检测试剂溶液，37℃孵育30～60min，洗板，得到结合金属卟啉标记HBsAb的HBsAg标准抗原微孔板和结合金属卟啉标记HBsAb的HBsAg待测抗原微孔板；
(4)检测：于步骤(3)得到的结合金属卟啉标记HBsAb的HBsAg标准抗原微孔板和结合金属卟啉标记HBsAb的HBsAg待测抗原微孔板中分别加入新鲜配制的发光底物工作液，10～30℃静置5～10min，检测420nm处的发光强度，计算出待测样品中HBsAg的浓度；所述发光底物工作液为0.1～0.5mol/L 3-氨基邻苯二甲酰肼50～100μL和质量浓度0.1％～1.0％过氧化氢50～100μL。
所述的发光底物工作液优选为0.1mol/L 3-氨基邻苯二甲酰肼和质量浓度1.0％过氧化氢。
进一步，所述的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的检测试剂检测HBsAg的方法按以下步骤进行：
(1)包被：用pH 7.0～7.5、0.1～0.5mol/L的磷酸盐缓冲液与HBsAb水溶液配制1.0～2.5μg/mL的HBsAb包被液，每孔100μL加入96聚苯乙烯微孔板中，4℃放置过夜或37℃放置30～60min，弃包被液，每孔加入200μL含1％～5％牛血清蛋白的所述磷酸盐缓冲液作封闭液，37℃封闭1～2h，用pH 7.0～7.5、0.1～0.5mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤，每次浸泡1～3min，洗板3次，30℃下真空干燥后放入封闭袋中真空保存，制得包被HBsAb的微孔板；所述HBsAb水溶液中HBsAb的浓度为1.0～5.0mg/mL；
(2)加样：将步骤(1)制备的包被HBsAb的微孔板分成标准品组及待测样品组，在标准品孔中加入50μL、浓度分别为10ng/mL、5.0ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.312ng/mL、0.156ng/mL和0.0ng/mL的HBsAg标准品，在待测样品孔中加入50μL预处理的待测样品，用封板膜封住反应孔，4℃放置过夜或37℃孵育30～60min，用pH 7.0～7.5、0.1～0.5mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤，每次浸泡1～3min，洗板3次，所述的待测样品的预处理为3000r/min离心30min，取上清；
(3)加标记抗体：将金属卟啉标记HBsAb即乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的检测试剂用磷酸缓冲液配制成浓度为1.0～5.0μg/mL的检测试剂溶液，将步骤(2)的标准品孔及待测样品孔中分别加入检测试剂溶液100μL，37℃孵育30～60min，用pH 7.0～7.5、0.1～0.5mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤，每次浸泡1～3min，洗板3次；
(4)检测：于步骤(3)的标准品孔及待测样品孔中分别加入新鲜配制的发光底物工作液，10～30℃静置5～10min，检测420nm处的发光强度，计算出待测样品中HBsAg的浓度；所述发光底物工作液为0.1～0.5mol/L 3-氨基邻苯二甲酰肼100μL和质量浓度0.1％～1.0％过氧化氢100μL。
本发明采用双抗体夹心法化学发光免疫检测HBsAg的含量，其原理为：把待测样品和标记好的抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗体结合，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的标记物量与HBsAg的量成一定比例，加入底物，催化发光，光的强度与样品中HBsAg的量直接相关；因此，可根据光的强弱进行定量或定性分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：(1)A3B型金属卟啉配合物和HBsAb耦合后很容易将游离的金属卟啉分子与耦合物分离，得到高纯度的标记抗体，降低化学发光免疫检测HBsAg时的非特异吸附本底信号，从而大大提高检测灵敏度；(2)高标记率金属卟啉标记抗体的获得，大大降低了检测体系的***误差，确保检测的准确性；(3)本发明集合了化学发光免疫检测及酶标方法的优点，克服酶标方法高非特异本底信号及低标记率的缺陷，进一步提高检测的灵敏度和准确度；(4)本发明方法简便、快速，易实现自动化，不仅具有免疫反应的特异性、化学发光反应的高灵敏性，而且还具有化学标记物的稳定性；(5)本发明为乙型肝炎病毒表面抗原的快速、准确检测和乙肝病毒的预防与治疗提供了新的手段。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1新型高标记率的水溶性A3B型金属卟啉标记抗体的制备
将10mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入1mL含有5mg金属卟啉水溶液中，在20℃下磁力搅拌10min，然后加入4mL含有2.0mg乙肝病毒表面抗体(HBsAb)的水溶液，继续在20℃下搅拌3h，产物在4℃下3000r/min离心20min，上清液用10g固体硫酸铵进行盐析，将盐析后的沉淀用磷酸缓冲液(pH 7.0)透析1h，至透过液为无色，冷冻干燥，从而分离出高标记率的金属卟啉标记HBsAb，即为HBsAg的检测试剂。实施例2A3B型金属卟啉标记HBsAb化学发光免疫检测HBsAg
(1)包被：用pH 7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液将125μL 1.0mg/mL的HBsAb水溶液定容50.0mL，配制2.5μg/mL的包被液，每孔100μL加入96孔白底透的聚苯乙烯微孔板中，4℃放置过夜，弃包被液，每孔加入200μL含1％牛血清蛋白(BSA)的上述的磷酸盐缓冲液作封闭液，37℃封闭2h，用pH 7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤，每次浸泡3min，洗板3次，30℃下真空干燥后放入封闭袋中真空保存，制得包被HBsAb的微孔板；
(2)加样：将步骤(1)制备的包被HBsAb的微孔板分成标准品组及待测样品组，将浓度分别为10、5.0、2.5、1.25，0.625、0.312、0.156和0.0ng/mL的HBsAg标准品50μL分别加入标准品孔中，50μL待测样品(3000r/min离心30min，取上清)加入待测样品孔中，用封板膜封住反应孔，37℃孵育30min，用pH 7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤，每次浸泡3min，洗板3次；所述的待测样品的预处理为3000r/min离心30min，取上清；
(3)加标记抗体：将实施例1制备的HBsAg的检测试剂，即A3B型金属卟啉标记的HBsAb，用pH 7.0的磷酸盐缓冲液配制为2.5μg/mL的金属卟啉标记的HBsAb溶液，将100μL金属卟啉标记的HBsAb溶液分别加入步骤(2)的标准品孔及待测样品孔中，37℃孵育30min，用pH7.0的磷酸盐缓冲液洗涤，每次浸泡3min，洗板3次；
(4)检测：于步骤(3)的标准品孔及待测样品孔中分别加入新鲜配制的0.1mol/L 3-氨基邻苯二甲酰肼100μL和质量浓度1.0％过氧化氢100μL，10℃下静置10min，在微孔板检测仪(DTX 880、BECKMANCOULTER)上检测420nm处的发光强度，以发光强度为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线并拟合线性回归方程，根据样品在420nm处的发光强度，计算出待测样品中HBsAg的浓度。
实施例3 A3B型金属卟啉标记HBsAb化学发光免疫检测HBsAg
(1)包被：用pH 7.4、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液将50μL 1.0mg/mL的HBsAb水溶液定容50.0mL，配制1.0μg/mL的包被液，每孔200μL加入96孔白底透的聚苯乙烯微孔板中，37℃放置60min，弃包被液，每孔加入200μL含5％牛血清蛋白(BSA)的上述的磷酸盐缓冲液作封闭液，37℃封闭1h，用pH 7.4、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤，每次浸泡3min，洗板3次，30℃下真空干燥后放入封闭袋中真空保存，制得包被HBsAb的微孔板；
(2)加样：将步骤(1)制备的包被HBsAb的微孔板分成标准品组及待测样品组，将浓度分别为10、5.0、2.5、1.25，0.625、0.312、0.156和0.0ng/mL的HBsAg标准品50μL分别加入标准品孔中，50μL待测样品(3000r/min离心30min，取上清)加入待测样品孔中，用封板膜封住反应孔，37℃孵育30min，用pH 7.4、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤，每次浸泡3min，洗板3次，所述的待测样品的预处理为3000r/min离心30min，取上清；
(3)加标记抗体：将实施例1制备的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的检测试剂即A3B型金属卟啉标记的HBsAb用pH 7.4的磷酸盐缓冲液配制为1.0μg/mL的金属卟啉标记的HBsAb溶液，将200μL金属卟啉标记的HBsAb溶液分别加入步骤(2)的标准品孔及待测样品孔中，37℃孵育60min，用pH 7.4、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤，每次浸泡3min，洗板3次；
(4)检测：每孔加入新鲜配制的0.5mol/L 3-氨基邻苯二甲酰肼100μL和质量浓度1.0％过氧化氢100μL，25℃下静置5min，在微孔板检测仪(DTX 880、BECKMAN COULTER)上检测420nm处的发光强度，以发光强度为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线并拟合线性回归方程，根据样品在420nm处的发光强度，计算出待测样品中HBsAg的浓度。
Claims (6)
1.一种乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的检测试剂，其特征在于所述的检测试剂是以水溶性A3B型金属卟啉标记乙肝病毒表面抗体HBsAb得到的的金属卟啉标记HBsAb，所述的水溶性A3B型金属卟啉如式(I)所示：
式(I)中R为
n为0～6的自然数。
2.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的检测试剂，其特征在于所述的式(I)中n为0。
3.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的检测试剂，其特征在于所述的检测试剂按如下方法制得：将N-羟基琥珀酰亚胺加入浓度为5mg/mL的水溶性A3B型金属卟啉水溶液中，在10～30℃下搅拌10～30min，然后加入含有HBsAb的水溶液，继续在10～30℃下搅拌3～5h，反应产物在0～10℃下离心分离两次，合并上清液并用硫酸铵进行盐析，将盐析后的沉淀用pH 7.0～7.5的磷酸盐缓冲液透析1～3h，至透过液为无色，冷冻干燥，从而分离出金属卟啉标记的HBsAb，即为乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的检测试剂；所述的含有HBsAb的水溶液中HBsAb的质量以N-羟基琥珀酰亚胺质量计为0.1～0.5mg/mg，含有HBsAb的水溶液的浓度为0.1～0.5mg/mL。
4.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的检测试剂，其特征在于所述的检测试剂检测HBsAg的方法为：
(1)将HBsAb包被于固相载体上，制成包被HBsAb的微孔板，所述固相载体为96聚苯乙烯微孔板；
(2)取步骤(1)制得的包被HBsAb的微孔板，分别加入HBsAg标准品和待检测的HBsAg样品，经过4℃放置过夜或37℃孵育30～60min，使待测样品和标准品中的HBsAg分别与HBsAb结合，洗涤，除去未结合的HBsAg，得到结合HBsAg标准抗原的微孔板和结合HBsAg待测抗原的微孔板；
(3)加标记抗体：将乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的检测试剂用磷酸缓冲液配制成浓度为1.0～5.0μg/mL检测试剂溶液，将步骤(2)得到的结合HBsAg标准抗原的微孔板和结合HBsAg待测抗原的微孔板中分别加入体积为200μL所述的检测试剂溶液，37℃孵育30～60min，洗板，得到结合金属卟啉标记HBsAb的HBsAg标准抗原微孔板和结合金属卟啉标记HBsAb的HBsAg待测抗原微孔板；
(4)检测：于步骤(3)得到的结合金属卟啉标记HBsAb的HBsAg标准抗原微孔板和结合金属卟啉标记HBsAb的HBsAg待测抗原微孔板中分别加入新鲜配制的发光底物工作液，10～30℃静置5～10min，检测420nm处的发光强度，计算出待测样品中HBsAg的浓度；所述发光底物工作液为0.1～0.5mol/L 3-氨基邻苯二甲酰肼50～100μL和质量浓度为0.1％～1.0％过氧化氢50～100μL。
5.如权利要求4所述的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的检测试剂，其特征在于所述的检测试剂检测HBsAg的方法中所述的发光底物为0.1mol/L 3-氨基邻苯二甲酰肼和质量浓度1.0％过氧化氢。
6.如权利要求4所述的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的检测试剂，其特征在于所述的检测试剂检测HBsAg的方法按以下步骤进行：
(1)包被：用pH 7.0～7.5、0.1～0.5mol/L的磷酸盐缓冲液与HBsAb水溶液配制1.0～2.5μg/mL的HBsAb包被液，每孔100μL加入96聚苯乙烯微孔板中，4℃放置过夜或37℃放置30～60min，弃包被液，每孔加入200μL含1％～5％牛血清蛋白的所述磷酸盐缓冲液作封闭液，37℃封闭1～2h，用pH7.0～7.5、0.1～0.5mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤，每次浸泡1～3min，洗板3次，30℃下真空干燥后放入封闭袋中真空保存，制得包被HBsAb的微孔板；所述HBsAb水溶液中HBsAb的浓度为1.0～5.0mg/mL；
(2)加样：将步骤(1)制备的包被HBsAb的微孔板分成标准品组及待测样品组，在标准品孔中加入50μL、浓度分别为10ng/mL、5.0ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.312ng/mL、0.156ng/mL和0.0ng/mL的HBsAg标准品，在待测样品孔中加入50μL预处理的待测样品，用封板膜封住反应孔，4℃放置过夜或37℃孵育30～60min，用pH 7.0～7.5、0.1～0.5mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤，每次浸泡1～3min，洗板3次，所述的待测样品的预处理为3000r/min离心30min，取上清；
(3)加标记抗体：将乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的检测试剂用磷酸缓冲液配制成浓度为1.0～5.0μg/mL的检测试剂溶液，于步骤(2)的标准品孔及待测样品孔中分别加入所述的检测试剂溶液100μL，37℃孵育30～60min，用pH 7.0～7.5、0.1～0.5mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤，每次浸泡1～3min，洗板3次；
(4)检测：于步骤(3)的标准品孔及待测样品孔中分别加入新鲜配制的发光底物工作液，10～30℃静置5～10min，检测420nm处的发光强度，计算出待测样品中HBsAg的浓度；所述发光底物工作液为0.1～0.5mol/L 3-氨基邻苯二甲酰肼100μL和质量浓度0.1％～1.0％过氧化氢100μL。
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