CN102181570A - 辅助鉴定鼠遗传稳定性相关基因的专用引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种辅助鉴定鼠遗传稳定性相关基因的专用引物及其应用。所述专用引物包括序列1和2所示DNA组成的p53引物对。所述专用引物还包括序列3和4所示DNA组成的p21引物对、序列5和6所示DNA组成的chek1引物对、序列7和8所示DNA组成的atm引物对、序列9和10所示DNA组成的cdk1引物对、序列11和12所示DNA组成的helb引物对和序列13和14所示DNA组成的atr引物对中的至少一种。本发明提供的方法具有操作简单、高效特异的特点，同时具有较高的应用价值，可为转基因小鼠的安全性评价和标准制定提供参考。
Description
技术领域
本发明涉及一种辅助鉴定鼠遗传稳定性相关基因的专用引物及其应用。
背景技术
在动物的基因组中，p21、cdk1、p53、chek1、helb、atr和atm等基因是维持动物遗传稳定的主要基因，它们在细胞内复杂的调控网络中占据了重要的位置，这些基因的稳定表达对细胞的生长、维持和分化都具有重要意义。
Cdk1蛋白能够与核苷酸结合，是周期蛋白依赖蛋白激酶，参与蛋白氨基酸磷酸化，调控有丝***细胞周期，负调控细胞增殖。p21基因也称cdknla，编码周期蛋白依赖激酶抑制因子1A，分布于细胞核中，具有蛋白激酶活性，是周期蛋白依赖蛋白激酶抑制因子，调控周期蛋白依赖蛋白激酶，介导负调控细胞增殖，细胞内信号诱导细胞凋亡。Chek1是CHK1检控点同源物(裂殖酵母)分布于浓缩核染色体；具有、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性；参与DNA损伤检控点，调控周期蛋白依赖蛋白激酶、具有DNA修复功能等。Helb基因(helb基因)编码DNA解旋酶B。atm基因被公认为是一个肿瘤抑制基因，共济失调毛细血管扩张突变(包括互补组A，C和D)分布于细胞核，可以直接或间接的参与DNA损伤修复，从而影响细胞周期、减数***重组、信号转导和负调控进程，其突变或缺损后共济失调毛细血管扩张、抑癌功能随之丧失，引起乳腺癌、淋巴瘤等病变。p53基因是一种肿瘤抑制基因，在所有恶性肿瘤中，50％以上会出现该基因的突变，P53介导的细胞信号转导途径在调节细胞正常生命活动中起重要作用，它与细胞内其它信号转导通路间的联系十分复杂，其中P53参与调控的基因已超过160种。
由此可见小鼠基因组序列的大量信息为研究基因功能及其表达调控、胚胎发育和人类疾病的分子机制提供了研究基础和技术手段，因此小鼠作为最主要的转基因模式动物，被广泛的应用于生命科学和医药研究中。但是这把双刃剑引起的安全问题也日渐引起世界的广泛关注：如食用安全、环境安全、伦理安全等。
外源基因***位点的不同可造成不同程度的基因改变，可能引起非预期效应。常常因外源基因的表达产物意外激活(或抑制)其他自然基因的表达，进而改变动物体内一些正常生理过程，从而导致小鼠发育异常或产生疾病；被修饰的基因产物有可能破坏细胞正常生理功能及代谢平衡，影响小鼠的健康，甚至具有潜在的致癌性。因此在转基因小鼠和研究中，检测转基因小鼠自然基因表达情况的十分必要，尤其是与遗传稳定性相关的基因。目前我国制定的关于转基因动物安全检测问题的管理条例仍不完善，与相关检测技术亦不能完全配套。因此，建立检测p21基因、cdk1基因、p53基因、chek1基因、helb基因、atr基因和atm基因的RT-PCR方法对检测转基因小鼠遗传稳定性具有重要意义，有助于安全评价标准的制定。
发明内容
本发明的目的是提供一种辅助鉴定鼠遗传稳定性相关基因的专用引物及其应用。
本发明提供的辅助鉴定鼠遗传稳定性相关基因的专用引物(引物组合物)，包括p53引物对；所述p53引物对由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成。
所述专用引物还可包括p21引物对、chek1引物对、atm引物对、cdk1引物对、helb引物对和atr引物对中的至少一种；所述p21引物对由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成；所述chek1引物对由序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成；所述atm引物对由序列表的序列7所示DNA和序列表的序列8所示DNA组成；所述cdk1引物对由序列表的序列9所示DNA和序列表的序列10所示DNA组成；所述helb引物对由序列表的序列11和序列表的序列12所示DNA组成；所述atr引物对由序列表的序列13和序列表的序列14所示DNA组成。
所述专用引物具体可由所述p53引物对、所述p21引物对、所述chek1引物对、所述atm引物对、所述cdk1引物对、所述helb引物对和所述atr引物对组成。
所述鼠遗传稳定性相关基因具体可为p53基因、p21基因、chek1基因、atm基因、cdk1基因、helb基因和atr基因中的至少一个；所述p53基因如序列表的序列15所示；所述p21基因如序列表的序列16所示；所述chek1基因如序列表的序列17所示；所述atm基因如序列表的序列18所示；所述cdk1基因如序列表的序列19所示；所述helb基因如序列表的序列20所示；所述atr基因如序列表的序列21所示。
以上任一所述的专用引物均可用于辅助鉴定鼠遗传稳定性相关基因。
所述鼠遗传稳定性相关基因具体可为p53基因、p21基因、chek1基因、atm基因、cdk1基因、helb基因和atr基因中的至少一个；所述p53基因如序列表的序列15所示；所述p21基因如序列表的序列16所示；所述chek1基因如序列表的序列17所示；所述atm基因如序列表的序列18所示；所述cdk1基因如序列表的序列19所示；所述helb基因如序列表的序列20所示；所述atr基因如序列表的序列21所示。
本发明还保护一种辅助鉴定鼠遗传稳定性相关基因的方法，包括如下步骤：
以待测鼠的cDNA为模板，用所述专用引物中的每个引物对分别进行PCR扩增，根据PCR扩增产物辅助鉴定鼠遗传稳定性相关基因；所述鼠遗传稳定性相关基因为p53基因、p21基因、chek1基因、atm基因、cdk1基因、helb基因和atr基因中的至少一个；所述p53基因如序列表的序列15所示(GenBank Accession No.NM_001127233.1)；所述p21基因如序列表的序列16所示(GenBank Accession No.NM_007669.4)；所述chek1基因如序列表的序列17所示(GenBank Accession No.NM_007691.5)；所述atm基因如序列表的序列18所示(GenBank Accession No.NM_007499.2)；所述cdk1基因如序列表的序列19所示(GenBank Accession No.NM_007659.3)；所述helb基因如序列表的序列20所示(GenBank Accession No.NM_080446.2)；所述atr基因如序列表的序列21所示(GenBank Accession No.NM_019864.1)。
所述p53引物对用于辅助鉴定所述p53基因，其目的PCR扩增产物为369bp；所述p21引物对用于辅助鉴定所述p21基因，其目的PCR扩增产物为218bp；所述chek1引物对用于辅助鉴定所述chek1基因，其目的PCR扩增产物为400bp；所述atm引物对用于辅助鉴定所述atm基因，其目的PCR扩增产物为675bp；所述cdk1引物对用于辅助鉴定所述cdk1基因，其目的PCR扩增产物为278bp；所述helb引物对用于辅助鉴定所述helb基因，其目的PCR扩增产物为485bp；所述atr引物对用于辅助鉴定所述atr基因，其目的PCR扩增产物为686bp。
所述PCR扩增的反应体系具体可为：ddH2O 17μl，10×PCR Buffer 2.5μl，2.5mMdNTP 2μl，10μmol/L的每条引物各0.5μl，cDNA 2μl，2.5U/μL Taq polymerase0.5μl。
所述PCR扩增的反应参数具体可为：94℃5min；94℃30s、57℃30s、72℃40s，30个循环；72℃5min。
所述鼠具体可为小鼠，所述小鼠具体可为C57/129Sv品系的小鼠。
本发明公开了辅助鉴定小鼠遗传稳定性相关基因(p21基因、cdk1基因、p53基因、chek1基因、helb基因、atr基因和atm基因)的专用引物，基于该专用引物开发了助鉴定小鼠遗传稳定性相关基因的RT-PCR方法，并优化了检测条件和检测体系。实现了7对引物在同一条件下扩增7个基因的目的。本发明提供的方法具有操作简单、高效特异的特点，同时具有较高的应用价值，可为转基因小鼠的安全性评价和标准制定提供参考。
附图说明
图1为实施例2的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为实施例3的琼脂糖凝胶电泳图。
图3为实施例4的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。TIANGENTM Quant cDNA第一链合成试剂盒又称TIANGENTMQuantscript RT Kit，产品目录号为KR103。10×PCR Buffer、dNTP(2.5mM)和Taq DNApolymerase均购自威格拉斯生物技术(北京)有限公司。实施例中所用的小鼠品系为C57/129Sv，购自军事科学院。
实施例1、辅助鉴定鼠遗传稳定性的专用引物的制备
辅助鉴定鼠遗传稳定性的专用引物由p53引物对(由p53-F和p53-R组成)、p21引物对(由p21-F和p21-R组成)、chek1引物对(由chek1-F和chek1-R组成)、atm引物对(由atm-F和atm-R组成)、cdk1引物对(由cdk1-F和cdk1-R组成)、helb引物对(由helb-F和helb-R组成)和atr引物对(由atr-F和atr-R组成)组成。
合成表1所示的各条引物，合成的引物组成辅助鉴定鼠遗传稳定性的专用引物。
专用引物中各条引物均单独包装。
表1各条引物的核苷酸序列及其靶序列长度
实施例2、退火温度的优化
一、制备cDNA
1、Trizol法提取小鼠脾脏总RNA，测定浓度为3.3μg/μl，稀释至1μg/μl。
2、用TIANGENTM Quant cDNA第一链合成试剂盒将步骤1的总RNA反转录为cDNA。
反应液(20μl)：10×RT mix 2μl，dNTP混合液(2.5mmol/L)2μl，Random(10μmol/L)2μl，总RNA(1μg/L)2μl，Quant Reverse Transcriptase 1μl，RNase-free 水11μl。
反应条件：37℃，1小时。
二、PCR扩增
以步骤一的cDNA为模板，分别用实施例1制备的p53引物对、p21引物对、chek1引物对、atm引物对、cdk1引物对、helb引物对和atr引物对进行PCR扩增。
采用上述七对引物对的PCR扩增体系(25μl)均为：ddH2O 17μl，10×PCR Buffer2.5μl，2.5mM dNTP 2μl，上、下游引物(10μmol/L)各0.5μl，cDNA 2μl，Taqpolymerase(2.5U/μL)0.5μl。
采用上述七对引物对的PCR扩增均在PCR仪(ABI veriti 96well Thermal cycler)中进行，参数为：94℃5min，1个循环；94℃30s、退火温度(每个引物对采用三种退火温度，分别为54℃、57℃和60℃)30s、72℃40s，30个循环；72℃5min，1个循环；4℃保存。
PCR扩增结束后，每种PCR扩增产物取5μL，进行2％琼脂糖凝胶电泳。
结果见图1。结果表明：采用七对引物分别对七个靶基因的进行扩增，采用54-60℃的退火温度，扩增效果差异不大，特异性均较好。将57℃定为最优退火温度。
实施例3、引物浓度的优化
一、制备cDNA
1、Trizol法提取小鼠脾脏总RNA，测定浓度为3.3μg/μl，稀释至1μg/μl。
2、用TIANGENTM Quant cDNA第一链合成试剂盒将步骤1的总RNA反转录为cDNA。
反应液(20μl)：10×RT mix 2μl，dNTP混合液(2.5mmol/L)2μl，Random(10μmol/L)2μl，总RNA(1μg/L)2μl，Quant Reverse Transcriptase 1μl，RNase-free水11μl。
反应条件：37℃，1小时。
二、PCR扩增
以步骤一的cDNA为模板，分别用实施例1制备的p53引物对、p21引物对、chek1引物对、atm引物对、cdkl引物对、helb引物对和atr引物对进行PCR扩增。
采用上述七对引物对的PCR扩增体系(25μl)均为：ddH2O 17μl，10×PCR Buffer2.5μl，2.5mM dNTP 2μl，上、下游引物(每个反应体系中上下游引物的浓度相同，分别加入三种浓度的引物溶液：5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)各0.5μl，cDNA2μl，Taq polymerase(2.5U/μL)0.5μl。
采用上述七对引物对的PCR扩增均在PCR仪(ABI veriti 96well Thermal cycler)中进行，参数为：94℃5min，1个循环；94℃30s、57℃30s、72℃40s，30个循环；72℃5min，1个循环；4℃保存。
PCR扩增结束后，每种PCR扩增产物取5μL，进行2％琼脂糖凝胶电泳。
结果见图2。结果表明：采用七对引物分别对七个靶基因的进行扩增，引物浓度为10μmol/L时扩增特异性较高。
实施例3、应用专用引物检测小鼠的遗传稳定相关基因
一、制备cDNA
1、Trizol法提取小鼠脾脏总RNA，测定浓度为3.3μg/μl，稀释至1μg/μl。
2、用TIANGENTM Quant cDNA第一链合成试剂盒将步骤1的总RNA反转录为cDNA。
反应液(20μl)：10×RT mix 2μl，dNTP混合液(2.5mmol/L)2μl，Random(10μmol/L)2μl，总RNA(1μg/L)2μl，Quant Reverse Transcriptase 1μl，RNase-free水11μl。
反应条件：37℃，1小时。
二、PCR扩增
以步骤一的cDNA为模板，分别用实施例1制备的p53引物对、p21引物对、chek1引物对、atm引物对、cdk1引物对、helb引物对和atr引物对进行PCR扩增。
采用上述七对引物对的PCR扩增体系(25μl)均为：ddH2O 17μl，10×PCR Buffer2.5μl，2.5mM dNTP 2μl，上、下游引物(10μmol/L)各0.5μl，cDNA 2μl，Taqpolymerase(2.5U/μL)0.5μl。
采用上述七对引物对的PCR扩增均在PCR仪(ABI veriti 96well Thermal cycler)中进行，参数为：94℃5min，1个循环；94℃30s、57℃30s、72℃40s，30个循环；72℃5min，1个循环；4℃保存。
PCR扩增结束后，每种PCR扩增产物取5μL，进行2％琼脂糖凝胶电泳。
结果见图3。结果表明：采用七对引物分别对七个靶基因的进行扩增，均能得到目的条带，目的带清晰、产物特异。
将各个目的条带进行测序。测序结果表明：采用p53引物对进行PCR扩增，PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列15自5’末端第1255-1623位核苷酸(p53基因如序列15所示)，369bp；采用p21引物对进行PCR扩增，PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列16自5’末端第223-440位核苷酸(p21基因如序列16所示)，218bp；采用chek1引物对进行PCR扩增，PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列17自5’末端第720-1119位核苷酸(chek1基因如序列17所示)，400bp；采用atm引物对进行PCR扩增，PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列18自5’末端第9592-10266位核苷酸(atm基因如序列18所示)，675bp；采用cdk1引物对进行PCR扩增，PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列19自5’末端第2001-2278位核苷酸(cdk1基因如序列19所示)，278bp；采用helb引物对进行PCR扩增，PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列20自5’末端第1240-1724位核苷酸(helb基因如序列20所示)，485bp；采用atr引物对进行PCR扩增，PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列21自5’末端第172-857位核苷酸(atr基因如序列21所示)，686bp。
将所述专用引物中的每条引物的5’端或3’端分别增加或减少1至5个核苷酸，或将所述专用引物中的每条引物进行1至5个核苷酸的替换，采用相同的PCR条件和程序进行PCR扩增，电泳显示PCR扩增产物具有杂带，无法得到专一性良好的特异性条带，会给后续的基因分析或测序增加工作量。
Claims (10)
1.辅助鉴定鼠遗传稳定性相关基因的专用引物，包括p53引物对；所述p53引物对由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成。
2.如权利要求1所述的专用引物，其特征在于：所述专用引物还包括p21引物对、chek1引物对、atm引物对、cdk1引物对、helb引物对和atr引物对中的至少一种；所述p21引物对由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成；所述chek1引物对由序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成；所述atm引物对由序列表的序列7所示DNA和序列表的序列8所示DNA组成；所述cdk1引物对由序列表的序列9所示DNA和序列表的序列10所示DNA组成；所述helb引物对由序列表的序列11和序列表的序列12所示DNA组成；所述atr引物对由序列表的序列13和序列表的序列14所示DNA组成。
3.如权利要求2所述的专用引物，其特征在于：所述专用引物由所述p53引物对、所述p21引物对、所述chek1引物对、所述atm引物对、所述cdk1引物对、所述helb引物对和所述atr引物对组成。
4.如权利要求1至3中任一所述的专用引物，其特征在于：所述鼠遗传稳定性相关基因为p53基因、p21基因、chek1基因、atm基因、cdk1基因、helb基因和atr基因中的至少一个；所述p53基因如序列表的序列15所示；所述p21基因如序列表的序列16所示；所述chek1基因如序列表的序列17所示；所述atm基因如序列表的序列18所示；所述cdk1基因如序列表的序列19所示；所述helb基因如序列表的序列20所示；所述atr基因如序列表的序列21所示。
5.权利要求1至4中任一所述的专用引物在辅助鉴定鼠遗传稳定性相关基因中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述鼠遗传稳定性相关基因为p53基因、p21基因、chek1基因、atm基因、cdk1基因、helb基因和atr基因中的至少一个；所述p53基因如序列表的序列15所示；所述p21基因如序列表的序列16所示；所述chek1基因如序列表的序列17所示；所述atm基因如序列表的序列18所示；所述cdk1基因如序列表的序列19所示；所述helb基因如序列表的序列20所示；所述atr基因如序列表的序列21所示。
7.一种辅助鉴定鼠遗传稳定性相关基因的方法，包括如下步骤：
以待测鼠的cDNA为模板，用权利要求1至3中任一所述专用引物中的每个引物对分别进行PCR扩增，根据PCR扩增产物辅助鉴定鼠遗传稳定性相关基因；所述鼠遗传稳定性相关基因为p53基因、p21基因、chek1基因、atm基因、cdk1基因、helb基因和atr基因中的至少一个；所述p53基因如序列表的序列15所示；所述p21基因如序列表的序列16所示；所述chek1基因如序列表的序列17所示；所述atm基因如序列表的序列18所示；所述cdk1基因如序列表的序列19所示；所述helb基因如序列表的序列20所示；所述atr基因如序列表的序列21所示。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述p53引物对用于辅助鉴定所述p53基因，其目的PCR扩增产物为369bp；所述p21引物对用于辅助鉴定所述p21基因，其目的PCR扩增产物为218bp；所述chek1引物对用于辅助鉴定所述chek1基因，其目的PCR扩增产物为400bp；所述atm引物对用于辅助鉴定所述atm基因，其目的PCR扩增产物为675bp；所述cdk1引物对用于辅助鉴定所述cdk1基因，其目的PCR扩增产物为278bp；所述helb引物对用于辅助鉴定所述helb基因，其目的PCR扩增产物为485bp；所述atr引物对用于辅助鉴定所述atr基因，其目的PCR扩增产物为686bp。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为：ddH2O17μl，10×PCR Buffer 2.5μl，2.5mM dNTP 2μl，10μmol/L的每条引物各0.5μl，cDNA 2μl，2.5U/μL Taq polymerase 0.5μl。
10.如权利要求7至9中任一所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应参数为：94℃5min；94℃30s、57℃30s、72℃40s，30个循环；72℃5min。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20110914 |