CN102181489A

CN102181489A - 出芽短梗霉发酵海蓬子秸秆产酶制备阿魏酸和低聚糖的方法

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Publication number: CN102181489A
Application number: CN2011100601103A
Authority: CN
Inventors: 邵荣; 余晓红; 张春银; 顾振新; 许伟; 肖玲; 陈洪兴; 刘珊珊
Original assignee: JIANGSU LVHAI ORGANIC FOOD DEVELOPMENT Co Ltd; Yangcheng Institute of Technology
Current assignee: JIANGSU LVHAI ORGANIC FOOD DEVELOPMENT Co Ltd; Yangcheng Institute of Technology; Yancheng Institute of Technology
Priority date: 2011-03-14
Filing date: 2011-03-14
Publication date: 2011-09-14

Abstract

本发明涉及微生物发酵海蓬子秸秆产酶制备阿魏酸和低聚糖的应用。本发明所述的微生物指出芽短梗霉，海蓬子秸秆经干燥粉碎达一定粒径后，经出芽短梗霉的代谢作用后产生木聚糖酶和阿魏酸酯酶的混合酶制剂，在此混合酶的协同作用下降解海蓬子秸秆细胞壁，获得包括阿魏酸、低聚糖在内的生理活性物质，其所具有的抗氧化和清除自由基、抗血栓、降血脂及防治冠心病，并具有抗菌消炎以及抗突变和防癌的作用，可以在医药、食品和化妆品工业中广泛应用。可以显著提高海蓬子副产物秸秆的经济价值。

Description

出芽短梗霉发酵海蓬子秸秆产酶制备阿魏酸和低聚糖的方法

技术领域

本发明涉及海蓬子秸秆在制备生物活性物质中的应用。

背景技术

据***教科文组织(UNESCO)和世界粮农组织(FAO)的不完全统计，全世界现有盐渍土9.55亿hm2。根据中科院南京土壤所的最新研究，我国各种类型的盐碱土总面积已达到9913万hm²。与此同时，全球淡水资源短缺，淡水贮量仅占总贮水量的2.5％，土壤盐渍化与淡水严重不足已成为限制农业发展的世界性问题。为缓解人地矛盾，充分利用海水和盐土资源，国际学术界和多国政府对耐盐植物的开发和盐土农业的发展给予了极大的重视。海蓬子(学名盐角草，Salicorniabigelovii)是科学家们从世界各地、生长在不同环境中的2000～3000种耐盐植物中筛选出的其中最优秀的一种。目前，已在沙特***、墨西哥、***联合酋长国、印度等国家几个规模达250hm²的样板种植场试验成功。

近年来，我国不仅在国家“863”规划中有专题资助海蓬子方面的研究，各地实业机构和科研单位也相继投入资金进行应用性开发。目前，我国辽宁、河北、山西、陕西、宁夏、甘肃、山东、江苏、海南等省区都有海蓬子的生产。江苏盐城市的海蓬子生产已显成效，该市自2000年从美国引种种植后，经过4年的***选育、驯化，盐城海蓬子已成为改良后拥有自主知识产权的创新品种，其出芽率已经达95％，适宜在我国大部分沿海地区种植同时，该市的海蓬子生产已经产业化，成立了享誉国内外的绿苑海蓬子有限公司，并开发出了海蓬子系列产品。试验结果表明，海蓬子在大田中的生物产量已经达到16500～19500kg/hm²，产种量达1800～2250kg/hm²，可生产食用油籽约2000kg/hm²。因此，大面积种植海蓬子、开发利用海蓬子具有很高的社会和经济效益。

目前海蓬子秸秆的综合利用率不到20％，产量巨大的细胞壁物质多被丢弃或作为饲料，经济价值不高。近年来，如何降解细胞壁，获得包括低聚糖、阿魏酸、黄酮类物质在内的众多生理活性物质，提高海蓬子副产物的经济价值，具有一定的研究价值。秸秆的主要成分都是细胞壁。细胞壁主要由纤维素、半纤维素、木质素、蛋白质等组成。纤维素构成细胞壁的“骨架”，半纤维素、木质素、蛋白质、角质、色素等物质填充在“骨架”中。在构成纤维素、半纤维素、果胶等物质的关键多糖(木聚糖、木葡聚糖、***木聚糖、聚半乳糖等)的侧链残基上，往往存在一种重要的生理活性物质——反式阿魏酸。在植物初生壁内，阿魏酸常与多糖相交联形成一种复杂的“网络结构”。在植物体中，这种交联结构同时也可调控植物细胞的生长、延伸，成为植物抵御病原体侵袭的屏障。

海蓬子秸秆中细胞壁多糖的含量在50％以上，如能采用适当方法降解，这些副产品都可以成为功能性食品原料低聚糖(主要是低聚木糖)和阿魏酸的重要来源。低聚木糖是目前已知的低聚糖中双歧杆菌增殖效果最好的一个品种，除具有低聚糖所共有的不被消化特性、无龋齿性、促进人体对钙的吸收等功能特性外，还具有良好的pH值及热稳定性。目前低聚木糖的生产方法主要包括：①酸水解法；②热水抽提(包括蒸汽***)法；③酶水解法；④微波降解法。酸水解法对设备的要求高，投资大，且反应会伴随有害物的生成。热水抽提法生产的低聚木糖结晶颜色深，在很大程度上限制了其应用。微波降解法是一种较新的低聚木糖生产方法。目前低聚木糖主要是利用***木聚糖酶降解细胞壁物质获得。酶法水解与其他方法相比具有：作用条件温和、原料来源广泛，获得的产品还常常连接了黄酮和酚酸等物质，生理活性比一般的低聚木糖高等优点。但由于细胞壁材料中的反式阿魏酸将多糖和木质素交联，直接使用酶法降解水解效率低。为了提高酶水解效率，生产中一般先采用碱处理胞壁材料，但会导致环境污染并丢失反式阿魏酸。因此采用能同时分泌降解糖苷键和酯键的微生物发酵海蓬子秸秆利用混合酶的协同作用从秸秆细胞壁中释放出低聚糖和阿魏酸具有重要的应用前景。

阿魏酸的化学名称为4-羟基-3-甲基-2-苯丙烯酸。它是植物界普遍存在的一种酚酸，在植物中常与细胞壁中的多糖、低聚糖、多胺、酯类和木质素交联构成细胞壁的一部分，很少以游离状态存在。其主要的生理功能有：抗氧化和清除自由基、抗血栓、降血脂及防治冠心病。并具有抗菌消炎以及抗突变和防癌作用。反式阿魏酸在美国、日本已允许用作食品添加剂，目前在医药、食品和化妆品工业中广泛应用。生产阿魏酸的方法有化学合成法和天然法。化学合成法是以香兰醛和丙二酸为原料，通过缩合反应而成。但该法反应时间长(3周)，溶剂用量大，产率也很低，且生产的为反式和顺式阿魏酸的混合物。现在工业中普遍采用碱法降解米糠中的谷维素制备阿魏酸。但该法受原料(含量较低)的限制，产量上不去，成本较高，因而国际市场上阿魏酸的价格居高不下。另外一种方法是碱解或酶解植物细胞壁中的多糖获得反式阿魏酸。

近年来，研究者在设法提高低聚木糖的酶水解产率的同时，也注意到了阿魏酸酯酶的作用。在植物细胞壁上，由于阿魏酸的交联，至使胞壁多糖之间紧密结合，单一使用某种多糖水解酶，并不能很好的渗入多糖分子内部，导致水解率太低。如果能采用阿魏酸酯酶和多糖水解酶共同作用于细胞壁，同时打断阿魏酸酯键和糖苷键，无疑将使低聚糖的水解产率大大提高，同时又可生产阿魏酸。本课题组致力于出芽短梗霉的特性和发酵应用研究多年积累了相关的研究成果。在出芽短梗霉的代谢研究过程中发现：其可以在分泌木聚糖酶的同时释放出阿魏酸酯酶且两种酶可以协同作用于糖苷键和酯键从而将低聚木糖和阿魏酸从秸秆细胞壁上释放出来。

出芽短梗霉(Aureobacidium pullulans或Pul-lularia pullulans)是一类与酵母有密切关系的真菌。出芽短梗霉发酵能产生胞外多聚糖、酶、抗菌素、单细胞蛋白等多种产物，这些物质用途非常广泛，尤其是所产生的胞外多聚糖(短梗霉多糖或卜多糖或普鲁兰多糖)具有极佳的成膜性、成纤维性、阻氧性、可塑性、粘结性和易自然降解等许多独特的理化和生物学特性，无毒无害，对人体无任何副作用。广泛地用于医药制造，食品包装，水果和海产品保鲜，化妆品工业，烟草制造工业和农业种子保护等众多领域，是一种有极大开发价值和前景的多功能新型生物制品。国外对出芽短梗霉的研究较早，而且已有各种产品，日本已经允许其产品应用于食品添加剂，而我国对出芽短梗霉的研究还不多见。因而出芽短梗霉应用于海蓬子秸秆的发酵产生功能性物质阿魏酸和低聚糖具有菌种安全性的保障，以及海蓬子副产物高效、高附加值综合利用的多重意义。

在采用双酶法时，还应该考虑到双酶的选择，只有选择合适的阿魏酸酯酶和木聚糖酶才能达到最大的协同效应。目前具有一定的阿魏酸酯酶活性，可用于水解细胞壁物质的商业用酶主要有诺维信公司生产的SP584、Novozym342、Vis-cozyme、Ultraflo L等几种混合酶制剂。FAE-III与木聚糖酶协同作用于细胞壁，可以释放最大量的阿魏酸，但目前FAE-III都是各实验室经黑曲霉发酵自行生产，还没有工业化产品。同样用于双酶法水解中的木聚糖酶的选取也十分重要。今后还可考察在双酶法水解体系中添加果胶酶、纤维素酶等其他多糖酶，以达到更高的水解率。

对底物进行必要的预处理，包括粉碎、高压、微波、超声波处理等，可能会提高水解率，但目前对这方面所做的研究还不多。Yu等人在采用双酶法降解燕麦胶生产阿魏酸的研究中发现：底物的预处理对阿魏酸的产率有显著影响，过250目筛的底物水解率高于过100目筛的底物。张璟采用双酶法降解麦麸时研究发现微波、高温高压处理均可以显著提高阿魏酸的产率。如前文所述，玉米麸中阿魏酸的含量较高，但水解率不高，解决这个问题的方法就是进行有效的预处理。Saulnier对玉米麸采用了瞬间***和高压预处理，生产出70％以上的阿魏酸。Estelle采用高压预处理玉米麸，再用阿魏酸酯酶和木聚糖酶联合作用，也达到了阿魏酸90.3％的高释放率。

目前对如何从酶解液中分离阿魏酸的研究不多，但分离低聚糖的技术则较成熟。分离阿魏酸主要采取的方法是吸附法。Couteau从活性炭、聚苯乙烯交联树脂、PVPP等吸附介质中进行了筛选，研究表明活性炭以其对阿魏酸高度的吸附能力(每100g吸附22g)、不结合单糖分子、容易洗脱等优点成为了最好的吸附介质。在活性碳吸附结束后，可以用乙醇把吸附的阿魏酸洗脱下来。在之后的研究中，他进一步探讨了活性炭吸附和洗脱过程中的主要参数：吸附柱的高度、溶液流动速度、活性炭的吸附饱和程度、接触时间、温度等。提出当活性炭完全饱和之后，经洗脱可以从酶解液中获得最多的阿魏酸(50％)。

如何有效地利用阿魏酸酯酶和多糖水解酶之间的协同效应，使这两种酶有效地打断植物细胞壁中阿魏酸与长链多糖之间形成的“复杂网络”，提高水解的效率，得到生产低聚木糖和阿魏酸的新方法，或获得功能性更强的复合型产品，已经成为一个崭新的研究课题。

发明内容

本发明的目的：利用出芽短梗霉能够同时分泌木聚糖酶和阿魏酸酯酶双酶的特性，协同降解海蓬子秸秆细胞壁，释放出生物活性物质低聚木聚糖和阿魏酸，实现海蓬子秸秆高效、高附加值综合利用的多重价值。

本发明的技术方案：将海蓬子秸秆进行相应的预处理后，包括自然晒干或烘干后，经粉碎筛分达到一定粒径后，或经挤压膨化后，经出芽短梗霉代谢后产生木聚糖酶和阿魏酸酯酶混合酶，酶解海蓬子秸秆细胞壁，形成含有生物活性物质低聚木聚糖和阿魏酸的混合发酵基，经活性炭吸附、有机溶剂沉淀或膜过滤分离阿魏酸和低聚木聚糖。

本发明的有益效果：当今研究和开发利用生长于广袤海岸荒漠和海滩上的盐生植物，已成为当今世界农业的重大课题，在盐碱地上耕作是一种新的思维方式。因为海蓬子生长在不毛之地的盐碱地上，土地费用比较低。另外，它无虫害，不需要用农药，也不需要锄草，海蓬子种植管理费用不高。然而海蓬子的产量却很高，其废弃副产物秸秆的利用率还不到20％，形成的经济附加值极低。海蓬子秸秆中细胞壁多糖的含量在50％以上，如能采用适当方法降解，这些副产品都可以成为功能性食品原料低聚糖(主要是低聚木糖)和阿魏酸的重要来源。出芽短梗霉具有同时分泌木聚糖酶和阿魏酸酯酶双酶的特性，能够协同作用于海蓬子秸秆中细胞壁多糖的降解，释放出功能性食品原料低聚木聚糖和阿魏酸，从而实现海蓬子秸秆的高效、高附加值的综合利用。

附图说明

图1实施例4中出芽短梗霉发酵前后海蓬子秸秆纤维结构变化

Fig.1 Change of Salicornia stalk fiber configuration before and after fermentation

注：图中A为发酵前海蓬子秸秆纤维结构；B为发酵后海蓬子秸秆纤维结构

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明，但实施例不限制本发明的保护范围。

实施例1出芽短梗霉代谢海蓬子秸秆产酶效果分析

发酵培养基：20～80g/L的海蓬子秸秆处理液，添加0.05～0.3％的KH₂PO₄和0.05～0.4％的MgSO₄·7H₂O和0.005～0.04％的V_B1；

海蓬子秸秆处理液制备工艺：海蓬子秸秆烘干粉碎后过20～60目筛子筛分(20～80g/L) →用1～5％硫酸溶液调pH至4.5～6.0→30～90℃保温2h→胶体磨处理5～25min；

采用高压蒸汽灭菌，灭菌温度为121℃，时间15～20min。

母种培养：在温度为25～30℃，摇床转速80～160r/min，摇瓶装液量为20～100mL/250mL三角瓶，接种出芽短梗霉的4块直径约为6mm的母种菌块，培养5d；

发酵条件：在温度为25～30℃，摇床转速80～160r/min，摇瓶装液量为20～100mL/250mL三角瓶，出芽短梗霉接种量2～10％，培养4～10d。

阿魏酸酯酶活性：在Andersen等方法的基础上加以调整。酶解底物为阿魏酸甲酯，阿魏酸甲酯水溶性较差，试验中用甲醇溶解，溶液浓度为50mM。测定时，用pH6.0的0.1M柠檬酸溶液将50mM的阿魏酸甲酯溶液稀释10倍，取2mL稀释后的阿魏酸甲酯溶液预热至40℃，添加2mL粗酶液，于40℃保持4h，反应后于95℃保持10min以灭酶。冷却后，于10000rpm下离心10min，上清液用0.45μm滤膜过滤，用HPLC法测定酶解释放的阿魏酸含量。酶活定义：40℃下，单位时间(1min)内1mL粗酶液水解阿魏酸甲酯释放1μmol阿魏酸定义为1个酶活单位(U/mL)。

木聚糖酶活性：参照Dogaris等的方法，以木糖为标准；酶活定义：1mL粗酶液单位时间(1min)于40℃水解桦树木聚糖生成1μmol木糖为1个酶活单位(U/mL)。

表1出芽短梗霉生成木聚糖酶和阿魏酸酯酶活性

Table 1Xylanase and ferulic acid esterase activity of pullulan

表1为真菌出芽短梗霉发酵海蓬子秸秆产木聚糖酶和阿魏酸酯酶的情况。木聚糖酶是水解海蓬子秸秆半纤维素主链生成低聚木糖的关键酶，阿魏酸酯酶具有水解低聚木糖中阿魏酸酯键释放阿魏酸的作用，因而真菌出芽短梗霉是发酵海蓬子秸秆制备低聚木糖和阿魏酸的较佳菌株。

实施例2出芽短梗霉代谢海蓬子秸秆产酶培养基的优化

培养基I 在海蓬子秸秆处理液中添加V_B10.05～0.4g/L、0.50～4.0g/L MgSO₄·7H₂O和磷酸二氢钾。

培养基II 在海蓬子秸秆处理液中添加V_B10.05～0.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.50～5.0g/L和酵母膏0.50～5.0g/L。

培养基对出芽短梗霉产酶影响

由表2可知，茶薪菇在不同培养基中发酵时，菌体产酶情况显著不同。优化的培养基组成中，出芽短梗霉生成的胞外木聚糖酶和阿魏酸酯酶活性均显著提高；与优化前相比，木聚糖酶酶活提高了31％，阿魏酸酯酶活性增加量为20％。

表2出芽短梗霉在不同培养基中产酶情况

Table 2Enzymes and activities of pullulan during fermentation in different media

实施例3出芽短梗霉代谢海蓬子秸秆产酶发酵条件的优化

发酵条件I pH5.0、装液量50mL和接种量6％。

发酵条件II pH5.5、装液量60mL和接种量12％，发酵温度均为25℃。

发酵培养基麦麸处理液添加V_B10.14g/L、MgSO₄·7H₂O 1.10g/L和酵母膏2.50g/L。发酵条件对出芽短梗霉产酶影响

表3出芽短梗霉在不同条件下发酵产酶情况

Table 3Enzymes and activities pullulan during fermentation in different conditions

由出芽短梗霉在不同发酵条件下的产酶情况(表3)可知，在优化的发酵条件下培养，可改变出芽短梗霉生成胞外酶活性，其中木聚糖酶和阿魏酸酯酶活性均明显提高。与优化前相比，木聚糖酶活性提高了20％；阿魏酸酯酶活性为发酵前的127％。

实施例4出芽短梗霉代谢海蓬子秸秆产酶制备阿魏酸和低聚木糖的效果

图1显示了发酵前后海蓬子秸秆纤维结构的变化，其中A为海蓬子秸秆细胞壁纵向结构。发酵前麦麸纤维结构致密，表面光滑；发酵后其纵向结构断裂，纵向表层不再光滑，出现褶皱，原因是出芽短梗霉在发酵过程生成的纤维素酶和木聚糖酶，水解海蓬子秸秆纤维结构。阿魏酸和低聚糖的产率分别达到3.21mg/g和0.23g/g。

Claims

1.出芽短梗霉发酵海蓬子秸秆产酶制备阿魏酸和低聚糖的应用。

2.根据权利要求1所述的出芽短梗霉发酵海蓬子秸秆，其特征是：本发明所述的发酵方式，是指液态发酵、固态发酵。

3.根据权利要求2所述的海蓬子秸秆，其特征是：海蓬子秸秆包括木质化的成熟秸秆，未木质化的幼龄秸秆。

4.根据权利要求3所述的海蓬子秸秆，其特征是：木质化的成熟秸秆经烘干或自然晒干后，粉碎过20-60目筛子筛分后供出芽短梗霉发酵；或粉碎后经20-40目筛子筛分后经挤压膨化后供出芽短梗霉代谢；或未木质化的幼龄秸秆经打浆后被出芽短梗霉发酵。

5.根据权利要求1所述的出芽短梗霉发酵海蓬子秸秆产酶制备阿魏酸和低聚糖的应用，其特征是：出芽短梗霉发酵海蓬子秸秆产生木聚糖酶和阿魏酸酯酶的混合酶，以此混合粗酶液酶解预处理过的海蓬子秸秆制备阿魏酸和低聚糖；或以分离纯化后的酶制剂降解预处理过的海蓬子秸秆细胞壁制备阿魏酸和低聚糖；或以出芽短梗霉发酵海蓬子秸秆将产酶与制备阿魏酸和低聚糖合二为一进行。

6.根据权利要求1所述的出芽短梗霉发酵海蓬子秸秆产酶制备阿魏酸和低聚糖的应用，其特征是：通过有机溶剂提取法或膜过滤法或离子交换法来提取分离阿魏酸和低聚糖。