CN102181053B - 一种疏水基团修饰的聚乙烯亚胺衍生物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于聚合物改性领域，具体涉及一种酸敏感疏水改性的聚乙烯亚胺及其作为基因载体的应用，所述衍生物含有酸敏感可降解缩醛功能基团，具体地，所述衍生物为缩醛分子三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷缩醛(TMB-THME)修饰的聚乙烯亚胺衍生物，名为聚乙烯亚胺-(三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷)。本发明所述聚乙烯亚胺-(三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷)增强了PEI的DNA复合能力及与细胞的相互作用，内涵体内可将疏水基团转变为亲水基团，实现DNA复合物的解离和DNA的胞内释放，并且细胞毒性低。
Description
技术领域
本发明属于聚合物改性领域，具体涉及一种酸敏感疏水改性的聚乙烯亚胺及其作为基因载体的应用。
背景技术
基因治疗对于人类许多疾病如癌症、心血管疾病、传染性疾病、遗传性疾病等的治疗具有广阔的应用前景。对于成功的基因治疗而言，必须将治疗基因靶向到病灶部位。病毒载体都是目前最有效的基因载体。但病毒载体具有一些内在的缺点，如免疫原性、靶向性差、DNA装载量有限、及生产和使用程序复杂。近年来，非病毒基因载体特别是聚阳离子载体引起了研究者们广泛的关注，因为其与病毒载体相比具有许多优点。例如，载体的结构和性质可控、DNA装载量大、可多次重复注射、可规模化生产等。此外，高分子载体可通过适当修饰，延长其体内循环时间，靶向运送治疗基因到病灶部位。然而，与病毒载体相比，现有高分子载体转染效率较低。缺乏安全高效的基因运载体系是目前临床基因治疗的最大瓶颈。
在过去的几年里，基于聚阳离子的“人工病毒”用作安全高效的基因载体取得了巨大的发展。例如Langer等发展了一系列聚氨酯用作基因载体，既有利于转染试剂的快速筛选，又可帮助理解结构-毒性-转染之间的关系（Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42, 3153-3158）。利用类似的方法，Feijen 和Goh等独立开发了一系列超支化的聚氨酯并研究了其体外转染（J. Control. Release 2005, 109, 317-329；Biomacromolecules 2005, 6, 3166-3173）。Kim、 Park和Hennink等开发了不同类型的可降解的聚阳离子用作非病毒基因载体（J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 6524-6525；J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 5633-5639；Bioconjugate Chem. 2006, 17, 1077-1084；J Control. Release 2008, 126, 97-110）。Engbersen 和Kim等设计了一系列还原敏感的聚氨酯用于细胞内基因转染（Bioconjugate Chem. 2006, 17, 1233-1240；Bioconjugate Chem. 2007, 18, 138-145）。
除了设计新型的聚阳离子，传统的高分子载体的修饰尤其是聚乙烯亚胺（PEI）的修饰得到关注。由于其高的电荷密度和内涵体pH缓冲能力，PEI在多种细胞中显示高的转染效率。PEI的转染主要取决于其分子结构和分子量。其中，25 kDa支化PEI（25 kDa bPEI）和22 kDa线性PEI（22 kDa lPEI）被证明是目前的最佳转染试剂，并被公认为目前非病毒基因载体的黄金标准。然而，PEI具有不同程度的毒性，且与病毒载体相比转染效率较低。最近几年，基于低分子量PEI的低毒性，人们设计合成了多种可降解的PEI高分子及交联体用作体外基因转染。可降解的PEI相比低分子量的PEI具有高得多的转染效率，有些甚至高于25 kDa bPEI，利用疏水基团修饰PEI是一种有效提高低分子量PEI基因转染效率的方法，例如Kim课题组报道胆固醇（cholesterol）修饰后的1.8 kDa PEI在多种细胞中的转染效率相比1.8 kDa PEI具很大提高（Bioconjugate Chem 2001;12(3):337-345）。Klibanov等报道了十二酸酯化的2 kDa PEI的转染效率相比25 kDa PEI提高了5倍（Proc Natl Acad Sci U S A 2002;99(23):14640-14645）。Uludag 等报道了脂肪脂类修饰的2 kDa PEI具有与25 kDa PEI相当的转染效率（Mol Pharm 2009;6(6):1798-1815）。Ramezani 等报道了烷基低聚胺接到10 kDa PEI上在N2A小鼠神经母细胞中具有与25 kDa PEI相当水平的转染效率（Biomaterials 2009;30(25):4187-4194）。
发明内容
本发明的目的是提供一种疏水基团修饰的聚乙烯亚胺衍生物。
为达到上述目的，本发明具体技术方案是：一种疏水基团修饰的聚乙烯亚胺衍生物，所述衍生物含有酸敏感可降解缩醛功能基团，具体地，所述衍生物为缩醛分子三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷缩醛 (TMB-THME)修饰的聚乙烯亚胺衍生物，其结构通式如下所示：
当主链聚乙烯亚胺的数均分子量为1.5～2 kDa时，主链聚乙烯亚胺接枝缩醛分子三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷缩醛的接枝数为1～5；当主链聚乙烯亚胺的数均分子量为9.5～10.5 kDa，并且主链聚乙烯亚胺接枝缩醛分子三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷缩醛的接枝数为5～15。
上述技术方案中，三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷缩醛分子通过胺酯键链接到聚乙烯亚胺，得到的聚乙烯亚胺衍生物命名为聚乙烯亚胺-(三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷)（PEI-g-(TMB-THME)n）。
制备上述聚乙烯亚胺衍生物的方法包括以下步骤：
(1) 合成三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷（TMB-THME）：将1,1,1-三羟基乙烷和对甲基苯磺酸溶解四氢呋喃中，然后将2,4,6-三甲氧基苯甲醛和4 埃分子筛加入其中，45～55℃下反应8～16h后得到三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷，其反应过程如下所示：
(2)氯甲酸对硝基苯酯（p-NC）活化三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷（TMB-THME-PC）：将三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷溶解在二氯甲烷中，在惰性气体保护下，将三乙胺、吡啶、氯甲酸对硝基苯酯加入其中，室温下反应8～16h后，得到活化的三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷，其反应过程如下所示：
(3)制备聚乙烯亚胺-(三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷)（PEI-g-(TMB-THME)n）：将聚乙烯亚胺（PEI）溶解在二氯甲烷中，将活化的三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷（TMB-THME-PC）溶解在二氯甲烷中，惰性气体保护下，将TMB-THME-PC的二氯甲烷溶液缓慢滴加到PEI的二氯甲烷溶液中，滴加完毕，室温下反应20～30h，得到聚乙烯亚胺-(三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷)，其反应过程如下所示：
制备过程中，步骤(3)中，可以控制活化的三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷（TMB-THME-PC）的用量来调整m和n的比例关系。
上述技术方案中，聚乙烯亚胺-(三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷)在水中可溶，例如：对于10 kDa聚乙烯亚胺，TMB-THME修饰度为5，9和14（每分子聚乙烯亚胺含TMB-THME的个数）均可溶于水；对于1.8 kDa聚乙烯亚胺，TMB-THME修饰度为1.3，2.1和4.2均可溶于水；并且聚乙烯亚胺-(三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷)在pH 7.4下相对稳定，但在弱酸性环境下（如pH 5.0）快速水解，将疏水修饰转变为亲水修饰。
上述技术方案中，所述聚乙烯亚胺-(三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷)可以用于制备符合转染要求的DNA纳米复合物，由于疏水分子的引入，改性PEI在与DNA作用形成复合物时，静电和疏水同时作用形成更紧密的复合物，故改性后的PEI-g-(TMB-THME)n可以装载DNA形成粒径较小、表面电位较高的复合物。例如：改性10 kDa PEI所得PEI-g-(TMB-THME)n在氮磷比大于等于5/1时，即可有效地压缩DNA，形成粒径100~170 nm、表面电位+25~+43 mV的复合物，在氮磷比为10/1时，PEI-g-(TMB-THME)n装载DNA形成的复合物粒径为110~160 nm，表面电位为+25~+28 mV，而10 kDa PEI与DNA形成的复合物粒径为175 nm，表面电位为+18 mV。同样，TMB-THME修饰改性1.8 kDa PEI后所得PEI-g-(TMB-THME)n也与DNA形成粒径较小，表面电位较高的复合物，例如，在氮磷比为20/1时，改性1.8 kDa PEI形成的复合物粒径是120~190 nm，表面电位为+22~+26 mV，而1.8 kDa PEI形成粒径为450 nm，表面电位是+22 mV的DNA复合物。此外，TMB-THME改性PEI没有影响到PEI的pH缓冲能力。
上述技术方案中，所述聚乙烯亚胺-(三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷)中缩醛键在不同的pH下的水解情况可以通过紫外测得。以PEI (10 kDa)-g-(TMB-THME)9为例，结果显示在pH 4.0、5.0和6.0下的半衰期分别是1.3h、2.8h和11h，而在pH 7.4下24h内的水解很少（<12%）。同时，通过DLS和凝胶延迟实验研究了复合物中DNA在pH 5.0和7.4下的释放行为。以PEI-g-(TMB-THME)9形成的DNA复合物为例，结果表明在3 h内，在pH 5.0下复合物粒径增大至800 nm以上，而在pH 7.4下粒径只有微小的变化。同时，表面电位在pH 5.0下6 h内降低至-25 mV左右，而在pH 7.4下表面电位基本不变。凝胶延迟实验结果进一步表明改性10 kDa PEI/DNA复合物在pH 7.4下具有较高的稳定性，但在pH 5.0下DNA则很快地释放出来。
上述技术方案中，采用本发明所述聚乙烯亚胺-(三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷)与DNA形成的复合物可以进一步用于细胞内基因转染。以pGL3表达荧光素酶为报告基因的体外基因转染实验表明：本发明所得PEI-g-(TMB-THME)n和DNA的复合物在氮磷比10/1和20/1下对HeLa和293T细胞在有和无血清的条件下都具有高的转染效率。例如，PEI-g-(TMB-THME)14/DNA复合物在其最优氮磷比下与10 kDa bPEI/DNA复合物相比，在有和无血清的条件下的转染效率分别提高了235和175倍，相比25 kDa bPEI在其最优氮磷比下的转染效率分别提高了16和7倍。并且通过MTT方法测定聚合物的毒性的结果表明：改性10 kDa PEI所得PEI-g-(TMB-THME)n在转染所需的浓度下（0.6 到 2.4 μmol/L）是无毒的。
由于本发明所得聚乙烯亚胺-(三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷)具有上述性质，因此，聚乙烯亚胺-(三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷)在pH 7.4下可有效压缩DNA形成表面带正电荷的纳米复合物（<250 nm），该DNA复合物在pH 7.4下相对稳定，但在弱酸性环境下（如pH 5.0）则会由于缩醛快速水解而导致复合物解离，释放DNA，因此，可高效运载DNA到细胞内，产生高的转染效率；并且，聚乙烯亚胺-(三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷)具有较低的细胞毒性。
因此，本发明同时要求保护上述聚乙烯亚胺-(三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷)作为DNA载体的应用，具体应用过程中，所述DNA载体和DNA之间的氮磷比关系为：主链为9.5～10.5 kDa的PEI的DNA载体装载DNA时的N/P比为10/1～20/1，主链为1.5～2 kDa的PEI的DNA载体装载DNA时的N/P比为20/1~40/1。
由于上述技术方案的应用，本发明与现有技术相比，具有以下优点：
(1) 本发明所述聚乙烯亚胺-(三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷)中由于引入疏水修饰，因此，可增强PEI 的DNA复合能力及与细胞的相互作用。
(2) 本发明所述聚乙烯亚胺-(三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷)在低pH环境下，酸敏感基团降解，疏水修饰转变为亲水修饰，有利于DNA复合物的解离和DNA的胞内释放，本发明中10 kDa bPEI经酸敏感疏水修饰后得到的聚乙烯亚胺-(三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷)，对HeLa细胞的转染效率提高了175倍，与25 kDa的bPEI最优氮磷比下转染效率相比提高了16倍。
(3) 本发明所述聚乙烯亚胺-(三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷)增强了PEI 的DNA复合能力及与细胞的相互作用，内涵体内可将疏水基团转变为亲水基团，实现DNA复合物的解离和DNA的胞内释放，并且细胞毒性低。
附图说明
图1.实施例中改性聚乙烯亚胺用作基因释放载体示意图；
图2.实施例一和二中三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷（TMB-THME）（A）和活化后的三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷（TMB-THME-NC）（B）的氢核磁图谱；
图3.实施例五中PEI (10 kDa)-g-(TMB-THME)9的氢核磁图谱；
图4.实施例五中改性10 kDa PEI的缓冲能力示意图；
图5.实施例五中改性1.8 kDa PEI的缓冲能力示意图；
图6.实施例五中PEI (10 kDa)-g-(TMB-THME)n/DNA复合物的粒径分布（A）及表面电位（B）示意图；
图7.实施例五中PEI (1.8 kDa)-g-(TMB-THME)n/DNA复合物的粒径分布（A）及表面电位（B）示意图；
图8.实施例五中PEI (10 kDa)-g-(TMB-THME)n/DNA复合物的凝胶电泳实验结果；
图9.实施例六中PEI (10 kDa)-g-(TMB-THME)9/DNA复合物中缩醛键在不同pH下的水解趋势；
图10.实施例七中PEI (10 kDa)-g-(TMB-THME)9/DNA复合物在不同pH下缩醛键的水解引起DNA释放引起的粒径（A）和表面电位（B）的变化对比；
图11.实施例七中PEI (10 kDa)-g-(TMB-THME)9/DNA复合物在不同pH下缩醛键水解引发DNA释放的凝胶电泳实验结果；
图12.实施例八中改性10 kDa PEI在不同N摩尔浓度下的毒性结果；
图13.实施例九中PEI (10 kDa)-g-(TMB-THME)n/DNA复合物在HeLa细胞中无血清条件下（A）及有血清条件下（B）的转染结果；
图14.实施例九中PEI (10 kDa)-g-(TMB-THME)n/DNA复合物在293T细胞中无血清条件下（A）及有血清条件下（B）的转染结果。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例一：三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷（TMB-THME）的合成
1，1，1-三羟基乙烷（THME, 6.667 g, 55.5 mmol）和对甲基苯磺酸（0.5278 g, 2.775 mmol）首先在50 ℃下溶解在100 mL四氢呋喃中，然后2，4，6-三甲氧基苯甲醛（TMB，3.63 g, 18.5 mmol）和7.5 g 4 埃分子筛加入其中。50 ℃下反应过夜后，加入7 mL三乙胺，并用75 mL 二氯甲烷稀释。过滤掉分子筛并用二氯甲烷洗涤，减压旋干得白色固体，固体用二氯甲烷溶解后用0.1 M pH 8.0 PB缓冲溶液萃取三次，收集有机相后使用无水硫酸镁干燥过夜，第二天过滤掉硫酸镁并减压旋干得到白色固体，白色固体在真空干燥箱中干燥2天。产率：54.6 %。
TMB-THME的核磁表征见附图2 A：1H NMR (400 MHz, CDCl3): d 6.16 (s, 2H), d 6.06 (s, 1H), d 4.23 (s, 2H), d 3.98 (s, 2H), d 3.88 (s, 6H), d 3.86 (s, 3H), d 3.62 (s, 2H), d 0.76 (s, 3H)。
实施例二：氯甲酸对硝基苯酯（p-NC）活化三甲氧基苯甲缩醛-三羟基乙烷（TMB-THME-PC）
实施例一中白色产物TMB-THME（2.31 g，7.8 mmol）溶解在70 mL二氯甲烷中，在通氮气保护下将三乙胺（2.36 g，23.4 mmol）、吡啶（0.60 g，7.8 mmol）、氯甲酸对硝基苯酯（1.565 g，9.13 mmol）加入其中，室温下反应过夜。反应结束，反应液加到300 mL无水***中（沉淀三乙胺盐酸盐），过滤得滤液沉淀到冰正己烷中，过滤得微褐色固体，真空干燥2天。产率：60 %。
TMB-THME-PC的核磁表征见附图2 B：1H NMR (400 MHz, CDCl3): d 8.30 (d, 2H), d 7.42 (d, 2H), d 6.10 (s, 2H), d 6.00 (s, 1H), d 4.77 (s, 2H), d 4.05 (d, 2H), d 3.83 (s, 6H), d 3.79 (s, 3H), d 3.68 (d, 2H), d 0.90 (s, 3H)。
实施例三：改性10 kDa PEI（PEI (10 kDa)-g-(TMB-THME)n）的合成
10 kDa PEI（0.3 g，6.97 mmol）溶解在6 mL二氯甲烷中，TMB-THME-PC（0.497 g，1.1 mmol）溶解在CH2Cl2中，氮气保护下，逐滴将TMB-THME-PC滴加到10 kDa PEI的二氯甲烷溶液中，滴加完毕，室温下反应24小时。反应结束后，反应液首先在冰***中沉淀三次，之后再用二次水溶解产品，用MWCO 3500透析袋透析除去对硝基苯酚，冷冻干燥2天得到微黄色固体。得到PEI (10 kDa)-g-(TMB-THME)9，产率73 %。
其中PEI (10 kDa)-g-(TMB-THME)9的核磁表征如下见附图3：1H NMR (400 MHz, CDCl3): d 6.07 (s, 2H), d 5.93 (s, 1H), d 4.50 (s, 2H), d 3.97 (s, 2H), d 3.81 (s, 6H), d 3.75 (s, 3H), d 3.57 (s, 2H), d 0.74 (s, 3H), d 3.00-2.50 (PEI)。通过调节疏水分子的投料个数9、12、17，得到含不同疏水分子个数分别为5、9、14的改性10 kDa PEI。TMB-THME修饰度为5，9和14（每分子聚乙烯亚胺含TMB-THME的个数）均可溶于水。具体结果见下表1：
表1. 疏水修饰的改性10kDa PEI的基本性质表征
| 序号 | 改性10 kDa PEI | 设计的TMB-THME的理论接枝数 | 核磁计算的TMB-THME的实际接枝数 | 缓冲能力 (%) |
| 1 | PEI-g-(TMB-THME)5 | 9 | 5 | 13.9 |
| 2 | PEI-g-(TMB-THME)9 | 12 | 9 | 13.7 |
| 3 | PEI-g-(TMB-THME)14 | 17 | 14 | 13.0 |
| 4 | 10 kDa PEI | - | - | 13.5 |
实施例四：改性1.8 kDa PEI（PEI (1.8 kDa)-g-(TMB-THME)n）的合成
1.8 kDa PEI（0.184 g，4.279 mmol）溶解在6 mL二氯甲烷中，TMB-THME-PC（0.385 g，0.8558 mmol）溶解在二氯甲烷中，氮气保护下，逐滴将TMB-THME-PC滴加到1.8 kDa PEI的二氯甲烷溶液中，滴加完毕，室温下反应24小时。反应结束后，反应液首先减压旋蒸至干，之后用二次水溶解，然后用MWCO 1000透析袋透析除去对硝基苯酚，透析结束先过滤除去析出的TMB-THME部分，滤液冷冻干燥2天得到微黄色固体。得到PEI (1.8 kDa)-g-(TMB-THME)4.2，产率46 %。
其中PEI （1.8 kDa）-g-(TMB-THME)4.2的核磁表征如下：1H NMR (400 MHz, CDCl3): d 6.07 (s, 2H), d 5.93 (s, 1H), d 4.50 (s, 2H), d 3.97 (s, 2H), d 3.81 (s, 6H), d 3.75 (s, 3H), d 3.57 (s, 2H), d 0.74 (s, 3H), d 3.00-2.50 (PEI)。通过调节疏水分子的投料个数比为1.6、4.2、8.4，得到含不同疏水分子个数分别为1.3、2.1、4.2的改性1.8 kDa PEI。TMB-THME修饰度为1.3，2.1和4.2均可溶于水。具体结果见下表2：
表2. 疏水修饰的改性1.8 kDa PEI的基本性质表征
| 序号 | 改性1.8 kDa PEI | 设计的TMB-THME的理论接枝数 | 核磁计算的TMB-THME的实际接枝数 | 缓冲能力 (%) |
| 1 | PEI-g-(TMB-THME)1.3 | 1.6 | 1.3 | 13.0 |
| 2 | PEI-g-(TMB-THME)2.1 | 4.2 | 2.1 | 12.7 |
| 3 | PEI-g-(TMB-THME)4.2 | 8.4 | 4.2 | 9.9 |
| 4 | 1.8 kDa PEI | - | - | 13.2 |
实施例五：复合物的制备及表征
1H NMR是用Varian Inova 400 型共振波谱仪以氘代氯仿（CDCl3）为溶剂测得，通过核磁确定衍生物的取代度。PEI-g-(TMB-THME)n衍生物的缓冲能力是通过酸碱滴定在pH 10.0~2.0范围内测得。简言之，PEI-g-(TMB-THME)n衍生物（0.1 mmol N）先溶在5 mL 150 mM NaCl中，然后使用1 M的NaOH调节pH至10.0，之后使用0.1 M HCl快速滴定样品并测定pH。作为对比，10 kDa、1.8 kDa、25 kDa PEI按照同样的方法滴定。缓冲能力定义为pH 7.4至5.1之间胺基被质子化的比例，并按照下面的公式计算：Buffer capacity (%) =100 (⊿VHCl × 0.1 M) / Nmol。
此处，⊿VHCl是将溶液的pH值从7.4调节到5.1所需要的HCl的体积（0.1 M），Nmol是聚合物中所有可质子化的胺基的比例。
参照图1，以1 mg/mL的浓度将PEI (10 kDa)-g-(TMB-THME)n溶解在HEPES缓冲溶液（20 mM, pH 7.4）中。按氮磷比10/1、20/1、40/1计算得所需的量，将600 μL PEI (10 kDa)-g-(TMB-THME)n的HEPES溶液加到150 μL的质粒DNA（37.5 μg/mL）中，涡流摇动5秒，然后在室温下培育。30 min后测定复合物的粒径及表面电位。
按前述方法以氮磷比1/1、2/1、3/1、5/1、8/1制备PEI (10 kDa)-g-(TMB-THME)n/DNA复合物。在制备的复合物中加入一定量的溴化乙啶和溴酚蓝溶液，之后在TAE缓冲溶液中0.8 %的琼脂糖上以110 V跑胶40 分钟，实验结束观测实验结果。
按相同的方法在氮磷比20/1、40/1、60/1下制备PEI (1.8 kDa)-g-(TMB-THME)n/DNA复合物并测定粒径和表面电位。
该实施例的结果参见图4～8，其中，图4~5表明TMB-THME改性PEI没有影响到PEI的pH缓冲能力。图6表明改性10 kDa PEI所得PEI-g-(TMB-THME)n在氮磷比大于等于5/1时，即可有效地压缩DNA，形成粒径100~170 nm、表面电位+25~+43 mV的复合物，在氮磷比为10/1时，PEI-g-(TMB-THME)n装载DNA形成的复合物粒径为110~160 nm，表面电位为+25~+28 mV，而10 kDa PEI与DNA形成的复合物粒径为175 nm，表面电位为+18 mV。图7表明 TMB-THME修饰改性1.8 kDa PEI后所得PEI-g-(TMB-THME)n也与DNA形成粒径较小，表面电位较高的复合物，例如，在氮磷比为20/1时，改性1.8 kDa PEI形成的复合物粒径是120~190 nm，表面电位为+22~+26 mV，而1.8 kDa PEI形成粒径为450 nm，表面电位是+22 mV的DNA复合物。图8表明所有改性修饰后的10 kDa PEI在N/P比为3/1下均可与DNA有效复合。
实施例六：通过紫外测定复合物中缩醛键在不同pH下的水解
通过紫外在290 nm处的吸收测定缩醛的水解。将在氮磷比10/1下制备的PEI (10 kDa)-g-(TMB-THME)9/DNA复合物分为等量的四份，用4.0 M pH 4.0、5.0、6.0的醋酸缓冲溶液将其中三份分别调到pH 4.0、5.0、6.0，另一份加入等体积的4.0 M pH 7.4的磷酸缓冲溶液以保持复合物相同的盐浓度。在不同的时间点，分别取其中的80 μL并加3.5 mL 磷酸缓冲溶液（0.1 M，pH 7.4）测定紫外在290 nm处的吸收。最终所有的样品加2滴浓盐酸以确保所有的缩醛键完全水解作为计算水解率的100 %基准。
所得结果参见图9，结果显示在pH 4.0、5.0和6.0下的半衰期分别是1.3h、2.8h和11h，而在pH 7.4下24h内的水解很少（<12%）。
实施例七：酸性条件下缩醛键水解引发的DNA释放行为
将在氮磷比10/1下制备的PEI (10 kDa)-g-(TMB-THME)9/DNA复合物分为等量的两份，用4.0 M pH 5.0的醋酸缓冲溶液将其中一份调节pH至5.0，另一份加入等体积的4.0 M pH 7.4的磷酸缓冲溶液以保持相同的盐浓度。在不同的时间点，pH 5.0下培育的样品加4.0 M pH 7.4的磷酸缓冲溶液将pH 调回7.4，同时pH 7.4下培育的样品加等量的4.0 M pH 7.4磷酸缓冲溶液以保持相同的盐浓度，之后进行粒径和表面电位的测量。结果见图10。结果表明在3 h内，在pH 5.0下复合物粒径增大至800 nm以上，而在pH 7.4下粒径只有微小的变化。同时，表面电位在pH 5.0下6 h内降低至-25 mV左右，而在pH 7.4下表面电位基本不变。
在氮磷比10/1下制备的PEI (10 kDa)-g-(TMB-THME)9/DNA复合物按同样的调节pH值并培育4.5 h后，调节pH回7.4，同时加入一定量的葡聚糖硫酸钠（电荷比为40/1），半小时后以实施例五中同样的方法进行凝胶延迟实验。结果见图11，其中孔 1: DNA; 孔2: 10 kDa PEI; 孔3: PEI-g-(TMB-THME)5; 孔4: PEI-g-(TMB-THME)9; 孔5: PEI-g-(TMB-THME)14. 孔2-5加入一定量的葡聚糖硫酸钠 （DSS，DSS与DNA的电荷比为40/1）。凝胶延迟实验结果进一步表明改性10 kDa PEI/DNA复合物在pH 7.4下具有较高的稳定性，但在pH 5.0下DNA则很快地释放出来。
实施例八：MTT方法研究了PEI (10 kDa)-g-(TMB-THME)n的毒性
在293T细胞中通过MTT方法研究了改性10 kDa PEI的毒性。首先在96孔板中每个孔加6000个细胞并加100 mL含10%血清的培养基，培养至每个孔中细胞密度达到70～80 %。每孔加入不同的浓度的PEI (10 kDa)-g-(TMB-THME)n溶液随后再培养48 h。用200 μL新鲜的培养基换掉培养基。每孔加入25 μL MTT溶液（4 mg/mL PBS中）并在37 ℃下培养4 h。 吸出培养基，活细胞产生的MTT-甲瓒溶解在150 mL DMSO中，然后使用酶标仪测定每个孔在490 nm处的吸收。细胞相对存活率通过与只有培养基的孔中的490 nm处的吸收相比得到。每组数据有5个平行样。
结果参见图12，结果表明：改性10 kDa PEI所得PEI-g-(TMB-THME)n在转染所需的浓度下（0.6 到 2.4 μmol/L）是无毒的。
实施例九：PEI (10 kDa)-g-(TMB-THME)n/DNA复合物在不同细胞中的转染实验
以质粒pGL3为报告基因进行在HeLa和293T细胞中的转染，转染过程参见图1。转染是用在氮磷比10/1和20/1下形成的PEI (10 kDa)-g-(TMB-THME)n/DNA复合物进行的。细胞首先种在24孔板（细胞密度是60000细胞/孔）中，在37 ℃下维持5 %的CO2浓度10 %血清的培养基中培育至细胞密度达到70 %。转染实验为：细胞先用PBS缓冲溶液洗涤，随后每孔加入100 mL 的复合物溶液（含1 mg的质粒DNA）和400 mL含有10 %血清或无血清的培养基在37 ℃下培育4 h。之后除去复合物，并加入500 mL 含10 %血清的新鲜培养基，细胞再培育2 天。使用商业化的荧光素酶检测试剂盒（浦隆生物）在TD-20/20 光度计 (Promega, USA) 上定量测定荧光素酶。转染效率以每mg 蛋白的相对荧光强度表示。以25 kDa bPEI在其最优氮磷比10/1下形成的复合物作为参考标准。所有的实验数据平行三组。
结果见图13、14，以pGL3表达荧光素酶为报告基因的体外基因转染实验表明：本发明所得PEI-g-(TMB-THME)n和DNA的复合物在氮磷比10/1和20/1下对HeLa和293T细胞在有和无血清的条件下都具有高的转染效率。例如，PEI-g-(TMB-THME)14/DNA复合物在其最优氮磷比下与10 kDa bPEI/DNA复合物相比，在有和无血清的条件下的转染效率分别提高了235和175倍，相比25 kDa bPEI在其最优氮磷比下的转染效率分别提高了16和7倍。
Claims (3)
1.一种疏水基团修饰的聚乙烯亚胺，其特征在于：所述聚乙烯亚胺为缩醛分子三甲氧基苯甲缩醛-三羟甲基乙烷缩醛修饰的聚乙烯亚胺，所述聚乙烯亚胺含有酸敏感可降解缩醛功能基团，其结构通式如下所示：
式中，主链聚乙烯亚胺的数均分子量为1.5～2 kDa，并且主链聚乙烯亚胺接枝缩醛分子三甲氧基苯甲缩醛-三羟甲基乙烷缩醛的接枝数为1～5。
2.一种疏水基团修饰的聚乙烯亚胺，其特征在于：所述聚乙烯亚胺为缩醛分子三甲氧基苯甲缩醛-三羟甲基乙烷缩醛修饰的聚乙烯亚胺，所述聚乙烯亚胺含有酸敏感可降解缩醛功能基团，其结构通式如下所示：
；
式中，主链聚乙烯亚胺的数均分子量为9.5～10.5 kDa，并且主链聚乙烯亚胺接枝缩醛分子三甲氧基苯甲缩醛-三羟甲基乙烷缩醛的接枝数为5～15。
3.权利要求1或2所述疏水基团修饰的聚乙烯亚胺作为DNA载体的应用。
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