CN102174550A

CN102174550A - 一种重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因及其表达载体和用途

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Publication number: CN102174550A
Application number: CN 201110031855
Authority: CN
Inventors: 药立波; 李霞; 王秦豪; 茹懿; 申亮亮; 张璟
Original assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Current assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Priority date: 2011-01-28
Filing date: 2011-01-28
Publication date: 2011-09-07
Anticipated expiration: 2031-01-28
Also published as: CN102174550B

Abstract

本发明公开了一种重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因及其表达载体和用途，重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因是将IRS-1的PTB结构域基因与CHIP的U-box结构域基因连接，具体的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。所构建的PTB-U-box融合基因，能够被克隆到不同的表达载体，从而通过不同的途径进入到肿瘤细胞中发挥作用，所述的表达载体包括真核表达载体或腺病毒表达载体。该融合基因在转染肿瘤细胞之后，能够下调宿主肿瘤细胞的致癌相关蛋白IGF-1R，肿瘤细胞的细胞增殖和侵袭能力显著被降低，表现出对肿瘤细胞的增殖抑制和侵袭抑制，从而达到抗肿瘤的效果。

Description

一种重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因及其表达载体和用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及基因重组及其表达，特别涉及一种重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因及其表达载体和用途。

背景技术

1、CHIP的概述

CHIP(Carboxy terminus of Hsc70 Interacting Protein)是一类进化保守的、广泛分布的胞浆蛋白，最初被认为是一种共伴侣蛋白(co-chaperone)。由于其分子中含有一个U-box结构域，因此本质上又属于一类E3泛素连接酶。CHIP通过促进蛋白质的泛素化、降解，在蛋白质质量控制、稳定性调控过程中起着重要的作用。在乳腺癌组织中，CHIP的表达与肿瘤分级呈负相关；实验证据还表明CHIP可以抑制肿瘤的增殖和转移。这些研究提示增强CHIP的作用有可能作为一种新的肿瘤治疗策略。

1)CHIP含有一个TPR结构域以及一个U-box结构域

CHIP蛋白由N末端开始，分别由TPR结构域(tetratricopeptide repeatdomain)、Linker和U-box结构域构成。TPR结构域介导蛋白-蛋白相互作用，能够与热休克蛋白Hsc70/Hsp70、Hsp90C末端相互识别并结合，调控热休克蛋白底物/客户蛋白的折叠过程；Linker的功能尚不明确，目前只了解它对于TPR依赖的相互结合是必需的；C端的U-box结构域赋予了CHIP泛素连接酶活性，负责募集泛素结合酶E2并将结合在E2上的泛素转移至TPR结构域所结合的伴侣分子及其底物蛋白上，促进这些分子在蛋白酶体中降解。

2)CHIP分子作为共分子伴侣和一类泛素连接酶，是细胞内蛋白质折叠-重折叠机器和泛素-蛋白酶体***这两种通路之间的分子枢纽，参与细胞内蛋白质质量控制

细胞依赖蛋白质质量控制***(protein quality control，QC)来持续监测新生肽链的折叠和错误折叠蛋白的修复或降解，以维持细胞的稳态。QC由分子伴侣(包括Hsp70、Hsp40等)和泛素-蛋白酶体***组成，前者帮助新生肽链的折叠与重折叠，后者负责降解错误折叠或损伤的蛋白。

CHIP作为一种共分子伴侣，能够借助其TPR结构域与分子伴侣Hsp70C末端相互结合，调节分子伴侣Hsp70家族成员与底物蛋白的结合和释放；另外，CHIP与Hsp70结合后能够阻止Hsp70的折叠，并依赖其U-box结构域和泛素连接酶活性促进底物蛋白的降解。通过上述方式，CHIP直接参与细胞内蛋白质的质量控制。

3)新近研究提示CHIP具有抑制肿瘤细胞增殖和转移的作用

CHIP分布广泛，尤其在代谢活跃的组织中其表达水平很高，如骨骼肌、心脏和脑。在细胞中，CHIP主要定位在胞质内，也有少部分存在于核中。最近的研究表明，在人乳腺癌组织中，CHIP的表达水平与肿瘤恶性程度和分级反相关。机制研究和细胞实验表明，CHIP通过促进多种致癌蛋白例如HER2、ER-a、GR、SRC-3等的泛素化、降解，从而抑制肿瘤的增殖和转移。

2、重组泛素连接酶的应用

在泛素化过程中泛素连接酶E3负责特异性识别与结合底物。近年来多个研究组应用重组技术构建重组泛素连接酶，成功降解正常情况下并非泛素化***天然底物的某些蛋白。例如通过修饰泛素连接酶复合物Skp1-Cullin1-F-box(SCF)的底物结合亚单位F-box构成的重组F-box蛋白CFP，可靶向性降解pRB和β-catenin。将分别来自BRCA1和BARD的两个RING与增殖细胞核抗原PCNA进行重组后，该重组分子以蛋白酶体依赖的方式降低p57蛋白的水平，并且下调其功能。而李霞等的研究也表明，利用Cb1构建的重组泛素连接酶能够有效的下调乳腺癌细胞中高表达的HER2，从而达到抑制肿瘤生长的目的。这些研究证实利用重组的泛素连接酶，可靶向性地降解一些疾病相关分子。但目前还没有利用CHIP泛素连接酶活性构建重组泛素连接酶进行基因治疗研究的相关报道。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因及其表达载体和用途，构建基于CHIP的泛素连接酶活性区域构建融合基因，所构建的融合基因具有靶向性的泛素化和降解功能，可用于抗肿瘤的药物的制备或进行基因治疗。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因，是将IRS-1的PTB结构域基因与CHIP的U-box结构域基因连接。

所述的重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

所述的重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因通过EcoR I、EcoR V酶切位点克隆入真核表达载体pFLAG-CMV4，得到重组泛素连接酶真核表达载体pFLAG-CMV4-PTB-U-box。

所述的重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因克隆入目标载体pAd/CMV/V5-DEST中，得到重组腺病毒载体pAd/CMV/V5-DEST-PTB-U-box。

所述的重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因应用于抗IGF-1R阳性表达肿瘤药物的制备。

所述的抗肿瘤药物的制备的应用是将重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因克隆入真核表达载体或腺病毒表达载体。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明将能够识别并结合IGF-1R的IRS-1的PTB结构域基因与具有泛素连接酶活性的CHIP的U-box结构域基因，通过PCR融合构成重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因，该融合基因被表达后能够靶向性降解致癌相关蛋白IGF-1R，其中，PTB结构域负责对IGF-1R靶向性结合，U-box负责将泛素分子连接至底物以促进底物发生泛素化和降解。

所构建的PTB-U-box融合基因，能够被克隆到不同的表达载体，从而通过不同的途径进入到肿瘤细胞中发挥作用，所述的表达载体包括真核表达载体或腺病毒表达载体。

本发明基于PTB-U-box融合基因，构建了重组泛素连接酶真核表达载体pFLAG-CMV4-PTB-U-box，该载体在转染肿瘤细胞之后，能够下调宿主肿瘤细胞的致癌相关蛋白IGF-1R，肿瘤细胞的细胞增殖和侵袭能力显著被降低，表现出对肿瘤细胞的增殖抑制和侵袭抑制，从而达到抗肿瘤的效果。

而基于PTB-U-box融合基因，构建的重组腺病毒载体pAd/CMV/V5-DEST-PTB-U-box，在产生包含融合基因的病毒颗粒之后，当达到一定滴度之后能够被注射到肿瘤实体当中。

附图说明

图1为构建的PTB-U-box融合基因的电泳检测结果图；

图2为重组真核表达载体pFLAG-CMV4-PTB-U-box的双酶切鉴定结果图；

图3为入门载体pENTR-PTB-U-box的双酶切鉴定的电泳检测结果图；

图4为免疫印迹检测融合基因PTB-U-box对宿主肿瘤细胞IGF-1R蛋白下调的结果图；

图5为MTT比色法检测转染不同载体的Hela细胞的细胞增殖曲线图；

图6为转染不同载体的Hela细胞克隆形成能力的Giemsa染色结果图；

图7为转染不同载体的Hela细胞克隆形成率的柱状分析结果图；

图8为转染不同载体的Hela细胞的细胞侵袭视野观察结果图；

图9为转染不同载体的Hela细胞的细胞侵袭计数柱状结果图。

具体实施方式

本发明利用接头分子IRS-1(Insulin Receptor Substrate 1)的PTB结构域(Phosphotyrosine Binding domain)能够识别并结合***受体(Insulin-like Growth Factor Receptor 1，IGF-1R)的特性和CHIP的泛素连接酶活性，构建能够靶向性降解致癌相关蛋白IGF-1R的重组泛素连接酶PTB-U-box。所构建的融合基因PTB-U-box是分别克隆IRS-1的PTB结构域基因与具有泛素连接酶活性的CHIP的U-box结构域基因，采用重组PCR进行融合；其中，PTB结构域负责对IGF-1R靶向性结合，U-box负责将泛素分子连接至底物以促进底物发生泛素化、降解。下面结合融合基因PTB-U-box、真核表达载体和重组腺病毒的构建，及促进致癌相关蛋白IGF-1R的降解对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因的构建

1.1PTB和U-box结构域基因的克隆

根据Genbank中IRS-1的PTB基因序列、CHIP的U-box基因序列分别设计扩增引物对P用于扩增PTB基因序列作为对照，扩增引物对P1、P2，用于融合基因的重组扩增，具体设计为：

引物对P：

上游引物：ggcgaattca atggaggctg gggaggactt gag 33；

下游引物：ggcgatatcc tagcgagggc ggaactcatc ac 32；

引物对P1、P2：

Up：ggcgaattca atggaggctg gggaggactt gag 33；

M1：gttcagccgg cgagggcgga actcatc 27；

M2：cgccctcgcc ggctgaactt cggggacg 28；

Down：ggcgatatcc tagtagtcct ccacccagcc attc 34；

其中，扩增PTB的下游引物序列M1中引入U-box基因片段的5’端的几个反向互补核苷酸，扩增U-box的上游引物序列M2引入PTB基因片段3’-端几个核苷酸，以便两个截短体在后续重组PCR反应中相融合。同时，在扩增PTB的上游引物序列Up中引入酶切位点EcoR I，扩增U-box的下游引物序列Down中引入酶切位点EcoR V。

然后，以Hela细胞的cDNA为模板，分别以引物对P、P1(Up，M1)为扩增引物对，PCR扩增PTB结构域基因，PCR扩增程序为：94℃5min，94℃30s，57℃45s，72℃30s，35cycle；

以Hela细胞的cDNA为模板，以引物对P2(M2，Down)为扩增引物对，PCR扩增U-box结构域基因，PCR扩增程序为94℃5min，94℃30s，58℃30s，72℃30s，35cycle。

收集PCR扩增产物，纯化后获得PTB结构域基因与U-box结构域基因。

1.2PTB-U-box融合基因的构建

利用重组PCR，将扩增的PTB结构域基因与扩增的U-box结构域基因进行基因融合：

将引物对P1扩增的PTB结构域基因与引物对P2扩增的U-box结构域基因等量混合物(1∶1混合)为模板，以PTB上游引物Up、U-box下游引物Down作为引物对，进行重组PCR，使PTB和U-box相融合，PCR扩增程序为：94℃5min，94℃30s，61℃45s，72℃1min，35cycle。收集重组PCR扩增的产物，纯化后获得PTB-U-box融合基因。

对PTB结构域基因与PTB-U-box融合基因进行凝胶电泳检测的结果如图1所示，其中泳道M为Marker，PTB结构域基因的片段大小为372bp，PTB-U-box(PTB-U)融合基因的片段大小为906bp，与预期设计相符合。

2、PTB-U-box融合基因的重组真核表达载体、重组腺病毒载体的构建

2.1重组真核表达载体pFLAG-CMV4-PTB-U-box的构建

分别用限制性内切酶EcoR I、EcoR V对PTB-U-box融合基因和真核表达载体pFLAG-CMV4分别进行双酶切，回收酶切片段之后，用T4连接酶将酶切后的PTB-U-box融合基因与pFLAG-CMV4载体相连接。

连接反应完成以后，连接产物转化DH5α感受态细胞，培养过夜后，挑取单个克隆，摇菌培养，提取质粒并进行EcoR I、EcoR V双酶切鉴定，最后进行测序验证；将所构建成功的重组分子命名为pFLAG-CMV4-PTB-U-box，此即为重组泛素连接酶PTB-U-box真核表达载体。

双酶切鉴定的电泳结果如图2所示，其中泳道M为Marker，泳道CMV4-PTB是将PTB结构域基因***载体作为酶切检测对照，泳道CMV4-PTB-U为融合基因的真核表达载体的酶切检测结果，可以看出两个载体均被酶切成大小两个片段，而其中的小片段PTB-U融合基因大于作为对照的PTB结构域基因。

对比测序结果，PTB-U-box融合基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

1.3重组腺病毒载体pDEST-PTB-U-box的构建

重组腺病毒的构建使用Invitrogen公司的ViraPower^TM腺病毒载体***，该***包括入门载体pENTR^TM，目标载体pAd/CMV/V5-DEST，LR clonase，Proteinase K等。首先扩增的PTB结构域基因和PTB-U-box融合基因，利用限制性内切酶EcoR I、EcoR V以及T4连接酶，分别将这两条片段***到入门载体pENTR^TM3C中。经酶切鉴定和测序验证之后，进行LR反应，在PH为8.0的TE buffer中，LR重组酶的作用下，25℃反应1h，将目的片段PTB或PTB-U-box融合基因，从入门载体转移到目标载体pAd/CMV/V5-DEST中。然后加入Proteinase K，37℃作用10分钟终止反应，取重组产物1μL转化Top10感受态细胞，挑取单克隆，摇菌培养并用含30μg/ml氯霉素的氨苄青霉素LB培养液负性筛选，对氯霉素敏感株提取质粒，双酶切鉴定，最后测序验证；测序正确的融合基因重组入目标载体的载体命名为重组腺病毒载体pAd/CMV/V5-DEST-PTB-U-box。

对入门载体pENTR-PTB-U-box的双酶切鉴定的电泳检测结果如图3所示，其中图3a为作为对照的pENTR-PTB载体，图3b为pENTR-PTB-U-box入门载体的双酶切鉴定结果，可以看出两个载体均被酶切成大小两个片段，而其中的小片段PTB-U融合基因大于作为对照的PTB结构域基因。

在重组腺病毒载体pAd/CMV/V5-DEST-PTB-U-box构建完成之后，将其感染人胚肾胚HEK-293细胞，产生具有传染性的病毒颗粒，用斑点杂交法测定重组病毒颗粒的滴度，获得足够的滴度后，可进行荷瘤鼠瘤体局部注射，在动物水平检测该重组泛素连接酶的抑制肿瘤作用效果。

3、真核表达载体转染IGF-1R阳性肿瘤细胞系Hela，促进IGF-1R的降解，并且抑制细胞增殖和侵袭

将IGF-1R表达阳性的对数生长期的Hela肿瘤细胞以每孔2×10⁵细胞的密度接种于6孔培养板内，培养液均为含10％小牛血清的DMEM，在二氧化碳培养箱(37℃)中培养。次日当细胞生长至80％时，按照Lipofectamine^TM2000说明书进行脂质体转染，将真核表达载体pFLAG-CMV4-PTB-U-box转染Hela肿瘤细胞。

3.1免疫印迹检测融合蛋白PTB-U-box对宿主肿瘤细胞IGF-1R蛋白的下调

收集培养的重组Hela肿瘤细胞，加入细胞裂解液，冰上裂解细胞30min，收集细胞提取物，利用免疫印迹检测转染融合基因PTB-U-box的肿瘤细胞中IGF-1R蛋白的含量的变化，以转染了pFLAG-CMV4空质粒、转染pFLAG-CMV4-PTB载体的Hela肿瘤细胞作为转染融合基因的Hela肿瘤细胞的对照。

在进行免疫印迹检测时，抗FLAG抗体(M2)购自sigma公司，抗IGF-1Rα/β抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司，荧光标记的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG购自Odyssey公司。

免疫印迹检测结果如图4所示，转染pFLAG-CMV4-PTB载体、pFLAG-CMV4-PTB-U-box载体之后，以抗FLAG标签抗体检测结果显示转染的目的片段PTB或PTB-U-box均相应地得到表达。

IGF-1Rα、β免疫印迹检测结果显示：与转染了pFLAG-CMV4空质粒及pFLAG-CMV4-PTB(PTB)的对照细胞相比较，转染了pFLAG-CMV4-PTB-U-box的Hela细胞中其IGF-1Rα、β条带颜色均明显变浅，也即其IGF-1Rα、β含量相应的减少，而作为对照的Anti-tubulin其免疫印迹检测显示一致，无明显变化；这说明在相同转染条件下，融合基因PTB-U-box的表达对Hela肿瘤细胞中IGF-1R蛋白产生了靶向性降解，使得其IGF-1R蛋白发生下调。

3.2MTT比色实验和克隆形成实验检测融合基因PTB-U-box表达对宿主肿瘤细胞增殖的影响

分别转染pFLAG-CMV4空载体(CMV4)、pFLAG-CMV4-PTB(PTB)和pFLAG-CMV4-PTB-U-box(PTB-U)的Hela细胞株，24小时后以2000个细胞/孔的密度接种于96孔板，于接种后1～5天每天进行MTT比色法检测，比较三种转染细胞的细胞增殖，绘制细胞增殖曲线。结果如图5所示，其中横坐标为转染后的天数，纵坐标为反应活细胞数的吸光度值，可以看出，从第2天起，转染空载体和PTB的肿瘤细胞的增殖情况基本一致，而转染PTB-U-box融合基因的肿瘤细胞的增殖明显滞后于前两者，这表明融合基因的表达抑制了肿瘤细胞的增殖。

分别转染pFLAG-CMV4空载体(CMV4)、pFLAG-CMV4-PTB(PTB)和pFLAG-CMV4-PTB-U-box(PTB-U)的Hela细胞株，24小时后以200个细胞数接种于60mm培养皿，同时加入G418至终浓度600μg/ml，培养14天，对细胞进行Giemsa染液染色、照相并计算克隆形成率，检测转染细胞的平板克隆形成能力。染色后的照片如图6所示，克隆形成率的柱状分析结果如图7所示，结合图6、图7，可以明显看出，转染空载体和PTB的Hela细胞所形成的细胞克隆数无明显差别，而转染PTB-U的Hela细胞所形成的细胞克隆数与前两者相比明显减少，表明肿瘤细胞转染融合基因在表达之后，明显抑制Hela细胞的克隆形成能力，进一步说明了融合基因表达后对肿瘤细胞增殖的抑制。

3.3Transwell实验检测融合基因PTB-U-box表达对宿主肿瘤细胞侵袭的影响

分别转染pFLAG-CMV4空载体(CMV4)、pFLAG-CMV4-PTB(PTB)和pFLAG-CMV4-PTB-U-box(PTB-U)的Hela细胞株，进行transwell侵袭实验，将细胞稀释成10⁴个/ml，每个transwell小室(预先铺matrigel 80μl)接种200μl，24h后以棉签充分擦除小室内的matrigel，用Giemsa染液进行细胞染色，倒置显微镜下(200×)观察照相，并进行细胞计数，随机计数10个视野，计算平均侵袭细胞数。

倒置显微镜的观察结果如图8所示，细胞计数柱状结果图如图9所示，结合图8、图9，可以明显看出在transwell小室接种同样数量的细胞24h之后，转染空载体和PTB的Hela细胞发生侵袭的细胞数量无明显差别，而转染融合基因的Hela细胞侵袭数与前两者相比明显减少，表明肿瘤细胞转染融合基因在表达之后，明显抑制Hela细胞的侵袭能力，说明融合基因PTB-U-box的表达能够抑制肿瘤细胞的侵袭能力。

经上述验证表面：重组泛素连接酶PTB-U-box的真核表达质粒pFLAG-CMV4-PTB-U-box，转染IGF-1R阳性肿瘤细胞系Hela后，通过促进IGF-1R下调，能够有效抑制IGF-1R阳性细胞的增殖和侵袭，具有抗IGF-1R阳性肿瘤的效果和用途。

Claims

1.一种重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因，其特征在于，是将IRS-1的PTB结构域基因与CHIP的U-box结构域基因连接。

2.如权利要求1所述的重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因，其特征在于，所述的重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

3.如权利要求1或2所述的重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因，其特征在于，所述的重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因通过EcoR I、EcoR V酶切位点克隆入真核表达载体pFLAG-CMV4，得到重组泛素连接酶真核表达载体pFLAG-CMV4-PTB-U-box。

4.如权利要求1或2所述的重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因，其特征在于，所述的重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因克隆入目标载体pAd/CMV/V5-DEST中，得到重组腺病毒载体pAd/CMV/V5-DEST-PTB-U-box。

5.权利要求1或2所述的重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因应用于抗IGF-1R阳性表达肿瘤药物的制备。

6.如权利要求5所述的抗肿瘤药物的制备的应用，其特征在于，将重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因克隆入真核表达载体或腺病毒表达载体。