CN102171345A - Δ6去饱和酶及其在制备多不饱和脂肪酸中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及Δ6去饱和酶，它具有将亚油酸[“LA”；18:2ω-6]转化成γ-亚麻酸[“GLA”；18:3ω-6]和/或将α-亚麻酸[“ALA”；18:3ω-3]转化成十八碳四烯酸[“STA”；18:4ω-3]的能力。公开了包含此类编码Δ6去饱和酶的片段的分离核酸片段和重组构建体、以及使用这些在含油酵母中的Δ6去饱和酶制备长链多不饱和脂肪酸[“PUFA”]的方法。

Description

Δ6去饱和酶及其在制备多不饱和脂肪酸中的用途

本专利申请要求提交于2008年8月1日的美国临时申请61/085,482的优先权，其公开内容全文以引用方式并入本文。

发明领域

本发明属于生物技术领域。更具体地讲，本发明涉及编码Δ6脂肪酸去饱和酶的多核苷酸序列的鉴定以及这些去饱和酶在制备长链多不饱和脂肪酸[“PUFA”]中的用途。

背景技术

人们正研究包括植物、藻类、真菌、原生藻菌(stramenopiles)和酵母在内的多种不同宿主作为商业化多不饱和脂肪酸[“PUFA”]生产的手段。基因工程已经证明能够基本上改变一些宿主(甚至那些天然不能产生亚油酸[LA；18:2ω-6]和α-亚麻酸[ALA；18:3ω-3]脂肪酸)的天然能力以高水平的生产多种长链ω-3/ω-6PUFA。无论这是天然能力还是重组技术的结果，生产花生四烯酸[ARA；20:4ω-6]、二十碳五烯酸[EPA；20:5ω-3]和二十二碳六烯酸[DHA；22:6ω-3]可能都需要表达Δ6去饱和酶。

迄今为止鉴定的大多数Δ6去饱和酶具有将LA转化成γ-亚麻酸[GLA；18:3ω-6]的基本能力，以及将ALA转化成十八碳四烯酸[STA；18:4ω-3]的次级活性。基于Δ6去饱和酶可在例如ARA、EPA和DHA合成中起作用，已经投入相当大的努力鉴定和研究这些来自不同来源的酶。同样地，在公开文献(例如GenBank)和专利文献(例如美国专利5,968,809、7,067,285、和7,335,476以及美国专利申请公布2006-0117414)中已经公开了多种Δ6去饱和酶。连同Δ5、Δ8和Δ4去饱和酶一起，已知Δ6去饱和酶是长链PUFA“前端”去饱和酶(其中去饱和发生在先前存在的双键和脂肪酸酰基的羧基末端之间，与甲基定向的去饱和相反)。这些去饱和酶特征在于三个组氨酸框[H(X)_3-4H(SEQ ID NO：3和4)、H(X)_2-3HH(SEQ ID NO：5和6)和H/Q(X)_2-3HH(SEQ ID NO：7和8)]，以及是细胞色素b₅融合超家族的成员，因为它们在N末端具有融合细胞色素b₅结构域，该结构域起到电子供体的作用。

尽管编码Δ6去饱和酶的基因是已知的，仍需要这些酶的附加种类，它们具有不同的酶特性，适于在多种宿主生物中的异源表达以用于生产ω-3/ω-6脂肪酸。申请人已经通过从红藻紫球藻(Porphyridium cruentum)中分离编码Δ6去饱和酶的基因满足了所述需求。

发明概述

本发明涉及编码具有Δ6去饱和酶活性的多肽的新的遗传构建体，以及它们在藻类、细菌、酵母、类眼虫、卵菌、原生藻菌和真菌中的使用，用于产生PUFA。

因此本文提供了分离的核酸分子，其包含编码Δ6去饱和酶的核苷酸序列，所述分离的核酸分子选自：

(a)编码如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的分离的核酸分子；

(b)在以下杂交条件下与(a)杂交的分离的核酸分子：0.1X SSC，0.1％ SDS，65℃并用2X SSC，0.1％SDS洗涤，随后用0.1XSSC，0.1％ SDS洗涤；或者

与(a)或(b)完全互补的分离的核酸分子。

在第二实施方案中，本发明提供分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含编码至少471个氨基酸的Δ6去饱和酶的第一核苷酸序列，所述去饱和酶基于BLASTP比对方法在与包含如SEQ ID NO：2所示的序列的多肽进行比较时具有至少80％的同一性；

或包含第一核苷酸序列的互补序列的第二核苷酸序列。

在第三实施方案中，本发明提供由本发明的核酸序列编码的多肽以及包含相同多肽的微生物宿主细胞。

在第四实施方案中，本发明提供用于产生γ-亚麻酸的方法，该方法包括：

a)提供表达权利要求1或权利要求4的核酸序列的微生物宿主细胞；以及

b)在产生γ-亚麻酸的条件下，在亚油酸源的存在下培养(a)的宿主细胞。

在第五实施方案中，本发明提供用于产生十八碳四烯酸的方法，该方法包括：

a)提供表达权利要求1或权利要求4的核酸序列的微生物宿主细胞；以及

b)在产生十八碳四烯酸的条件下，在α-亚麻酸的存在下培养(a)的宿主细胞。

附图简述和序列表

图1A和图1B示出了ω-3和ω-6脂肪酸生物合成途径，并且当考虑下文对该途径的描述时应被视为一起。

图2是两个保守区域的比对，这两个保守区域位于来自三角褐指藻(Phaeodactylum tricornatum)(SEQ ID NO：37)、小立碗藓(Physomitrella patens)(SEQ ID NO：38)、地钱(Marchantia polymnorpha)(SEQ ID NO：39)、和高山被孢霉(Mortierella alpina)(SEQID NO：40)的Δ6去饱和酶中；以及来自小眼虫(Euglena gracilis)(SEQID NO：41)的Δ8去饱和酶中，使用LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的MegAlign^TM v6.1程序进行比对。保守氨基酸的三个加框区域对应于七个简并引物。

图3是pY109#1的质粒图谱。

根据下面的详细描述和附带的序列描述可以更充分地理解本发明，下面的详细描述和附带的序列描述形成了本申请的一部分。

下面的序列遵循37C.F.R.§1.821-1.825(“对包含核苷酸序列和/或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则”(“Requirements for Patent Applications Containing Nuceotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures-the Sequence Rules”))，并且符合世界知识产权组织(World Intellectual Property Organization)(WIPO)ST.25标准(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)以及行政指令(Administrative Instructions)的208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中所列出的规定。

SEQ ID NO：1至50是表1中鉴定的ORF编码基因、蛋白质(或它们的部分)、引物或质粒。

表1

核酸和蛋白质SEQ ID号总汇

发明详述

本文中公开了新的紫球藻(Porphyridium cruentum)Δ6去饱和酶和编码这种去饱和酶的基因，其可用于操纵产生健康的PUFA的生化途径。

PUFA或其衍生物可用作膳食替代品或补充剂，尤其是婴儿代乳品(formula)，以用于接受静脉内营养法的患者或用来预防或治疗营养不良。作为另外一种选择，可将纯化的PUFA(或其衍生物)掺入到食用油、脂肪或调配的人造黄油中以便食用者在正常使用中将获得所需量的膳食补充。PUFA还可以掺入到婴儿代乳品、营养补充剂或其它食品中并且可用作抗炎或降胆固醇剂。任选地，该组合物可用于药用(人药或兽药)。

本文引用的所有专利和非专利文献以引用方式并入本文。

在本公开中，使用了大量术语和缩写。给出了如下定义。

“开放阅读框”缩写为“ORF”。

“聚合酶链反应”缩写为“PCR”。

“美国典型培养物保藏中心”缩写为“ATCC”。

“多不饱和脂肪酸”缩写为“PUFA”。

“三酰基甘油”缩写为“TAG”。

“总脂肪酸”缩写为“TFA”。

如本文所用，术语“发明”或“本发明”不旨在局限于本发明的任一具体实施方案，而是在一般情况下适用于如权利要求和说明书中所描述的本发明的任何实施方案和所有实施方案。

术语“脂肪酸”指不同链长的长链脂族酸(链烷酸)，链长为约C₁₂至C₂₂(尽管更长和更短链长的酸都是已知的)。主要的链长介于C₁₆和C₂₂之间。脂肪酸的结构可用简单的记号***“X:Y”来表示，其中X表示具体脂肪酸中碳(“C”)原子的总数，而Y表示双键的数目。另外的关于“饱和脂肪酸”对“不饱和脂肪酸”、“单不饱和脂肪酸”对“多不饱和脂肪酸”[“PUFA”]、以及“ω-6脂肪酸”(“ω-6或n-6”)对“ω-3脂肪酸”[“ω-3或n-3”]之间的区别的详细信息在美国专利7,238,482中有所提供，该专利以引用方式并入本文。

本文用于描述PUFA的命名法如下表2所示。在标记为“简化符号(Shorthand Notation)”的栏中，使用ω-参考体系指示碳原子的数目，从ω碳原子(为此将其编号为1)开始计算双键的数目和最靠近ω碳原子的双键的位置。该表的其余部分汇总了ω-3和ω-6脂肪酸及其前体的俗名、将在整个说明书中其余部分使用的缩写以及每种化合物的化学名称。

表2

多不饱和脂肪酸及其前体的命名

虽然使用本文所述方法，表3列出的ω-3/ω-6PUFA最可能在含油酵母的油级分中积聚，但是该列表不应理解为限制性的或完全的。

术语“油脂”是指在25℃时为液体且通常为多不饱和的脂类物质。在含油生物中，油构成总脂质的主要部分。“油”主要由三酰基甘油[“TAG”]组成，但也可包含其他中性脂类、磷脂和游离脂肪酸。油中的脂肪酸组合物和总脂质的脂肪酸组合物一般来讲是相似的；因此，总脂质中的PUFA浓度的提高或降低将对应于油中的PUFA浓度的提高或降低，反之亦然。

“中性脂类”指那些一般以贮存脂肪形式存在于细胞中的脂质体中的脂质，它们的名称是因为在细胞pH下，所述脂质无带电基团。它们一般是完全非极性的，对水无亲和力。中性脂类一般指脂肪酸的单酯、二酯、和/或三酯，也分别称为单酰基甘油、二酰基甘油或三酰基甘油，或统称为酰基甘油。为了从酰基甘油中释放游离脂肪酸，必须发生水解反应。

术语“三酰基甘油”[“TAG”]指由酰化甘油分子的三个脂肪酰残基组成的中性脂类。TAG能够包含长链PUFA和饱和脂肪酸，以及较短的饱和的和不饱和的脂肪酸。

术语“总脂肪酸”[“TFA”]本文指所有细胞脂肪酸的总量，所述脂肪酸在给定实例中能通过碱酯交换方法(本领域已知的方法)被衍生化成脂肪酸甲酯[“FAME”]，例如它可以是生物质或油。因此，总脂肪酸包括来自中性脂类级分(包括二酰基甘油、单酰基甘油和TAG)的脂肪酸和来自极性脂质级分(包括PC和PE级分)的脂肪酸，但是不包括游离脂肪酸。

术语细胞的“总脂质含量”是TFA的量度，以干细胞重量[“DCW”]百分比的形式表示，然而总脂质含量能够用DCW[“FAME％ DCW”]百分比表示的FAME量度近似表示。因此总脂质含量[“TFA％ DCW”]等同于例如每100毫克DCW的总脂肪酸毫克数。

总脂质中的脂肪酸浓度本文表示为TFA的重量百分比[“％ TFA”]，例如每100毫克TFA的给定脂肪酸毫克数。除非在本文公开内容中另作具体说明，给定脂肪酸相对于总脂质的百分比等同于按％TFA计的脂肪酸浓度(例如总脂质的％EPA等同于EPA％ TFA)。

术语“脂质特征”和“脂质组合物”是可互换的，并且指在特定脂质级分(例如在总脂质或油中)中包含的单个脂肪酸的量，其中所述量用TFA重量百分比形式表示。混合物中存在的各个脂肪酸的总量应当是100。

术语“PUFA生物合成途径”指将油酸转化成诸如LA、EDA、GLA、DGLA、ARA、DRA、DTA和DPAn-6之类的ω-6脂肪酸和诸如ALA、STA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA之类的ω-3脂肪酸的代谢过程。该过程在文献中已有很好的描述(如参见美国专利申请2006-0115881-A1)。简而言之，该过程涉及通过添加碳原子来延长碳链和通过加入双键来使分子去饱和这通过存在于内质网膜内的一系列特异性去饱和酶和延伸酶(称为“PUFA生物合成途径酶”)进行。更具体地讲，“PUFA生物合成途径酶”指与PUFA生物合成相关联的任何以下酶(以及编码所述酶的基因)，包括：Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9延伸酶、C_14/16延伸酶、C_16/18延伸酶、C_18/20延伸酶和/或C_20/22延伸酶。

术语“Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径”将指最低程度包括至少一种Δ6去饱和酶和至少一种C_18/20延伸酶(也可互换地称为Δ6延伸酶)的PUFA生物合成途径，从而使得能分别从LA和ALA开始，以GLA和/或STA作为中间体脂肪酸来合成DGLA和/或ETA。通过其他去饱和酶和延长酶的表达，还可以合成ARA、EPA、DPA和DHA。

术语“去饱和酶”指可以在一种或多种脂肪酸中去饱和(即引入双键)而产生所关注的脂肪酸或前体的多肽。尽管在整个说明书中使用ω-指代***来指代特定的脂肪酸，但使用Δ-***从底物的羧基端计数来表示去饱和酶的活性更方便。本文特别受关注的是Δ6去饱和酶，它去饱和从分子羧基末端开始编号为第六和第七碳原子的脂肪酸，并且能够例如催化LA转化成GLA和/或催化ALA转化成STA。其他脂肪酸去饱和酶包括例如：Δ8去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ4去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶和Δ9去饱和酶。在本领域中，基于Δ15和Δ17去饱和酶将ω-6脂肪酸转化成它们的ω-3对应物的能力(如分别将LA转化成ALA以及将ARA转化成EPA)，偶尔也将它们称作“ω-3去饱和酶”、“ω-3去饱和酶”和/或“ω-3去饱和酶”。所期望的是通过用脂肪酸去饱和酶的基因来转化合适的宿主并测定它对该宿主脂肪酸分布的作用，从而经验性地测定特定脂肪酸去饱和酶的特异性。

就本文目的而言，术语“PcD6”指分离自红藻紫球藻(Porphyridium cruentum)的Δ6去饱和酶(SEQ ID NO：2)，该酶由本文SEQ ID NO：1的核苷酸序列编码。同样地，术语“PcD6S”指经密码子优化以用于在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中表达的来源于紫球藻(P.cruentum)的合成Δ6去饱和酶(即SEQ ID NO：46和47)。

术语“转化效率”和“底物转化百分比”指特定酶(如去饱和酶)能够将底物转化成产物的效率。转化效率根据下式测量：([产物]/[底物+产物])*100，其中‘产物’包括直接产物和途径中来源于它的所有产物。

术语“延长酶”指能延长脂肪酸碳链从而产生比该延长酶作用于其上的脂肪酸底物长2个碳原子的酸的多肽。该延长过程在与脂肪酸合酶相关的多步骤机制中发生，如美国专利申请公布2005/0132442所述。由延伸酶体系催化的反应的实例是将GLA转化成DGLA、将STA转化成ETA、将LA转化成EDA、将ALA转化成ETrA、将ARA转化成DTA和将EPA转化成DPA。

通常，延长酶的底物选择性有些广泛，但由链长度和不饱和程度两者来区分。例如，C_14/16延伸酶将利用C₁₄底物(例如肉豆蔻酸)，C_16/18延伸酶将利用C₁₆底物(例如棕榈酸)，C_18/20延伸酶将利用C₁₈底物(例如LA、ALA、GLA、STA)，而C_20/22延伸酶将利用C₂₀底物(例如ARA、EPA)。就本文目的而言，能够确定两种不同类型的C_18/20延伸酶：Δ6延伸酶将催化GLA和STA分别转化成DGLA和ETA，而Δ9延伸酶能够催化LA和ALA分别转化成EDA和ETrA。

重要的是，须注意一些延伸酶具有广泛的特异性并因而单个延伸酶可能能催化几种延伸酶反应(如，从而可作为C_16/18延伸酶和C_18/20延伸酶起作用)。可能理想的是，通过用脂肪酸延伸酶的基因来转化合适的宿主并测定它对该宿主脂肪酸概况的作用，从而经验性地测定脂肪酸延伸酶的特异性。

术语“含油的”指那些倾向于以油形式贮存它们的能源的生物(Weete，Fungal Lipid Biochemistry，第2版，Plenum，1980)。通常，含油微生物的细胞油含量符合S形曲线，其中脂质浓度增加直至在对数生长期晚期或稳定生长期早期它达到最高浓度，随后在稳定生长期晚期和死亡期期间逐渐下降(Yongrmanitchai和Ward，Appl.Environ.Microbiol.，57：419-25(1991))。含油微生物积累油超过它们的干细胞重量的约25％的情形并不鲜见。

术语“含油酵母”指那些能够产油并被归类为酵母的微生物。含油酵母的实例包括但不限于以下属：耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属。

术语“保守结构域”或“基序”指进化上相关的蛋白质的比对序列中在特定位置处保守的一组氨基酸。虽然同源蛋白质之间在其他位置的氨基酸可以发生变化，但在特定位置高度保守的氨基酸表明对蛋白质的结构、稳定性或活性来说是必需的氨基酸。因为它们可通过它们在蛋白质同系物家族的比对序列中的高度保守来鉴定，所以它们可用作识别标签或“签名”来确定具有新的测定序列的蛋白质是否属于以前鉴定的蛋白质家族。普遍存在于Δ6去饱和酶(即动物、植物和真菌)中的基序包括三个组氨酸框(即H(X)_3-4H(SEQ ID NO：3和4)、H(X)_2-3HH(SEQ ID NO：5和6)以及H/Q(X)_2-3HH(SEQ ID NO：7和8))。

术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸片段”和“分离的核酸片段”在本文中可互换使用。这些术语涵盖核苷酸序列等的范围。多核苷酸可以是RNA或DNA的聚合物，它们可以是单链或双链，任选地包含合成的、非天然的或改性的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的多核苷酸可由cDNA、基因组DNA、合成DNA或它们的混合物的一个或多个片段构成。核苷酸(通常以它们的5’-单磷酸形式存在)通过单字母命名指代如下：“A”指腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别用于RNA或DNA)，“C”指胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”指鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”指尿苷酸，“T”指脱氧胸苷酸，“R”指嘌呤(A或G)，“Y”指嘧啶(C或T)，“K”指G或T，“H”指A或C或T，“I”指肌苷，“N”指任何核苷酸。

当在合适的温度和溶液离子强度条件下单链形式的核酸片段可以退火至另一核酸片段时，核酸片段“可杂交”至另一核酸片段，例如cDNA、基因组DNA或RNA分子。杂交条件和洗涤条件是众所周知的，并在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)，该文献以引用方式并入本文，尤其是第11章和表11.1。温度和离子浓度条件决定了杂交的“严格性”。可以调节严格性条件以筛选中度相似的片段(例如来自远缘生物的同源序列)，到筛选高度相似的片段(例如从近缘生物复制功能性酶的基因)。杂交后的洗涤可确定严格性条件。一组优选的条件使用一系列洗涤步骤，开始是6X SSC，0.5％ SDS在室温洗涤15分钟，然后用2X SSC，0.5％ SDS在45℃重复30分钟，然后用0.2X SSC，0.5％ SDS在50℃重复洗涤两次，每次30分钟。一组较优选的严格性条件使用较高温度，其中洗涤步骤与上述那些步骤相同，不同的是最后两次用0.2X SSC，0.5％ SDS洗涤30分钟的洗涤温度提高到60℃。另一组优选的高严格性条件是最后两次洗涤是在65℃下用0.1×SSC、0.1％ SDS进行。例如，另一组严格性条件包括在0.1×SSC、0.1％ SDS中于65℃下杂交，并用2×SSC、0.1％ SDS洗涤，随后用0.1×SSC、0.1％ SDS洗涤。

杂交需要两种核酸含有互补序列，但是取决于杂交的严格性，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适严格性取决于核酸的长度和互补的程度，所述长度和互补程度是本领域内所熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm)按以下顺序依次降低：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言，已经获得了计算Tm的方程式(参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更重要，而且寡核苷酸的长度决定了其特异性(参见Sambrook等人，同上，11.7-11.8)。在一个实施方案中，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。可杂交核酸的最小长度优选地为至少约15个核苷酸；更优选为至少约20个核苷酸；最优选长度为至少约30个核苷酸。此外，技术人员将认识到，可根据需要根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液盐浓度。

氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”指这样的部分，该部分包括的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以推定鉴定所述多肽或基因，所述鉴定或者可以由本领域技术人员通过人工评价序列来完成，或者可以利用诸如BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1993))的算法进行计算机自动化的序列比较和鉴定。一般来讲，为了推测鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源，需要有十个或更多邻接氨基酸或者三十个或更多核苷酸的序列。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定(如Southern杂交)和基因分离(如细菌菌落或噬斑的原位杂交)的方法中。此外，12至15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物，以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“基本部分”所包含的序列应足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。本文公开教导了编码特定真菌蛋白质的完整的氨基酸和核苷酸序列。具有如本文报道序列的有益效果，技术人员现在可使用全部公布序列或它们的主要部分用于本领域技术人员已知的目的。因此，本公开包括在附随序列表中报道的完全序列，以及那些上述序列的主要部分。

术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例如，针对DNA，腺苷与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此本公开涵盖与所附序列表中报道的全长序列互补的分离核酸片段，以及那些基本上类似的核酸序列。

术语“同源性”或“同源”互换使用。它们指这样的核酸片段，即其中一个或多个核苷酸碱基改变并不会影响该核酸片段介导基因表达或产生某种表型的能力。这些术语也指核酸片段的修饰(例如缺失或***一个或多个核苷酸)，相对于初始的未经修饰的核酸片段，基本上不会改变所得核酸片段的功能特性。

此外，技术人员认识到，同源核酸序列也由它们在中等严格条件(如0.5×SSC，0.1％ SDS，60℃)下，与本文所示例的序列杂交的能力，或杂交至本文公开的核苷酸序列的任何部分以及杂交至与其功能相当的序列的能力所限定。可以调节严格性条件以筛选中度相似的片段(例如来自远缘生物的同源序列)，到筛选高度相似的片段(例如从近缘生物复制功能性酶的基因)。

术语“选择性杂交”包括指在严格杂交条件下，核酸序列与特定核酸靶序列以比其与非靶核酸序列的杂交更高的可检测程度(例如至少2倍于背景)杂交，并指基本排除了非靶核酸。选择性杂交的序列通常彼此具有约至少80％的序列同一性，或90％的序列同一性，最多并包括100％的序列同一性(即完全互补)。

术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指探针将会选择性杂交至其靶序列的条件。严格条件是序列依赖性的并将因不同的环境而异。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。作为另一种选择，可调节严格条件以允许序列中的一些错配，以便检测到更低程度的相似性(异源探测)。通常，探针的长度少于约1000个核苷酸，任选长度少于500个核苷酸。

通常，严格条件将是如下那些条件：在pH7.0至8.3下盐浓度低于约1.5M钠离子，通常约0.01至1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度为至少约30℃，而对于长的探针(例如多于50个核苷酸)温度为至少约60℃。严格条件也可以通过加入诸如甲酰胺之类的去稳定剂来实现。示例性的低严格条件包括在37℃下于含有30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液中杂交，以及在50至55℃下用1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)洗涤。示例性的中等严格条件包括在37℃下于40至45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，以及在55至60℃下用0.5×至1×SSC洗涤。示例性的高严格条件包括在37℃下于50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，以及在60至65℃下用0.1×SSC洗涤。例如，另一组严格性条件包括在0.1×SSC、0.1％ SDS中于65℃下杂交，并用2×SSC、0.1％ SDS洗涤，随后用0.1×SSC、0.1％SDS洗涤。

特异性通常取决于杂交后洗涤，最终洗涤溶液的离子强度和温度是关键因素。对于DNA-DNA杂交体，T_m可以用Meinkoth等人，Anal.Biochem.，138：267-284(1984)中的等式估算：T_m＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是一价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中的鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％是杂交溶液中的甲酰胺百分比，L是碱基对中杂交体的长度。T_m是(在确定的离子强度和pH下)50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。每1％的错配会将T_m降低约1℃；因此能调节T_m、杂交和/或洗涤条件以杂交到所期望同一性的序列。例如，如果要寻求具有≥90％同一性的序列，则可将T_m降低10℃。通常，在确定的离子强度和pH下，严格条件选择为比特定序列及其互补序列的热解链温度[“T_m”]低约5℃。然而，非常严格的条件能够利用比T_m低1、2、3、或4℃的杂交和/或洗涤温度；中等严格条件能够利用比T_m低6、7、8、9、或10℃的杂交和/或洗涤温度；并且，低严格条件能够利用比T_m低11、12、13、14、15、或20℃的杂交和/或洗涤温度。利用所述等式、杂交和洗涤组合物以及所期望的T_m，本领域的技术人员将会理解，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化已经在本质上进行了描述。如果所需的错配程度导致T_m低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC的浓度以便能使用更高的温度。核酸杂交的广泛指南存在于Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter 2“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”，Elsevier，New York(1993)；以及Current Protocols in Molecular Biology，Chapter 2，Ausubel等人，Eds.，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)。杂交和/或洗涤条件可进行至少10、30、60、90、120或240分钟。

术语“同一性百分比”指两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，它通过序列比较进行测定。“同一性百分比”也指多肽或多核苷酸序列间的序列关联程度，看情况通过比较序列间的匹配百分比进行测定。可通过已知方法容易地计算“同一性百分比”和“相似性百分比”，包括但不限于在以下文献中描述的那些方法：1)Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.，Ed.)Oxford University：NY(1988)；2)Biocomputing：Informatics and Genome Projects(Smith，D.W.，Ed.)Academic：NY(1993)；3)Computer Analysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，Eds.)Humania：NJ(1994)；4)Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje，G.，Ed.)Academic(1987)；以及，5)Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.and Devereux，J.，Eds.)Stockton：NY(1991)。

设定确定同一性百分比的优选方法来用于给出待测试序列之间的最佳匹配。用于测定同一性百分比和相似性百分比的方法在公开可获得的计算机程序中进行编辑。序列比对和百分比同一性可使用LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的MegAlign^TM程序进行计算。序列的多重比对采用包括几种改变形式的算法在内的“Clustal比对方法”进行，包括“Clustal V比对方法”和“Clustal W比对方法”(在Higgins和Sharp，CABIOS，5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191(1992))并且存在于LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)的MegAlign^TM程序(8.0.2版)中。用Clustal程序比对序列后，可通过查看程序中的“序列距离”表来获得“同一性百分比”。

就多重比对而言，使用Clustal V比对方法，预设值对应于空位罚分＝10以及空位长度罚分＝10。使用Clustal V方法进行的成对比对和蛋白序列同一性百分比计算的默认参数为KTUPLE＝1，空位罚分＝3，窗口＝5，DIAGONALS SAVED＝5。就核酸而言，这些参数为KTUPLE＝2，空位罚分＝5，窗口＝4，DIAGONALS SAVED＝4。使用Clustal W比对方法进行多重比对的默认参数对应于空位罚分＝10，空位长度罚分＝0.2，Delay Divergent Seqs(％)＝30，DNA转移权重＝0.5，蛋白质权重矩阵＝Gonnet Series，DNA权重矩阵＝IUB。

“BLASTN比对方法”是由美国国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI)提供的算法，用于使用默认参数比较核苷酸序列，而“BLASTP比对方法”是由NCBI提供的算法，用于使用默认参数比较蛋白序列。

本领域的技术人员非常清楚，多种程度的序列同一性可用于从其他物种中鉴定多肽，其中这类多肽具有相同或相似的功能或活性。合适的核酸片段，即根据本文公开的分离多核苷酸，编码与本文报道的氨基酸序列至少约70-85％相同的多肽，而较优选的核酸片段编码与本文报道的氨基酸序列至少约85-95％相同的氨基酸序列。虽然上文描述了优选地范围，同一性百分比的可用实例包括50％至100％之间的任何整数百分比，例如51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。该分离核苷酸片段的任何全长或部分互补的序列也是有用的。

合适的核酸片段不但具有上述同源性，而且通常编码具有至少50个氨基酸，优选至少100个氨基酸，更优选至少150个氨基酸，更优选至少200个氨基酸，最优选至少250个氨基酸的多肽。

“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。因此，本文所述的是任何包含编码所有或主要部分的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸片段，所述氨基酸序列编码基本上如SEQ ID NO：2所示的藻类多肽。技术人员熟知由特定宿主细胞使用指定给定氨基酸的核苷酸密码子表现出的“密码子偏好性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，希望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。

“合成基因”可从寡核苷酸基本单位装配得到，它可使用本领域技术人员已知的方法化学合成。将这些寡核苷酸基本单位退火，然后连接以形成基因链段，随后进行酶促装配以构建完整基因。因此，基于最优化核苷酸序列以反映宿主细胞的密码子偏倚性，可以定制基因用以最优化基因表达。如果密码子使用偏向于宿主偏好的那些密码子，则技术人员会理解成功的基因表达的可能性。优选密码子的测定可基于对来源于宿主细胞的基因的测量来进行，其中序列信息是可用的。例如，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的密码子使用特征在美国专利7,125,672中提供。

“基因”指表达为特定蛋白的核酸片段，并且可单独指编码区或者可包括在编码序列之前(5’非编码序列)和之后(3’非编码序列)的调节序列。“天然基因”指与其自身调节序列一起天然存在的基因。“嵌合基因”指非天然基因的任何基因，包含非天然一起存在的调节序列和编码序列。因此，嵌合基因可包含来自不同来源的调控序列和编码序列，或者来自相同来源、但是排列方式与天然存在的基因不同的调控序列和编码序列。“内源性基因”指在生物体基因组中的天然位置的天然基因。“外源”基因指通过基因转移导入宿主生物中的基因。外源基因可包含***非天然生物中的天然基因、导入天然宿主中的新位置的天然基因、或者嵌合基因。“转基因”是通过转化程序已经被导入基因组中的基因。“经密码子最优化的基因”是其密码子使用频率经设计用以模仿宿主细胞优选的密码子使用频率的基因。

“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调节序列”指位于编码序列上游(5’非编码序列)、中间、或下游(3’非编码序列)并影响相关联的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调控序列可包括启动子、增强子、静默子、5’非翻译前导序列(例如在转录起始位点和翻译启动密码子之间的序列)、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。

“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可整个源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件或生理条件而引导基因的表达。导致基因在大部分时间内在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。还应当进一步认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。

术语“3′非编码序列”和“转录终止子”指位于编码序列下游的DNA序列。这包括多腺苷酸化识别序列和编码能影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其它序列。多腺苷酸化信号通常表征为影响多腺苷酸片添加到mRNA前体的3′末端。3′区可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。

“RNA转录物”指由RNA聚合酶催化的DNA序列转录所产生的产物。当RNA转录物与DNA序列拷贝完全互补时，它指初级转录物。当RNA序列是来源于初级转录物的转录后加工的RNA序列时，将RNA转录物称为成熟RNA。“信使RNA”或“mRNA”指无内含子的RNA，它可以由细胞翻译成蛋白质。“cDNA”指与mRNA模板互补并用逆转录酶从mRNA模板中合成的DNA。cDNA可为单链的，或者可用DNA聚合酶I的Klenow片段将其转化成双链形式。“有义”RNA指RNA转录物，它包括mRNA并能在细胞内或体外被翻译成蛋白。“反义RNA”指与全部或部分靶初级转录物或mRNA互补的RNA转录物，并且它阻止靶基因的表达(美国专利5,107,065)。

术语“可操作地连接”指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。术语“重组体”是指例如通过化学合成或通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段而实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。

如本文所用，术语“表达”指转录和有义(mRNA)或反义RNA的稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。因此如本文所用，术语“表达”也指产生功能性终产物(例如mRNA或蛋白[或者是前体，或者是成熟产物])。

“转化”指将核酸分子转移至宿主生物中，导致在遗传上稳定遗传。例如，核酸分子可以是自主复制的质粒，例如，或者它可以整合进宿主生物的基因组中。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”或“转化体”生物体。

术语“质粒”和“载体”指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA片段的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状)，其中多个核苷酸序列已连接或重组为一种独特构建体，该独特构建体能够将表达盒引入细胞中。

术语“表达盒”指包含外来基因并且除该外来基因以外还具有使得该基因在外来宿主中的表达增强的元件的DNA片段。表达盒一般将包含所选基因的编码序列和所选基因产物表达所需的位于编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调控序列。因此，表达盒通常由以下部分组成：1)启动子序列；2)编码序列[“ORF”]；以及3)3′非翻译区域(即终止子)，它在真核细胞中通常包含聚腺苷酸位点。表达盒通常包含于载体中以有利于克隆和转化。可以将不同表达盒转化进包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞在内的不同生物体中，只要能针对每种宿主使用正确的调控序列。

术语“重组构建体”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体”和“重组DNA构建体”本文可互换使用。重组构建体包括人造的核酸片段组合，例如天然条件下不一起存在的调控序列和编码序列。因此，重组DNA构建体可以包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。此类构建体可独自使用或与载体组合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于本领域技术人员熟知的将要用于转化宿主细胞的方法。例如可以使用质粒载体。技术人员熟知为了成功地转化、筛选和繁殖包括本文所述的任何分离的核酸片段的宿主细胞，必须存在于载体上的遗传因子。技术人员还将认识到，不同的独立转化事件将导致不同水平和模式的表达(Jones等人，EMBO J.，4：2411-2418(1985)；DeAlmeida等人，Mol.Gen.Genetics，218：78-86(1989))，因此为了获得显示所需表达水平和模式的菌株或细胞系，必须对多个事件进行筛选。这样的筛选可通过DNA的Southern印迹分析、mRNA表达的Northern印迹分析、蛋白表达的Western分析或表型分析等完成。

术语“序列分析软件”指用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件将包括但不限于：1)GCG程序软件包(Wisconsin Package Version 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；2)BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschul等人，J.Biol.，215：403-410(1990))；3)DNASTAR(DNASTAR，Inc.Madison，WI)；4)Sequencher(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)；和5)整合了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date 1992，111-20.Editor(s)：Suhai，Sandor.Plenum：New York，NY)。在这一描述中，除非另外指明，只要序列分析软件用于分析，分析结果都基于所用程序的“默认值”。在此所用的“默认值”将指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)；Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.Experiments with Gene Fusions；Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，公布于Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience，Hoboken，NJ(1987)。

通常，含油微生物的脂质蓄积是响应存在于生长培养基中的总的碳氮比而触发。该过程(导致含油微生物中游离棕榈酸(16:0)的从头合成)在美国专利公开7,238,482中有详细描述。棕榈酸是长链饱和和不饱和脂肪酸衍生物的前体，这些脂肪酸衍生物通过延长酶和去饱和酶的作用形成(图1)。

通过一系列反应形成TAG(脂肪酸的初级贮藏单位)，这些反应涉及：1)通过酰基转移酶将一分子酰基-CoA酯化成甘油3-磷酸以生成溶血磷脂酸；2)通过酰基转移酶将第二分子酰基-CoA酯化以生成1，2-二酰基磷酸甘油(通常鉴定为磷脂酸)；3)通过磷脂酸磷酸酶移除磷酸以生成1，2-二酰基甘油[“DAG”]；并且，4)通过酰基转移酶的作用增加第三个脂肪酸以形成TAG。可将多种脂肪酸掺入TAG，包括饱和的和不饱和的脂肪酸以及短链和长链脂肪酸。

其中油酸转化成ω-3/ω-6脂肪酸的代谢过程包括通过添加碳原子使碳链延长和通过加入双键使分子去饱和。这需要存在于内质网膜内的一系列特殊去饱和酶和延长酶。然而，如在图1中看到的和如下所述的，存在多个用于产生特定ω-3/ω-6脂肪酸的替代途径。

具体地讲，图1描述了下文所述的途径。所有途径都需要最初通过Δ12去饱和酶将油酸转化成亚油酸[“LA”](第一个ω-6脂肪酸)。然后使用“Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径”并用LA作底物，如下形成长链ω-6脂肪酸：1)通过Δ6去饱和酶将LA转化成γ-亚麻酸[“GLA”]；2)通过C18/20延伸酶将GLA转化成二高-γ-亚麻酸[“DGLA”]；3)通过Δ5去饱和酶将DGLA转化成花生四烯酸[“ARA”]；4)通过C_20/22延伸酶将ARA转化成二十二碳四烯酸[“DTA”]；以及，5)通过Δ4去饱和酶将DTA转化成二十二碳五烯酸[“DPAn-6”]。作为另外一种选择，“Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶”可利用α-亚麻酸[“ALA”]作底物，如下生成长链ω-3脂肪酸：1)通过Δ15去饱和酶将LA转化成ALA，第一个ω-3脂肪酸；2)通过Δ6去饱和酶将ALA转化成十八碳四烯酸[“STA”]；3)通过C_18/20延伸酶将STA转化成二十碳四烯酸[“ETA”]；4)通过Δ5去饱和酶将ETA转化成二十碳五烯酸[“EPA”]；5)通过C_20/22延伸酶将EPA转化成二十二碳五烯酸[“DPA”]；以及6)通过Δ4去饱和酶将DPA转化成二十二碳六烯酸[“DHA”]。任选地，可将ω-6脂肪酸转化成ω-3脂肪酸；例如，通过Δ17去饱和酶活性分别从DGLA和ARA中生产ETA和EPA。

ω-3/ω-6脂肪酸生物合成的替代途径利用Δ9延伸酶和Δ8去饱和酶(即，“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”)。更具体地讲，可通过Δ9延伸酶将LA和ALA分别转化成二十碳二烯酸[“EDA”]和二十碳三烯酸[“ETrA”]；然后Δ8去饱和酶将EDA转化成DGLA和/或将ETrA转化成ETA。随后如上所述形成下游PUFA。

预期需要在特定宿主生物中导入用以产生ω-3/ω-6脂肪酸的特定功能将取决于宿主细胞(及其天然的PFUA概况和/或去饱和酶/延伸酶概况)、底物的可利用性和所需的终产物。例如，在一些实施方案中优选的是Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径的表达，而不是Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径的表达，因为通过前面的途径产生的PUFA无GLA和/或STA。

本领域技术人员将能够鉴定多种编码ω-3/ω-6脂肪酸生物合成所需的每种酶的候选基因。可用的去饱和酶和延长酶序列可源自任何来源，例如，分离自天然来源(来自细菌、藻类、真菌、植物、动物等)、经由半合成途径产生或从头合成。虽然导入宿主的去饱和酶和延伸酶基因的特定来源不是至关重要的，但选择具有去饱和酶或延伸酶活性的特定多肽的考虑因素包括：1)多肽的底物特异性；2)是否多肽或其组分是限速酶；3)是否去饱和酶或延伸酶是合成期望PUFA必需的；4)多肽所需的辅因子；和/或，5)是否在多肽产生后对其进行修饰(例如通过激酶或异戊烯转移酶进行修饰)。表达的多肽优选具有与它在宿主细胞中的位置的生化环境相容的参数(对于另外的详细内容，参见美国专利7,238,482)。

在另外的实施方案中，考虑每种特定的去饱和酶和/或延伸酶的转化效率也将是有用的。更具体地讲，由于每种酶极少能以100％的效率将底物转化成产物，宿主细胞所产生的未纯化的油的最终脂质概况将通常是由期望的ω-3/ω-6脂肪酸及多种上游PUFA中间产物组成的多种PUFA的混合物。因此，当使所需脂肪酸的生物合成最优化时，每种酶的转换效率也是要考虑的变量。

考虑到上述各个考虑事项，具有合适去饱和酶和延长酶活性(如Δ6去饱和酶、C_18/20延长酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、C_14/16延长酶、C_16/18延长酶、Δ9延长酶、Δ8去饱和酶、Δ4去饱和酶和C_20/22延长酶)的候选基因可根据可公开获得的文献(如GenBank)、专利文献和对具有产生PUFA的能力的生物的实验分析来鉴定。这些基因将适用于导入到特定的宿主生物中，以使该生物能合成PUFA或增强生物的PUFA合成。

本公开涉及编码Δ6去饱和酶的核苷酸序列，它们分离自紫球藻(Porphyridium cruentum)并在下表3中概述。

表3

紫球藻(Porphyridium cruentum)Δ6去饱和酶概述

缩写	核苷酸SEQ ID NO	氨基酸SEQ ID NO
			PcD6	1	2
PcD6S	46	47

*注意：SEQ ID NO：47与SEQ ID NO：2的序列相同。

因此本文所述的是分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码至少471个氨基酸的Δ6去饱和酶的第一核苷酸序列，所述去饱和酶基于BLASTP比对方法在与包含如SEQ ID NO：2所示的序列的多肽进行比较时具有至少80％的同一性；或包含第一核苷酸序列的互补序列的第二核苷酸序列。

将紫球藻(P.cruentum)Δ6去饱和酶核苷酸碱基和推断的氨基酸序列与公开数据库进行比较，所述比较使用BLAST算法(Altschul，S.F.等人，NucleicAcids Res.25：3389-3402(1997)和FEBS J.，272：5101-5109(2005)；由National Center for Biotechnology Information[“NCBI”]提供)，揭示最相似的已知序列在长度为471个氨基酸的序列上与本发明的Δ6去饱和酶的氨基酸序列具有约40％的同一性。更优选的氨基酸片段与本文中的序列具有至少约70％-80％的同一性，其中具有至少80％-90％同一性的那些序列尤其适合，而具有至少约90％-95％同一性的那些序列是最优选的。类似地，优选的对应本发明ORF的编码核酸序列的Δ6去饱和酶是编码活性蛋白质的那些并且其与本文所报道的编码Δ6去饱和酶的核酸序列具有至少约70％-80％的同一性，其中具有至少约80％-90％同一性的那些序列尤其适合，而具有至少约90％-95％同一性的那些序列是最优选的。

在其他的实施方案中，本发明的PcD6序列可经密码子最优化以用于在特定的宿主生物中表达。如本领域所熟知的，这可以成为进一步优化酶在候选宿主中的表达的有用手段，因为使用宿主优选的密码子可以显著提高编码该多肽的外源基因的表达。通常，宿主优选的密码子可在所关注的具体宿主物种中通过检查蛋白质(优选那些最大量表达的蛋白质)中的密码子使用以及确定哪些密码子的使用频率最高来测定。然后，可利用宿主物种中优选的密码子整个或部分地合成具有例如去饱和酶活性的所关注的多肽的编码序列。也可以合成DNA的全部(或部分)以去除将存在于转录的mRNA中的二级结构的任何去稳定化序列或区域。也可以合成DNA的全部(或部分)以将碱基组成改变成期望宿主细胞中更优选的碱基组成。

因此，PcD6(SEQ ID NO：1)的密码子经优化以在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中表达。根据以前的解脂耶氏酵母密码子使用特征测定结果、优选的那些密码子的鉴定、以及围绕“ATG”起始密码子的共有序列的测定结果(参见美国专利7,238,482和美国专利7,125,672)，这是可能的。所得的合成基因称为PcD6S(SEQ ID NO：46)。由经密码子最优化的Δ6去饱和酶基因编码的蛋白质序列(即SEQ IDNO：47)与野生型蛋白质序列(即SEQ ID NO：2)相同。

基于野生型PcD6序列，本领域的技术人员应当能够利用本文中的教导内容来产生多种适用于在候选宿主(即，除解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)之外的其他宿主)中最佳表达的其他经密码子最优化的Δ6去饱和酶蛋白。因此，本文公开涉及任何密码子优化的Δ6去饱和酶蛋白，它来源于PcD6的野生型序列(即，由SEQ ID NO：2编码的序列)。这包括但不限于如SEQ ID NO：46所示的核苷酸序列，它编码合成的Δ6去饱和酶蛋白(即，PcD6S)，该蛋白其密码子经优化以在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中表达。在替代实施方案中，可期望修改一部分编码PcD6的密码子以促进宿主生物中的基因表达，宿主生物包括但不限于植物或植物部分、藻类、细菌、可供选择的酵母、类眼虫、卵菌、原生藻菌或真菌。

任何本发明的去饱和酶序列(即PcD6或PcD6S)或其任何部分都可用于利用序列分析软件来搜索相同或其他细菌、藻类、真菌、卵菌、酵母、原生藻菌、类眼虫或植物物种中的Δ6去饱和酶同源物。通常，这种计算机软件通过将同源程度赋予多种置换、缺失和其他修饰来匹配相似的序列。

使用软件算法，如具有低复杂度滤波器和以下参数的BLASTP比对方法：Expect value＝10，matrix＝Blosum 62(Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997))，该方法是用于将任何Δ6去饱和酶蛋白对核酸或蛋白序列数据库进行比较并从而鉴定在优选宿主生物中的相似已知序列的熟知方法。

使用算法软件搜索已知序列数据库尤其适于分离对公开可获得的Δ6去饱和酶序列具有相对低的同一性百分比的同源物，如那些SEQ IDNO：2中描述的序列。可预测的一点是：分离与公开可获得的去饱和酶序列具有至少约70％-85％同一性的Δ6去饱和酶同源物将是相对更容易的。此外，那些至少约85％-90％相同的序列将尤其适于分离，那些至少约90％-95％相同的序列将最容易分离。

通过使用去饱和酶独有的基序也能够鉴定去饱和酶同源物。这些基序可能提供对去饱和酶蛋白蛋白结构、稳定性或活性来说必需的区域，并且这些基序可用作诊断工具以迅速鉴定新去饱和酶基因。基序普遍存在于Δ6去饱和酶(即动物、植物和真菌)中，包括三个组氨酸框(即，H(X)_3-4H(SEQ ID NO：3和4)、H(X)_2-3HH(SEQ ID NO：5和6)以及H/Q(X)_2-3HH(SEQ ID NO：7和8))。这三个基序都存在于PcD6(SEQ ID NO：2)中，进一步证明PcD6预期具有Δ6去饱和酶活性。

备选地，任何本发明的去饱和酶序列或其部分可杂交试剂用以鉴定Δ6去饱和酶同源物。核酸杂交试验的基本组成包括探针、怀疑含有所关注的基因或基因片段的样品及特定的杂交方法。合适的探针通常是与待检测核酸序列互补的单链核酸序列。探针与待检测的核酸序列是“可杂交的”。尽管探针的长度可在5个碱基到数万个碱基之间变化，但通常约15个碱基到约30个碱基的探针长度是合适的。只需要探针分子的部分与待检测的核酸序列互补。另外，探针和靶序列之间不需要完全互补。杂交确实可以在并不完全互补的分子之间发生，结果是杂交区内的一定比率的碱基没有与正确的互补碱基配对。

杂交方法是非常确实的。通常探针和样品必须在允许核酸杂交的条件下混合。这涉及在正确浓度和温度条件下在存在无机或有机盐时使探针和样品接触。探针和样品核酸必须接触足够长的时间，使探针和样品核酸之间的任何可能的杂交都可发生。混合物中的探针或标记的浓度将决定杂交发生所需的时间。探针或靶标的浓度越高，所需的杂交孵育时间就越短。任选地，可以加入离液剂(如氯化胍、硫氰酸胍、硫氰酸钠、四氯乙酸锂、高氯酸钠、四氯乙酸铷、碘化钾或三氟乙酸铯)。如果需要，能将甲酰胺加入杂交混合物，通常为30-50％(v/v)[“按体积计”]。

可以采用多种杂交溶液。通常，这些杂交溶液包含约20％至60％体积，优选30％体积的极性有机溶剂。普通的杂交溶液采用约30-50％v/v甲酰胺、约0.15至1M氯化钠、约0.05至0.1M缓冲液(如柠檬酸钠、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH范围约6-9))、约0.05至0.2％去污剂(如十二烷基硫酸钠)或0.5-20mM的EDTA、FICOLL(Pharmacia Inc.)(约300-500千道尔顿)、聚乙烯吡咯烷酮(约250-500千道尔顿)和血清白蛋白。一般的杂交溶液还将包含约0.1至5mg/mL未经标记的载体核酸、片段化的核酸DNA(如小牛胸腺或鲑精DNA或酵母RNA)，以及任选约0.5％至2％wt/vol[“重量体积比”]的甘氨酸。还可以包含其它添加剂，例如包括多种极性水溶性或可膨胀试剂(如聚乙二醇)、阴离子聚合物(如聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯)和阴离子糖类聚合物(如硫酸葡聚糖)在内的体积排阻剂。

核酸杂交可适用于多种测定形式。最合适的形式之一是夹心测定形式。夹心测定尤其适用于在非变性条件下杂交。夹心型测定的主要成分是固体支持体。固体支持体具有吸附或共价连接至其上的固定核酸探针，该探针未经标记并且与序列的一部分互补。

任何Δ6去饱和酶核酸片段或任何鉴定的同源物可用于从相同或其它细菌、藻类、真菌、卵菌、类眼虫、原生藻菌、酵母或植物物种中分离编码同源蛋白的基因。使用序列依赖性规程分离同源基因是本领域熟知的。序列依赖型规程的实例包括但不限于：1)核酸杂交方法；2)DNA和RNA扩增方法例如核酸扩增技术的各种应用，例如，聚合酶链反应[“PCR”](美国专利4,683,202)；连接酶链反应[“LCR”](Tabor，S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：1074(1985))；或链置换扩增反应[“SDA”](Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：392(1992))；以及，3)文库构建和互补筛选方法。

例如，编码与本文描述的Δ6去饱和酶相似的蛋白质或多肽的基因可以用本领域技术人员熟知的方法，通过将核酸片段的全部或部分用作DNA杂交探针来筛选来自任何期望的酵母或真菌(其中那些产生GLA和/或STA的生物将是优选的)的文库而得以直接分离。基于核酸序列的特异性寡核苷酸探针可通过本领域已知的方法(Maniatis，同上)设计和合成。而且，整个序列可直接用于通过熟练技术人员已知的方法，例如随机引物DNA标记、切口平移或末端标记技术，来合成DNA探针，或使用可获得的体外转录体系来合成RNA探针。另外，可设计特异性引物并将其用于扩增部分(或全长)的本发明序列。所得的扩增产物可在扩增反应过程中直接标记或在扩增反应后标记，并用作探针来在合适的严格条件下分离全长的DNA片段。

通常，在PCR类型的扩增技术中，引物具有不同的序列而且彼此之间不互补。取决于所需的检测条件，应该设计引物序列以提供既有效又可靠的靶核酸的复制。PCR引物设计方法是本领域常见且熟知的(Thein和Wallace，“The use of oligonucleotide as specific hybridization probes in the Diagnosis of Genetic Disorders”，Human Genetic Diseases：A Practical Approach，K.e.Davis Ed.，(1986)，第33-50页，IRL：Herndon，VA；以及Rychlik，W.，In Methods in Molecular Biology，White，B.a.Ed.，(1993)Vol.15，第31-39页，PCR Protocols：Current Methods and Applications.Humania：Totowa，NJ)。

通常，可以将Δ6去饱和酶序列的两个短片段在PCR规程中用于从DNA或RNA扩增编码同源基因的更长的核酸片段。也可以对克隆的核酸片段文库进行PCR，其中一个引物的序列来源于公开的核酸片段。其它引物序列利用mRNA前体编码真核基因3′末端存在的多腺苷酸片。

备选地，第二个引物序列可以基于来源于克隆载体的序列。例如，技术人员可以按照RACE规程(Frohman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85：8998(1988))，通过用PCR扩增在转录物内单个位点与3′或5′端之间的区域的拷贝来产生cDNA。以3′和5′方向取向的引物可用公开的序列设计。使用可商业获得的3′RACE或5′RACE体系(例如Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)，可以分离特异性的3′或5′cDNA片段(Ohara等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，86：5673(1989)；Loh等人，Science，243：217(1989))。

作为另外一种选择，任何本文所述的Δ6去饱和酶核酸片段(或其经鉴定的任何同源物)均可用于产生新的和/或改良的脂肪酸去饱和酶。如本领域所熟知的，体外诱变和选择、化学诱变、“基因改组(gene shuffling)”法或其它手段可用于获得天然存在的去饱和酶基因的突变(其中此类突变可包括去除、***和点突变，或它们的组合)。这将分别产生具有去饱和酶活性的多肽，在体内具有较期望的物理学和动力学参数，以在宿主细胞内发挥作用，例如较长的半衰期或较高的期望PUFA生产速率。或者如果需要的话，可以通过常规诱变、所得突变多肽表达及其活性测定来测定所需多肽(即Δ6去饱和酶)对酶活性重要的区域。这些技术的综述在美国专利专利公开7,238,482中有详细描述。源自PcD6的所有这类突变蛋白和编码它们的核苷酸序列均在本公开的范围内。

改良的脂肪酸也可通过结构域交换合成，其中将本文所述的任何Δ6去饱和酶核酸片段的功能结构域与备选的去饱和酶基因的功能结构域交换，从而产生新的蛋白质。如本文所用，“结构域”或“功能结构域”指能够引起微生物中的生物学应答的核酸序列。

用于操纵生物化学途径的方法是本领域技术人员熟知的。期望在合适的启动子控制下编码本文所描述的Δ6去饱和酶(即PcD6、PcD6S或其它突变酶、经密码子最优化的酶或它们的同源物)的嵌合基因的导入将导致GLA和/或STA分别在转化的宿主生物内的产生增加。同样，本文公开的是用于直接产生PUFA的方法，其包括将脂肪酸底物(即LA和/或ALA)暴露给本文所述的去饱和酶(例如PcD6或PcD6S)，以便该底物转化成期望的脂肪酸产物(即分别是GLA和/或STA)。

更具体地讲，本文提供了在微生物宿主细胞(例如酵母、藻类、细菌、类眼虫、卵菌、原生藻菌和真菌)中生产GLA的方法，其中微生物宿主细胞包含：

a)编码Δ6去饱和酶多肽的重组核苷酸分子，其中基于BLASTP比对方法在与具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽进行比较时，该去饱和酶多肽具有至少80％的氨基酸同一性；并且

b)LA源；

其中使微生物宿主细胞在使编码Δ6去饱和酶的核酸片段表达并使LA转化成GLA的条件下生长，而且其中可任选回收GLA。

在另一个实施方案中，可使用Δ6去饱和酶将ALA转化成STA。因此本文提供了生产STA的方法，其中所述微生物宿主细胞包含：

a)编码Δ6去饱和酶多肽的重组核苷酸分子，其中基于BLASTP比对方法在与具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽进行比较时，该去饱和酶多肽具有至少80％的氨基酸同一性；并且

b)ALA源；

其中使微生物宿主细胞在使编码Δ6去饱和酶的核酸片段表达并使ALA转化成STA的条件下生长，而且其中可任选回收STA。

作为另一种选择，本文描述的每种Δ6去饱和酶基因及其相应的酶产物可间接用于产生多种ω-6和ω-3PUFA(参见图1和美国专利7,238,482)。发生了间接产生ω-3/ω-6PUFA，其中脂肪酸底物经由中间步骤或途径中间产物间接转化成期望的脂肪酸产物。因此，预期可以将本文描述的Δ6去饱和酶(即PcD6、PcD6S、或其他突变酶、经密码子最优化的酶或它们的同源物)与另外的编码PUFA生物合成途径的酶(如Δ6去饱和酶、C_18/20延长酶、Δ17去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、C_14/16延长酶、C_16/18延长酶、Δ9延长酶、Δ5去饱和酶、Δ4去饱和酶、C_20/22延长酶)的基因结合表达以导致更高水平地产生长链ω-3/ω-6脂肪酸(如ARA、EPA、DTA、DPAn-6、DPA和/或DHA)。

在优选的实施方案中，公开的Δ6去饱和酶将最低程度地结合表达C_18/20延伸酶。然而，包含于具体表达盒中的具体基因将取决于宿主细胞(及其PUFA概况和/或去饱和酶/延伸酶概况)、底物的可利用性和所需的终产物。

作为另外一种选择，基于本文描述的完整序列、那些完整序列的互补序列、那些序列的基本部分、源于那些序列的经密码子最优化的去饱和酶以及那些与其基本同源的序列，破坏宿主生物内的天然Δ6去饱和酶可能是有用的。

必须制备重组构建体，其包含编码Δ6去饱和酶(即，PcD6、PcD6S或其他突变酶、密码子优化的酶或它们的同源物)的开放阅读框，并且将该重组构建体导入合适的宿主细胞。本领域的技术人员认识到标准来源的材料如下所述：1)构建、操纵和分离大分子的特定条件和程序，例如DNA分子、质粒等；2)生成重组DNA片段和重组表达构建体；以及3)筛选并分离克隆。参见Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.的Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(下文称为“Maniatis”)；Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，公布于Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience，Hoboken，NJ(1987)。

一般来讲，存在于构建体中的序列的选择取决于所需的表达产物、宿主细胞的性质以及提出的相对于未转化细胞分离转化细胞的手段。技术人员已知基因元件必须存在于质粒载体上以成功地转化、选择并增殖包含嵌合基因的宿主细胞。然而，通常载体或盒含有引导相关基因的转录和翻译的序列、选择标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包括控制转录启动(即，启动子)的基因的5′区域、基因编码序列和控制转录终止(例如终止子)的DNA片段的3′区域。最优选的是当两个控制区都来源于来自转化的宿主细胞的基因，尽管它们无需来源于对生产宿主是天然的基因。

用于在驱动在期望微生物宿主细胞中的本发明Δ6去饱和酶ORF表达的转录启动控制区(也称为启动控制区或启动子)为人们所熟知。这些控制区可包含启动子、增强子、静默子、内含子序列、3’UTR和/或5′UTR区域、以及蛋白和/或RNA稳定元件。此类元件的强度和特异性可不同。事实上，能够引导这些基因在所选宿主细胞中表达的任何启动子(即天然的、合成的或嵌合的启动子)都是适用的，但来自宿主物种的转录和翻译区是尤其有用的。在宿主细胞中的表达能够以诱导型或组成型的方式发生。诱导型表达通过诱导可操作地连接至受关注的基因的可调控启动子的活性发生，而组成型表达通过利用组成型启动子发生。

当宿主细胞是酵母时，酵母细胞中的功能性转录和翻译区域尤其从宿主菌种中提供(例如参见美国专利申请公布2006-0115881-A1，对应于国际专利申请公布WO 2006/052870，用于在解脂耶氏酵母中使用的优选转录起始调节区)。可以使用许多调控序列的任意一种，这取决于是期望组成型转录还是诱导型转录、启动子在表达所关注的ORF中的效率、构建的容易性等。

已经发现围绕翻译起始密码子“ATG”的核苷酸序列影响酵母细胞的表达。如果所需多肽在酵母中表达差，则可以修饰外源基因的核苷酸序列以包括有效的酵母翻译起始序列来获得最佳的基因表达。对酵母中的表达而言，这可以通过使无效表达基因框内融合至内源酵母基因(优选高度表达的基因)而使其定点诱变来完成。作为另外一种选择，可以测定宿主中的共有翻译起始序列并将该序列引入异源基因中，以便它们在所关注宿主中最优化表达。

可在重组构建体中提供编码转录终止区域的3′非编码序列，该序列可以来自从中获取初始区的基因或不同基因的3′区域。大量的终止区是已知的并且(在用于与它们源自的属和物种相同和不同的属和物种时)在多种宿主中发挥的功能令人满意。终止区也可以源于优选宿主的天然的多种基因。选择终止区更多的是从方便的角度出发而不是为了任何特性。在备选的实施方案中，3′-区也可以是合成的，因为本领域的技术人员可利用可用的信息来设计和合成用作转录终止子的3′-区序列。终止区可以是非必需的，但是是高度优选的。

仅仅将基因***克隆载体不确保它能以期望的速率、浓度、量等表达。响应于对高表达率的需要，通过操作许多控制转录、RNA稳定性、翻译、蛋白质稳定性和位置、氧限制和从微生物宿主细胞分泌的不同遗传元件，已经建立了许多专用的表达载体。一些操纵特征包括：相关转录启动子和终止子序列的性质；克隆基因的拷贝数(其中可通过增加质粒拷贝数或将克隆基因多次整合到基因组中将附加的拷贝在单个表达构建体中克隆和/或将附加的拷贝导入宿主细胞中)；基因是质粒传染的还是整合到宿主细胞基因组中的；合成外来蛋白的最终细胞位置；蛋白在宿主生物中的翻译效率和正确折叠；克隆基因的mRNA和蛋白在宿主细胞中的内部稳定性；以及在克隆基因中的密码子使用使得其频率接近宿主细胞中的优选密码子使用频率。这些特征中的每一个可用于本文所述的方法和宿主细胞以进一步优化Δ6去饱和酶的表达。

例如，Δ6去饱和酶通过使用更强的启动子(调控型的或组成型的)引起表达增加、通过从mRNA或编码蛋白中移除/删除去稳定化序列、或通过将稳定序列加到mRNA(美国专利申请4,910,141)上，能在转录水平上提高所需基因的表达。作为另外一种选择，可将附加拷贝的Δ6去饱和酶基因导入重组宿主细胞中，从而增加PUFA的生产和积聚，这或者通过在单表达构建体中克隆附加拷贝的基因，或者通过提高质粒拷贝数将附加拷贝导入宿主细胞中，或者通过多次整合将克隆基因导入基因组中。

在制备包含至少一个嵌合基因(其包含启动子、Δ6去饱和酶开放阅读框[“ORF”]和终止子)的重组构建体后，将其置于能够在宿主细胞中自主复制的质粒载体中，或直接整合到宿主细胞基因组中。表达盒的整合可以在宿主基因组中随机地发生或者可以通过使用这样的构建体来靶向，即该构建体含有足以靶向宿主基因座中的重组的与宿主基因组同源的区。如果构建体靶向内源性基因座，则转录和翻译调控区的全部或某些可以由内源性基因座提供。

如果两个或更多个基因从独立的复制载体表达，则每个载体具有不同的选择手段并且应当缺乏与其他构建体的同源性以便维持稳定表达和防止元件在构建体之间重配(reassortment)。可用实验方法确定对调控区、选择手段和所引入的构建体的增殖方法的正确选择，以便所有导入的基因都以需要的水平表达从而提供所需产品的合成。

包含所关注的基因的构建体可以通过任何标准技术导入微生物宿主细胞中。这些技术包括转化(如醋酸锂转化[Methods in Enzymology，194：186187(1991)])、基因枪轰击(bolistic impact)、电穿孔、显微注射、真空过滤或将所关注的基因引入宿主细胞中的任何其它方法。

为方便起见，已经通过任何方法***纵以摄取DNA序列(如表达盒)的宿主细胞在本文中将称为“转化的”或“转化体”或“重组体”。转化的宿主将具有至少一个表达构建体的拷贝，而且可以具有两个或更多个拷贝，这取决于该基因是整合进基因组内、被扩增还是存在于具有多拷贝数的染色体外元件上。转化宿主细胞能通过选择导入构建体上包含的标记进行鉴定。作为另外一种选择，分离的标记构建体可用期望的构建体进行共转化，该方法与多种将多个DNA分子导入宿主细胞的转化技术一样。

通常转化宿主通过它们在选择培养基上生长的能力进行选择，选择培养基可掺入抗生素或缺乏未转化宿主必需的生长因子，如营养物质或生长因子。导入的标记基因可赋予抗生素抗性，或编码必需的生长因子或酶，从而当在转化宿主中表达时允许在选择培养基上生长。转化宿主的选择也能发生在表达标记蛋白能被直接地或间接地检测出来时。附加的选择技术在美国专利7,238,482、美国专利7,259,255和国际专利申请公布WO 2006/052870中进行了描述。

转化后，适用于Δ6去饱和酶(以及任选在宿主细胞中共表达的其他PUFA酶)的底物可以由宿主自然产生或通过转基因产生，或者它们可以由外部来源提供。

无论选择哪种宿主或表达构建体，必须筛选多个转化子以获取显示期望表达水平和模式的菌株。例如Juretzek等人(Yeast，18：97-113(2001)提出在解脂耶氏酵母中的整合DNA片段的稳定性取决于单个转化子、受体菌株和所用的靶向平台。这种筛选可以通过DNA印迹的Southern分析(Southern，J.Mol.Biol.，98：503(1975))、mRNA表达的Northern分析(Kroczek，J.Chromatogr.Biomed.Appl.，618(1-2)：133-145(1993))、蛋白质表达的Western分析、PUFA产物的表型分析或GC分析来完成。

多种真核生物适合作为宿主，从而产生包含如本文所述的Δ6去饱和酶的转化体，所述真核生物包括细菌、酵母、藻类、原生藻菌、卵菌、类眼虫和/或真菌。这是可预期的，因为转录、翻译和蛋白生物合成结构是高度保守的。因此，合适的宿主可包括在多种原料(包括简单或复杂的碳水化合物、脂肪酸、有机酸、油、甘油和醇类和/或碳氢化合物)上于广泛的温度和pH值范围内生长的那些宿主。

优选的微生物宿主是含油生物。这些含油生物天然能够合成并积聚油，其中总油含量可占细胞干重的超过约25％，更优选占细胞干重的超过约30％，而最优选占细胞干重的超过约40％。将多种细菌、藻类、类眼虫、藓、真菌、酵母和原生藻菌被天然地归类为含油生物。在另一个实施方案中，能够将非含油生物基因修饰成含油生物，例如酵母如啤酒糖酵母。

在较优选的实施方案中，微生物宿主细胞是含油酵母。通常鉴定为含油酵母的属包括但不限于：耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。更具体地讲，示例性的油合成酵母包括：圆红冬孢酵母、斯达氏油脂酵母、产油油脂酵母，拉可夫氏假丝酵母、铁红假丝酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母、茁芽丝孢酵母、皮状丝孢酵母、胶粘红酵母、牧草红酵母、和解脂耶氏酵母(以前归类为解脂假丝酵母)。最优选的含油酵母是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；而且，在其它实施方案中，最优选的是命名为ATCC#20362、ATCC#8862、ATCC#18944、ATCC#76982 and/or LGAM S(7)1的解脂耶氏酵母菌株(Papanikolaou S.和Aggelis G.，Bioresour.Technol.，82(1)：43-9(2002))。

适用于转化含油酵母(即解脂耶氏酵母)的具体教导内容包括美国专利4,880,741、美国专利5,071,764，以及Chen，D.C.等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.，48(2)：232-235(1997))。应用于在解脂耶氏酵母中工程化GLA、ARA、EPA和DHA的特定教导分别在国际专利申请11/198975(国际专利申请公布WO 2006/033723)、美国专利申请11/264784(国际专利申请公布WO 2006/055322)、美国专利申请11/265761(国际专利申请公布WO 2006/052870)以及美国专利申请11/264737(国际专利申请公布WO 2006/052871)中提供。

在该酵母中表达基因的优选方法是将线性DNA整合到宿主基因组中；而且，当期望基因高水平表达时，整合到基因组中的多个位置可以是尤其有用的[如在Ura3基因座(GenBank登录号AJ306421)、Leu2基因座(GenBank登录号AF260230)、Lys5基因座(GenBank登录号M34929)、Aco2基因座(登录号AJ001300)、Pox3基因座(Pox3：GenBank登录号XP_503244；或Aco3：GenBank登录号AJ001301)、Δ12去饱和酶基因座(美国专利7,214,491)、Lip1基因座(GenBank登录号Z50020)、Lip2基因座(GenBank登录号AJ012632)、SCP2基因座(GenBank登录号AJ431362)、Pex3基因座(GenBank登录号CAG78565)、Pex16基因座(GenBank登录号CAG79622)和/或Pex10基因座(GenBank登录号CAG81606)]。

优选的用于解脂耶氏酵母的选择方法是对卡那霉素、潮霉素和氨基糖苷G418的抗性以及在缺乏尿嘧啶、亮氨酸、赖氨酸、色氨酸或组氨酸的培养基上生长的能力。在另一个实施方案中，5-氟乳清酸(5-氟尿嘧啶-6-羧酸一水合物；“5-FOA”)可用于选择酵母Ura^-突变体(美国专利申请公布2009-0093543-A1)，或者天然乙酰羟酸合酶(或乙酰乳酸合酶；E.C.4.1.3.18)，赋予磺酰基脲抗除草剂性(国际专利申请公布WO 2006/052870)，利用其选择转化体。一种独特的方法利用位点特异性重组酶体系，“回收利用”一对优选的选择标记用于多次连续转化，该方法也在美国专利申请公布2009-0093543-A1中提出。

基于以上文献，本文所公开的是分别生产GLA或STA的方法，该方法包括：

(a)提供含油酵母(例如解脂耶氏酵母)，其包含：

(i)编码Δ6去饱和酶多肽的第一重组核苷酸分子，该核苷酸分子可操作地连接至至少一个调控序列；

(ii)分别由LA和/或ALA组成的去饱和酶底物来源；以及，

(b)在存在合适的可发酵碳源的情况下使步骤(a)的酵母生长，其中编码Δ6去饱和酶多肽的基因得以表达而且分别将LA转化成GLA和/或将ALA转化成STA；以及，

(c)任选地分别回收步骤(b)中的GLA和/或STA。

可能需要供给底物。在优选的实施方案中，Δ6去饱和酶多肽如SEQID NO：2所示；因此例如编码Δ6去饱和酶多肽的基因的核苷酸序列可如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：46所示(其中至少227个密码子已经经过优化以在耶氏酵母属中相对于SEQ ID NO：1表达)。

由于含油酵母中天然产生的PUFA仅限于18:2脂肪酸(即LA)和通常较少的18:3脂肪酸(即ALA)，因此除了本文所述的Δ6去饱和酶之外，还可对含油酵母进行基因工程改造以表达多种对长链PUFA生物合成所必需的酶(由此使得能产生例如ARA、EPA、DPA和DHA)。

具体地讲，含油酵母是本文所预期的，其中所述酵母包含：

(a)包含分离的多核苷酸的第一重组DNA构建体，该多核苷酸编码Δ6去饱和酶多肽，并被可操作地连接至至少一个调控序列；并且

(b)至少一个另外的重组DNA构建体，该构建体包含可操作地连接至至少一种调控序列的分离多核苷酸，其编码多肽，所述多肽选自：Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9延伸酶、C_14/16延伸酶、C_16/18延伸酶、C_18/20延伸酶和C_20/22延伸酶。

其他合适的微生物宿主包括含油细菌、藻类、类眼虫、原生藻菌、卵菌和其他真菌；并且在这个广泛的微生物宿主组中，特别要关注的是合成ω-3/ω-6脂肪酸的微生物(或者那些能通过遗传工程达到该目的的微生物[例如其他酵母如啤酒糖酵母])。因此例如用任何本发明的Δ6去饱和酶基因在诱导型或调控型启动子的控制下转化高山被孢霉(其商业用于生产ARA)能够产生转化生物，该转化生物能够合成增量的GLA，通过共表达C_18/20延伸酶和Δ5去饱和酶可将GLA进一步转化成ARA。Mackenzie等人(Appl.Environ.Microbiol.，66：4655(2000))描述了转化高山被孢霉的方法。类似地，用于转化破囊壶菌目微生物(例如破囊壶菌属(Thraustochytrium)、裂殖壶菌属(Schizochytrium))的方法在美国专利7,001,772中公开。

不管经选择用于表达本文所述Δ6去饱和酶的宿主如何，为了获取显示所需表达水平和模式的菌株，必须筛选多个转化子。这种筛选可以通过DNA印迹的Southern分析(Southern，J.Mol.Biol.，98：503(1975))、mRNA表达的Northern分析(Kroczek，J.Chromatogr.Biomed.Appl.，618(1-2)：133-145(1993))、蛋白质表达的Western和/或Elisa分析、PUFA产物的表型分析或GC分析来完成。

有关本发明的Δ6去饱和酶序列的知识将可用于操纵多种宿主细胞中的ω-3和/或ω-6脂肪酸的生物合成。用于操纵生物化学途径的方法是本领域的技术人员熟知的；并且期望可能使用多个操纵最大化在含油酵母/尤其是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中的ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成。这种操纵可能需要直接在PUFA生物合成途径中进行代谢工程改造，或者需要另外对为PUFA生物合成途径提供碳的途径进行操纵。可用于上调期望的生化途径和下调不期望的生化途径的方法是本领域技术人员熟知的。

例如与ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途径竞争能量或碳的生化途径或干扰特定PUFA终产物产生的天然PUFA生物合成途径中的酶可以通过基因破坏来去除或通过其他手段(如反义mRNA)来下调。

关于在PUFA生物合成途径中使用操纵(及其相关联的技术)作为增加GLA、ARA、EPA或DHA的手段的详细讨论分别存在于国际专利申请公布WO 2006/033723、国际专利申请公布WO2006/055322[美国专利申请公布2006-0094092-A1]、国际专利申请公布WO 2006/052870[美国专利申请公布2006-0115881-A1]以及国际专利申请公布WO 2006/052871[美国专利申请公布2006-0110806-A1]中，它们是在TAG生物合成途径和TAG降解途径中期望的操纵(及其相关联的技术)。

通过任何一种上述策略调节脂肪酸生物合成途径的表达都可能是有用的。例如，本文提供了一种方法，其中将编码Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶生物合成途径中关键酶的基因导入含油酵母以生产ω-3和/或ω-6脂肪酸。利用对宿主生物进行代谢工程改造的多种手段，使本发明的Δ6去饱和酶基因在天然条件下不具有ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途径的含油酵母中表达并协调这些基因的表达，以最大程度地产生优选的PUFA产物将是特别有用的。

使转化的微生物宿主细胞在使嵌合基因(例如去饱和酶、延伸酶)的表达最优化而且产生的所需PUFA的产率最大且最经济的条件下生长。通常，可以被优化的培养基条件包括碳源的类型和量、氮源的类型和量、碳氮比、不同矿物离子的量、氧水平、生长温度、pH、生物量生产期的时长、油积聚期的时长以及细胞收获的时间和方法。使所关注的微生物(例如含油酵母，如解脂耶氏酵母)通常在复合培养基(例如酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖肉汤培养基(YPD))或缺乏生长所必需的成分并由此强迫选择所需表达盒的确定成分的基本培养基(如Yeast Nitrogen Base(DIFCO Laboratories，Detroit，MI))中生长。

本发明的发酵培养基必须含有合适的碳源。合适的碳源在美国专利7,238,482中提出。虽然预期本文方法中利用的碳源可包括多种碳源，优选的碳源是糖(例如葡萄糖)、甘油、和/或脂肪酸。

氮可以由无机源(如(NH₄)₂SO₄)或有机源(如尿素或谷氨酸盐)提供。除了合适的碳源和氮源，发酵培养基还必须含有合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲液、维生素和本领域技术人员已知的适合含油宿主生长并促进PUFA产生所必需的酶促途径的其他组分。要特别注意促进脂质和PUFA合成的几种金属离子(如Fe⁺2、Cu⁺2、Mn⁺²、Co⁺²、Zn⁺²、Mg⁺²)(Nakahara，T.等人，Ind.Appl.Single Cell Oils，D.J.Kyle和R.Colin，eds.第61-97页(1992))。

优选的生长培养基是常见的商业制备培养基，例如Yeast Nitrogen Base(DIFCO Laboratories，Detroit，MI)。也可以使用其他确定成分的生长培养基或合成的生长培养基，适于转化宿主细胞生长的培养基对微生物学或发酵科学来说将是已知的。适于发酵的pH范围通常介于约pH4.0至pH8.0之间，其中优选将pH5.5至pH7.5作为初始生长条件的范围。发酵可以在有氧或厌氧条件下进行，其中优选为微氧条件。

通常，在含油酵母细胞中积聚高水平的PUFA需要包括两个阶段的过程，由于代谢状态必须在生长和脂肪的合成/贮存之间达到“平衡”。因此，最优选的是，包括两个阶段的发酵过程是在含油酵母(如解脂耶氏酵母)中产生PUFA所必需的。这种方法在美国专利公开7,238,482中有所描述，其也描述了多种合适的发酵工艺设计(即分批式、补料分批式和连续式)和生长过程中的注意事项。

PUFA可以游离脂肪酸的形式或以酯化的形式(例如酰基甘油、磷脂、硫脂或糖脂)存在于宿主微生物中，并且可以通过本领域熟知的多种手段从宿主细胞中提取。关于酵母脂质的提取技术、质量分析和可接受标准的一篇综述是Z.Jacobs(Critical Reviews in Biotechnology，12(5/6)：463-491(1992))的综述。有关下游加工的简述也可由A.Singh和O.Ward(Adv.Appl.Microbiol.，45：271-312(1997))提供。

通常，用于纯化PUFA的手段可包括用有机溶剂萃取(例如，美国专利6,797,303和美国专利5,648,564)、超声处理、超临界流体萃取(如使用二氧化碳)、皂化和物理手段(例如挤压)，或它们的组合。另外的详细信息可参考美国专利7,238,482的教导内容。

有过多掺入了ω-3和/或ω-6脂肪酸(尤其是如ALA、GLA、ARA、EPA、DPA和DHA)的食物和饲料产品。

预期包含长链PUFA的微生物量、部分纯化的包含PUFA的微生物量、纯化的包含PUFA的微生物油和/或纯化的PUFA将在食物和饲料产品中起作用以赋予该制剂健康益处。更具体地讲，包含ω-3和/或ω-6脂肪酸的油将适用于多种食品和饲料产品包括但不限于：食物类似物、肉产品、谷类产品、烘焙食品、小吃食品和乳制品(详见美国专利申请公布2006-0094092)。

此外，本发明的组合物可用于制剂中以在医疗食物(包括医疗营养品、膳食补充剂、婴儿代乳品以及药物产品)中赋予健康益处。食物加工和食物配制领域的技术人员将了解所述各种油的量和组成如何加入到食物或饲料产品中。该量在本文中将称为“有效”量并将取决于食物或饲料产品、期望补充该产品的膳食或医疗食物或医疗营养品旨在纠正或治疗的医学状况。

实施例

在以下实施例中进一步描述本发明，所述实施例示出了实施本发明的简要方法，但不完全限定其所有可能变型。

一般方法

实施例中使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且描述于：1)Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.的Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(Maniatis)；2)T.J.Silhavy，M.L.Bennan，和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions；Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；和3)Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，由Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience公布，Hoboken，NJ(1987)。

适用于微生物培养物的维持和生长的材料和方法是本领域熟知的。适用于下面实施例的技术可在Manual of Methods for General Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips，Eds)，American Society for Microbiology：Washington，D.C.(1994))；或Thomas D.Brock in Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第2版，Sinauer Associates：Sunderland，MA(1989)的描述中找到。除非另外指明，用于微生物细胞的生长和维持的所有试剂、限制性内切酶和材料均获自Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)、DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)。除非另外指明，大肠杆菌XL-2细胞(目录号200150)购自Stratagene(San Diego，CA)；大肠杆菌菌株通常生长在37℃ Luria Bertani(LB)平板上。

一般的分子克隆根据标准方法(Sambrook等人，同上)来完成。DNA序列是在ABI自动测序仪上采用染料终止剂技术(美国专利5,366,860；EP 272,007)使用载体和***片段特异性引物的组合来产生的。序列编辑是在Sequencher(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)中进行的。所有序列在两个方向上覆盖至少两次。基因序列的比较是使用DNASTAR软件(DNAStar Inc.，Madison，WI)来完成。

缩写含义如下：“sec”表示秒，“min”表示分钟，“h”或“hr”表示小时，“d”表示天，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“μM”表示微摩尔每升，“mM”表示毫摩尔每升，“M”表示摩尔每升，“mmol”表示毫摩尔，“μmole”表示微摩尔，“g”表示克，“μg”表示微克，“ng”表示纳克，“U”表示单位，“bp”表示碱基对并且“kB”表示千碱基。

表达盒的命名：

表达盒的结构将通过简单的记号***“X::Y::Z”表示，其中X描述启动子片段，Y描述基因片段而Z描述终止子片段，它们均彼此可操作地连接。

解脂耶氏酵母的转化和培养：

具有ATCC保藏号#20362、#76982和#90812的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株购自美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)。解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株通常生长在28-30℃的若干个培养基上，培养基配方如下文所示。根据标准方法，按需要通过将20g/L琼脂添加到每种液体培养基中来制备琼脂平板。

YPD琼脂培养基(每升)：10g酵母提取物[Difco]，20g Bacto蛋白胨[Difco]；以及20g葡萄糖。

基本培养基(MM)(每升)：20g葡萄糖，1.7g酵母氮源基础，无氨基酸；1.0g脯氨酸；pH6.1(不需要调节)。

基本培养基+Tergitol(MMT)(每升)：如上制备MM培养基并加入tergitol，浓度0.2％(wt/vol)。

基础培养基+5-氟乳清酸(MM+5-FOA)(每升)：20g葡萄糖、6.7g酵母氮源基础、75mg尿嘧啶、75mg尿苷和适量FOA(Zymo Research Corp.，Orange，CA)，基于对一系列从100mg/L至1000mg/L的浓度的FOA活性试验(因为供应商提供的每批料中会发生改变)。

解脂耶氏酵母的转化在美国专利申请公布2009-0093543-A1中进行了描述，该文献以引用方式并入本文。

解脂耶氏酵母的脂肪酸分析：

对于脂肪酸分析，将细胞通过离心收集并如Bligh，E.G.& Dyer，W.J.(Can.J.Biochem.Physiol.，37：911-917(1959))。通过将脂质提取物与甲醇钠进行酯交换反应而制备脂肪酸甲酯[“FAME”](Roughan，G.和Nishida I.，Arch Biochem Biophys.，276(1)：38-46(1990))并随后将其用配有30m×0.25mm(内径)柱的Hewlett-Packard 6890气相色谱仪(GC)进行分析。烘箱温度以3.5℃/分钟从170℃(保持25分钟)升到185℃。

为了进行直接的碱催化酯交换反应，收获耶氏酵母属细胞(0.5mL培养物)，在蒸馏水中洗涤一次，并在Speed-Vac中在真空下干燥5-10分钟。将甲醇钠(100μl，浓度为1％)和已知量的C 15:0三酰基甘油(C15:0 TAG；目录号T-145，Nu-Check Prep，Elysian，MN)加入样本中，然后将样本涡旋振荡30分钟，温度为50℃。在加入3滴1M氯化钠和400μL己烷后，涡旋并离心样本。移除上层并用GC进行分析。

经由GC分析记录的FAME峰值在与已知脂肪酸进行比较时通过它们的保留时间进行鉴定，并且通过比较FAME与已知量的内部标准品(C15:0 TAG)的峰面积进行定量。因此，根据下式计算近似量(μg)的任意脂肪酸FAME[“μg FAME”]：(指定脂肪酸的FAME峰面积/标准品FAME峰面积)*(μg 标准品C15:0 TAG)，根据下式计算一定量(μg)的任意脂肪酸[“μg FA”]：(指定脂肪酸的FAME峰面积/标准品FAME峰面积)*(μg标准品C 15:0TAG)*0.9503，因为1μg C15:0TAG等于0.9503μg脂肪酸。注意：0.9503的转换因子是大多数脂肪酸测定的近似值，其范围介于0.95和0.96之间。

概述每种单个脂肪酸以TFA％重量表示的量的脂质特征通过用单个FAME峰面积除以所有FAME峰面积的总数并乘以100进行计算。

实施例1

构建紫球藻(Porphyridium cruentum)cDNA文库

本实施例描述使用BD-Clontech Creator^TM Smart^TM cDNA文库试剂盒(目录号K1053-1，Mississauga，ON，Canada)、在制备总RNA并分离poly(A)+RNA后构建紫球藻(Porphyridium cruentum)cDNA文库。

具体地讲，紫球藻菌株CCMP 1328的培养物购自The Provasoli-Guillard National Center for Culture of Marine Phytoplankton(Boothbay Harbor，Maine)。在Beckman GH3.8转子中以3750rpm离心10分钟沉淀细胞，重悬在2×0.6mL Trizole试剂(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)中。将重悬细胞转移到两个2mL螺帽管中，每管包含0.6mL 0.5mm的玻璃珠。将细胞在HOMOGENIZE设置的Biospec微型珠粒打浆机(mini bead beater)(Bartlesville，OK)中均化2分钟。将管短暂离心以除去小珠。将液体转移到2个新的1.5mL微离心管中并加入0.2mL氯仿/异戊醇(24∶1)到每管。用手将管摇动1分钟并静置3分钟。然后将管在4℃、14,000rpm离心10分钟。将上层转移到2个新管中。将异丙醇(0.5mL)加到每个管中。将管在室温孵育15分钟，随后在4℃、14,000rpm离心10分钟。将沉淀物用1mL75％乙醇(用无RNA酶的水)洗涤并晾干。然后将总RNA样本溶解在500μl无RNA酶的水中。

使用Qiagen oligoTex mRNA微型试剂盒(目录号70022；Valencia，CA)，按照制造商规程从总RNA样本中分离Poly(A)+RNA。将总RNA样本与500μl缓冲液OBB和55μl Oligotex悬浮液混合。将混合物在70℃孵育3分钟，并且在室温下冷却10分钟。然后在Eppendorf微量离心管中以14,000rpm离心2分钟。弃去上清液。将沉淀物重悬在400μl缓冲液OW2中并加载到随试剂盒供应的离心柱上。将柱置于1.5mL微量离心管中，在Eppendorf微量离心管中以14,000rpm离心1分钟。将柱转移到新的1.5mL微量离心管中，并施用400μl缓冲液OW2到柱上。在以14,000rpm再次离心1分钟后，将柱转移到新的无RNA酶的1.5mL微量离心管中。加入20μl预热到70℃的缓冲液OEB从柱中洗脱Poly(A)+RNA，随后在14,000rpm离心1分钟。重复洗脱步骤一次并合并两个洗脱样本。

使用在BD-Clontech Creator^TM Smart^TM cDNA文库试剂盒(以前的目录号为K1053-1；也称为目录号634903)中的LD-PCR方法和0.1μgpolyA(+)RNA样本生成cDNA。具体地讲，为了合成cDNA的第1链，将1μl poly(A)+RNA样本与1μl SMART IV寡核苷酸(SEQ IDNO：9)以及1μl CDSIII/3’PCR引物(SEQ ID NO：10)在两个1.5mL微量离心管中混合。将混合物在72℃加热2分钟并在冰上冷却2分钟。每个管中加入以下物质：2μl第一链缓冲液，1μl 20mM DTT，1μl 10mMdNTP混合物和1μl Powerscript逆转录酶。将混合物在42℃孵育1小时并在冰上冷却。

将第1链cDNA合成混合物用作模板，用于PCR反应。具体地讲，反应混合物包含以下物质：2μl第1链cDNA混合物，2μl 5’-PCR引物(SEQ ID NO：11)，2μl CDSIII/3’-PCR引物(SEQ ID NO：10)，80μl水，10μl 10X Advantage 2 PCR缓冲液，2μl 50X dNTP混合物和2μl 50XAdvantage 2聚合酶混合物。组成两个反应混合物。将GenAmp 9600仪的热循环条件设为95℃20秒，然后95℃5秒，15个循环，68℃ 6分钟。通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色定量PCR产物。

用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。就每个反应混合物而言，将PCR产物与500μl缓冲液PB混合。将混合物加载到离心柱中并在14,000rpm离心1分钟。用0.75mL的缓冲液PE洗涤柱子，并在14,000rpm离心1分钟。然后将柱在14,000rpm再次离心1分钟。加入50μl水到柱中洗脱cDNA样本，室温下将柱静置1分钟，并在14,000rpm下离心柱1分钟。合并两个样本。

随后用SfiI(79μl cDNA与10μl 10X SfiI缓冲液，10μl SfiI酶和1μl100X BSA混合，混合物在50℃孵育2小时)消化纯化的cDNA。加入二甲苯苯胺染料(2μl，浓度1％)。然后在与Creator^TM Smart^TM cDNA文库试剂盒一起提供的Chroma Spin-400柱上，严格按照制造商规程分离混合物。从柱上收集的组分通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。收集包含cDNA的前三个组分并用乙醇沉淀cDNA。将沉淀的cDNA再溶解在7μl水中并连接成pDNR-LIB，其在Creator^TM Smart^TM cDNA文库试剂盒中供应。

实旋例2

克隆紫球藻(Porphyridium cruentum)Δ6去饱和酶

红藻紫球藻(Porphyridium cruentum)的脂肪酸特征显示存在EDA和GLA(Siran，D.等人，Lipids，31(12)：1277(1996))，在表明在该藻类中生物合成EPA可利用Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径和/或Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径的其中一种或两种。在从生物中克隆Δ8去饱和酶的尝试中，使用简并引物分离去饱和酶样蛋白的内部部分。

克隆并测序编码紫球藻(Porphyridium cruentum)去饱和酶样蛋白 内部部分的PCR产物

使用简并PCR引物克隆去饱和酶的内部片段，所述引物针对已知Δ6和Δ8去饱和酶中高度保守的氨基酸区域制备。为此目的，将来自三角褐指藻(Phaeodactylum tricornatum)(GenBank登录号AAL92563[gi_19879689]；SEQ ID NO：37)、小立碗藓(Physomitrella patens)(GenBank登录号CAA11033[gi_3790209]；SEQ ID NO：38)、地钱(Marchantia polymnorpha)(GenBank登录号AAT85661[gi_50882491]；SEQ ID NO：39)和高山被孢霉(Mortierella alpina)(GenBank登录号AAL73947[gi_18483175]；SEQ ID NO：40)的Δ6去饱和酶和来自小眼虫(Euglena gracilis)(GenBank登录号AAD45877[gi_5639724]；SEQ ID NO：41)的Δ8去饱和酶使用LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的MegAlign^TM v6.1程序进行比对。该比对部分如图2所示；并且设计简并引物以退火如图2所示的保守氨基酸序列的加框区域。具体地讲，针对保守氨基酸序列WQQMGWL(S/A)HD(SEQ ID NO：15)制备上游简并引物523(SEQ ID NO：12)、524(SEQ ID NO：13)和525(SEQID NO：14)。针对保守氨基酸序列HHL(W/F)P(T/S)(M/L)PRHN(SEQ ID NO：18)制备下游简并引物526(SEQ ID NO：16)和527(SEQID NO：17)，并且针对保守氨基酸序列GGL(N/H)YQIEHH(SEQ IDNO：21)制备下游简并引物528(SEQ ID NO：19)和529(SEQ ID NO：20)。

使用紫球藻(Porphyridium cruentum)cDNA文库(实施例1)作为模板以及如表4所述的上游和下游简并引物的不同组合，进行四个单独的PCR反应。

表4

进行简并PCR反应以分离推定去饱和酶

PCR反应	上游简并引物	下游简并引物	期望的PCR产物大小
				#1	523和524(合并的)	526和527(合并的)	约700bp
#2	523和524(合并的)	528和529(合并的)	约700bp
				#3	525	526和527(合并的)	约700bp
#4	525	528和529(合并的)	约700bp

使用LA Taq^TM DNA聚合酶(TaKaRa Bio Inc.，Otsu，Shiga，520-2193，Japan；目录号TAK_RR002M)，按照制造商的说明书进行PCR。热循环条件为95℃1分钟，然后95℃1分钟，30个循环，55℃1分钟，72℃1分钟，随后在72℃最终延伸10分钟。PCR产物在琼脂糖凝胶中电泳并切除期望的～700bp PCR片段，所述片段在所有反应中能观察到，使用GeneClean试剂盒(Qbiogene，Carlsbad，CA；目录号1001-600)进行纯化，并且克隆到由TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA；目录号K4530-20)提供的pCR4-TOPO载体中。将连接物转化到大肠杆菌XL-2细胞(Stratagene)中。

使用T3(SEQ ID NO：22)和T7(SEQ ID NO：23)引物对来自六个转化体的质粒DNA中的克隆PCR产物进行测序。所有六个转化体的内部序列，即不包括简并上游和下游引物区域的序列，是彼此相似的。更具体地讲，所有6个内部序列的比较结果揭示它们在总计17个不同残基上(其中仅有5个是沉默突变)有差异。无两个克隆具有相同的突变残基表明许多突变体可能是由于PCR错误导致。其中一个紫球藻(Porphyridium cruentum)克隆的693bp的序列如SEQ ID NO：51所示。

SEQ ID NO：51的同一性如下进行测定：利用National Center for Biotechnology Information[“NCBI”]BLASTP 2.2.18(蛋白质-蛋白质Basic Local Alignment Search Tool；Altschul等人，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402(1997)；以及Altschul等人，FEBS J.，272：5101-5109(2005))，使用其翻译后的序列搜索在BLAST“nr”蛋白数据库中包含的序列的相似性。分析该序列与“nr”数据库中包含的所有公开可用的蛋白序列的相似性。与克隆的紫球藻(P.cruentum)序列最相似(基于同源性)的是高山被孢霉Δ6去饱和酶(GenBank登录号AAF08685.1；SEQ ID NO：24)。

克隆推定去饱和酶的3’末端

为了克隆推定去饱和酶的3’末端，使用上文克隆的PCR产物的内部序列设计正向的基因特异性PCR引物(即，引物535[SEQ ID NO：25]和引物536[SEQ ID NO：26])用于3’巢式PCR。

因此，如上所述使用来自实施例1的紫球藻(Porphyridium cruentum)cDNA文库作为模板，包含基因特异性引物535(SEQ IDNO：25)和CDSIII/3’PCR引物(SEQ ID NO：10；其中具有序列5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)₃₀(A/G/C)N-3’的CDSIII/3’PCR引物在BD-Clontech Creator^TM Smart^TM cDNA文库试剂盒(目录号K1053-1，Mississauga，ON，Canada)中被提供)的引物对进行PCR。然后使PCR反应产物进行第二次巢式PCR反应，该反应利用包含基因特异性引物536(SEQ ID NO：26)和CDSIII/3’PCR引物(SEQ ID NO：10)的引物对进行。PCR反应物在1％琼脂糖凝胶上电泳。

切除期望大小(ca.500bp)的PCR产物，使用GeneClean试剂盒(Qbiogene)进行纯化，并且连接到TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)中提供的pCR4-TOPO载体中。将连接DNA转化到大肠杆菌XL-2细胞(Stratagene)中。克隆产物从6个单独转化体的质粒DNA中测序。来自一个克隆的410bp的序列如SEQ ID NO：52所示。

所有序列的比对结果揭示在5个位点的突变核苷酸残基可能由于PCR错误导致。

克隆推定去饱和酶的5’末端

使用5’RACE试剂盒(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA；目录号18374-058)，按照制造商的说明书克隆推定去饱和酶cDNA的5’末端。为此目的，使用上文克隆的PCR产物的内部序列设计反向的基因特异性PCR引物(即，引物533[SEQ ID NO：27]、引物534[SEQ IDNO：28]和引物537[SEQ ID NO：29])。设计后者以与5’RACE试剂盒中的AUAP引物(SEQ ID NO：30)一起作用。

使用该试剂盒合成第一链cDNA，所述合成使用基因特异性引物533(SEQ ID NO：27)并用紫球藻(Porphyridium cruentum)总RNA(实施例1)作为模板。按照制造商的说明书用RNA酶处理第一链cDNA，通过S.N.A.P.柱进行纯化，并且用TdT加尾。

使用试剂盒提供的正向AAP引物(SEQ ID NO：31，具有5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3’序列，其中I＝脱氧次黄苷)和反向基因特异性引物534(SEQ ID NO：28)，利用加尾的cDNA作为模板，扩增cDNA的5’末端。PCR反应物在1％琼脂糖凝胶上电泳。

观察到对应于期望大小(ca.800bp)的弱带。切除所有介于500和1000bp之间的片段，使用GeneClean试剂盒(Qbiogene)进行纯化并用其作为模板，利用正向AUAP引物(SEQ ID NO：30)和反向基因特异性引物537(SEQ ID NO：29)，按照试剂盒说明书进行第二次巢式5’RACE。PCR反应物在1％琼脂糖凝胶上电泳。

切除所有PCR产物，使用GeneClean试剂盒(Qbiogene)进行纯化并连接到TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)提供的pCR4-TOPO载体中。将连接产物转化到大肠杆菌XL-2细胞(Stratagene)中。克隆的PCR产物从来自5个单独转化体的质粒DNA中测序。序列比对揭示5个序列中的4个是相同的。这个822bp的序列如SEQ ID NO：53所示。

第五个序列相对于SEQ ID NO：53具有3个错配(即，A441G、C653T和G722A，导致H 125G和L196F突变)；然而将该序列中的差异再次假定为可能由于PCR错误导致。

推定去饱和酶的5′末端(SEQ ID NO：53)、内部(SEQ ID NO：51)和3′末端(SEQ ID NO：52)序列进行电子装配以制备全长DNA序列(SEQ ID NO：1)。

克隆全长去饱和酶cDNA

因为推定去饱和酶的5′末端、内部和3′末端序列使用非防错的LATaq^TM DNA聚合酶(TaKaRa Bio Inc.)获得，全长去饱和酶通过PCR使用防错的PfuUltra^TM高保真DNA聚合酶(Stratagene，San Diego，CA；目录号600380)进行克隆。为此目的，PCR以来自实施例1的紫球藻(Porphyridium cruentum)cDNA文库作为模板，使用基于推定上述去饱和酶克隆的5’和3’末端序列设计的上游引物539(SEQ ID NO：32)和下游引物540(SEQ ID NO：33)，按照制造商的说明书进行PCR。使用GeneClean试剂盒(Qbiogene)切除并纯化期望大小(ca.1470bp)的PCR产物。

耶氏酵母属表达质粒pY91来源于质粒pY91M(SEQ ID NO：34；如美国专利申请公布2006-0115881-A1所述)，在通过NcoI-NotI消化切除嵌合斑马鱼(Danio rerio)Δ6去饱和酶[“DrD6”]基因后获得。然后连接包含全长推定紫球藻(Porphyridium cruentum)去饱和酶的1470bp PCR产物，连接通过融合克隆在pY91的NcoI和Not I位点之间(In-Fusion^TM PCR Cloning试剂盒，目录号631774；Clontech，Mountain View，CA)，使得克隆的ORF可操作地连接至解脂耶氏酵母(Tarrrowia lipolytica)FBAIN启动子(美国专利7,202,356)和耶氏酵母属Pex20基因(GenBank登录号AF054613)的Pex20终止子序列。

将连接的DNA转化到大肠杆菌XL-2细胞(Stratagene)中。对质粒DNA的限制性分析表明7个转化体中的6个具有期望的Sal1/BglII片段。将在这些质粒中的三个质粒(即，小量制备的#1，#2和#4)中的克隆cDNA ORF***序列一起命名为pY109。分别使用上游和下游测序引物373(SEQ ID NO：35)和507(SEQ ID NO：36)对ORF进行测序。

三个cDNA序列的比对表明pY109#1和pY109#4是相同的，而pY109#2具有6个核苷酸残基差异，其中5个差异导致氨基酸取代。突变残基A591T是沉默突变，而突变残基C494T、T785C、T980C、C1052T和A1118G导致S165L、L262S、I327T、A351V和H373R氨基酸变体(就列出的各个取代而言[即A591T]，首字母对应于pY109#1中的核苷酸或氨基酸残基，第二个字母对应于存在于pY109#2中相同位置上的核苷酸或氨基酸残基，即A591T指示pY109#1中在位点591上的腺嘌呤变为pY109#2中的胸腺嘧啶，而S165L指示pY109#1中在位点165上的丝氨酸变为pY109#2中的亮氨酸)。H373R突变是高度保守的残基。

质粒pY109#1中紫球藻(Porphyridium cruentum)Δ6去饱和酶ORF(称为“PcD6”)的1416个核苷酸的序列如SEQ ID NO：1所示，而推断出的对应于SEQ ID NO：1的471个氨基酸的序列如SEQ ID NO：2所示。质粒pY109#1(SEQ ID NO：44)如图3所示，包含嵌合FBAIN::PcD6::Pex20基因以及一个ColE1质粒复制起点、一个氨苄青霉素抗性基因(Amp^R)用于在大肠杆菌中选择、一个大肠杆菌f1复制起点、一个耶氏酵母属自主复制序列(ARS18；GenBank登录号A17608)和一个耶氏酵母属Ura3基因(GenBank登录号AJ306421)。

质粒pY109#2中紫球藻(Porphyridium cruentum)Δ6去饱和酶ORF(称为“PcD6*”)的1416个核苷酸的序列如SEQ ID NO：42所示，而推断的对应于SEQ ID NO：42的471个氨基酸的序列如SEQ ID NO：43所示。pY109#2的核苷酸序列如SEQ ID NO：45所示。

PcD6(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列通过NCBI的BLASTP 2.2.18在BLAST“nr”蛋白序列数据库中搜索包含的相似序列(包括所有非冗余GenBank CDS翻译、来源于3维结构的Brookhaven Protein Data Bank(PDB)的序列、在SWISS-PROT蛋白质序列数据库的最终主版本中包括的序列、不包括那些来自WGS项目的环境样本的PIR和PRF)进行评估，所述搜索使用默认参数(预期阈值＝10；字长＝3；评分参数矩阵＝BLOSUM62；缺口成本：存在＝11，延伸＝1)。概述该序列与SEQ ID NO：2的BLASTP比较结果具有最高的相似性，这根据％同一性、％相似性和预期值而被报道。将“％同一性”定义为两个蛋白间的相同氨基酸百分比。将“％相似性”定义为两个蛋白间相同的或保守的氨基酸的百分比。“预期值”估计匹配的统计学显著性，用一个给定值明确说明在用这一大小的绝对随机数据库搜索中的匹配数目。

因此，使用全长氨基酸序列PcD6(即，SEQ ID NO：2)作为查询序列，预期值5e-91的BLASTP搜索结果显示它与高山被孢霉(Mortierella alpina)(GenBank登录号AAF08685.1)的Δ6脂肪酸去饱和酶具有40％的同一性和57％的相似性。此外，PcD6与高山被孢霉(Mortierella isabellina)(GenBank登录号AAL73948.1)的Δ6去饱和酶具有39％的同一性和57％的相似性。

普遍存在于Δ6去饱和酶中的三个组氨酸框(即，H(X)_3-4H(SEQID NO：3和4)、H(X)_2-3HH(SEQ ID NO：5和6)和H/Q(X)_2-3HH(SEQ ID NO：7和8))经确认存在于SEQ ID NO：2中。具体地讲，SEQID：2的氨基酸残基198-202是His-Asp-Phe-Leu-His[或HDFLH；SEQ IDNO：48]；氨基酸残基235-239是His-Asn-His-His-His[或HNHHH；SEQID NO：49]；并且氨基酸残基416-420是Gln-Ile-Glu-His-His[或QIEHH；SEQ ID NO：50]。

实施例3

推定紫球藻(Porphyridium cruentum)Δ6去饱和酶ORF的功能表 征

质粒pY109#1(SEQ ID NO：44)和pY109#2(SEQ ID NO：45)各包含一个嵌合FBAIN::紫球藻(Porphyridium cruentum)Δ6去饱和酶::Pex20基因，将这两个质粒转化到多个解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株中。GC分析表明pY109#1中的PcD6(SEQ ID NO：1和2)当表达时能够活性地将LA去饱和成GLA。

解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株Y2224和L103的分离

菌株Y2224(来自野生型耶氏酵母属菌株ATCC#20362的Ura3基因的自发突变FOA抗性突变体)如美国专利申请公布2007-0292924-A1的实施例13所述进行分离。

菌株L103生产按总脂肪酸[“TFA”]百分比计47％的ALA，该菌株如美国专利申请公布2006-0115881-A1的实施例18所述生成。针对野生型解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)ATCC#20362的该菌株的基因型如下：Ura3-，3拷贝的嵌合FBAIN::FmD15:Lip2基因(其中FmD15是串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)Δ15去饱和酶基因；也参见美国专利申请公布2005-0132442-A1)，2拷贝的嵌合GPD::FmD15:XPR基因和1拷贝的嵌合FBAIN::FmD12::Lip2基因(其中FmD12是串珠镰刀菌(F.moniliforme)Δ12去饱和酶基因；也参见美国专利7,504,259)。

转化、选择和生长

通过标准醋酸锂方法将质粒pY109#1和pY109#2(来自实施例2，分别包含PcD6和PcD6*)转化到解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株Y2224和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株L103中。

通过在MM平板上培养三天选择URA原养型微生物。将每个菌株的四个单独转化体划线接种到新的MM平板上，在30℃培养过夜，并且用于接种3mL MM。相同制备Y2224和L103对照菌株的四等份培养物。在30℃振荡器中培养过夜后，收获细胞并重悬在包含EDA和ETrA混合物的MMT(MM+tergitol)中，每种脂肪酸的最终脂肪酸浓度为0.5mM。持续培养24小时。收获细胞，用NP-40(目录号127087-87-0，Sigma，St.Louis，MO)和蒸馏水洗涤。提取总脂质并进行酯转移。如一般方法所述，通过GC分析FAME。

每个菌株的4个转化体的脂肪酸组合物以及平均脂肪酸组成在下表中显示。将脂肪酸鉴定为16:0、18:0、18:1(ω-9)、18:2(ω-6)、GLA(18:3ω-6)、ALA(18:3ω-3)、STA(18:4ω-3)、EDA(20:2ω-6)、DGLA(20:3ω-6)、ARA(20:4ω-6)、ETrA(20:3ω-3)、ETA(20:4ω-3)和EPA(20:5ω-3)。转化效率(缩写为“CE”)如下计算：：([产物]/[底物+产物])*100。因此，“Δ6CE”如下计算：GLA/(LA+GLA)*100]；与之相比，“Δ8CE”如下计算：DGLA/(EDA+DGLA)*100。

为了进行比较，野生型解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株ATCC#20362的脂肪酸组成(％TFA)如下所示：7.9％的16:0，14.2％的16:1(n-11)，1.2％的18:0，50.0％的18:1(n-9)以及25.1％的18:2(n-6)，该菌株在YPD中另外生长1天，随后在MMT中生长1天。GLA在野生型ATCC#20362中缺乏。

在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株Y2224的pY109#1转化体中缺乏GLA，这指示Δ6去饱和酶活性由Y109#1中的PcD6 ORF(SEQ ID NO：1)编码。更具体地讲，pY109#1(SEQ ID NO：44)转化体当在解脂耶氏酵母菌株Y2224中表达时具有25％的Δ6去饱和酶转化效率。期望通过密码子优化和转基因的染色体整合改善该转化效率。

与之相比，在解脂耶氏酵母菌株L103(菌株Y2224的衍生物)的pY109#2转化体中缺乏GLA，这指示由Y109#2(SEQ ID NO：45)中的PcD6*ORF(SEQ ID NO：42)编码的Δ6去饱和酶活性缺失。这最可能归因于与在pY109#1中表达的PcD6序列相比，在PcD6*中有5个氨基酸残基差异。

在pY109#1和pY109#2转化体中存在痕量DGLA表明两个转化体都具有微量Δ8去饱和酶活性。然而不清楚这一点的真伪：由于在外来脂肪酸混合物中的痕量DGLA污染导致背景水平的DGLA。

概括地说，这一实验数据证明紫球藻(Porphyridium cruentum)Δ6去饱和酶(即，如SEQ ID NO：1和2所示的PcD6)当在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中表达时活性地将LA去饱和成GLA。

实施例4

用于解脂耶氏酵母的经密码子最优化的Δ6去饱和酶基因(PcD6S) 的合成

紫球藻(Porphyridium cruentum)Δ6去饱和酶基因[“PcD6”]的密码子使用将被优化以在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中表达，优化方法类似于在国际专利申请公布WO 2004/101753和U.S.Pat.7,125,672中所述的方法。具体地讲，将基于PcD6(SEQ ID NO：1)的编码序列设计密码子优化的Δ6去饱和酶基因(称为“PcD6S”)，设计根据耶氏酵母属密码子使用模式(美国专利7,125,672)、围绕着“ATG”翻译起始密码子的共有序列、以及RNA稳定性的一般规则(Guhaniyogi，G.和J.Brewer，Gene，265(1-2)：11-23(2001))。除了修改翻译起始位点之外，1416bp的编码区中还有248bp将被修改(17.5％)，以及227个密码子将被优化(48.1％)。将把NcoI位点和NotI位点分别加到翻译起始密码子附近和PcD6S(SEQ ID NO：46)的终止密码子之后。由密码子优化的基因编码的蛋白序列将与野生型序列(即，SEQ ID NO：2)具有同一性。设计的PcD6S基因将通过GenScript Corporation(Piscataway，NJ)合成并克隆到pUC57(GenBank登录号Y14837)中以生成pPcD6S。

本领域的技术人员将能够切除pPcD6S中包含的PcD6S基因(SEQID NO：46)、将其连接到包含合适调控序列的合适表达载体中(例如pY91，如SEQ ID NO：34所示)、并且在合适的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株中表达PcD6S。期望PcD6S的Δ6去饱和酶转化效率将比得上或超过PcD6(SEQ ID NO：1和2)的去饱和酶转化效率。

Claims (14)

1.分离的核酸分子，其包含编码Δ6去饱和酶的核苷酸序列，所述分离的核酸分子选自：

(a)编码如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的分离的核酸分子；

(b)在以下杂交条件下与(a)杂交的分离的核酸分子：0.1X SSC，0.1％ SDS，65℃，并且用2X SSC，0.1％SDS洗涤，随后用0.1X SSC，0.1％ SDS洗涤；或者，

与(a)或(b)完全互补的分离的核酸分子。

2.权利要求1的分离的核酸分子，其中至少227个密码子经密码子优化以在耶氏酵母属中表达。

3.权利要求1的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子选自SEQID NO：1和SEQ ID NO：46。

4.分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含编码至少471个氨基酸的Δ6去饱和酶的第一核苷酸序列，所述酶基于BLASTP比对方法在与具有如SEQ ID NO：2所示的序列的多肽进行比较时具有至少80％的同一性；

或包含第一核苷酸序列的互补序列的第二核苷酸序列。

5.编码如SEQ ID NO：2所示的Δ6去饱和酶的多肽。

6.嵌合基因，其包含可操作地连接至少一种调控序列的权利要求1或4中任一项的分离的核酸分子。

7.包含权利要求1或权利要求4的分离的核酸序列的微生物宿主细胞。

8.权利要求7的微生物宿主细胞，其中所述微生物宿主细胞选自酵母、藻类、细菌、类眼虫、原生藻菌、卵菌和真菌。

9.权利要求8的微生物宿主细胞，其中所述细胞是选自被孢霉属(Mortierella)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、和裂殖壶菌属(Schizochytrium)的属的成员。

10.权利要求8的微生物宿主细胞，其中所述细胞是含油的酵母。

11.权利要求10的微生物宿主细胞，其中所述含油酵母是选自下组的属的成员：耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。

12.一种生产γ-亚麻酸的方法，所述方法包括：

a)提供表达权利要求1或权利要求4的核酸序列的微生物宿主细胞；以及

b)在产生γ-亚麻酸的条件下，在亚油酸源的存在下培养(a)的宿主细胞。

13.一种生产十八碳四烯酸的方法，所述方法包括：

a)提供表达权利要求1或权利要求4的核酸序列的微生物宿主细胞；以及

b)在产生十八碳四烯酸的条件下，在α-亚麻酸源的存在下培养(a)的宿主细胞。

14.根据权利要求12或13中的任一项的方法，其中：

a)所述分离的核酸分子具有选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：46的核酸序列；并且

b)所述宿主细胞是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。

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