CN102171327B - 蝇蚧霉v-5菌株、使用该菌株的害虫防治方法和含有该菌株的微生物农药 - Google Patents

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Abstract

需要一种对环境安全、速效并且在对害虫的卵和幼虫喷雾处理的情况下杀虫效果优异的微生物农药。本发明提供一种使用蝇蚧霉V-5菌株(保藏编号：FERM BP-11135)防治至少一种选自由粉虱类、蚜虫类、叶螨类、蓟马类、锈螨类、潜叶虫类、螟蛾类、甘蓝夜蛾类和天牛类组成的组的害虫的方法；和包含所述菌株的微生物农药。

Description

蝇蚧霉V-5菌株、使用该菌株的害虫防治方法和含有该菌株的微生物农药
技术领域
本发明涉及一种蝇蚧霉(Lecanicillium muscarium)V-5菌株、使用该菌株的害虫防治方法和含有该菌株的微生物农药。本发明用于环境友好地、快速和长时间地害虫防治，特别是在农业和园艺领域中。 
背景技术
一些丝状真菌是昆虫类和螨虫类的天敌，例如，属于轮枝菌(Verticillium)属和白僵菌(Beauveria)属的天敌丝状真菌已实际上用作杀虫剂。一些在过去分类为蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii)的菌株基于分生孢子和瓶梗的形态学观察和β-微管蛋白基因的限制性片段长度多态性分析最近已重新分类为蝇蚧霉(Lecanicillium muscarium)。结果，本发明的菌株和商品名为MYCOTAL的菌株(由KOPPERT制备)重新分类为蝇蚧霉。专利文献1公开了具有绿色植物表面粘着性能的微生物农药，其包含作为昆虫病原真菌(entomopathogenic fungus)的具有对绿色植物表面的粘着活性的蜡蚧轮枝菌菌株，但是没有描述本发明的菌株。此外，作为杀虫剂的包含蝇蚧霉的微生物农药，MYCOTAL在市场上是作为蜡蚧轮枝菌可湿性粉剂，但是本发明菌株的菌落与MYCOTAL中含有的菌株的菌落不同。 
引用目录 
专利文献 
专利文献1：JP-A-2003-335612 
发明内容
发明要解决的问题
本发明的技术问题是提供一种新的丝状真菌菌株，所述菌株作为对环境安全、速效并且在对害虫的卵和幼虫喷雾处理的情况下杀虫效果优异的微生物农药是有用的。 
用于解决问题的方案
为解决上述问题的目的，本发明人已发现比常规已知的属于蝇蚧霉的丝状真菌表现出目标害虫的更高死亡率和可在更短时间内防治目标害虫的本发明的菌株。即，本发明涉及蝇蚧霉V-5菌株(保藏编号：FERM BP-11135)、使用该菌株的害虫防治方法及包含该菌株的微生物农药。 
(蝇蚧霉V-5菌株的分离和保藏申请) 
本发明的蝇蚧霉V-5菌株(下文称为本发明的菌株)是从日本滋贺县草津市西涉川2丁目3番1号的石原产业(株)中心研究所(ISHIHARA SANGYO KAISHA，LTD.，CENTRAL RESEARCH INSTITUTE(2-3-1，Nishishibukawa，Kusatsu，Shiga，Japan))温室中的银叶粉虱分离的菌株。本发明的菌株基于其形态学性质(分生孢子梗上形成有椎形瓶梗的轮生体和在顶端上形成有块状的单个分生孢子，瓶梗长度为11.2μm-34.3μm，基部直径为1.1μm-2.7μm，分生孢子为椭圆或棍棒形并且其大小为1.4μm-3.4μm×2.1μm-7.5μm，菌落为白色至淡黄白色，并且没有观察到形成次生瓶梗)和基于β-微管蛋白基因的限制性片段长度多态性的结果(通过PCR扩增540bp的DNA片段和通过HaeIII消化形成360bp和180bp的片段)，根据R.Zare和W.Gams等人的分类(Nova Hedwigia 73：1-50，2001)鉴定为蝇蚧霉。本发明的菌株在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology，International Patent Organism Depositary)(Chuo 6，1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan)保藏为蝇蚧霉V-5菌株(保藏编号：FERM BP-11135)并于2009年6月10日被该中心接收。其为具有杀虫和杀螨作用的丝状真菌，包含该菌株的微生物农药在防治害虫方面是有用的。 
发明的效果
当使用本发明的菌株时，可显著有效地防治害虫。因为本发明的菌株繁殖能力优异，其可确保高细胞浓度并且还保持优异的杀虫效果。基于此，可以进行有效的害虫防治。此外，因为其表现了对害虫卵期的杀虫效果，所以可以在早期实施有效的害虫防治。此外，因为本发明使用丝状真菌，其还具有对环境显著高的安全性并且在需要速效性和持续效果的防治害虫的情况下也是有用的。 
附图说明
[图1]显示试验例3中本发明的菌株的菌落的照片。 
[图2]显示试验例3中从MYCOTAL分离的菌株的菌落的照片。 
具体实施方式
本发明的菌株可通过将其原样施用或在任选用水稀释后作为微生物农药使用。其施用浓度和施用量依赖于不同的条件如害虫的种类、害虫的生长阶段和气候条件等而改变，但是作为每1公亩中本发明的菌株的孢子数，施用量通常为5×106个孢子至5×1012个孢子，优选5×107个孢子至5×1011个孢子。 
本发明的菌株可通过将其制成制剂作为微生物农药使用。在制备制剂的过程中，可使用用于配制昆虫病原菌作为微生物 农药的一般方法。如果需要，可通过与载体(例如，固体载体和液体载体)、表面活性剂、其他配制佐剂等任意组合配制为粉剂、可湿性粉剂、混悬剂和油悬浮剂(oil flowable)等形态。其中，优选的形态是最初制成粉剂然后溶解于水以在使用前喷雾的可湿性粉剂。当将本发明的菌株制成可湿性粉剂并通过用水稀释而使用时，在以本发明的菌株浓度按施用溶液中的孢子数量计一般为每1ml为102个孢子至1010个孢子，优选每1ml为103个孢子至108个孢子的方式稀释可湿性粉剂后施用该菌株。 
固体载体的实例包括硅藻土、氢氧化钙、碳酸钙、滑石、白炭黑、高岭土、膨润土、高岭石、绢云母的混合物、粘土、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸钠、沸石和淀粉。此外，液体载体的实例包括溶剂如水、甲苯、二甲苯、溶剂石脑油、二噁烷、丙酮、异佛尔酮、甲基异丁基酮、氯苯、环己烷、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮和酒精；植物油和矿物油如橄榄油、爪哇木棉油、蓖麻油、棕榈油、山茶油、椰子油、芝麻油、玉米油、米糠油、花生油、棉籽油、大豆油、菜籽油、亚麻籽油、桐油和液体石蜡；等。 
表面活性剂的实例包括阴离子表面活性剂，如脂肪酸盐、安息香酸盐、烷基磺化琥珀酸盐、二烷基磺化琥珀酸盐、聚羧酸盐、烷基硫酸酯盐、烷基硫酸盐、烷芳基硫酸盐、烷基二甘醇醚硫酸盐、硫酸醇酯盐(salt of alcohol sulfuric acid ester)、烷基磺酸盐、烷芳基磺酸盐、芳基磺酸盐、木质素磺酸盐、烷基二苯基醚二磺酸盐、聚苯乙烯磺酸盐、烷基磷酸酯盐、烷芳基磷酸盐、苯乙烯基芳基磷酸盐、聚氧乙烯烷基醚硫酸酯盐、聚氧乙烯烷芳基醚硫酸盐、聚氧乙烯烷芳基醚硫酸酯盐、聚氧乙烯烷基醚磷酸盐、聚氧乙烯烷芳基磷酸酯盐、和萘磺酸与***的缩合物的盐；非离子表面活性剂，如失水山梨醇脂肪酸 酯、甘油脂肪酸酯、脂肪酸聚甘油酯、脂肪酸醇聚二醇醚、炔二醇、乙炔醇、氧化烯嵌段共聚物、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷芳基醚、聚氧乙烯苯乙烯基芳基醚、聚氧乙烯二醇烷基醚、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油和聚氧乙烯脂肪酸酯；等。这些表面活性剂可改进喷雾时真菌菌体的可分散性和铺展性。 
其他配方佐剂的实例包括乳化剂、分散剂、稳定剂、润湿剂、混悬剂、展着剂、渗透剂、杀真菌剂等。乳化剂的实例包括木质素磺酸盐、藻酸盐等。分散剂的实例包括聚乙烯醇、***树胶、羧甲基纤维素等。稳定剂的实例包括酸性磷酸异丙酯、聚氧乙烯树脂酸(酯)、松香酸盐等。润湿剂的实例包括二萘基甲烷二磺酸盐等。 
在使用本发明的菌株防治害虫的方法中，如果需要，使用喷雾器如动力喷雾器、肩挂式喷雾器、手动喷雾器，通过将其喷雾至害虫、害虫栖息地、待防治害虫的植物等而施用药剂。此外，施用中，该药剂可通过与不表现出对天敌丝状真菌不良影响的其他杀虫剂和杀螨剂以及肥料、杀菌剂、植物生长调节剂等混合而施用。 
通过本发明的害虫防治方法而防治的害虫实例包括粉虱类，如温室粉虱(Trialeurodes vaporariorum)、烟粉虱(Bemisia tabaci)和柑桔粉虱(Dialeurodes citri)；蚜虫类，如桃蚜(Myzus persicae)、棉蚜(Aphis gossypii)、甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)、茄无网蚜(Aulacorthum solani)、萝卜蚜(Lipaphis erysimi)、大戟长管蚜(Macrosiphum euphorbiae)和葱蚜(Neotoxoptera formosana)；叶螨类，如柑桔全爪螨(Panonychus citri)、苹果全爪螨(Panonychus ulmi)、二斑叶螨(Tetranychus urticae)和神泽氏叶螨(Tetranychus kanzawai)；蓟马类，如花蓟马(Frankliniella  intonsa)、西花蓟马(Frankliniella occidentalis)、棕榈蓟马(Thrips palmi)和茶黄蓟马(Scirtothrips dorsalis)；锈螨类，如皮氏刺皮瘿螨(Aculops pelekassi)和番茄刺皮瘿螨(Aculops lycopersici)；潜叶虫类，如三叶草斑潜蝇(Liriomyza trifolii)；螟蛾类；甘蓝夜蛾类；天牛类，如马库白星天牛(Anoplophora malasiaca)和菊天牛(Phytoecia rujiventris)；等。要防治的害虫的优选实例包括粉虱类、蓟马类等。此外，待防治害虫的植物的实例包括果树、如橙树、苹果树、梨树、桃树、葡萄树、无花果树和樱桃果树；茶树；蔬菜类，如茄子、黄瓜、西红柿、菠菜、卷心菜和欧芹；水果类，如草莓、瓜类和西瓜；花树类，如玫瑰花树、菊花树、康乃馨树、樱桃树和山茶花树；观叶植物，如秋海棠；等。 
使用本发明的菌株作为母株通过自然突变或诱导突变得到的突变菌株只要其具有与本发明的菌株相同的特征也包含于本发明的菌株之内。制备这些突变菌株的方法的实例包括常规已知的方法，如其中对母株用诱变剂如紫外线照射和亚硝基胍(NTG)进行人工突变处理然后选择具有优异杀虫效果的菌株的方法。 
接下来，描述本发明的具体实施方案，但是本发明不应限制于这些实施方案。 
(1)一种用于防治害虫的方法，所述方法包括用本发明的菌株处理害虫。 
(2)根据(1)中所述的方法，其中所述害虫是选自由粉虱类、蚜虫类、叶螨类、蓟马类、锈螨类、潜叶虫类、螟蛾类、甘蓝夜蛾类和天牛类组成的组的至少一种。 
(3)根据(1)中所述的方法，其中所述害虫是粉虱类。 
(4)根据(1)中所述的方法，其中所述害虫是蓟马类。 
实施例
试验例1(对烟粉虱卵的喷雾试验) 
试验方法 
(1)将4个种植有一株叶期黄瓜(品种：Hokushin)的直径为7cm的盆置于昆虫箱(260×340×340mm)中并使B类烟粉虱成虫产卵7小时。将其中以该方式产卵的各盆转移至保持在25℃在黑暗条件下的昆虫室中每天8小时并静置以使粉虱生长。产卵5天(烟粉虱：卵期)后，记录产于黄瓜叶上的卵数。 
(2)使用喷雾枪，将已稀释和调整至给定浓度的喷雾液体(分生孢子混悬剂，制备后2小时内)以每4个盆中的喷雾水量变为50ml的方式一次喷雾至各盆的茎叶部分。喷雾后立即将它们转移至盖着的塑料容器(保持于100％湿度，底部填充水)中并使其在25℃在黑暗条件下静置15小时。此后，使黄瓜叶在与(1)相同条件下的昆虫室中静置。 
(3)使用立体显微镜判断烟粉虱的生或死以计算药液喷雾处理后7天(烟粉虱：1和2龄幼虫期)、13天(烟粉虱：2和3龄幼虫期)、19天(烟粉虱：4龄幼虫期)和26天(烟粉虱：羽化痕(post-emergence)期)的死亡率。关于这一点，为了比较，还使用通过将前述商品名MYCOTAL(由KOPPERT制备)稀释以得到作为实际浓度的分生孢子浓度3.0×106/ml而制备的喷雾液体来实施试验。试验结果如表1所示。 
试验结果 
[表1] 
Figure BPA00001310257400081
试验例2(对烟粉虱幼虫的喷雾试验) 
试验方法 
(1)将5个种植有一株叶期黄瓜(品种：Hokushin)的直径为7cm的盆置于昆虫箱(260×340×340mm)中并使B类烟粉虱成虫产卵7小时。将其中以该方式产卵的各盆转移至保持在25℃在黑暗条件下的昆虫室中每天8小时并静置以使粉虱生长。产卵10天(烟粉虱：1和2龄幼虫期)后，记录寄生于黄瓜叶上的卵数。 
(2)使用喷雾枪，将已稀释和调整至给定浓度的喷雾液体(分生孢子混悬剂，制备后2小时内)以每5个盆中的喷雾水量为50ml的方式一次喷雾至各盆的茎叶部分。喷雾后立即将它们转移至盖着的塑料容器(保持于100％湿度，底部填充水)中并使其在25℃在黑暗条件下静置15小时。此后，使黄瓜叶在与(1)相同条件下的昆虫室中静置。 
(3)使用立体显微镜判断烟粉虱的生或死以计算液体喷雾处理后8天(烟粉虱：2和3龄幼虫期)、14天(烟粉虱：3和4龄幼虫期)、17天(烟粉虱：4龄幼虫期至羽化痕)和21天(烟粉虱：羽化痕)的死亡率。关于这一点，为了比较，还使用通过将前述商品名MYCOTAL(由KOPPERT制备)稀释以得到作为实际浓度的分生孢子浓度1.0×106/ml而制备的喷雾液体来实施试验。 试验结果如表2所示。 
试验结果 
[表2] 
Figure BPA00001310257400091
试验例3(本发明的菌株与现存菌株之间菌落形态的比较) 
(1)马铃薯蔗糖琼脂培养基(下文称为PSA)的制备 
将200g去皮马铃薯在离子交换水中煮沸，并将沸汤用四层纱布过滤。向过滤的马铃薯汤中添加20g蔗糖和15g琼脂，之后进一步煮沸以溶解蔗糖和琼脂。调整体积至1升后，使用高压灭菌器将得到的溶液在121℃进行灭菌处理20分钟以制备PSA。此后，将20ml PSA分注(dispensed)到干净工作台中的灭菌布氏培养皿(直径为86mm)中以制备PSA培养基。 
(2)菌株的培养 
将少量各菌株接种至PSA培养基的中心位置并在黑暗条件下25℃恒温箱中静态培养每天8小时。随时间观察菌落的状况并在接种28天后拍照。作为菌株，使用本发明的菌株和从MYCOTAL分离的菌株。 
(3)结果 
如图1所示，本发明菌株的菌落在其中心部分与***部分之间没有显示显著的差别并且整体上均一展开。另一方面，如图2所示，从MYCOTAL分离的菌株的菌落的中心部分呈立体膨胀而菌落的***部分扁平。以这种方式，两种菌株形成了明显不同的菌落。
试验例4(本发明的菌株与现存菌株之间的比较试验) 
(1)以与试验例3相同的方式通过将20ml PSA分注于干净工作台中的灭菌的布氏培养皿(直径为86mm)中来制备PSA培养基。将0.5ml稀释和调整的分生孢子混悬剂(含有约5个分生孢子)以使得它们整体上均一分布的方式逐滴接种至PSA培养基，然后在黑暗条件下在25℃恒温箱中静置培养每天8小时以形成菌落。作为分生孢子混悬剂，使用本发明菌株的分生孢子混悬剂和从MYCOTAL分离的菌株的分生孢子混悬剂。 
(2)在接种两周后，测量通过单个分生孢子形成的菌落的半径，使用手术刀将各菌落与琼脂一起从培养基切出。将所切出的菌落的四分之一转移至装有3ml离子交换水的小布氏培养皿(直径为4cm)中以洗去分生孢子。进一步，使用2ml离子交换水再洗去粘着于所切出的琼脂上的分生孢子。以这种方式，得到5ml分生孢子洗液。将0.5ml得到的分生孢子洗液分注至试管中，用4.5ml离子交换水稀释并使用漩涡混合器(Vortex mixer)彻底混合以制备用于计数分生孢子数的试验液体。 
(3)将用于计数分生孢子数的试验液体滴至计数室，在显微镜下计数分生孢子数和计算培养基表面上的总分生孢子数。结果如表3所示。关于这一点，如果需要，将用于计数分生孢子数的试验液体在稀释至可计数分生孢子数的浓度后滴至计数室。此外，实施该试验5次，平均值表示为结果。 
[表3] 
Figure BPA00001310257400111
作为试验结果，发现了以下。本发明菌株的菌落半径比MYCOTAL菌株的菌落直径长1.4倍(以面积计是1.9倍)，发现两种菌株之间有显著差别(t-试验，p＜0.05)。此外，对于一个菌落中分生孢子的总数，本发明的菌株比MYCOTAL分离的菌株高约9倍，发现两种菌株之间有显著差别(t-试验，p＜0.05)。此外，本发明菌株的一个菌落中的分生孢子浓度比MYCOTAL分离的菌株大出约4.8倍，发现有显著差别(t-试验，p＜0.05)。从该试验发现，本发明的菌株比现有菌株在分生孢子的增殖率和浓度方面有优越性。 
试验例5(本发明的菌株对西花蓟马的有效性试验) 
调查在直径为17cm的3个盆中种植的茄子(品种：Senryo-2)上寄生的西花蓟马幼虫数后，将包含本发明菌株的喷雾液体用水稀释和调整以得到分生孢子浓度5.0×107(分生孢子/ml)(分生孢子混悬剂，制备后2小时内)并使用自动喷雾器(NZ-2，由Sakata制造)以充分量喷雾至所有的叶子。将喷雾后的3个盆置于温室中并在高湿度条件下保持约15小时，然后以通常的方法管理该温室。在喷雾7天后调查寄生于所有茄子叶上的幼虫数。试验结果如表4所示。关于这一点，作为用于比较而没有处理的区，通过喷雾水代替喷雾液体实施相同的试验。在没有处理的区中幼虫数增加到约1.4倍，而在处理区中幼虫数减少到约 1/3。因此，确认了防治效果。 
[表4] 
Figure BPA00001310257400121
试验例6(本发明的菌株对温室粉虱的有效性试验) 
(1)将2个种植有一株叶期菜豆(品种：新江户川菜豆(Shinedogawa natane))的直径为7cm的盆置于昆虫箱(260×340×340mm)中并使温室粉虱成虫产卵7小时。将其中以该方式产卵的各盆转移至保持在23℃在黑暗条件下的昆虫室中每天8小时并静置以使温室粉虱生长。产卵10天(温室粉虱：1和2龄幼虫期)后，记录菜豆叶上寄生的幼虫数。 
(2)使用喷雾枪，将已稀释和调整至给定浓度的喷雾液体(分生孢子浓度：1.0×106/ml和1.0×107/ml两种浓度)以喷雾水量为各盆中10ml的方式一次喷雾至各盆菜豆的茎叶部分。分生孢子混悬剂在制备的2小时内使用。喷雾后立即将它们转移至盖着的塑料容器(在100％湿度下保持，底部填充水)中并使其在23℃在黑暗条件下静置15小时。此后，使菜豆叶在与(1)相同条件下的昆虫室中静置。 
(3)使用立体显微镜判断温室粉虱的生或死以计算液体喷雾处理3天后(温室粉虱：羽化痕)的死亡率。试验结果如表5所示。 
[表5] 
Figure BPA00001310257400131
接下来，描述本发明的制剂例，但是本发明中的制剂量、剂型等不仅仅局限于所描述的实施例。 
制剂例1 
将本发明菌株的约1012个分生孢子悬浮于10升蒸馏水中并与100g硅藻土(Celite)混合并向其添加10g乳糖，之后用喷雾干燥器干燥。作为保水性物质，向其中添加50g聚乙烯醇以制备粉剂。 
制剂例2 
将85.0重量％液体石蜡和0.5重量％聚氧乙烯脂肪酸酯放入玻璃瓶中并彻底混合。向所得到的混合物中添加10.0重量％的在制剂例1中得到的本发明菌株的粉剂，然后混合，从而得到油悬浮剂。 
尽管已经详细地并参照其具体实施方案描述了本发明，但对本领域熟练技术人员显而易见的是在不脱离本发明的精神和范围内可以对其作出各种变化和改进。 
本申请基于2008年8月11日递交的日本专利申请(JP2008-206866)，本文将其全部内容引入作为参考。 
本文引用的所用文献均整体引入。 
产业上的可利用性
当使用本发明的菌株时，可显著有效地防治害虫。因为本 发明的菌株的增殖性优异，其可确保高细胞浓度并且还保持优异的杀虫效果。基于此，可以进行有效的害虫防治。此外，因为其表现了对害虫卵期的杀虫效果，所以可以在早期实施有效的害虫防治。此外，因为本发明使用丝状真菌，所以其还具有对环境显著高的安全性并且在需要速效性和持续效果的害虫防治的情况下也是有用的。 

Claims (6)

1.一种蝇蚧霉(Lecanicillium muscarium)V-5菌株，其保藏编号为FERM BP-11135。
2.一种用于防治害虫的方法，其包括用权利要求1所述的菌株处理害虫。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述害虫是选自由粉虱类、蚜虫类、叶螨类、蓟马类、锈螨类、潜叶虫类、螟蛾类、甘蓝夜蛾类和天牛类组成的组中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述害虫是粉虱类。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述害虫是蓟马类。
6.一种微生物农药，其包含权利要求1所述的菌株。
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