CN102170774A - 用于产生包含修饰的脂肪酸的三酰基甘油的多肽及方法 - Google Patents

用于产生包含修饰的脂肪酸的三酰基甘油的多肽及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102170774A
CN102170774A CN2009801234808A CN200980123480A CN102170774A CN 102170774 A CN102170774 A CN 102170774A CN 2009801234808 A CN2009801234808 A CN 2009801234808A CN 200980123480 A CN200980123480 A CN 200980123480A CN 102170774 A CN102170774 A CN 102170774A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fatty acid
seed
cell
polypeptide
acyltransferase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2009801234808A
Other languages
English (en)
Inventor
周雪荣
S·P·辛格
A·格林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Grains Research and Development Corp
Original Assignee
Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Grains Research and Development Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO, Grains Research and Development Corp filed Critical Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Publication of CN102170774A publication Critical patent/CN102170774A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23D—EDIBLE OILS OR FATS, e.g. MARGARINES, SHORTENINGS, COOKING OILS
    • A23D9/00—Other edible oils or fats, e.g. shortenings, cooking oils
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6458—Glycerides by transesterification, e.g. interesterification, ester interchange, alcoholysis or acidolysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6463—Glycerides obtained from glyceride producing microorganisms, e.g. single cell oil
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及生产包含官能团的修饰的脂肪酸的方法，所述官能团是羟基、环氧基、炔基(acetylenic group)或共轭双键。例如，本发明提供了种子、种子油和生产种子油的方法，其中种子或种子油脂肪酸含量的至少23％(mol％)包含所述官能团。还提供了10种新多肽，其多核苷酸，它们可以用于特别是在转基因植物及适合发酵的细胞中生产所述修饰的脂肪酸。

Description

用于产生包含修饰的脂肪酸的三酰基甘油的多肽及方法
发明领域
本发明涉及生产包含官能团的修饰的脂肪酸的方法，所述官能团是羟基、环氧基、炔基(acetylenic group)或者共轭双键。例如，本发明提供了种子、种子油和生产种子油的方法，其中种子或种子油脂肪酸含量的至少23％(mol％)包含所述官能团。还提供了10种新多肽，其多核苷酸，它们可以用于特别是在转基因植物及适合发酵的细胞中生产所述修饰的脂肪酸。
发明背景
植物油如种子油大多数含有变化比例的有限数目脂肪酸，它们在脂肪酸碳链中是饱和的(无碳-碳双键)、单不饱和的(在酰基链中有一个碳-碳双键)或多不饱和的(两个或三个双键)。它们主要作为三酰基甘油(TAG)存在于种子中，所述三酰基甘油具有甘油骨架，脂肪酸被酯化到甘油的所有3个羟基位置。
植物细胞如发育种子胚的细胞合成脂肪酸骨架并在其质体中进行第一次去饱和。饱和的和单不饱和的脂肪酸从质体输出并转移到ER膜中的脂质，在此它们供进一步去饱和或者修饰。它们然后从膜脂质中去除并用于组装TAG，TAG是种子储存油的主要成分。
FA的生物合成途径
植物中脂肪酸生物合成的第一部分在质体中发生。在第一步中，乙酰CoA被乙酰CoA羧化酶(EC 6.4.1.2)羧基化以形成丙二酸单酰-CoA。通过脂肪酸合酶复合物的作用，从丙二酸单酰CoA通过重复缩合至结合于酰基载体蛋白(ACP)的生长的酰基链而形成脂肪酸，形成16:0-ACP。其然后延伸至18:0-ACP并去饱和形成18:1-ACP，进入酯化为CoA的细胞溶胶库。从那儿，脂肪酸可以掺入单-、二-或三甘油中。进一步的去饱和或者其它修饰在酰基链转移到磷脂、特别是当酯化为磷脂酰胆碱(PC)时发生。
在PC上修饰的脂肪酸可以通过一系列代谢途径被转移到TAG，已鉴定了许多酶在PC、酰基-CoA和TAG库之间的脂肪酸流量(flux)中起作用。这些酶在图1中示出。这些酶还被认为参与转运不平常脂肪酸至TAG中。酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT，EC 2.3.1.23)可逆在PC-和CoA-结合形式之间转移脂肪酸。磷脂酶A1或A2也可以通过从PC裂解脂肪酸而转移酰基基团至酰基-CoA库，产生非酯化脂肪酸，非酯化脂肪酸可以被酰基-CoA合成酶(EC 6.2.1.3)酯化为CoA。三种酶进行甘油骨架的相继酰化以在所谓的Kennedy途径中使用酰基-CoA底物产生TAG，这些酶是甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT，EC 2.3.1.15)，溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT，EC 2.3.1.51)和二酰基甘油酰基转移酶(DGAT，EC 2.3.1.20)。DGAT在磷脂被磷脂酸磷酸酶(phosphatidate phosphatase)(EC 3.1.3.4)去磷酸化后起作用。
在Arabidopsis中已鉴别了至少8个编码GPAT的基因和5个编码LPAAT的基因，尽管不清楚哪种同种型在种子的TAG生物合成中最重要。编码对不太常见脂肪酸底物如芥子酸具有一些选择性的LPAAT的基因已被克隆并被用于增加这些脂肪酸在转基因作物物种中的积累，尽管所述增加是轻微的(Lassner et al.，1995；Knutzon et al.，1999)。
修饰的脂肪酸从PC直接到DAG和TAG的潜在移动也有两个已知的CoA不依赖性途径。PC骨架可以通过经胆碱磷酸转移酶(CPT，EC 2.7.8.2)除去磷脂酰胆碱头部基团而转化为DAG分子。以此方式形成的DAG可用于经DGAT作用合成TAG。脂肪酸也可以通过磷脂:二酰基甘油酰基转移酶(PDAT，EC 2.3.1.158)直接从PC转移掺入TAG中，但是这个酶在TAG生物合成中的定量作用可能在不同***中有变化。已推测PDAT分别在发育的蓖麻子和Crepis palaestina种子中从PC除去蓖麻油酸和斑鸠菊酸起主要作用(Dahlqvist et al.，2000；Banas et al.，2000)。
不寻常脂肪酸合成
植物中合成的脂肪酸不限于所有植物中常见的5或6种脂肪酸，而是有许多其它的修饰的脂肪酸(MFA)展示在植物界。如果它们能够在高产油料种子作物中廉价地和可再生地产生，那么存在于非食用植物的种子油中的许多MFA有作为工业应用的原材料的相当价值。这些包括具有不同链长即18碳以上或者由其它官能团修饰的脂肪酸。最近关注在那些C18脂肪酸，它们通过加入羟基或环氧基或者通过形成炔类(三重碳-碳)键或者共轭双键而在Δ12位被修饰。当在自然界发现时，直至MFA通常仅在种子油中积累，不在植物其它组织或者磷脂膜中积累。工程化植物可以提供针对MFA的替代的可再生资源给石油化工业者，如果它们能在种子中产生并且以足够比例积累在三酰基甘油中。这需要种子被遗传工程化以便(a)以高数量合成MFA，及(b)优选将MFA转移到TAG上的所有三个位置。
一些MFA的合成已在转基因种子中通过编码催化常见脂肪酸转化为MFA的修饰酶的基因的表达而证实。这些包括具有非常长链长度和高水平多不饱和化的脂肪酸(例如EPA&DHA)，及具有在Δ12位的修饰的脂肪酸如环氧化(斑鸠菊酸)，羟基化(蓖麻油酸)，炔化(acetylenation)(还阳参油酸)和共轭(例如桐酸)。但是，无例外地观察到转基因种子油中的MFA的百分比比在脂肪酸修饰基因所来源的生物体中的积累水平(通常80-90％MFA)低得多。例如，表达外源Δ12-羟化酶的转基因烟草中蓖麻油酸(12-羟基-octadec-cis-9-enoic acid；12-OH 18:1Δ9)水平(＜1％)或者表达外源Δ12-羟化酶的转基因Arabidopsis中蓖麻油酸水平(高达17％)比获得所述羟化酶的天然蓖麻中的水平(Ricinus communis，高达90％蓖麻油酸)低得多(van de Loo，1995)。相似地，当克隆自Crepis palaestina的环氧化物酶(epoxygenase)在转基因Arabidopsis种子中表达时，种子油积累高达15％斑鸠菊酸(12，13-epoxy-9-octadecenoic acid)，相比之下在C.palaestina中为60％斑鸠菊酸(Lee et al.，1998)。相似地，在转基因种子中表达来自Crepis alpina的炔化酶(acetylenase)(Lee et al.，1998)、来自Morordica charantia和Impatiens balsamina的接合酶(conjugase)(Cahoon et al.，1999)、来自Calendula officinalis的接合酶(Qiu et al.，2001)和来自油桐树Aleurites fordii的双官能去饱和酶/接合酶(Dyer et al.，2002)之后观察到低水平的MFA。
考虑到这些数据的一致性，很清楚在积累高水平MFA的天然植物中有额外因素在起作用。还不知道这些因素是什么。已推测了一些因素，包括修饰脂肪酸对内源Δ12去饱和酶活性的抑制，因此降低了底物水平(Zhou et al.，2006)，具有对MFA的特异性的TAG组装基因的存在，修饰酶在内质网(ER)或者植物细胞中的其它区室的不同的亚细胞定位及组装，酶在天然植物中的更高的稳定性，或者MFA的有效合成及转移到TAG中需要合适的代谢环境(Dyer and Mullen，2008)。转基因中高水平MFA积累的失败可能是由于受体植物将MFA从膜脂质中去除及有效转移到TAG的能力差所致。
这些因素中的一些已经被实验测试，成功性一般。通过使用遗传背景针对底物水平而被优化的植物已经增加了产物水平，例如使用在FAD3和FAE1基因中具有突变而增加作为FA修饰酶的底物的亚油酸水平的Arabidopsis品系。FAD3和FAE1基因编码的酶否则将底物转向其它反应途径。或者，产物水平可以通过表达额外的外源Δ12去饱和酶基因而增加(Zhou et al.，2006)。Lu et al.(2006)筛选了来自蓖麻的基因的cDNA文库，以选择能增强在转基因Arabidopsis的种子油中的羟基脂肪酸积累的基因，鉴别了三个基因能提供产物水平的不多的增加。
但是，尽管这些努力，但是当异源基因在油料植物中表达时，MFA产物水平作为种子油中总脂肪酸的百分比仍保持在低于大约20％。因此，需要升高植物特别是在其种子中具有商业有用水平的油的植物的TAG中的MFA的水平。
发明概述
本发明人鉴别了生产具有至少23％种子油的脂肪酸含量包含修饰的脂肪酸的种子油的方法。
因此，在本发明第一方面，提供了生产种子油的方法，包括步骤：
i)获得在其种子油中具有一或多种修饰的脂肪酸的转基因种子，以及
ii)加工种子以提取种子油，
其中修饰的脂肪酸包含官能团，所述官能团是羟基、环氧基、炔基或者共轭双键，其中种子油脂肪酸含量的至少23％(mol％)包含所述官能团，和/或在种子油中具有所述官能团的脂肪酸与缺乏所述官能团的脂肪酸的摩尔比是至少23∶77。
优选地，种子来自任何芸苔(Brassica sp.)，Gossypium hirsutum，亚麻(Linum usitatissimum)，向日葵(Helianthus sp.)，红花(Carthamus tinctorius)，大豆(Glycine max)，玉蜀黍(Zea mays)或者拟南芥(Arabidopsis thaliana)。种子可以来自Crambe abyssinica，Camelina sativa，Cuphea sp，Vernonia galamensis或烟草(Nicotiana tabacum)。优选地，所述Brassica物种是Brassica napus，Brassica juncea，Brassica rapa或Brassica carinata。更优选地，种子来自亚麻或红花。在一个实施方案中，这种不是来自大豆或者拟南芥或者两者。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括收获种子。在进一步的实施方案中，加工种子包括粉碎种子和/或用有机溶剂提取种子油。在另一个实施方案中，所述方法包括纯化种子油，如通过使油脱胶或者澄清油以除去杂质或者化学处理油，如调整油的pH。所述方法可进一步包括分级分离油的步骤，以降低一些脂质成分或杂质的水平。
还提供了包含一或多种修饰的脂肪酸的转基因种子，所述修饰的脂肪酸包含官能团，所述官能团是羟基、环氧基、炔基或者共轭双键，其中种子油脂肪酸含量的至少23％(mol％)包含所述官能团，和/或在种子油中具有所述官能团的脂肪酸与缺乏所述官能团的脂肪酸的摩尔比是至少23∶77。
在另一方面，本发明提供了在其种子油中具有斑鸠菊酸和/或蓖麻油酸的转基因红花种子，其中种子油总脂肪酸含量的至少17％(mol％)是斑鸠菊酸和/或蓖麻油酸，且其中种子包含编码脂肪酸羟化酶或脂肪酸环氧化物酶的外源多核苷酸。
在另一方面，本发明提供了在其种子油中具有斑鸠菊酸和/或蓖麻油酸的转基因Gossypium hirsutum种子，其中种子油总脂肪酸含量的至少17％(mol％)是斑鸠菊酸和/或蓖麻油酸，且其中种子包含编码脂肪酸羟化酶或脂肪酸环氧化物酶的外源多核苷酸。
在另一方面，本发明提供了在其种子油中具有斑鸠菊酸和/或蓖麻油酸的转基因芸苔种子，其中种子油总脂肪酸含量的至少15％(mol％)是斑鸠菊酸和/或蓖麻油酸，且其中种子包含编码脂肪酸羟化酶或脂肪酸环氧化物酶的外源多核苷酸。
在另一方面，本发明提供了在其种子油中具有斑鸠菊酸和/或蓖麻油酸的转基因亚麻种子，其中种子油总脂肪酸含量的至少15％(mol％)是斑鸠菊酸和/或蓖麻油酸，且其中种子包含编码脂肪酸羟化酶或脂肪酸环氧化物酶的外源多核苷酸。
本发明的种子还可以进一步通过本文描述的有关生产种子的方法或者来自种子的种子油的特征进行限定，反之亦然。
在另一方面，本发明提供了产生本发明的种子的转基因植物。
在一个实施方案中，所述种子包含编码12去饱和酶的外源多核苷酸。
在进一步的实施方案中，少于4％(mol％)的种子油总脂肪酸含量是亚油酸。
在进一步的实施方案中，具有官能团的脂肪酸是C14，C16，C18，C20，C22或C24脂肪酸或者其任意两个或多个的组合。
在另一个实施方案中，具有官能团的脂肪酸主要是C18脂肪酸。
在进一步的实施方案中，C18脂肪酸是C18:1，C18:2或其组合。
在优选的实施方案中，具有官能团的脂肪酸是C18:1的12，13-环氧基衍生物或者C18:1的12-羟基衍生物。
在进一步优选的实施方案中，i)羟基基团与酰基链的碳-12键合，ii)环氧基基团或炔基基团在酰基链的碳12和13之间，或者iii)共轭双键在修饰的脂肪酸的酰基链的碳11和12之间。
优选地，转基因种子包含编码脂肪酸羟化酶、脂肪酸环氧化物酶、脂肪酸炔化酶(acetylenase)或者脂肪酸接合酶(conjugase)的外源多核苷酸。
优选地，转基因种子包含编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)，甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)、酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)、CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT)、磷脂酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)或者二酰基甘油:二酰基甘油酰基转移酶(DDAT)外源多核苷酸，或者其两或多种的组合。
在一个实施方案中，转基因种子包含编码DGAT，GPAT，LPAAT，LPCAT，PLA2，CPT和PDAT的一或多种外源多核苷酸。
在另一个实施方案中，转基因种子包含编码DGAT，GPAT，LPAAT，LPCAT，PLA2和PDAT的一或多种外源多核苷酸。
在另一个实施方案中，转基因种子包含编码GPAT，LPAAT，DGAT2和/或PDAT的一或多种外源多核苷酸。
在另一个实施方案中，转基因种子包含编码GPAT和LPAAT的一或多种外源多核苷酸。
在另一个实施方案中，转基因种子包含编码GPAT和DGAT2和/或DGAT3的一或多种外源多核苷酸。
在另一个实施方案中，转基因种子包含编码LPAAT和DGAT2和/或DGAT3的一或多种外源多核苷酸。
在另一个实施方案中，转基因种子包含编码GPAT，LPAAT和DGAT2和/或DGAT3的一或多种外源多核苷酸。
在另一个实施方案中，转基因种子进一步包含编码LPCAT和/或PLA2的一或多种外源多核苷酸。
在上述实施方案中，DGAT2和/或DGAT3可以用DDAT置换。
在另一个实施方案中，转基因种子进一步包含编码去饱和酶和/或延长酶的外源多核苷酸。
在进一步的实施方案中，去饱和酶是12去饱和酶。
优选地，转基因种子进一步包含导入的突变或者外源多核苷酸，所述外源多核苷酸下调种子的内源酶的产生和/或活性，所述内源酶选自DGAT，GPAT，LPAAT，LPCAT，PLA2，PLC，PLD，CPT，PDAT，DDAT，去饱和酶，或者延长酶或者其两种或多种的组合。
在一个实施方案中，所述去饱和酶是15去饱和酶。
在进一步的实施方案中，所述延长酶是延长C18脂肪酸的延长酶。
下调内源酶的产生和/或活性的外源多核苷酸包括但非限于反义多核苷酸、有义多核苷酸、催化多核苷酸、microRNA、编码结合所述内源酶的多肽的多核苷酸及双链RNA。
优选地，所述双链RNA(dsRNA)分子包含寡核苷酸，所述寡核苷酸包含编码所述内源酶的多核苷酸的至少19个连续核苷酸，其中该分子双链部分至少19个碱基对长并包含所述寡核苷酸。
在进一步的实施方案中，所述双链RNA从一个启动子表达，其中双链部分的链通过单链部分连接。
优选地，下调内源酶的产生和/或活性的外源多核苷酸不显著影响由种子中的转基因编码的酶的产生和/或活性。
优选地，对于种子产生的每种转基因多肽，直向同源内源多肽的水平和/或活性当与等基因非转基因种子相比时被下调。
在进一步的方面，本发明提供了包含一或多种修饰的脂肪酸的种子油，所述修饰的脂肪酸包含官能团，所述官能团是羟基、环氧基、炔基或者共轭双键，其中种子油脂肪酸含量的至少23％(mol％)包含所述官能团，和/或在种子油中具有所述官能团的脂肪酸与缺乏所述官能团的脂肪酸的摩尔比是至少23∶77。
优选地，种子油得自转基因种子。
优选地，种子来自芸苔，Gossypium hirsutum，亚麻，向日葵，红花，大豆，玉蜀黍或拟南芥。更优选地，种子来自亚麻或红花。
还提供了生产本发明种子的方法，包括生长本发明的植物并收获种子。
在另一方面，本发明提供了增强植物组织或器官中一或多种修饰的脂肪酸的产生的方法，所述方法包括在植物组织或器官中表达：
i)编码脂肪酸羟化酶、脂肪酸环氧化物酶、脂肪酸炔化酶、脂肪酸接合酶或其两种或多种的组合的第一外源多核苷酸，及
ii)编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)、甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)、酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)、CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT)、磷脂酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)或二酰基甘油:二酰基甘油酰基转移酶(DDAT)或其两种或多种的组合的第二外源多核苷酸，
其中所述修饰的脂肪酸包含官能团，所述官能团是羟基、环氧基、炔基或者共轭双键，其中产生的增强是这样的，在用氯仿/甲醇从所述组织或器官提取总脂肪酸后，在所述组织或器官的油中所述包含官能团的修饰的脂肪酸的水平作为植物组织或器官的总脂肪酸含量的百分比增加至少6％，并且其中所述至少6％的增加是相对于具有所述第一外源多核苷酸但是缺乏第二外源多核苷酸的相应组织或器官中的总脂肪酸水平而言。
优选地，植物组织或器官来自芸苔，Gossypium hirsutum，亚麻，向日葵，红花，大豆，玉蜀黍或拟南芥。更优选地，植物组织或器官来自亚麻或红花。
在另一方面，本发明提供了产生转基因细胞的方法，所述转基因细胞与等基因非转基因细胞相比具有增强的产生一或多种修饰的脂肪酸的能力，所述方法包括向细胞中导入：
i)编码脂肪酸羟化酶、脂肪酸环氧化物酶、脂肪酸炔化酶、脂肪酸接合酶或其两种或多种的组合的第一外源多核苷酸，
ii)编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)、甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)、酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)、CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT)、磷脂酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)或二酰基甘油:二酰基甘油酰基转移酶(DDAT)或其两种或多种的组合的第二外源多核苷酸，及
iii)分析细胞或其后代的与等基因非转基因细胞相比增强的产生修饰的脂肪酸的能力，
其中所述修饰的脂肪酸包含官能团，所述官能团是羟基、环氧基、炔基或者共轭双键，并且其中步骤i)和ii)可以同时进行或者以任何顺序相继进行。
本领域技术人员明白，步骤i)可以在步骤ii)之前进行，反之亦然。另外，可以提供两个以上外源多核苷酸以编码三或多种限定的酶。另外，一或多种外源多核苷酸可以存在于同一个连续多核苷酸分子中。
优选地，细胞是植物细胞或者适合发酵的细胞。
优选地，细胞是植物细胞，所述方法进一步包括产生转基因植物。
本领域技术人员明白，步骤iii)可包括分析包含所述细胞或其后代的组织、器官或者生物体。
优选地，所述方法进一步包括选择产生至少23％(mol％)的油的脂肪酸含量包含所述官能团的油的转基因细胞，和/或选择产生油中具有所述官能团的脂肪酸与缺乏所述官能团的脂肪酸的摩尔比是至少23∶77的油的转基因细胞。
还提供了用本发明方法获得的细胞或其后代。
在进一步的方面，本发明提供了产生转基因植物的方法，所述转基因植物与等基因非转基因植物相比具有增强的产生一或多种修饰的脂肪酸的能力，所述方法包括：
i)向第一植物细胞中导入编码脂肪酸羟化酶、脂肪酸环氧化物酶、脂肪酸炔化酶、脂肪酸接合酶或其两种或多种的组合的第一外源多核苷酸，
ii)向第二植物细胞中导入编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)、甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)、酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)、CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT)、磷脂酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)或二酰基甘油:二酰基甘油酰基转移酶(DDAT)或其两种或多种的组合的第二外源多核苷酸，
iii)从所述第一植物细胞产生包含所述第一外源多核苷酸的第一植物，
iv)从所述第二植物细胞产生包含所述第二外源多核苷酸的第二植物，及
v)将所述第一植物或其后代与所述第二植物或其后代杂交以产生包含所述第一外源多核苷酸和第二外源多核苷酸的植物，
其中所述修饰的脂肪酸包含官能团，所述官能团是羟基、环氧基、炔基或者共轭双键，并且其中步骤i)和ii)可以同时进行或者以任何顺序相继进行，步骤iii)和iv)可以同时进行或者以任何顺序相继进行。
优选地，所述方法进一步包括分析所述第一植物、第二植物、产生自步骤v)的植物和/或其后代的与等基因非转基因植物相比增强的产生修饰的脂肪酸的能力。
还提供了用本发明方法获得的植物或其后代植物。
在进一步的方面，本发明提供了生产包含一或多种修饰的脂肪酸的油的方法，所述方法包括在转基因细胞中表达：
i)编码脂肪酸羟化酶、脂肪酸环氧化物酶、脂肪酸炔化酶、脂肪酸接合酶或其两种或多种的组合的第一外源多核苷酸，及
ii)编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)、甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)、酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)、CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT)、磷脂酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)、二酰基甘油:二酰基甘油酰基转移酶(DDAT)或其两种或多种的组合的第二外源多核苷酸，
其中所述修饰的脂肪酸包含官能团，所述官能团是羟基、环氧基、炔基或者共轭双键。
优选地，所述细胞是植物细胞或者适合发酵的细胞。
优选地，所述方法进一步包括在转基因细胞中表达第三外源多核苷酸，所述第三外源多核苷酸下调选自GPAT、LPAAT、DGAT、LPCAT、PLA2、PLC、PLD、CPT、PDAT、DDAT，去饱和酶或延长酶或其两种或多种的组合的种子内源酶的产生和/或活性。
在进一步的方面，本发明提供了第一外源多核苷酸和第二外源多核苷酸在产生转基因细胞中的用途，所述第一外源多核苷酸编码脂肪酸羟化酶、脂肪酸环氧化物酶、脂肪酸炔化酶、脂肪酸接合酶或其两种或多种的组合，所述第二外源多核苷酸编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)、甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)、酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)、CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT)、磷脂酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)或其两种或多种的组合，所述转基因细胞当与等基因非转基因细胞相比时具有增强的产生一或多种修饰的脂肪酸的能力，其中所述修饰的脂肪酸包含官能团，所述官能团是羟基、环氧基、炔基或者共轭双键。
在进一步的方面，本发明提供了真核细胞，其包含编码多肽的外源多核苷酸，所述多肽是：
i)具有SEQ ID NO：1-42，98，99，102或103任一氨基酸序列的多肽，
ii)具有与SEQ ID NO：1-42，98，99，102或103任一或多个序列至少30％相同的氨基酸序列的多肽，和/或
iii)是i)或ii)的生物学片段的多肽。
优选地，所述多肽是二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)、甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)、酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)、CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT)、磷脂酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)、二酰基甘油:二酰基甘油酰基转移酶(DDAT)、环氧化物酶、酰基转移酶和/或磷脂酶。
优选地，所述细胞是植物细胞或适合发酵的细胞。
在另一方面，本发明提供了鉴别参与三酰基甘油合成的核酸分子的方法，包括：
i)获得与启动子可操纵连接的核酸分子，所述核酸分子编码多肽，所述多肽具有与SEQ ID NO：1-3，5-7，10-16，98，99，102或103任一或多个序列至少30％相同的氨基酸序列，
ii)将所述核酸分子导入所述启动子在其中有活性的细胞或者无细胞表达***，
iii)确定相对于导入所述核酸之前的细胞或无细胞表达***，三酰基甘油的产生是否被修饰，及
iv)任选地，选择修饰三酰基甘油的产生的核酸分子。
优选地，三酰基甘油包含修饰的脂肪酸，所述修饰的脂肪酸包含官能团，所述官能团是羟基、环氧基、炔基或者共轭双键或其两种或多种的组合。
优选地，所述核酸编码酶，所述酶具有甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)，1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)，二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)，磷脂酶C(PLC)，磷脂酶D(PLD)，CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT)磷脂酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)及二酰基甘油:二酰基甘油酰基转移酶(DDAT)的活性。
在进一步的方面，本发明提供了鉴别参与脂肪酸-CoA产生的核酸分子的方法，包括：
i)获得与启动子可操纵连接的核酸分子，所述核酸分子编码多肽，所述多肽具有与SEQ ID NO：4，8和9任一个或多个序列至少30％相同的氨基酸序列，
ii)将所述核酸分子导入所述启动子在其中有活性的细胞或者无细胞表达***，
iii)确定相对于导入所述核酸之前的细胞或无细胞表达***，脂肪酸-CoA和/或三酰基甘油的产生是否增强，及
iv)任选地，选择增强脂肪酸-CoA和/或三酰基甘油的产生的核酸分子。
优选地，脂肪酸-CoA和/或三酰基甘油包括修饰的脂肪酸，所述修饰的脂肪酸包含官能团，所述官能团是羟基、环氧基、炔基或者共轭双键或其两种或多种的组合。
优选地，所述核酸编码具有选自酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)和磷脂酶A2(PLA2)的活性的酶。
在另一方面，本发明提供了鉴别参与脂肪酸修饰的核酸分子的方法，包括：
i)获得与启动子可操纵连接的核酸分子，所述核酸分子编码多肽，所述多肽具有与SEQ ID NO：21-24任一个或多个序列至少30％相同的氨基酸序列，
ii)将所述核酸分子导入所述启动子在其中有活性的细胞或者无细胞表达***，
iii)确定相对于导入所述核酸之前的细胞或无细胞表达***，脂肪酸组成是否被修饰，及
iv)任选地，选择修饰脂肪酸组成的核酸分子。
优选地，脂肪酸包含官能团，所述官能团是羟基、环氧基、炔基或者共轭双键或其两种或多种的组合。
优选地，所述核酸编码具有选自环氧化物酶或12去饱和酶的活性的酶。
在进一步的方面，本发明提供了鉴别编码酰基转移酶或脂肪酶的核酸分子的方法，包括：
i)获得与启动子可操纵连接的核酸分子，所述核酸分子编码多肽，所述多肽具有与SEQ ID NO：1-20，25-42，98，99，102或103任一个或多个序列至少30％相同的氨基酸序列，
ii)将所述核酸分子导入所述启动子在其中有活性的细胞或者无细胞表达***，
iii)确定相对于导入所述核酸之前的细胞或无细胞表达***，脂肪酸组成如脂肪酸-CoA:脂肪酸-PC:三酰基甘油的比率是否被修饰，及
iv)任选地，选择修饰脂肪酸组成的核酸分子。
在一个实施方案中，脂肪酶活性是磷脂酶活性。
在另一方面，本发明提供了基本上纯化的和/或重组的多肽，其具有SEQID NO：1-42，98，99，102或103任一氨基酸序列，其生物学活性片段，或者具有与SEQ ID NO：1-42，98，99，102或103任一个或多个序列至少30％相同的氨基酸序列。
优选地，所述多肽是二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)、甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)、酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)、CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT)、磷脂酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)、二酰基甘油:二酰基甘油酰基转移酶(DDAT)、脂肪酸环氧化物酶、酰基转移酶和/或磷脂酶。
优选地，所述多肽在第一酯化脂肪酸底物上具有增强的酶活性，所述底物包含一条、二条或三条酰基链，每条链可以相同或不同，其中一条、二条或三条底物酰基链包含官能团，所述官能团是是羟基、环氧基、炔基或者共轭双键或其两种或多种的组合，其中增强的活性是相对于缺乏所述官能团的另一个相应的酯化脂肪酸底物而言。
优选地，所述第一酯化脂肪酸底物是包含所述官能团的酰基-CoA底物或者在sn-2位置酯化的酰基链上包所述含官能团的磷脂酰胆碱二酰基甘油底物。
在一个实施方案中，多肽可以纯化自Bernardia sp，特别是Bernardia pulchella。
所述多肽可以是进一步包含至少一种其它多肽序列的融合蛋白。所述至少一种其它多肽可以是增强本发明多肽的稳定性的多肽或者有助于融合蛋白纯化的多肽。
在另一方面，本发明提供了分离的和/或外源的多核苷酸，其包含：
i)选自SEQ ID NO：43-85，100，101，104或105中的任一个的核苷酸序列，
ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
iii)与SEQ ID NO：43-85，100，101，104或105的一或多个序列的蛋白质编码区至少30％相同的核苷酸序列，和/或
iv)在严格条件下与i)-iii)的任一个序列杂交的序列。
本发明还提供了包含编码多核苷酸的嵌合载体。优选地，所述多核苷酸可操纵地与启动子连接。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含本发明的重组多肽、本发明的外源多核苷酸和/或本发明的载体的细胞。
所述细胞可以是任何类型的细胞，优选地，植物、真菌、酵母、细胞或者动物细胞。
优选地，所述细胞不天然包含所述多肽、多核苷酸和/或载体。
在进一步的方面，本发明提供了产生本发明多肽的方法，所述方法包括在细胞或无细胞表达***中表达本发明的载体。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括分离所述多肽。
在另一方面，本发明提供了包含本发明的细胞的转基因非人生物体。
优选地，所述生物体是转基因的植物或适合发酵的生物体如酵母或真菌。
还提供了包含本发明的细胞的种子。
在另一方面，本发明提供了生产种子的方法，所述方法包括：
a)生长本发明的植物，及
b)收获种子。
在另一方面，本发明提供了生产含有修饰的脂肪酸的油的方法，所述方法包括从本发明种子、本发明植物、本发明细胞和/或本发明的转基因非人生物体中提取油。
在一个实施方案中，所述细胞是适合发酵的生物体的细胞，所述方法进一步包括将细胞暴露于至少一种脂肪酸前体。
在进一步的方面，本发明提供了发酵方法，包括步骤：
i)提供含有液体组合物的容器，所述液体组合物包含本发明的细胞或者适合发酵的含所述细胞的生物体及发酵和脂肪酸生物合成所需的组分，及
ii)提供适于所述容器中含有的液体组合物的发酵的条件。
在另一方面，本发明提供了生产修饰的脂肪酸的方法，所述方法包括将与磷脂酰胆碱、甘油或CoA酯化的脂肪酸与本发明多肽接触。
在进一步的方面，本发明提供了生产脂肪酸-CoA的方法，所述方法包括将与磷脂酰胆碱酯化的脂肪酸与本发明多肽接触。
在另一方面，本发明提供了进行环氧化物酶反应的方法，所述方法包括将脂肪酸与本发明多肽接触。
在另一方面，本发明提供了进行去饱和酶反应的方法，所述方法包括将脂肪酸与本发明多肽接触。
优选地，所述脂肪酸与CoA酯化。
在另一方面，本发明提供了进行酰基转移酶的方法，所述方法包括将脂肪酸与本发明多肽接触。
在另一方面，本发明提供了进行磷脂酶的方法，所述方法包括将脂肪酸与本发明多肽接触。
在另一方面，本发明提供了油或脂肪酸，其产自或者得自本发明的种子、本发明的植物、本发明的细胞和/或本发明的转基因非人生物体。
在另一方面，本发明提供了来自本发明的种子、本发明的植物、本发明的细胞和/或本发明的转基因非人生物体的提取物，其中所述提取物包含相对于来自等基因非转基因种子、植物、细胞或转基因非人生物体的相应提取物而言增加的修饰的脂肪酸水平。
在另一方面，本发明提供了特异结合本发明多肽的基本上纯化的抗体或其片段。
在另一方面，本发明提供了本发明的种子、本发明的植物、本发明的种子油、本发明的细胞、本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的转基因非人生物体、本发明的油、本发明的脂肪酸和/或本发明的提取物在制造工业产品中的用途。
还提供了组合物，其包含本发明的种子、本发明的植物、本发明的种子油、本发明的细胞、本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的转基因非人生物体、本发明的油、本发明的脂肪酸、本发明的提取物和/或本发明的抗体，及合适的载体。
在另一方面，本发明提供了鉴别多核苷酸的方法，所述的多核苷酸当存在于植物细胞中时，与缺乏所述多核苷酸的等基因细胞相比增强一或多种修饰的脂肪酸的产生，所述方法包括：
i)获得细胞中存在的编码参与三酰基甘油合成的多肽的基因的至少一部分的第一核苷酸序列，
ii)将所述第一核苷酸序列与第二核苷酸序列相比较以鉴别在所述第一和第二核苷酸序列之间不保守的区域，
iii)设计候选多核苷酸以下调细胞中所述多肽的活性水平，
iv)确定候选多肽下调细胞中所述多肽的活性水平的能力，及
v)选择下调细胞中所述多肽的活性水平的多核苷酸，
其中所述第二核苷酸序列来自不同植物物种但是编码具有与所述基因类似功能的多肽。
在一个实施方案中，步骤ii)包括将第一和第二核苷酸序列的3′非翻译区进行比较。
优选地，所述基因来自芸苔，Gossypium hirsutum，亚麻，向日葵，红花，大豆，Zea mays或拟南芥。更优选地，所述基因来自亚麻或红花。
在一个实施方案中，所述第二核苷酸序列包含SEQ ID NO 43-85，100，101，104或105提供的序列，或者其长度至少为19个核苷酸的片段。
很清楚，本发明一个方面的优选特征适用于本发明的许多其它方面。特别是，产生油、种子及包含所述种子的植物的实施方案相等适用于每个方面。
在说明书中，词语“包含、包括(comprise)”应理解为包括所述元件、整数或步骤，或者元件、整数或步骤的组，但不排除其它元件、整数或步骤，或者元件、整数或步骤的组。
本发明参照下述非限制性实施例和附图进行描述。
附图简述
图1.在PC上被修饰的脂肪酸可以被转移到TAG上的代谢途径示意图。
图2.三酰基甘油生物合成示意图。
序列表要点
SEQ ID NO：1-Bernardia pulchella二酰基甘油酰基转移酶2(DGAT2)的氨基酸序列
SEQ ID NO：2-Bernardia pulchella二酰基甘油酰基转移酶1(DGAT1)的氨基酸序列
SEQ ID NO：3-Bernardia pulchella二酰基甘油酰基转移酶3(DGAT3)的氨基酸序列
SEQ ID NO：4-Bernardia pulchella磷脂酶A2(PLA2)的氨基酸序列
SEQ ID NO：5-Euphorbia lagascae磷脂酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)的氨基酸序列
SEQ ID NO：6-Bernardia pulchella磷脂酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)的氨基酸序列
SEQ ID NO：7-Bernardia pulchella CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT)的氨基酸序列
SEQ ID NO：8-Bernardia pulchella酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶1(LPCAT1)的氨基酸序列
SEQ ID NO：9-Bernardia pulchella酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶2(LPCAT2)的氨基酸序列
SEQ ID NO：10-Bernardia pulchella磷脂酶C-a(PLC-a)的氨基酸序列
SEQ ID NO：11-Bernardia pulchella磷脂酶C-b(PLC-b)的氨基酸序列
SEQ ID NO：12-Bernardia pulchella磷脂酶C-c(PLC-c)的部分氨基酸序列
SEQ ID NO：13-Bernardia pulchella磷脂酶C-d(PLC-d)的部分氨基酸序列
SEQ ID NO：14-Bernardia pulchella磷脂酶Dα1(PLDα1)的氨基酸序列
SEQ ID NO：15-Bernardia pulchella甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)的氨基酸序列
SEQ ID NO：16-Bernardia pulchella 1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)的氨基酸序列
SEQ ID NO：17-Bernardia pulchella酰基转移酶1(AT1)的氨基酸序列
SEQ ID NO：18-Bernardia pulchella酰基转移酶2(AT2)的氨基酸序列
SEQ ID NO：19-Bernardia pulchella酰基转移酶3(AT3)的氨基酸序列
SEQ ID NO：20-Bernardia pulchella酰基转移酶4(AT4)的氨基酸序列
SEQ ID NO：21-Bernardia pulchella环氧化物酶-样蛋白的部分氨基酸序列
SEQ ID NO：22-Bernardia pulchella  12去饱和酶的氨基酸序列
SEQ ID NO：23-Bernardia pulchella  12去饱和酶，或FAD2样蛋白2的部分氨基酸序列.
SEQ ID NO：24-Bernardia pulchella  12去饱和酶，或FAD2样蛋白3的氨基酸序列
SEQ ID NO：25-Bernardia pulchella酰基转移酶样蛋白1的部分氨基酸序列
SEQ ID NO：26-Bernardia pulchella酰基转移酶样蛋白2的部分氨基酸序列
SEQ ID NO：27-Bernardia pulchella酰基转移酶样蛋白3的部分氨基酸序列
SEQ ID NO：28-Bernardia pulchella 3-酮酰基-CoA合酶4样蛋白的部分氨基酸序列
SEQ ID NO：29-Bernardia pulchella二酰基甘油酰基转移酶样蛋白的部分氨基酸序列.
SEQ ID NO：30-Bernardia pulchella磷脂酶-a(PL-a)的氨基酸序列
SEQ ID NO：31-Bernardia pulchella磷脂酶-b(PL-b)的部分氨基酸序列
SEQ ID NO：32-Bernardia pulchella磷脂酶-c(PL-c)的部分氨基酸序列
SEQ ID NO：33-Bernardia pulchella脂肪酶-d(L-d)的部分氨基酸序列
SEQ ID NO：34-Bernardia pulchella脂肪酶-e(L-e)的部分氨基酸序列
SEQ ID NO：35-Bernardia pulchella脂肪酶-f(L-f)的部分氨基酸序列
SEQ ID NO：36-Bernardia pulchella脂肪酶-g(L-g)的部分氨基酸序列
SEQ ID NO：37-Bernardia pulchella脂肪酶-h(L-h)的部分氨基酸序列
SEQ ID NO：38-Bernardia pulchella脂肪酶-i(L-i)的氨基酸序列
SEQ ID NO：39-Bernardia pulchella酯酶/脂肪酶/硫酯酶样家族蛋白的部分氨基酸序列
SEQ ID NO：40-Bernardia pulchella GDSL-基序脂肪酶/水解酶样蛋白1的部分氨基酸序列
SEQ ID NO：41-Bernardia pulchella GDSL-基序脂肪酶/水解酶样蛋白2的部分氨基酸序列
SEQ ID NO：42-Bernardia pulchella GDSL-基序脂肪酶/水解酶样蛋白3的部分氨基酸序列
SEQ ID NO：43-Bernardia pulchella二酰基甘油酰基转移酶2(DGAT2)的cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸232至1210
SEQ ID NO：44-Bernardia pulchella二酰基甘油酰基转移酶1(DGAT1)的cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸75至1727
SEQ ID NO：45-Bernardia pulchella二酰基甘油酰基转移酶3(DGAT3)的cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸73至1062
SEQ ID NO：46-Bernardia pulchella磷脂酶A2(PLA2)的cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸71至535
SEQ ID NO：47-Euphorbia lagascae磷脂酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)的cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸266至1801
SEQ ID NO：48-Bernardia pulchella磷脂酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)的cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸208至2256
SEQ ID NO：49-Bernardia pulchella CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT)的cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸514至1683
SEQ ID NO：50-Bernardia pulchella酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶1(LPCAT1)的cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸58至1437
SEQ ID NO：51-Bernardia pulchella酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶2(LPCAT2)的cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸139至1539
SEQ ID NO：52-Bernardia pulchella磷脂酶C-a(PLC-a)的cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸12至968
SEQ ID NO：53-Bernardia pulchella磷脂酶C-b(PLC-b)的cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸34至1299
SEQ ID NO：54-Bernardia pulchella磷脂酶C-c(PLC-c)的部分cDNA，蛋白质编码序列直至并包括核苷酸498
SEQ ID NO：55-Bernardia pulchella磷脂酶C-d(PLC-d)的部分cDNA，蛋白质编码序列直至并包括核苷酸334.
SEQ ID NO：56-Bernardiapulchella磷脂酶Dα1(PLDα1)的cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸125至2548
SEQ ID NO：57-Bernardia pulchella甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)的cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸29至1534
SEQ ID NO：58-Bernardia pulchella 1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)的cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸14至1393.
SEQ ID NO：59-Bernardiapulchella酰基转移酶1(AT1)的cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸99至1607.
SEQ ID NO：60-Bernardia pulchella酰基转移酶2(AT2)的cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸71至1393
SEQ ID NO：61-Bernardia pulchella酰基转移酶3(AT3)的cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸34至1419.
SEQ ID NO：62-Bernardia pulchella酰基转移酶4(AT4)的cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸45至1569.
SEQ ID NO：63-Bernardia pulchella环氧化物酶样蛋白的部分cDNA，蛋白质编码序列直至并包括核苷酸588.
SEQ ID NO：64-Bernardia pulchella  12去饱和酶的cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸117至1268.
SEQ ID NO：65-Bernardia pulchella FAD2样蛋白2的部分cDNA，蛋白质编码序列直至并包括核苷酸939.
SEQ ID NO：66-Bernardia pulchella FAD2样蛋白3的cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸111至1262.
SEQ ID NO：67-Bernardia pulchella酰基转移酶样蛋白1的部分cDNA，蛋白质编码序列直至并包括核苷酸176.
SEQ ID NO：68-Bernardia pulchella酰基转移酶样蛋白2的部分cDNA，蛋白质编码序列直至并包括核苷酸257.
SEQ ID NO：69-Bernardia pulchella酰基转移酶样蛋白3的部分cDNA，蛋白质编码序列直至并包括核苷酸77.
SEQ ID NO：70-Bernardia pulchella 3-酮酰基-CoA合酶4样蛋白的部分cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸94开始.
SEQ ID NO：71-Bernardia pulchella二酰基甘油酰基转移酶样蛋白的部分cDNA，蛋白质编码序列直至并包括核苷酸588.
SEQ ID NO：72-Bernardia pulchella磷脂酶-a(BpPL-a)的cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸17至1567.
SEQ ID NO：73-Bernardia pulchella磷脂酶-a(BpPL-a)的部分cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸1至674，包括一内含子.
SEQ ID NO：74-Bernardia pulchella磷脂酶-b(BpPL-b)的部分cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸134开始.
SEQ ID NO：75-Bernardia pulchella磷脂酶-c(BpPL-c)的部分cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸117开始
SEQ ID NO：76-Bernardia pulchella脂肪酶-d(BpL-d)的部分cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸200开始.
SEQ ID NO：77-Bernardia pulchella脂肪酶-e(BpL-e)的部分cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸224开始.
SEQ ID NO：78-Bernardia pulchella脂肪酶-f(BpL-f)的cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸15至1133.
SEQ ID NO：79-Bernardia pulchella脂肪酶-g(BpL-g)的部分cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸1至842.
SEQ ID NO：80-Bernardia pulchella脂肪酶-h(BpL-h)的部分cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸1至482
SEQ ID NO：81-Bernardia pulchella脂肪酶-i(BpL-i)的cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸410开始.
SEQ ID NO：82-Bernardia pulchella酯酶/脂肪酶/硫酯酶样家族蛋白的部分cDNA，蛋白质编码序列直至并包括核苷酸396.
SEQ ID NO：83-Bernardia pulchella GDSL-motif脂肪酶/水解酶样蛋白1的部分cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸244开始.
SEQ ID NO：84-Bernardia pulchella GDSL-基序脂肪酶/水解酶样蛋白2的部分cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸48开始
SEQ ID NO：85-Bernardia pulchella GDSL-基序脂肪酶/水解酶样蛋白3的部分cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸62开始
SEQ ID NO：86-97-寡核苷酸引物.
SEQ ID NO：98-Bernardia pulchella 1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)2的氨基酸序列.
SEQ ID NO：99-Bernardia pulchella 1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)3的氨基酸序列.
SEQ ID NO：100-Bernardia pulchella 1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)2的cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸80至1219.
SEQ ID NO：101-Bernardia pulchella 1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)3的cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸11至1064.
SEQ ID NO：102-Bernardia pulchella二酰基甘油酰基转移酶样蛋白的氨基酸序列.
SEQ ID NO：103-Bernardia pulchella二酰基甘油酰基转移酶样蛋白的氨基酸序列，SEQ ID NO：102的变体.
SEQ ID NO：104-Bernardia pulchella二酰基甘油酰基转移酶样蛋白的cDNA，蛋白质编码序列从核苷酸7至984.
SEQ ID NO：105-Bernardia pulchella二酰基甘油酰基转移酶样蛋白的cDNA，SEQ ID NO：104的变体，蛋白质编码序列从核苷酸63至1040.
发明详细描述
一般技术及定义
除非特别指出，本文使用的所有技术和学术术语均采用本领域(例如细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学、脂肪酸化学及生物化学)技术人员通常已知的含义。
除非特别指出，则本发明中利用的重组蛋白质、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员熟知的标准方法。这种技术在文献中描述和阐述，如J.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley and Sons(1984)、J.Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)、T.A.Brown(editor)、Essential Molecular Biology：A Practical Approach，Volumes 1 and 2，IRL Press(1991)、D.M.Glover and B.D.Hames(editors)，DNA Cloning：A Practical Approach，Volumes 1-4，IRL Press(1995 and 1996)以及F.M.Ausubel et al.(editors)，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括迄今为止的所有补充资料)、Ed Harlow and David Lane(editors)Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory，(1988)以及J.E.Coligan et al.(editors)Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons(包括迄今为止的所有补充资料)。
选择的定义
如本文所用，术语“种子油”是指得自植物种子/谷粒的组合物，其包含至少60％(w/w)的脂质。种子油在室温典型是液体。优选地，所述脂质主要(＞50％)包含长度为至少16个碳的脂肪酸。更优选地，种子油中总脂肪酸的至少50％是C18脂肪酸。所述脂肪酸典型是酯化形式，例如三酰基甘油、酰基-CoA或者磷脂。所述脂肪酸可以是游离脂肪酸和/或是酯化形式如三酰基甘油(TAG)。在一个实施方案中，本发明的种子油中至少50％、优选至少70％、更优选至少80％或者至少90％的脂肪酸可以是TAG。本发明的种子油可以是谷粒/种子或者其一部分的组成部分。或者，本发明的种子油从谷粒/种子种提取。因此，在一个实施方案中，本发明的“种子油”是“基本纯化的”或者“纯化的”油，其已经从自然状态与其关联的一或多种其它脂质、核酸、多肽或者其它污染分子中分离。优选基本纯化的油是至少60％、优选至少75％、更优选至少90％不存在与其自然关联的其它成分。本发明的种子油可进一步包含非脂肪酸分子，例如但不限于甾醇。在一个实施方案中，所述种子油是芥花籽油(Brassica napus，Brassica rapa ssp.)、芥子油(Brassica juncea)、其它Brassica油、葵花籽油(Helianthus annus)、亚麻籽油(Linum usitatissimum)、大豆油(Glycine max)、红花油(Carthamus tinctorius)、玉米油(Zea mays)、烟草油(Nicotiana tabacum)、花生油(Arachis hypogaea)、棕榈油、棉花籽油(Gossypium hirsutum)、椰子油(Cocos nucifera)、鳄梨油(Persea americana)、橄榄油(Olea europaea)、腰果油(Anacardium occidentale)、澳洲坚果油(Macadamia intergrifolia)、杏仁油(Prunus amygdalus)或者Arabidopsis种子油(拟南芥)。种子油可以通过本领域已知的任何方法从种子中提取。这典型包括用非极性溶剂提取，所述溶剂如二***、石油醚、氯仿/甲醇或者丁醇混合物。与谷粒中淀粉相关的脂质可以用水饱和丁醇提取。所述种子油可以通过本领域已知的方法“脱胶”以除去多糖，或者通过其它方式处理以除去污染物或者改善纯度、稳定性或者色泽。所述油中三酰基甘油及其它酯可以被水解以释放游离脂肪酸放，或者所述油氢化或者通过本领域已知的化学或者酶方法处理。
如本文所用，术语“油”是指包含至少60％(w/w)脂质的组合物。油在室温下典型是液体。优选地，所述脂质主要包含长度为至少16个碳的脂肪酸。所述脂肪酸典型是酯化形式，例如三酰基甘油、酰基-CoA或者磷脂。属脂肪酸可以是游离脂肪酸和/或三酰基甘油(TAG)。在一个实施方案中，本发明的油中至少50％、优选至少70％、更优选至少80％的脂肪酸可以是TAG。本发明的“油”如果得自种子则可以是“种子油”。油可以存在于或者得自出了种子之外的细胞、组织、器官或生物体中，在这种情况中所述油不是本文定义的种子油。
如本文所用，术语“脂肪酸”是指羧酸(或者有机酸)，通常具有长的脂肪族尾部，是饱和或者不饱和的。典型地，脂肪酸具有长度为至少8个碳原子的碳-碳键的链，优选长度为至少12个碳原子。最天然发生的脂肪酸具有偶数数目的碳原子，因为其生物合成包含具有两个碳原子的乙酸酯。脂肪酸可以是游离状态(非酯化)或者是酯化形式如结合的三酰基甘油、二酰基甘油酯、一酰基甘油酯、酰基-CoA(硫酯)或者其它结合形式。脂肪酸可以酯化为磷脂如卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或者双磷脂酰甘油形式。术语“脂肪酸(单数)”与“脂肪酸(复数)”通常可互换使用，然而技术人员意识到种子油包含一个以上的脂肪酸分子，通常包含一种类型以上的脂肪酸。
三酰基甘油(TAG)是其中甘油用三个脂肪酸酯化的甘油酯。在TAG合成的Kennedy途径中，前体sn-甘油-3-磷酸在由甘油-3-磷酸酰基转移酶催化的反应中在sn-1位置由脂肪酸辅酶A酯化，形成溶血磷脂酸(LPA)，其随后由乙酰甘油磷酸酰基转移酶在位置sn-2酰化形成磷脂酸。磷酸盐基团通过磷脂酸磷脂酶除去，所得的1，2-二酰基-sn-甘油(DAG)通过二酰基甘油酰基转移酶酰化形成三酰基-sn-甘油。
“修饰的脂肪酸”是指包含官能团的脂肪酸，所述官能团是羟基、环氧基、炔基(acetylenic group)或者共轭双键。这些类型的基团为本领域熟知，羟基包含氧原子和氢原子，其共价结合脂肪酸的碳链的碳基团；环氧基是三个成员的环，包含两个碳原子和一个氧原子；炔基包含脂肪酸碳链中两个碳之间的三键；共轭双键是与另一单键和多键(例如双键)共价结合的原子***如-C＝C-C＝C-C-。
斑鸠菊酸是顺式-12，13-环氧基-十八碳-顺式-9-烯酸(cis-12，13-epoxy-octadec-cis-9-enoid-acid)，而蓖麻油酸是12-羟基-9-顺式-十八碳烯酸(12-hydroxy-9-cis-octadecenoic acid)。优选地，这些修饰的脂肪酸组成TAG的一部分。如本文所用，bi-vernoleate和tri-vernoleate分别是指包含两个和三个vernolic fatty的TAG。此外，双-蓖麻醇酸酯和三-蓖麻醇酸酯分别是指包含两个和三个蓖麻油酸的TAG。
如本文所用，“三酰基甘油的产生被修饰”是相对术语，是指产生的TAG总量被修饰和/或产生的TAG的化学成分被修饰。在优选的实施方案中，使用本发明的方法鉴别的核酸编码增加包含修饰的脂肪酸的TAG产生的多肽。在优选的实施方案中，所述产生被增强，由此包含官能团的修饰的脂肪酸的水平在用氯仿/甲醇提取总脂肪酸之后作为总脂肪酸含量百分比增加至少6％。
如本文所用，“脂肪酸-CoA和/或三酰基甘油的产生增加”是相对术语，是指产生的脂肪酸-CoA和/或TAG总量增加。在优选的实施方案中，使用本发明的方法鉴别的核酸编码增加包含修饰的脂肪酸的脂肪酸-CoA和/或TAG产生的多肽。
如本文所用，“脂肪酸组成成分被修饰”是相对术语，是指产生的脂肪酸总量被修饰和/或产生的脂肪酸的化学成分被修饰。在优选的实施方案中，使用本发明的方法鉴别的核酸编码增加包含修饰的脂肪酸的脂肪酸产生的多肽。更优选地，使用本发明的方法鉴别的核酸编码增加包含修饰的脂肪酸的TAG产生的多肽。此外，当所述核酸编码酰基转移酶或者磷酸脂肪酶时，优选脂肪酸-CoA:脂肪酸-PC:三酰基甘油的比率被相对修饰，特别优选当与脂肪酸-PC对比时TAG的相对数量增加。
如本文所用，术语“具有增强的产生一或多种修饰的脂肪酸的能力的转基因细胞”是相对术语，其中本发明的转基因细胞与天然细胞对比，转基因细胞产生更多的修饰的脂肪酸，或者更高浓度的以TAG存在的修饰的脂肪酸(相对于其它脂肪酸)。
如本文所用，术语“主要的C18脂肪酸”是指种子油或者种子中至少50％、优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％以及更优选至少90％的脂肪酸是三酰基甘油、二酰基甘油酯和/或一酰基甘油酯如C18脂肪酸或者其衍生物如本文定义的修饰的脂肪酸，和/或不饱和脂肪酸如C18:1和/或C18:2。
“饱和的脂肪酸”沿着链不含有任何双键或者其它官能团。术语“饱和的”是指氢而言，在所有碳中(除了羧酸[-COOH]基团之外)含有尽可能多的氢。换句话说，omega(ω)末端含有3个氢(CH3-)，链内的每个碳含有2个氢(-CH2-)。
“不饱和的脂肪酸”是饱和脂肪酸的相似形式，不同之处是沿着链存在一或多个链烯官能团，每个链烯取代具有双键合“-CH＝CH-”部分(即与另一碳双键合的碳)的链中单键合的“-CH2-CH2-”部分。与双键的每一侧结合的两个接下来的碳原子可以顺式或者反式构型存在。
如本文所用，术语“单不饱和脂肪酸”是指任何这样的脂肪酸，在其碳链中包含至少12个碳原子，且链中仅一个链烯基团。如本文所用，术语“多不饱和脂肪酸”或者“PUFA”是指这样的脂肪酸，在其碳链中包含至少12个碳原子及至少两个链烯基团(碳-碳双键)。通常地，脂肪酸碳链中碳原子的数目是针对不分支的碳链。如果碳链是分支的，则碳原子的数目不包括侧链基团(sidegroups)中那些。在一个实施方案中，长链多不饱和脂肪酸是ω3脂肪酸，即在从脂肪酸的甲基末端第三个碳-碳键中具有去饱和(碳-碳双键)。在另一个实施方案中，长链多不饱和脂肪酸是ω6脂肪酸，即在脂肪酸的甲基末端第六个碳-碳键中具有去饱和(碳-碳双键)。
如本文所用，术语“长链多不饱和脂肪酸”或者“LC-PUFA”是指这样的脂肪酸，在其碳链中包含至少20个碳原子及至少两个碳-碳双键。
如本文使用，术语“环氧化物酶”或者“脂肪酸环氧化物酶”是指这样的酶，其将环氧基导入脂肪酸中导致环氧基脂肪酸产生。在优选的实施方案中，环氧基被导入在脂肪酸链上的第12个碳原子，在这种情况中，环氧化物酶是Δ12-环氧化物酶，特别是C16或者C18脂肪酸链。所述环氧化物酶可以是Δ9-环氧化物酶、Δ15环氧化物酶，或者在本领域已知的酰基链中的不同位置起作用。所述环氧化物酶可以是P450类别。优选的环氧化物酶是如WO98/46762所述的单加氧酶类别。许多环氧化物酶或者推定的环氧化物酶已经被克隆且为本领域已知。环氧化物酶的进一步实例包括包含SEQ ID NO：21所示氨基酸序列的蛋白质，由来自Crepis paleastina(Accession No.CAA76156，Lee et al.，1998)、Stokesia laevis(AAR23815，Hatanaka et al.，2004)(单加氧酶型)，Euphorbia lagascae(AAL62063)(P450型)的基因编码的多肽，人CYP2J2(花生四烯酸环氧化物酶，U37143)；人CYPIA1(花生四烯酸环氧化物酶，K03191)，以及其变体和/或突变体。
如本文所用，“羟化酶”或者“脂肪酸羟化酶”是指这样的酶，其将羟基基团导入脂肪酸中，导致羟化脂肪酸产生。在优选的实施方案中，羟基被导入在C18脂肪酸链上第2、12和/或17个碳原子。优选地，羟基被导入在第12个碳原子，在这种情况中，羟化酶是Δ12-羟化酶。在另一优选的实施方案中，羟基被导入在C16脂肪酸链上的第15个碳原子。羟化酶也可以具有脂肪酸去饱和酶活性。举例的编码Δ12-羟化酶的基因包括来自如下的那些基因：Ricinus communis(AAC9010，van de Loo 1995)，Physaria lindheimeri(ABQ01458，Dauk et al.，2007)，Lesquerella fendleri(AAC32755，Broun et al.，1998)，Daucus carota(AAK30206)，脂肪酸羟化酶，其使脂肪酸的末端羟化，例如：A，thaliana CYP86A1(P48422，脂肪酸ω-羟化酶)，Vicia sativa CYP94A1(P98188，脂肪酸ω-羟化酶)，小鼠CYP2E1(X62595，十二酸ω-1羟化酶)，大鼠CYP4A1(M57718，脂肪酸ω-羟化酶)，以及其变体和/或突变体。
如本文所用，术语“结合酶”或者“脂肪酸结合酶”是指在脂肪酸的酰基链中能形成共轭键的酶。举例的结合酶包括有来自如下的那些基因编码的那些结合酶：Calendula officinalis(AF343064，Qiu et al.，2001)，Vernicia fordii(AAN87574，Dyer et al.，2002)，Punica granatum(AY178446，Iwabuchi et al.，2003)和Trichosanthes kirilowii(AY178444，Iwabuchi et al.，2003)，以及其变体和/或突变体。
如本文所用，术语“炔化酶(acetylenase)”或者“脂肪酸炔化酶”是指这样的酶，其在脂肪酸中导入三键，导致乙炔脂肪酸产生。在优选的实施方案中，所述三键被导入在C18脂肪酸链的第2、6、12和/或17个碳原子。举例的炔化酶包括来自Helianthus annuus(AA038032，ABC59684)的那些炔化酶，以及其变体和/或突变体。
如本文所用，术语“二酰基甘油酰基转移酶”(EC 2.3.1.20；DGAT)是指这样的蛋白质，其将脂肪酰基从酰基-CoA或者二酰基甘油转移至二酰基甘油底物，产生三酰基甘油。因此，术语“二酰基甘油酰基转移酶活性”是指将酰基转移至二酰基甘油产生三酰基甘油。有三种已知类型的DGAT，分别称作DGAT1、DGAT2和可溶DGAT(DGAT3)。DGAT1多肽典型具有10个跨膜结构域，DGAT2典型具有2个跨膜结构域，而DGAT3典型是可溶的。举例的DGAT1多肽包括包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质，由来自如下的DGAT1基因编码的多肽：Aspergillus fumigatus(Accession No.XP_755172)、拟南芥(CAB44774)、Ricinus communis(AAR11479)、Vernicia fordii(ABC94472)、Vernonia galamensis(ABV21945，ABV21946)、Euonymus alatus(AAV31083)、Caenorhabditis elegans(AAF82410)、Rattus norvegicus(NP_445889)、Homo sapiens(NP_036211)，以及其变体和/或突变体。举例的DGAT2多肽包括包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质，由来自如下的DGAT2基因编码的多肽：拟南芥(Accession No.NP_566952)、Ricinus communis(AAY 16324)、Vernicia fordii(ABC94474)、Mortierella ramanniana(AAK84179)、Homo sapiens(Q96PD7，Q58HT5)、Bos taurus(Q70VD8)、Mus musculus(AAK84175)，以及其变体和/或突变体。举例的DGAT3多肽包括包含SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的蛋白质，由来自花生(Arachis hypogaea，Saha，et al.，2006)的DGAT3基因编码的多肽，以及其变体和/或突变体。
如本文所用，术语“磷脂酶A2”(PLA2)是指这样的蛋白质，其使磷脂的sn2-酰基键水解产生游离脂肪酸和溶血磷脂。因此，术语“磷脂酶A2活性”是指磷脂的sn2-酰基键水解产生游离脂肪酸和溶血磷脂。举例的磷脂酶A2多肽包括包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的蛋白质，由来自如下的PLA2基因编码的多肽：Arabidopsis如-α(At2g06925，AY136317)、AtsPLA2-β(At2g19690，AY136317)、AtsPLA2-γ(At4g29460，AY148346)、AtsPLA2-δ(At4g29470，AY148347)和PLA2s(At3g45880，AK226677和At1g61850，NM_104867)，以及其变体和/或突变体。
如本文所用，术语“磷脂酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶”(PDAT)是指这样的蛋白质，其将酰基从磷脂酰胆碱转移至二酰基甘油。因此，术语“磷脂酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶活性”是指将酰基从磷脂酰胆碱转移至二酰基甘油产生三酰基甘油。举例的磷脂酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶多肽包括包含SEQ ID NO：5和6所示氨基酸序列的蛋白质以及其变体和/或突变体。
如本文所用，术语“CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶”(CPT)是指将磷脂酰胆碱可逆地转变为二酰基甘油的蛋白质。因此，术语“CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶活性”是指将磷脂酰胆碱可逆地转变为二酰基甘油。举例的CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶多肽包括包含SEQ IDNO：7所示氨基酸序列的蛋白质，以及其变体和/或突变体。
如本文所用，术语“酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶”(EC 2.3.1.23；LPCAT)是指这样的蛋白质，其可逆地催化溶血磷脂酰胆碱的酰基-CoA-依赖性酰化，产生磷脂酰胆碱和CoA。因此，术语“酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶活性”是指溶血磷脂酰胆碱可逆地酰化，产生磷脂酰胆碱和CoA。举例的酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶多肽包括包含SEQ IDNO：8和9所示氨基酸序列的蛋白质，以其变体和/或突变体。
如本文所用，术语“磷脂酶C”(PLC)是指使PIP2水解产生二酰基甘油的蛋白质。因此，术语“磷脂酶C活性”是指PIP2水解产生二酰基甘油。举例的磷脂酶C多肽包括包含SEQ ID NO：10-13所示氨基酸序列的蛋白质，以及其变体和/或突变体。
如本文所用，术语“磷脂酶D”(PLD)是指水解磷脂酰胆碱产生磷脂酸和胆碱头基的蛋白质。因此，术语“磷脂酶D活性”是指磷脂酰胆碱水解产生磷脂酸和胆碱头基。举例的磷脂酶D多肽包括包含SEQ ID NO：14所示氨基酸序列的蛋白质，以及其变体和/或突变体。
如本文所用，术语“甘油-3-磷酸酰基转移酶”(GPAT)是指酰化sn-甘油-3-磷酸形成1-酰基-sn-甘油-3-磷酸的蛋白质。因此，术语“甘油-3-磷酸酰基转移酶活性”是指使sn-甘油-3-磷酸酰化形成1-酰基-sn-甘油-3-磷酸。举例的甘油-3-磷酸酰基转移酶多肽包括包含SEQ ID NO：15所示氨基酸序列的蛋白质，以及其变体和/或突变体。
如本文所用，术语“1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶”(LPAAT)是指在sn-2位置酰化sn-1-酰基-甘油-3-磷酸形成磷脂酸的蛋白质。因此，术语“1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶活性”是指在sn-2位置酰化sn-1-酰基-甘油-3-磷酸产生磷脂酸。举例的1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶多肽包括包含SEQID NO：16、98和99所示氨基酸序列的蛋白质，以及其变体和/或突变体。
如本文所用，术语“酰基转移酶”是指使酰基从一个分子转移至另一分子的蛋白质。因此，术语“酰基转移酶活性”是指使酰基从一个分子转移至另一分子。举例的酰基转移酶多肽包括包含SEQ ID NO：17-20、25-27和29所示氨基酸序列的蛋白质，以及其变体和/或突变体。
如本文所用，术语“3-酮酰基-CoA合成酶”是指催化丙二酰-CoA与酰基-CoA缩合产生3-酮酰基-CoA的蛋白质。因此，术语“3-酮酰基-CoA合成酶活性”是指使丙二酰-CoA与酰基-CoA缩合产生3-酮酰基-CoA。举例的3-酮酰基-CoA合成酶多肽包括包含SEQ ID NO：28所示氨基酸序列的蛋白质，以及其变体和/或突变体。
如本文所用，术语“磷脂酶”是指水解磷脂中特定的酯键的蛋白质。因此，术语“磷脂酶活性”是指使磷脂中特定的酯键水解。举例的酰基转移酶多肽包括包含SEQ ID NO：30-32所示氨基酸序列的蛋白质，以及其变体和/或突变体。
如本文所用，术语“脂肪酶”是指使脂肪水解为甘油和脂肪酸的蛋白质。因此，术语“脂肪酶活性”是指使脂肪水解为甘油和脂肪酸。举例的酰基转移酶多肽包括包含SEQ ID NO：33-42所示氨基酸序列的蛋白质，以及其变体和/或突变体。
如本文所用，“去饱和酶”、“脂肪酸去饱和酶”或者其变化用语是指这样的酶，其从脂肪酸的碳链中除去两个氢原子，产生碳-碳双键。去饱和酶分类为：i)delta-表示双键在脂肪酸的羧基固定位置产生(例如Δ12去饱和酶在羧基末端第12位置产生双键)，或者ii)omega(例如ω3去饱和酶)-表示双键在脂肪酸的甲基末端的特定位置产生。举例的去饱和酶包括WO2005/103253中所述那些酶。
生物化学迹象提示脂肪酸延长包括4个步骤：缩合、还原、脱水和二次还原。在本发明中，“延长酶”是指这样的多肽，其在延长复合物中存在其它成员的条件下在合适的生理条件下催化缩合步骤。已经示出延长蛋白质复合物的仅缩合成分(延长酶)在细胞中的异源或者同源表达是各自的酰基链延长必需的。因此，导入的延长酶从转基因宿主中能成功地恢复还原和脱水活性，以进行成功的延长。与脂肪酸底物的链长度和去饱和程度相关的延长反应的特异性被认为与缩合成分相关。这个成分也被认为是延长反应中的限速成分。迄今为止已经鉴别两组缩合酶。第一组酶参与饱和和单不饱和脂肪酸(C18-22)的延伸，例如Arabidopsis的FAE1基因。举例的形成的产物是在Brassicas中的芥子酸(22:1)。这组酶被称作FAE样酶，且未显示出在LC-PUFA生物合成中起作用。称作延长酶ELO家族的另一鉴别的脂肪酸延长酶根据ELO基因命名，其活性为酵母中鞘脂的极长链脂肪酸的合成所需。分离自合成生物体如藻类、苔藓、真菌和线虫的ELO-型延长酶的旁系同源物已经示出参与LC-PUFA的延长和合成。举例的延长酶包括在WO 2005/103253中描述的那些酶。
如本文所用，术语“下调内源酶的产生和/或活性的外源多核苷酸”或者其变化用语是指这样的多核苷酸，其编码下调所述产生和/或活性的RNA分子(例如编码siRNA)，或者外源多核苷酸自身下调所述产生和/或活性(例如siRNA被直接输送至例如细胞)。
术语“植物”包括整个植物、植物结构(例如叶、茎干)、根、花器官/结构、种子(包括胚芽、胚乳和种子包衣)、植物组织(例如微管组织、基本组织等)、细胞及其后代。所述植物、种子、植物一部分或者植物细胞可以是或者来自单子叶植物或者优选双子叶植物。
“转基因细胞”、“遗传修饰的细胞”或者其变化用语是指含有在相同物种、变种或者栽培种的野生型细胞基因中未发现的构建体(转基因)的细胞。
“转基因种子”、“遗传修饰的种子”或者其变化用语是指含有在相同植物物种、变种或者栽培种的野生型种子中未发现的基因构建体的种子。
“转基因植物”、“遗传修饰的植物”或者其变化用语是指含有在相同物种、变种或者栽培种的野生型植物中未发现的基因构建体(转基因)的植物。
“转基因”在本文具有生物技术领域通常的含义，包括已经通过重组DNA或者RNA技术产生或者改变的遗传序列，且已经导入植物或者其它细胞中。所述转基因可包括衍生自植物细胞的遗传序列。典型地，转基因已经通过人工操纵入转化而被导入植物或者其它细胞中，但是可以使用本领域技术人员公认的任何方法。
如本文所用，“谷粒”通常是指成熟的收获的谷粒，但是根据上下文也可以是指在吸胀(imbibition)或者萌发后的谷粒。成熟谷粒通常具有低于大约18-20％的含水量。如本文所用，“种子”包括成熟种子，如典型收获自植物的种子，以及发育中的种子，如典型在生长期间在植物中形成的种子。成熟种子典型是不活动的，即在静息状态。
如本文所用，术语“野生型”或者其变化用语是指未根据本发明进行修饰的细胞、组织或者植物。“等基因”是指与参考细胞、组织、种子或者植物在一或多个、通常不超过几个如两、三或者四个基因座有所不同的细胞、组织、种子或者植物，导致一或多种性状改变。所述基因座可具有一个单一基因或者遗传构建体，或者多个基因或者遗传构建体(通常不超过几个如两、三或者四个)，典型为转基因。如本文所用，“相应等基因”细胞、组织、种子或者植物是指缺少所述基因或者构建体的第二细胞、组织、种子或者植物，其与第一细胞、组织、种子或者植物仅所述基因或者构建体不同，且典型已经以与第一细胞、组织、种子或者植物相同的方式例如温度、培养条件等处理。等基因野生型细胞、组织或者植物可以用作对照，以对比外源核酸的表达水平或者如本文所述修饰的细胞、组织或者植物的性状修饰的程度和性质。
如本文所用，“可操纵地连接”是指两或多个核酸(例如DNA)节段之间的功能关系。典型地，其是指转录调节元件(启动子)与转录序列的功能关系。例如，如果启动子刺激或者调节编码序列在合适细胞中的转录，则启动子与编码序列如本文定义的多核苷酸可操纵地连接。通常地，与转录序列可操纵地连接的启动子转录调节元件与所述转录序列是物理性相接，即其是顺式作用。然而，一些转录调节元件如增强子不需要与其增强转录的编码序列物理性相接或者位于与其紧邻处。
如本文所用，术语“基因”采用其最广的含义，包括脱氧核糖核苷酸序列，其包含结构基因的蛋白质编码区及包括5’和3’末端上与编码区相邻位置的序列，与每一末端的距离为至少大约2kb，且参与所述基因的表达。位于编码区5’末端的序列且呈递在mRNA上序列被称作5’非翻译序列。位于编码区3’末端或者下游且呈递在mRNA上的序列被称作3’非翻译序列。术语“基因”涵盖了基因的cDNA及基因组形式。基因的基因组形式或者克隆含有可以由称作“内含子”或者“***区”或者“***序列”的非编码区中断的编码区。内含子是被转录进核RNA(hnRNA)中的基因节段；内含子可含有调节元件如增强子。内含子被从核或者原始转录体中除去或者“剪接除去”；内含子因此在信使RNA转录体(mRNA)中不存在。mRNA在翻译期间起作用，指定新生多肽中氨基酸的序列或者顺序。术语“基因”包括编码本文所述本发明的所有或者部分蛋白质的合成的或者融合的分子以及与上述任一序列互补的核苷酸序列。
如本文所用，术语“可以分离自…”是指所述多核苷酸或者编码的多肽由生物体天然产生，特别是由Bernardia sp.如Bernardia pulchella产生。
术语“提取物”是指细胞或者生物体如植物的任何部分。“提取”典型包括破坏细胞及或许部分纯化所得材料。天然地，“提取物”包括至少一种修饰的脂肪酸。提取物可以通过使用本领域标准技术制备。
如本文所用，短语“不明显影响由转基因编码的酶的产生和/或活性”是指所述酶的活性水平是缺少下调内源酶的产生和/或活性的外源多核苷酸的等基因转基因细胞的活性水平的至少75％，优选至少90％。
如本文所用，术语“在第一和第二核苷酸序列之间非保守的区域”是指第一序列的一部分，其与第二序列的至少19个核苷酸的一连续节段至任何区域低于50％相同性，优选低于30％相同性。
如本文所用，术语“相似功能”是指来自不同植物物种的直系同源基因，其已经从普通的祖先中进化。在优选的实施方案中，由直系同源基因编码的酶具有相同活性，但由第二序列核苷酸序列编码(或者由包含第二序列核苷酸序列的mRNA编码)的酶与由第一序列核苷酸序列编码的(或者由包含第一序列核苷酸序列的mRNA编码的)酶相比对和/或使用修饰的脂肪酸具有更高的活性水平。由直系同源基因编码的这种酶典型具有相同的酶委员会编号(EC号)。
细胞
本发明合适的细胞包括可以用编码本文所述多肽/酶的多核苷酸转化的任何细胞，且其因此能用于产生修饰的脂肪酸。其中导入所述多核苷酸的宿主细胞可以是未转化的细胞或者已经用至少一种核酸分子转化的细胞。这种核酸分子与修饰的脂肪酸合成、TAG合成相关或者不相关。本发明的宿主细胞可以内源性地(即天然地)能产生本发明的蛋白质，或者仅在用至少一种核酸分子转化之后产生这种蛋白质。
所述细胞可以是原核细胞或者真核细胞。本发明的宿主细胞可以是能产生本文所述至少一种蛋白质的任何细胞，包括细菌、真菌(包括酵母)、寄生虫、节肢动物、动物和植物细胞。优选的细胞是真核细胞，更优选酵母和植物细胞。在优选的实施方案中，所述植物细胞是种子。所述细胞可以在细胞培养中。所述细胞可以是分离的细胞，或者是多细胞生物体如植物或者真菌的一部分。所述细胞可以包含于植物的一部分如种子种。所述生物体可以是非人生物体。
在一个特别优选的实施方案中，所述细胞是适于发酵的生物体的细胞。如本文所用，术语“发酵方法”是指任何发酵方法或者包含发酵步骤的任何方法。发酵方法包括但不限于用于产生醇(例如乙醇、甲醇、丁醇)、有机酸(例如柠檬酸、乙酸、衣康酸(itaconic acid)、乳酸、葡萄糖酸)、酮(例如丙酮)、氨基酸(谷氨酸)、气体(例如H2和CO2)、抗生素(例如青霉素和四环素)、酶、维生素(例如核黄素，β-胡萝卜素)和激素。发酵方法也包括用于食用醇工业(例如啤酒和葡萄酒)、乳品业(例如发酵乳制品)、皮革工业和烟草业中的发酵方法。优选的发酵方法包括醇发酵方法，这些方法为本领域熟知。优选的发酵方法是厌氧发酵方法，这些方法为本领域熟知。
合适的发酵细胞、典型为微生物能使糖如葡萄糖或者麦芽糖直接或者间接发酵即转变为希望的发酵产物。举例的发酵微生物包括真菌生物，如酵母。如本文所用，“酵母”包括酵母菌(Saccharomyces spp.)、酿酒酵母、卡尔酵母(Saccharomyces carlbergensis)、念珠菌、克鲁维酵母(Kluveromyces spp.)、毕赤酵母(Pichia spp.)、汉逊酵母(Hansenula spp.)、木霉(Trichoderma spp.)、Lipomyces starkey以及脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。优选的酵母包括酵母菌菌株，特别是酿酒酵母。可商购的酵母包括例如Red Star/Lesaffre Ethanol Red(得自Red Star/Lesaffre，USA)、FALI(得自Fleischmann′s Yeast，a division of Burns Philp Food Inc.，USA)、SUPERSTART(得自Alltech)、GERT STRAND(得自Gert Strand AB，Sweden)以及FERMIOL(得自DSM Specialties)。
在一个实施方案中，所述细胞是动物细胞或者藻类细胞。所述动物细胞可以是任何类型的动物，例如非人动物细胞、非人脊椎动物细胞、非人哺乳动物细胞，或者水生动物如鱼类细胞，或者甲壳动物、非脊椎动物、昆虫等细胞。
可用作本发明宿主细胞的举例的细菌细胞是Synechococcus spp.(也称作Synechocystis spp.)，例如Synechococcus elongatus。
产生的修饰的脂肪酸的水平
在转基因细胞中产生的修饰的脂肪酸的水平很重要。该水平可以根据油中总脂肪酸含量的组成成分特别是MFA或者一组MFA(百分比)表示，或者可以通过本领域已知方法确定的其它方式。例如，总脂质可以从细胞、组织或者生物体中提取，在通过气相层析(GC)分析之前将脂肪酸转变为甲酯。这种技术在实施例1中描述。层析图中峰位置可用于鉴别每个特定的脂肪酸，综合每个峰下的区域确定该量。如本文所用，除非相反情况，则样品中特定脂肪酸的百分比是根据层析图峰下该脂肪酸区域与脂肪酸总区域的百分比确定。这基本相应于百分比(mol％)。脂肪酸的相同性可以通过GC-MS证实，如实施例1所述。
在某些实施方案中，由本发明的种子、细胞、植物或者生物体产生的或者在种子油中的脂肪酸含量的至少23％(mol％)、优选至少27％、28％、29％、30％或者至少31％的脂肪酸含量包含所述官能团。
在本发明的种子、种子油、细胞、植物或者生物体的其它实施方案中，在总三酰基甘油的sn-3位置酯化的脂肪酸的至少4％(mol％)、优选至少10％(mol％)包含所述官能团。
在本发明的种子、种子油、细胞、植物或者生物体的其它实施方案中，在总三酰基甘油的sn-2位置酯化的脂肪酸的至少10％(mol％)、优选至少20％、30％、40％或者至少50％包含所述官能团。
在本发明的种子、种子油、细胞、植物或者生物体的其它实施方案中，在总三酰基甘油的sn-1位置酯化的脂肪酸的至少4％(mol％)、优选至少10％(mol％)包含所述官能团。
在本发明的种子、种子油、细胞、植物或者生物体的其它实施方案中，由所述种子、细胞、植物或者生物体产生的油的至少10％、优选20％是双-vernoleate或者双-蓖麻油酯，或者其组合。
在本发明的种子、种子油、细胞、植物或者生物体的其它实施方案中，由所述种子、细胞、植物或者生物体产生的油的至少10％、优选10％是三-vernoleate或者三-蓖麻油酯，或者其组合。
在其它实施方案中，种子、细胞、植物或者生物体产生的油或者种子油中具有官能团的脂肪酸与缺少官能团的脂肪酸的摩尔比率是至少23∶77，更优选至少27∶73，更优选至少31∶69。
在进一步的方面，本发明的转基因红花(www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？mode＝Info&id＝4222&lvl＝3&lin＝f&keep＝1&srchmode＝1&unlock)种子具有至少17％(mol％)、优选至少23％的种子油总脂肪酸含量是斑鸠菊酸和/或蓖麻油酸。
在进一步的方面，本发明的转基因Gossypium hirsutum(www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？id＝3635)种子具有至少17％(mol％)、优选至少23％的种子油总脂肪酸含量是斑鸠菊酸和/或蓖麻油酸。
在进一步的方面，本发明的转基因Brassica sp种子具有至少15％(mol％)、优选至少23％的种子油总脂肪酸含量是斑鸠菊酸和/或蓖麻油酸。
在进一步的方面，本发明的转基因亚麻(www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？id＝4006)种子具有至少15％(mol％)、优选至少23％的种子油脂肪酸含量是斑鸠菊酸和/或蓖麻油酸。
本发明一方面涉及增强一或多种修饰的脂肪酸产生的方法。在这个方面，优选所述产生被增强，由此组织或者器官的油中包含所述官能团的修饰的脂肪酸的水平增加至少6％，更优选至少8％，作为在用氯仿/甲醇从所述组织或者器官中提取总脂肪酸之后植物组织或者器官的总脂肪酸含量的百分比，其中至少6％的增加、优选至少8％的增加时相对于具有第一外源多核苷酸但缺少第二外源多核苷酸的相应组织或者器官中总脂肪酸水平而言。
本发明再一方面涉及细胞、组织、种子、植物或者其它生物体中脂肪酸转变为修饰的脂肪酸的效力。如本文所用，转变效力可以根据MFA百分比/MFA百分比+底物FA(未修饰的FA)百分比计算。优选转变效力是至少25％，优选至少30％，更优选至少35％。
多肽
“基本纯化的多肽”或者“纯化的多肽”是指通常已经与其天然关联的脂质、核酸、其它肽及其它污染分子分离的多肽。优选地，基本纯化的多肽是至少60％、优选至少75％、更优选至少90％没有与其天然相关的其它成分。
文中关于多肽所用术语“重组”是指当多肽由细胞产生或者在无细胞表达***中产生时，与其天然状态相比其量或者比率改变。在一个实施方案中，所述细胞是非天然产生所述多肽的细胞。然而，所述细胞可以是包含非内源基因的细胞，导致产生的多肽的量改变。本发明的重组多肽包括未与产生其的转基因(重组)细胞或者无细胞表达***的其它成分分离的多肽，以及在这种细胞或者无细胞***中产生的多肽，其随后被纯化除去至少一些其它成分。
术语“多肽”和“蛋白质”通常可以互换使用。
多肽的相同性百分比％通过GAP(Needleman and Wunsch，1970)分析(GCG程序)确定，缺口生成罚分(gap creation penalty)＝5，缺口延伸罚分(gap extension penalty)＝0.3。查询序列的长度为至少15个氨基酸，GAP分析对比两个序列至少15个氨基酸区域。更优选地，查询序列的长度为至少50个氨基酸，GAP分析对比两个序列的至少50个氨基酸。更优选地，查询序列的长度为至少100个氨基酸，GAP分析对比两个序列的至少100个氨基酸。甚至更优选地，查询序列的长度为至少250个氨基酸，GAP分析对比两个序列的至少250个氨基酸。更优选地，GAP分析对比两个序列的全长。
如本文所用，“生物活性片段”是本发明多肽的一部分，其保留全长多肽的指定活性。生物活性片段可以是任何大小，只要其保留指定活性即可。优选地，生物活性片段保留全长蛋白质的至少10％的活性。
关于指定的多肽/酶，意识到高于上文提供的那些相同性百分比包含优选的实施方案。因此，在适当情况中，根据最小相同性百分比，优选所述多肽/酶包含这样的氨基酸序列，其与相关SEQ ID NO具有至少35％、优选至少40％，、更优选至少45％、更优选至少50％、更优选至少55％、更优选至少60％、更优选至少65％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少76％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少93％、更优选至少94％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％、更优选至少99.1％、更优选至少99.2％、更优选至少99.3％、更优选至少99.4％、更优选至少99.5％、更优选至少99.6％、更优选至少99.7％、更优选至少99.8％以及甚至更优选至少99.9％相同性。
在优选的实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：1所示序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQ IDNO：1具有至少69％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有二酰基甘油酰基转移酶活性。在优选的实施方案中，所述多肽具有2个跨膜结构域。
在另一个实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：2所示序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQ ID NO：2具有至少65％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有二酰基甘油酰基转移酶活性。在优选的实施方案中，所述多肽具有10个跨膜结构域。
在另一个实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：3所示序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQ ID NO：3具有至少34％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有二酰基甘油酰基转移酶活性。在优选的实施方案中，所述多肽是可溶的。
在另一个实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：4所示序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQ ID NO：4具有至少30％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有磷脂酶A2活性。
在另一个实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：5所示序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQ ID NO：5具有至少51％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有磷酯酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶活性。
在另一个实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：6所示序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQ ID NO：6具有至少34％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有磷酯酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶活性。
在另一个实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：7所示序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQ ID NO：7具有至少79％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶活性。
在另一个实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：8或9任一所示序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQ ID NO：8或9任一序列具有至少75％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶活性。
在另一个实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：10所示序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQ ID NO：10具有至少80％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有磷脂酶C活性。
在另一个实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：11所示序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQ ID NO：11具有至少66％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有磷脂酶C活性。
在另一个实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：12所示序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQ ID NO：12具有至少58％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有磷脂酶C活性。
在另一个实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：13所示序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQ ID NO：13具有至少79％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有磷脂酶C活性。
在另一个实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：14所示序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQ ID NO：14具有至少92％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有磷脂酶D活性。
在另一个实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：15所示序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQID NO：15具有至少81％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性。
在另一个实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：16、98或99所示序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQ ID NO：16、98或99具有至少36％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶活性。
在另一个实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：17所示序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQID NO：17具有至少85％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有酰基转移酶活性。
在另一个实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：18所示序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQID NO：18具有至少75％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有酰基转移酶活性。
在另一个实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：19所示序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQID NO：19具有至少89％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有酰基转移酶活性。
在另一个实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：20所示序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQ ID NO：20具有至少82％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有酰基转移酶活性。
在另一个实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：21所示序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQ ID NO：21具有至少34％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有脂肪酸环氧化物酶活性。
在另一个实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：22所示序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQ ID NO：22具有至少79％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有Δ12去饱和酶活性。
在另一个实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：23所示序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQ ID NO：23具有至少74％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有脂肪酸修饰活性。
在一个实施方案中，所述脂肪酸修饰活性是Δ12去饱和酶活性。
在另一个实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：24所示序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQ ID NO：24具有至少79％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有脂肪酸修饰活性。
在另一个实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：25、26和27所示任一或多个序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQ ID NO：25、26和27具有至少30％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有酰基转移酶活性。
本发明人鉴别了一组新的酰基转移酶，在本文被称作“二酰基甘油酰基转移酶-样”或者“DGAT2-样”酶。因此，在优选的实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：29、102和103所示任一或多个序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQ ID NO：29、102和103具有至少70％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有酰基转移酶活性。优选地，本发明的“DGAT2-样”多肽与DGAT2多肽比其它酰基转移酶如本文描述的那些酶更密切相关。推测这些酶是二酰基甘油酰基转移酶，特别是二酰基甘油:二酰基甘油酰基转移酶(DDAT)。DDAT使用两个二酰基甘油以产生TAG和游离脂肪酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：28所示序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQID NO：28具有至少80％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有酰基转移酶活性。
在另一个实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：30所示序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQID NO：30具有至少80％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有脂肪酶活性。
在另一个实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：31所示序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQID NO：31具有至少72％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有脂肪酶活性。
在另一个实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：32、33、34、36、37、38、39、40、41和42所示任一或多个序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQ ID NO：32、33、34、36、37、38、39、40、41和42具有至少30％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有脂肪酶活性。
在另一个实施方案中，本发明提供了基本纯化的和/或重组的多肽，其包含具有SEQ ID NO：35所示序列的氨基酸、其生物活性片段，或者与SEQID NO：35具有至少60％相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有脂肪酶活性。
本发明多肽的氨基酸序列突变体可以通过在本发明的核酸中导入合适的核苷酸改变或者通过在体外合成希望的多肽而制备。这种突变体包括例如氨基酸序列内残基的缺失、***或者取代。可以进行组合缺失、***和取代以获得最终的构建体，条件是最终多肽产物具有希望的特性。优选的氨基酸序列突变体相对于参考野生型多肽具有仅一个、两个、三个、四个或者低于十个氨基酸改变。
突变的(改变的)多肽可以使用本领域已知的任何技术制备。例如，本发明的多核苷酸可以进行体外诱变。这种体外诱变技术包括将多核苷酸亚克隆进合适载体中，使该载体转化进“突变”菌株如大肠杆菌XL-1 red(Stratagene)中，并使该转化的细菌增殖合适代数。在另一实施例中，对本发明的多核苷酸进行DNA改组技术，如Harayama(1998)所述。衍生自突变/改变的DNA的产物可以通过使用本文描述的技术筛选以确定其是否具有希望的活性，例如但不限于选自如下的活性：甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)、二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)、酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)、磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)，CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT)、磷脂酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)、二酰基甘油:二酰基甘油酰基转移酶(DDAT)和环氧化物酶。
在设计氨基酸序列突变体中，突变位点的位置和突变的性质依赖于待修饰的特性。突变位点可以单个修饰活在和系列修饰，例如通过(1)首先用选择的保守氨基酸取代，然后根据获得的结果用更多基团选择取代，(2)确实靶定残基，或者(3)***与定位位点相邻的其它残基。
氨基酸序列缺失通常在大约1-15个残基范围，更优选大约1-10个残基，典型为大约1-5个连续残基。
取代突变体具有在多肽中除去至少一个氨基酸残基并在这个位置***一个不同残基。最感兴趣的取代诱变位点包括鉴别为活性位点的位点。其它感兴趣的位点是其中得自不同株系或者物种的特定残基是相同的那些位点。这些位置对于生物活性可具有重要性。这些位点、尤其在至少三个其它相同保守位点序列内的那些位点，优选以相对保守的形式取代。这种保守取代示于表1，标题为“举例的取代”。
在优选的实施方案中，突变体/变体多肽当与天然发生的多肽相比时具有一或两个或三个或四个保守氨基酸改变。保守氨基酸改变的详细情况在表1中提供。在优选的实施方案中，所述改变不在一或多个基序中，所述基序在本发明提供的和/或本领域描述的具有相同功能的不同多肽之间是高度保守的。正如技术人员所意识到，当在重组细胞中表达时，推测这种小的改变不改变所述多肽的活性。
表1-举例的取代
  原始残基   举例的取代
  Ala(A)   val；leu；ile；gly
  Arg(R)   lys
  Asn(N)   gln；his
  Asp(D)   glu
  Cys(C)   ser
  Gln(Q)   asn；his
  Glu(E)   asp
  Gly(G)   pro，ala
  His(H)   asn；gln
  Ile(I)   leu；val；ala
  Leu(L)   ile；val；met；ala；phe
  Lys(K)   arg
  Met(M)   leu；phe
  Phe(F)   leu；val；ala
  Pro(P)   gly
  Ser(S)   thr
  Thr(T)   ser
  Trp(W)   tyr
  Tyr(Y)   trp；phe
  Val(V)   ile；leu；met；phe，ala
此外，如果需要，非天然氨基酸或者化学氨基酸类似物可以作为取代或者添加而被导入本发明的多肽中。这种氨基酸包括但不限于普通氨基酸的D-异构体，2，4-二氨基丁酸，α-氨基异丁酸，4-氨基丁酸，2-氨基丁酸，6-氨基己酸，2-氨基异丁酸，3-氨基丙酸，鸟氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，羟基脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，高瓜氨酸，半胱氨酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，环己基丙氨酸，β-丙氨酸，氟代氨基酸，设计(designer)氨基酸如β-甲基氨基酸，Cα-甲基氨基酸，Nα-甲基氨基酸，以及一般的氨基酸类似物。
在本发明范围内还包括这样的多肽，其在合成期间或者之后被不同修饰，例如生物素酰化、苄基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、由已知保护/封闭基团衍生化、蛋白酶解、与抗体分子或者其它细胞配体连接等。这些修饰可以增加本发明多肽的稳定性和/或生物活性。
本发明的多肽可以通过各种方式产生，包括天然多肽的产生和回收，重组多肽的产生和回收，以及多肽的化学合成。在一个实施方案中，本发明的分离的多肽是通过在有效产生多肽的条件下培养能表达多肽的细胞并回收所述多肽而产生。优选的培养细胞是本发明的重组细胞。有效的培养条件包括但不限于允许多肽产生的有效的培养基、生物反应器、温度、pH和氧条件。有效的培养基是指任何培养基，在其中培养细胞以产生本发明的多肽。这种培养基典型包含液体培养基，其具有可同化的碳、氮和磷酸盐来源，以及合适的盐、矿物质、金属及其它营养素如维生素。本发明的细胞可以在常规发酵生物反应器摇瓶、试管、微滴定培养皿和Petri平皿中培养。培养可以在适合重组细胞的温度、pH和氧含量下进行。这种培养条件为本领域技术人员已知。
多核苷酸和寡核苷酸
“分离的多核苷酸”，包括DNA、RNA或者其组合，单链或者双链，有义或者反义方向或者这两种方向的组合，dsRNA或者其它，是指与其天然关联或者连接的多核苷酸序列至少部分分离的多核苷酸。优选地，分离的多核苷酸至少60％、优选至少75％、更优选至少90％没有与其天然相关的其它成分。此外，术语“多核苷酸”与“核酸”、“基因”和“mRNA”可互换使用。
文中提及多核苷酸时所用术语“外源”是指多核苷酸以与其天然状态相比改变的量存在于细胞或者无细胞表达***中。在一个实施方案中，所述细胞是非天然细胞含所述多核苷酸的细胞。然而，所述细胞可以是包含非内源多核苷酸细胞，导致编码的多肽的产生量改变、优选增加。本发明的外源多核苷酸包括已经与其存在于其中的转基因(重组)细胞或者无细胞表达***的其它成分分离的多核苷酸，以及在这种细胞或者无细胞***中产生的多核苷酸，其随后被纯化除去至少一些其它成分。外源多核苷酸(核酸)可以是天然存在的核苷酸的一个连续节段，或者包含不同来源(天然发生的和/或合成的)的两或多个连续节段，结合形成一个多核苷酸。典型地，这种嵌合多核苷酸包含编码本发明多肽的至少一个开放读框，与适合驱动开放读框在感兴趣的细胞中转录的启动子可操纵地连接。
多核苷酸的相同性百分比％通过GAP(Needleman and Wunsch，1970)分析(GCG程序)确定，缺口生成罚分＝5，缺口延伸罚分＝0.3。除非特别指出，则查询序列长度为至少45个核苷酸，GAP分析对比两个序列至少45个核苷酸的区域。优选地，查询序列长度为至少150个核苷酸，GAP分析对比两个序列至少150个核苷酸的区域。更优选地，查询序列长度为至少300个核苷酸，GAP分析对比两个序列至少300个核苷酸。甚至更优选地，GAP分析对比两个序列相关开放读框的全长。
关于指定的多核苷酸，意识到高于上文提供的那些的相同性百分比％涵盖优选的实施方案。因此，在适当情况中，根据最小相同性百分比％，优选本发明的多核苷酸包含与相关SEQ ID NO.具有至少35％、更优选至少40％、更优选至少45％、更优选至少50％、更优选至少55％、更优选至少60％、更优选至少65％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少93％、更优选至少94％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％、更优选至少99.1％、更优选至少99.2％、更优选至少99.3％、更优选至少99.4％、更优选至少99.5％、更优选至少99.6％、更优选至少99.7％、更优选至少99.8％以及更优选至少99.9％相同性。
在优选的实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：43所示核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：43所示核苷酸序列的蛋白质编码区至少69％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有二酰基甘油酰基转移酶活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：44所示核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：44所示核苷酸序列的蛋白质编码区至少65％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有二酰基甘油酰基转移酶活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：45所示核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：45所示核苷酸序列的蛋白质编码区至少34％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有二酰基甘油酰基转移酶活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：46所示核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：46所示核苷酸序列的蛋白质编码区至少30％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有磷脂酶A2活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：47所示核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：47所示核苷酸序列的蛋白质编码区至少51％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有磷酯酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶酰基转移酶活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：48所示核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：48所示核苷酸序列的蛋白质编码区至少77％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有磷酯酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶酰基转移酶活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：49所示核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：49所示核苷酸序列的蛋白质编码区至少79％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：50所示核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：50所示核苷酸序列的蛋白质编码区至少79％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：51所示核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：51所示核苷酸序列的蛋白质编码区至少75％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：52所示核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：52所示核苷酸序列的蛋白质编码区至少80％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有磷脂酶C活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：53所示核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：53所示核苷酸序列的蛋白质编码区至少66％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有磷脂酶C活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：54所示核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：54所示核苷酸序列的蛋白质编码区至少58％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有磷脂酶C活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：55所示核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：55所示核苷酸序列的蛋白质编码区至少79％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有磷脂酶C活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：56所示核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：56所示核苷酸序列的蛋白质编码区至少92％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有磷脂酶D活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：57所示核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：57所示核苷酸序列的蛋白质编码区至少81％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有甘油-3-磷酸酰基转移酶活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：58、100或者101所示任一或多个核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：58、100或者101所示一或多个核苷酸序列的蛋白质编码区至少36％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：59所示核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：59所示核苷酸序列的蛋白质编码区至少58％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有酰基转移酶活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：60所示核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：60所示核苷酸序列的蛋白质编码区至少75％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有酰基转移酶活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：61所示核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：61所示核苷酸序列的蛋白质编码区至少89％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有酰基转移酶活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：62所示核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：62所示核苷酸序列的蛋白质编码区至少58％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有酰基转移酶活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：63所示核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：63所示核苷酸序列的蛋白质编码区至少34％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有脂肪酸环氧化物酶活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：64所示核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：64所示核苷酸序列的蛋白质编码区至少58％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有Δ12去饱和酶活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：65所示核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：65所示核苷酸序列的蛋白质编码区至少74％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有脂肪酸修饰活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：66所示核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：66所示核苷酸序列的蛋白质编码区至少79％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有脂肪酸修饰活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：67、68和69所示任一或多个核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：67、68和69所示任一或多个核苷酸序列的蛋白质编码区至少30％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有酰基转移酶活性的多肽。
如上所述，本发明人鉴别了一组新的酰基转移酶，在本文被称作“二酰基甘油酰基转移酶-样”或者“DGAT2-样”酶。因此，在优选的实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：71、104和105所示任一或多个核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：71、104和105所示任一或多个核苷酸序列的蛋白质编码区至少30％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有酰基转移酶活性、优选二酰基甘油酰基转移酶活性、更优选二酰基甘油:二酰基甘油酰基转移酶(DDAT)活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：70所示核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：70所示核苷酸序列的蛋白质编码区至少80％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有酰基转移酶活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：72所示核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：72所示核苷酸序列的蛋白质编码区至少80％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有脂肪酶活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：74所示核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：74所示核苷酸序列的蛋白质编码区至少74％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有脂肪酶活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：75、76、77、79、80、81、82、83、84和85所示任一或多个核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：75、76、77、79、80、81、82、83、84和85所示核苷酸序列的蛋白质编码区至少79％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有脂肪酶活性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
(i)SEQ ID NO：78所示核苷酸序列，
(ii)编码本发明多肽的核苷酸序列，
(iii)与SEQ ID NO：78所示核苷酸序列的蛋白质编码区至少60％相同的核苷酸序列，和/或
(iv)与(i)-(iii)任一序列在严格条件下杂交的序列，其中所述多核苷酸编码具有脂肪酶活性的多肽。
在进一步的实施方案中，本发明涉及与本文特别描述的那些多核苷酸基本相同的多核苷酸。如本文所用，针对多核苷酸所用术语“基本相同”是指一或几个(例如2、3或4个)核苷酸取代，同时保留由该多核苷酸编码的天然蛋白质的至少一种活性。此外，这个术语包括加入或者缺失核苷酸，导致编码的天然蛋白质的大小增加或者减少一或几个(例如2、3或4个)氨基酸，同时保留该多核苷酸编码的天然蛋白质的至少一种活性。
本发明的寡核苷酸可以是RNA、DNA或者其衍生物。这种寡核苷酸的最小大小是寡核苷酸与本发明的核酸分子上互补序列之间形成稳定杂交体需要的大小。优选地，所述寡核苷酸长度为至少15个核苷酸、更优选至少18个核苷酸、更优选至少19个核苷酸、更优选至少20个核苷酸、甚至更优选至少25个核苷酸。本发明包括可用作例如探针以鉴别核酸分子或者用作引物以产生核酸分子的寡核苷酸。用作探针的本发明的寡核苷酸典型与标记如放射性同位素、酶、生物素、荧光分子或者化学发光分子缀合。
探针和/或引物可用于从其它物种中克隆本发明多核苷酸同系物。此外，本领域已知的杂交技术也可用于筛选这种同系物的基因组或者cDNA文库。
本发明的多核苷酸和寡核苷酸包括在严格条件下与SEQ ID NO：43-85、100、101、104或者105所示序列杂交的那些多核苷酸和寡核苷酸。如本文所用，严格条件是：(1)应用低离子浓度和高温度洗涤，例如0.015MNaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％NaDodSO4，60℃；(2)在杂交期间应用变性剂如甲酰胺，例如50％(vol/vol)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白，0.1％Ficoll，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5，以及750mM NaCl，75mM柠檬酸钠，42℃；或者(3)应用50％甲酰胺，5×SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH 6.8)，0.1％焦磷酸钠，5×Denhardt′s溶液，超声处理的鲑精DNA(50g/ml)，0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，42℃，在0.2×SSC和0.1％SDS中。
本发明的多核苷酸与天然发生的分子相比可具有一或多个突变，这些突变是核苷酸残基的缺失、***或者取代。突变体可以是天然发生的(即分离自天然来源)或者合成的(例如通过对核酸进行定向诱变)。
通常地，多核苷酸或者寡核苷酸单体通过磷酸二酯键或者其类似物连接形成寡核苷酸，大小在从相对较短的如12-18个单体单位至几百个单体单位范围内。磷酸二酯键的类似物包括：硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phosphoranilidate、氨基磷酸酯。
反义多核苷酸
术语“反义多核苷酸”是指与编码本文指定多肽的特定mRNA分子的至少一部分互补且能干扰转录后事件如mRNA翻译的DNA或者RNA或者其组合分子。反义方法的使用为本领域熟知(见例如G.Hartmann and S.Endres，Manual of Antisense Methodology，Kluwer(1999))。反义技术在植物中的使用已经由Bourque，1995和Senior，1998回顾。Bourque，1995列举了反义序列如何作为基因失活方法用于植物***中的大量实例。她还指出实现任何酶活性100％抑制对于部分抑制不是必需的，更可能导致在***中可测量的改变。Senior(1998)指出反义方法目前是操纵基因表达的非常确定的技术。
本发明的反义多核苷酸在生理条件下与靶多核苷酸杂交。如本文所用，术语“在生理条件下杂交的反义多核苷酸”是指所述多核苷酸(其是全部或者部分单链的)至少能与编码蛋白质的mRNA在正常条件下在细胞中、优选植物细胞中形成双链多核苷酸。
反义分子可包括相应于结构基因的序列，或者实现控制基因表达或者剪接事件的序列。例如，反义序列可以相应于本发明基因的靶定编码区，或者5’-非翻译区(UTR)或者3’-UTR或者这些区域的组合。其可以与内含子序列部分互补，在转录期间或者之后可以被剪接除去，优选仅与靶基因的外显子序列互补。鉴于UTR通常较大差异性，靶向这些区域提供了更高的基因抑制特异性。
反义序列的长度应至少为19个连续核苷酸，优选至少50个核苷酸，更优选至少100、200、500或者1000个核苷酸。可以使用与完整基因转录体互补的全长序列。该长度优选为100-2000个核苷酸。反义序列与靶向转录体的相同性程度应为至少90％，更优选为95-100％。反义RNA分子当然可包含可发挥稳定分子作用的不相关的序列。
催化性多核苷酸
术语催化性多核苷酸/核酸是指这样的DNA分子或者含有DNA的分子(在本领域也称作脱氧核酶)或者RNA或者含有RNA的分子(也称作核酶)，其特异性识别独特的底物并催化这种底物的化学修饰。催化性核酸中的还算碱基可以是碱基A、C、G、T(以及对于RNA的U)。
典型地，催化性核酸含有反义序列，以特异性识别靶核酸，以及核酸裂解酶活性(在本文也称作催化结构域)。可特别用于本发明中的核酶的类型是锤头核酶(Haseloff and Gerlach，1988；Perriman et al.，1992)以及发夹核酶(Shippy et al.，1999)。
本发明的核酶和编码该核酶的DNA可以通过使用本领域已知的方法化学合成。所述核酶也可以从与RNA聚合酶启动子可操纵地连接的DNA分子(在转录时产生RNA分子)中制备，所述启动子是T7RNA聚合酶或者SP6 RNA聚合酶的启动子。因此，本发明还提供了编码本发明催化性多核苷酸的核酸分子，即DNA或者cDNA。当所述载体也含有与DNA分子可操纵地连接的RNA聚合酶启动子时，核酶可以在体外保温RNA聚合酶与核苷酸时产生。在一个单独的实施方案中，DNA可以***表达盒或者转录盒中。在合成之后，RNA分子可以通过与具有稳定核酶并使其对RNase抗性能力的DNA分子连接而被修饰。
使用本文所述反义多核苷酸，本发明的催化性多核苷酸也应能在“生理条件”下杂交靶核酸分子，所述条件即在细胞内的那些条件(尤其是在植物细胞中的条件).
RNA干扰
术语“RNA干扰”、“RNAi”或者“基因沉默”通常是指其中双链RNA分子降低核酸序列的表达，所述双链RNA分子对于所述核酸序列呈现出基本或者全面同源性。然而，最近揭示出RNA干扰可以通过使用非RNA双链分子实现(见例如US 20070004667)。
RNA干扰(RNAi)可特别用于特异性抑制特定蛋白质的产生。尽管不希望受理论的限制，Waterhouse et al.(1998)提供了一种模型，通过其可使用dsRNA(双链RNA)降低蛋白质产生。这种技术依赖于dsRNA的存在，其含有与感兴趣的基因的mRNA或者其一部分基本相同的序列，在这种情况中式编码本发明多肽的mRNA。便利地，dsRNA可以从单一启动子中在重组载体或者宿主细胞中产生，其中有义和反义序列在不相关序列的两侧，使得有义和反义序列杂交形成dsRNA分子，具有形成环结构的不相关序列。本发明的合适的dsRNA分子的设计和产生在本领域技术人员能力范围内，特别见Waterhouse et al.(1998)、Smith et al.(2000)、WO 99/32619、WO99/53050、WO 99/49029和WO 01/34815所述。
在一个实施例中，导入DNA，其指导与待失活的靶基因同源的至少部分双链RNA产物的合成。因此所述DNA包含有义和反义序列，当转录为RNA时，可以杂交形成双链RNA区域。在优选的实施方案中，有义和反义序列由间隔区分隔，所述间隔区包含内含子，当转录为RNA时所述内含子被剪接除去。这种排列示出导致较高效力的基因沉默。双链区可包含一或两个RNA分子，从一或两个DNA区中转录。认为双链分子的存在触发内源植物***中的应答，其破坏双链RNA及从靶植物基因中同源RNA转录，有效地降低或者消除靶基因的活性。
杂交的有义和反义序列的长度应均为至少19个连续核苷酸，优选至少30或者50个核苷酸，更优选至少100、200、500或者1000个核苷酸。可以使用对应完整基因转录体的全长序列。长度最优选为100-2000个核苷酸。有义和反义序列与靶向转录体的相同性程度应为至少85％，优选至少90％，更优选95-100％。所述RNA分子当然可包含不相关的序列，其发挥稳定分子的作用。RNA分子可以在RNA聚合酶II或者RNA聚合酶III启动子控制下表达。后者的实例包括tRNA或者snRNA启动子。
microRNA
MicroRNA调节是RNA沉默途径的一个明确的专门分支，其演变为朝向基因调节，偏离了常规的RNAi/PTGS。MicroRNA是一类特殊的小RNA，其在特征性反向重复中机构化的基因样元件中被编码。当转录时，microRNA基因产生茎-环前体RNA，随后从中加工microRNA。MicroRNA长度典型为大约21个核苷酸。释放的miRNA掺入RISC-样复合物中，该复合物含有发挥序列特异性基因抑制作用的Argonaute蛋白质的一特定亚集(见例如Millar and Waterhouse，2005；Pasquinelli et al.，2005；Almeida and Allshire，2005)。在一个实施方案中，microRNA具有21个连续核苷酸，其中至少20个核苷酸、优选全部21个核苷酸与靶基因转录区的21个连续核苷酸的互补序列相同。即microRNA在21个核苷酸的序列中可耐受1个错配的核苷酸，但是优选与靶基因该区域的互补序列相同。microRNA的茎-环前体RNA的剩余部分靶基因序列可以不相关，优选与天然发生的microRNA前体序列相关或者与其对应。
共抑制
可以使用的另一分子生物学方法是共抑制。共抑制的机制还不十分了解，但是认为其参与转录后基因沉默(PTGS)，以及在这方面可以与反义抑制的许多实例非常相似。所述方法包括在植物中以对于表达其的启动子有义方向导入基因的额外拷贝或者其片段。有义片段的大小、其与靶基因区域的对应性以及其与靶基因的序列相同性程度与上述反义序列一样。在一些情况中，基因序列的额外拷贝干扰靶植物基因的表达。参见WO 97/20936和EP 0465572描述的实施共抑制的方法。
基因构建体和载体
本发明的一个实施方案包括重组(嵌合)载体，其包含编码本文指定的多肽/酶的至少一个分离的多核苷酸分子，***能输送核酸分子至宿主细胞中的任何载体中。这种载体含有异源核酸序列，其是与本发明的核酸分子非天然相邻的核酸序列，优选衍生自除了所述核酸分子从中衍生的物种之外物种。所述载体可以是RNA或者DNA，是原核或者真核载体，典型是病毒或者质粒。
一种类型的重组载体包含与表达载体可操纵地连接的本发明的核酸分子。如上所述，短语可操纵地连接是指以一定方式在表达载体中***核酸分子，由此当转化进宿主细胞中时该分子能被表达。如本文所用，表达载体是DNA或者RNA载体，其能转化宿主细胞并影响指定核酸分子的表达。优选地，表达载体也能在宿主细胞中复制。表达载体可以是原核载体或者真核载体，典型是病毒或者质粒。本发明的表达载体包括在本发明的重组细胞中起作用(即指导基因表达)的任何载体，包括在细菌、真菌、体内寄生虫、节肢动物、其它动物和植物细胞中。优选的本发明表达载体可以指导酵母或者植物细胞中基因表达。
特别地，本发明的表达载体含有调节序列如转录控制序列、翻译控制序列、复制起源，及与重组细胞相容且控制本发明核酸分子表达的其它调节序列。特别地，本发明的重组分子包括转录控制序列。转录控制序列是控制转录的起始、延长和终止的序列。特别重要的转录控制序列是控制转录起始的那些序列，如启动子、增强子、操纵子和阻抑物序列。合适的转录控制序列包括可以在至少一种本发明重组细胞中起作用的任何转录控制序列。本领域技术人员已知各种这样的转录控制序列。
本发明的另一实施方案包括重组细胞，该重组细胞包含用一或多种本发明重组分子转化的宿主细胞。核酸分子转化进细胞中可以通过可以将核酸分子***细胞中的任何方法实现。转化技术包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、脂染、吸附和原生质体融合。重组细胞可以保持单细胞，或者可以生长为组织、器官或者多细胞生物体。转化的核酸可以保留在染色体外，或者可以整合进转化的(即重组)细胞染色体内的一或多个位点，以此方式保留其被表达的能力。
转基因植物及其部分
如本文所用，术语“植物”作为名词是指整个植物，但是要做形容词时是指存在于、得自、衍生自或者相关于植物的任何物质，例如植物器官(如叶、茎干、根、花)、单细胞(例如花粉)、种子、植物细胞等。实施本发明中使用的植物包括单子叶植物和双子叶植物。在优选的实施方案中，本发明的植物是农作物(例如谷物和豆类，玉米，小麦，马铃薯，木薯(tapioca)，水稻，高粱，小米，木薯(cassava)，大麦或者豌豆)，或者其它豆科植物。可以生长植物以产生可食用根、块茎、叶、茎干、花和果实。植物可以是蔬菜或者装饰植物。本发明的植物可以是：玉蜀黍(Zea mays)、加拿大油菜(Brassica napus、Brassica rapa ssp.)、亚麻(Linum usitatissimum)、苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cerale)、高粱(Sorghum bicolour、Sorghum vulgare)、向日葵(Helianthus annus)、小麦(Tritium aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(Gossypium hirsutum)、甘薯(Lopmoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Cofea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Anana comosus)、柠檬树(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia senensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、fig(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifer indica)、橄榄(Olea europaea)、番木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamia intergrifolia)、杏仁(Prunus amygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、燕麦或者大麦。
提供感兴趣的种子的谷物植物包括油料种子植物和豆类植物。感兴趣的种子包括谷物种子，如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、黑麦等。豆类植物包括豆(bean)和豌豆。豆包括guar、槐豆、葫芦巴、大豆、青刀豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。
在一个实施方案中，所述植物是油料植物，优选油料农作物。如本文所用，“油料植物”是用于从植物种子中商业性生产油的植物物种。所述植物可以在其果实如橄榄、油椰子或者椰子中产生高水平的油。优选地，所述油料植物是芸苔、Gossypium hirsutum、亚麻、向日葵、红花、大豆、Zea mays或者拟南芥。更优选地，油料植物是亚麻或者红花。
转基因植物可以通过使用本领域已知技术产生，如A.Slater et al.，Plant Biotechnology-The Genetic Manipulation of Plants，Oxford University Press (2003)和P.Christou and H.Klee，Handbook of Plant Biotechnology，John Wiley and Sons(2004)所述那些技术。
在优选的实施方案中，转基因植物对于已经导入的每个外源多核苷酸(转基因)是纯合的，由此其后代不隔离希望的表型。转基因植物对于导入的转基因也可以是杂合的，例如在从杂交体种子中生长的F1后代。这种植物可提供如本领域熟知的杂种优势这样的优势。
除了已经提及的其它转基因之外，转基因植物也可以包含进一步的转基因，其参与产生LC-PUFA例如但不限于Δ6去饱和酶、Δ9延长酶、Δ8去饱和酶、Δ6延长酶、对20:3底物具有活性的Δ5去饱和酶、ω-去饱和酶、Δ9延长酶、Δ4去饱和酶、Δ7延长酶和/或聚酮(polyketide)化合物合成酶途径的成员。举例的这种酶为本领域已知，包括在WO 05/103253(见例如WO 05/103253的表1)中描述的那些酶。
多核苷酸可以在转基因植物发育的所有阶段中组成型表达。根据植物或者植物器官的使用，多肽可以阶段特异性方式表达。此外，多核苷酸可以组织特异性表达。
本发明可以使用已知或者发现导致编码感兴趣的多肽的基因表达的调节序列。使用的调节序列的选择依赖于感兴趣的靶植物和/或靶器官。这种调节序列可以得自植物或者植物病毒，或者可以化学合成。这种调节序列为本领域技术人员熟知。
适于植物细胞稳定转染或者适于确立转基因植物的许多载体已经在例如Pouwels et al.，Cloning Vectors：A Laboratory Manual，1985，supp.1987；Weissbach and Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，1989和Gelvin et al.，Plant Molecular Biology Manual，Kluwer Academic Publishers，1990中描述。典型地，植物表达载体包括例如在5’和3’调节序列转录控制下的一或多个克隆的植物基因以及显性选择标记。这种植物表达载体也可以含有启动子调节区(例如控制可诱导或者组成型、环境或者发育调节的、或者细胞或组织特异性表达)，转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或聚腺苷酸化信号。
在植物细胞中活性的许多组成型启动子已经描述。在植物中组成型表达的合适启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、Figwort花叶病毒(FMV)35S、甘蔗杆状病毒启动子、鸭跖草黄斑驳病毒启动子、来自核酮糖-1，5-二-磷酸羧化酶的小亚基的光诱导的启动子、水稻胞质磷酸丙糖异构酶启动子、Arabidopsis的腺嘌呤磷酸核糖转移酶、水稻肌动蛋白1基因启动子、甘露氨酸合成酶和章鱼氨酸合成酶启动子、Adh启动子、蔗糖合成酶启动子、R基因复合物启动子，以及叶绿素α/β结合蛋白基因启动子。这些启动子用于产生在植物中表达的DNA载体；见例如PCT出版物WO 8402913。所有这些启动子均已用于产生各种类型植物表达的重组DNA载体。
为了在植物组织如种子中表达，优选本发明中使用的启动子在产生脂肪酸之前和/或期间在种子中相对高水平表达以在种子中积聚和贮存，所述种子特别是油料植物种子，如大豆、加拿大油菜、其它Brassicas、棉花、Zea mays、向日葵、红花或者亚麻。可以使用β-conglycinin启动子或者其它种子特异性启动子如核丝(linin)、napin和菜豆蛋白启动子。
在优选的实施方案中，启动子指导在发生脂肪酸和油生物合成的组织和器官中表达，特别是在种子细胞如胚乳细胞和发育中的胚细胞。合适的启动子是油料种子rape napin基因启动子(US 5,608,152)、Vicia faba USP启动子(Baumlein et al.，1991)、Arabidopsis油质蛋白启动子(WO 98/45461)、Phaseolus vulgaris菜豆蛋白启动子(US 5,504,200)、Brassica Bce4启动子(WO 91/13980)或者豆球蛋白B4启动子(Baumlein et al.，1992)，以及在单子叶植物如玉米、大麦、小麦、黑麦、水稻等植物中导致种子特异性表达的启动子。合适的启动子是大麦lpt2或者lpt1基因启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)或者在WO 99/16890中描述的启动子。其它启动子包括在Broun et al.(1998)和US 20030159173中描述的那些启动子。
5’非翻译前导序列可以衍生自选择的启动子以表达本发明多核苷酸的异源基因序列，且如果需要则可以特异性修饰以增加mRNA的翻译。关于优化转基因的表达，见Koziel et al.(1996)所述。5’非翻译区也可以得自植物病毒RNA(烟草花叶病毒、烟草蚀刻病毒、玉米矮小花叶病毒、苜蓿花叶病毒等)，得自合适的真核基因、植物基因(小麦和玉米叶绿素a/b结合蛋白基因前导序列)，或者得自合成的基因序列。本发明非限于其中非翻译区衍生自伴随启动子序列的5’非翻译序列的非翻译区的构建体。前导序列也可以衍生自不相关的启动子或者编码序列。可用于本发明中的前导序列包含玉米Hsp70前导序列(U.S.5,362,865和U.S.5,859,347)以及TMV omega元件。
转录的终止通过在嵌合载体中与感兴趣的多核苷酸可操纵地连接的3’非翻译DNA序列实现。重组DNA分子的3’非翻译区含有聚腺苷酸化信号，其在植物中起作用导致在RNA的3’末端加入腺苷酸化核苷酸。所述3’非翻译区可以得自在植物细胞中表达的各个基因。通常使用胭脂氨酸合成酶3’非翻译区、豌豆小亚基Rubisco基因的3’非翻译区、大豆7S种子贮存蛋白基因的3’非翻译区。含有农杆菌肿瘤诱导(Ti)质粒基因的聚腺苷酸化信号的3’转录的非翻译区也是合适的。
已经描述了四种一般方法将基因直接输送至细胞中：(1)化学方法(Graham et al.，1973)；(2)物理方法如显微注射(Capecchi，1980)、电穿孔(见例如WO 87/06614、US 5,472,869、5,384,253、WO 92/09696和WO 93/21335)，以及基因枪(见例如US 4,945,050和US 5,141,131)；(3)病毒载体(Clapp，1993；Lu et al.，1993；Eglitis et al.，1988)；以及(4)受体介导的机制(Curiel et al.，1992；Wagner et al.，1992)。
可以使用的加速方法包括例如微粒轰击等方法。输送转化核酸分子至植物细胞的一种举例的方法是微粒轰击。这种方法由Yang et al.，Particle Bombardment Technology for Gene Transfer，Oxford Press，Oxford，England(1994)综述。非生物粒子(微粒)可以用核酸包被并通过推力输送至细胞中。举例的粒子包括钨、金、铂等那些粒子。除了其是可再生转化单子叶植物的有效方式之外，微粒轰击的一个特别优势是既不分离原生质体，也不需要农杆菌感染的敏感性。通过加速输送DNA进Zea mays细胞的中的方法的一个举例的实施方案是biolistics α-粒子输送***，其可用于推进用DNA包被的粒子通过屏蔽(screen)如不锈钢或者Nytex屏蔽至用悬浮培养的玉米细胞包被的滤器表面上。适于本发明使用的粒子输送***是得自Bio-Rad Laboratories的氦加速PDS-1000/He基因枪。
对于轰击，悬浮培养的细胞可以在滤器上浓缩。含有被轰击的细胞的滤器以适当距离置于微粒轰击终止板下方。如果需要，在基因枪与待轰击的细胞之间也可以放置一或多个屏蔽。
或者，不成熟的胚或者其它靶细胞可以排列在固体培养基上。待轰击的细胞以合适距离位于微粒轰击终止板的下方。如果需要，在加速装置与待轰击细胞之间也放置一或多个屏蔽。通过使用本文所述技术，可以获得直至1000或者更多瞬时表达标记基因的细胞灶(foci)。在轰击后48小时细胞灶中表达外源基因产物的细胞的数目通常在1-10个范围内，平均为1-3个。
在轰击转化中，可以优化预轰击培养条件和轰击参数以产生最大数目的稳定转化体。进行轰击的物理和生物参数在这个技术中均是重要的。物理因素是参与操纵DNA/微粒沉淀的那些因素，或者影响大粒(macro-projectiles)或者微粒的飞行和速度的那些因素。生物因素包括在轰击之前或者之后立即参与操纵细胞的所有步骤，靶细胞的渗透调节帮助减轻与轰击相关的创伤，以及转化DNA的性质如线性化DNA或者完整超螺旋质粒。确信预轰击操纵对于成功转化不成熟胚特别重要。
在另一实施方案中，可以稳定转化质体。在高等植物中转化质体的方法包括粒子枪输送含有选择标记的DNA且通过同源重组使DNA靶向质体基因组(U.S.5,451,513、U.S.5,545,818、U.S.5,877,402、U.S.5,932479和WO 99/05265)。
因此，预期希望在小规模研究中调节轰击参数的各个方面，一充分优化条件。特别希望调节物理参数如缺口距离，飞行距离，组织距离以及氦压力。也通过修改影响受体细胞生理状态的条件使创伤因素最小化，因此可影响转化和整合效率。例如，可以调节受体细胞的渗透状态、组织水合及传代培养阶段或者细胞周期以优化转化。根据本发明的揭示，本领域技术人员已知其它常规调节的实施。
农杆菌-介导的转移是在植物细胞中导入基因的可广泛使用的***，因为DNA可以被导入全部植物组织中，从而不需要从原生质体中再生完整植物。使用农杆菌-介导的植物整合载体将DNA导入植物细胞中为本领域熟知(见例如US 5,177,010、US 5,104,310、US 5,004,863、US 5,159,135)。此外，T-DNA的整合式相对精确的过程，导致很少的重排。转移的DNA区域由边界序列限定，***DNA通常***植物基因组中。
现代农杆菌转化载体能在大肠杆菌以及农杆菌中复制，允许常规操作(Klee et al.，In：Plant DNA Infectious Agents，Hohn and Schell，eds.，Springer-Verlag，New York，pp.179-203(1985)。此外，在载体中进行农杆菌介导的基因转移的技术优势改良基因的重排，载体中限制位点促进能表达各个多肽编码基因的载体的构建。所述载体具有位于启动子和聚腺苷酸化位点两侧的合适多接头区，以指导***的多肽编码基因表达，且适于本发明目的。此外，含有有臂和无臂Ti基因的农杆菌可用于转化。在其中农杆菌转化时有效的那些植物变种中，由于基因转移的便利和指定性质而选择这种方法。
使用农杆菌转化方法形成的转基因植物在一个染色体上典型含有一个基因座。这种转基因植物可以被称作与加入的基因是半合的。更优选的是与加入的基因纯合的转基因植物，即含有两个加入的基因的转基因植物，一个基因在一对染色体的每条染色体上相同位置。纯合转基因植物可以通过有***配(自交)单独的隔离的含有一个加入基因的转基因植物而获得，使产生的一些种子发芽并针对感兴趣基因分析所得植物。
也应理解也可以交配两个不同的转基因植物，产生含有两个独立的隔离外源基因的后代。合适后代的自交可以产生对于这两个外源基因均纯合的植物。也涵盖与亲本植物回交及与非转基因植物远交，这是无性繁殖。通常用于不同性状和谷物的其它繁育方法的描述可见于Fehr，In：Breeding Methods for Cultivar Development，Wilcox J.ed.，American Society of Agronomy，Madison Wis.(1987)。
植物原生质体的转化可以使用基于磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔及组合这些处理方法实现。这些***用于不同植物变种依赖于特定植物株系从原生质体中再生的能力。举例的从原生质体中再生谷类植物的方法见Fujimura et al.，1985；Toriyama et al.，1986；Abdullah et al.，1986所述。
也可以使用其它细胞转化方法，包括但不限于将DNA导入植物中，通过将DNA直接转移进花粉中、通过将DNA直接注射进植物的生殖器官中，或者通过将DNA注射进未成熟胚的细胞中随后再水合干粉状的胚。
本领域熟知植物从单一植物原生质体转化体或者从各个转化的外植体中的再生、发育和栽培(Weissbach et al.，In：Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，San Diego，Calif.，(1988)。这种再生和生长方法典型包括选择转化的细胞、培养这些个体化细胞从胚发育至生根小植物阶段的步骤。相似地再生转基因胚和种子。之后将所得转基因生根幼芽种植于合适生长介质如土壤中。
含有外来的外源基因的植物的发育或者再生为本领域熟知。优选地，再生的植物是自花授粉，以提供纯合的转基因植物。此外，得自再生植物的花粉与农业重要品系的种子生长的植物杂交。相反，这些重要品系植物的花粉用于对再生植物授粉。使用本领域技术人员熟知的方法栽培含有希望的外源核酸的本发明的转基因植物。
主要通过使用Agrobacterium tumefaciens转染转化双子叶植物以及获得转基因植物的方法已经针对棉花(U.S.5,004,863，U.S.5,159,135，U.S.5,518,908)、大豆(U.S.5,569,834，U.S.5,416,011)、Brassica(U.S.5,463,174)、花生(Cheng et al.，1996)和豌豆(Grant et al.，1995)等公布。
转化谷类植物如小麦和大麦以通过导入外源核酸将遗传变异导入植物中以及从原生质体或者未成熟植物胚中再生该植物的方法为本领域熟知，见加拿大专利申请No.2,092,588、澳大利亚专利申请No 61781/94、澳大利亚专利No 667939、美国专利No.6,100,447、国际专利申请PCT/US97/10621、美国专利No.5,589,617、美国专利No.6,541,257所述，其它方法在专利说明书WO99/14314中阐述。优选地，转基因小麦或者大麦植物通过Agrobacterium tumefaciens介导的转化方法产生。携带希望的核酸构建体的载体可以导入可再生小麦的组织培养的植物或者外植体的细胞中，或者导入合适的植物***如原生质体中。
可再生小麦细胞优选来自未成熟胚的盾盖、成熟胚、衍生自这些组织的愈伤组织，或者分生组织。
为了证实转基因细胞和植物中转基因的存在，可以使用本领域技术人员已知的方法进行聚合酶链反应(PCR)扩增或者Southern印迹分析。转基因的表达产物可以通过各种方式检测，根据产物的性质而定，包括Western印迹和酶测定。量化蛋白质表达及检测在不同植物组织中复制的一个特别有用的方式是使用报道基因，如GUS。一旦获得转基因植物，则可以使其生长产生具有希望表型的植物组织或者其一部分。可以收获所述植物组织或者植物的一部分，和/或收集种子。种子可作为生长具有希望特征的组织或者一部分的额外植物的来源。
“聚合酶链反应”(PCR)是其中使用由“上游”和“下游”引物组成的“一对引物”或者“一组引物”及聚合催化剂如DNA聚合酶，典型为耐热聚合酶制成靶多核苷酸复制拷贝。PCR方法为本领域已知，见例如″PCR″(Ed.M.J.McPherson and S.G Moller(2000)BIOS Scientific Publishers Ltd，Oxford)教导。可以对分离自植物细胞的mRNA进行逆转录获得的cDNA进行PCR。然而，如果对分离自植物的基因组DNA进行PCR，则通常更容易。
引物是能以序列特异性方式杂交靶序列且在PCR期间延伸的寡核苷酸序列。扩增子或者PCR产物或者PCR片段或者扩增产物是延伸产物，其包含上述引物及新合成的靶序列拷贝。多重PCR***含有多组引物，导致同时产生一个以上的扩增子。引物可以与靶序列完全匹配，或者其可含有内在错配碱基，可导致在特定靶序列中导入限制酶或者催化核酸识别/裂解位点。引物也可以也含有额外序列和/或含有修饰的或者标记的核苷酸以促进扩增子的捕获或者检测。DNA变性、引物与其互补序列退火以及退火的引物用聚合酶延伸的重复循环导致靶序列指数扩增。术语靶或者靶序列或者模板是指被扩增的核酸序列。
对核苷酸序列进行直接测序的方法为本领域熟知，且可见例如Ausubel et al.(supra)和Sambrook et al.(supra)所述。测序可以通过任何合适方法进行，例如双脱氧测序、化学测序或者其变化方法。直接测序具有确定特定序列的任何碱基对中的变异的优势。
油的产生
本领域常规实施的技术可用于提取、加工和分析由本发明的细胞、植物、种子等产生的油。典型地，将植物种子煮熟、压榨并提取以产生粗制油，然后使其脱胶、精制、漂白及除臭。通常地，粉碎种子的技术为本领域已知。例如，油料种子可以通过对其用水喷雾，使含水量提升至例如8.5％，并使用光面辊用0.23-0.27mm的间隔设定(gap setting)压成薄片。根据种子的类型，在粉碎之前可以不加入水。应用热灭活酶、促进进一步细胞破裂、合并油滴以及聚集蛋白质颗粒，所有这些均便于进行提取。
大部分种子油通过螺旋压榨机释出。然后将通过螺旋压榨榨出的Cake用溶剂提取，例如用己烷提取，使用热示踪柱(heat traced column)进行。或者，可以使通过加压操作产生的粗制油通过具有槽沟(slotted wire)排水盖的澄清槽，以除去在加压操作期间与油一起表达(expressed)的固体。可以使澄清油通过板框式压滤机(plate and frame filter)，以除去任何剩余的精细固体颗粒。如果需要，从提取过程中回收的油可以组合澄清油以产生混合的粗制油。
一旦从粗制油中除去溶剂，组合加压和提取的部分，并进行正常油加工程序(即脱胶，碱法净化(caustic refining)，漂白及除臭)。可以通过在粗制油中加入浓缩的磷酸以使不能水合的磷脂转变为可水合形式，并且螯合存在的少量金属，由此进行脱胶。通过离心从油中分离出胶质。通过加入足量的氢氧化钠溶液以滴定所有脂肪酸并除去因此形成的皂(soap)，对油进行精制。
通过将油在真空下加热至260℃以除臭，并以大约0.1ml/分钟/100ml油的速度缓慢导入蒸汽。喷射大约30分钟后，使油在真空下冷却。将油典型地移至玻璃容器中，在冷冻贮存之前用氩冲刷。如果油的量受限，则可将油置于真空下，例如在Parr反应器中并加热至260℃持续同样长的时间除臭。这种处理改良了油的色泽并且除去了大部分挥发物质。
抗体
本发明还提供了本发明多肽或者其片段的抗体，如单克隆抗体或者多克隆抗体。因此，本发明进一步提供了产生本发明多肽的单克隆抗体或者多克隆抗体的方法。
术语“特异性结合”是指抗体结合重组(转基因)细胞中存在的本发明至少一种蛋白质而不结合其它蛋白质的能力，所述重组细胞特别是本发明的重组植物细胞。
如本文所用，术语“表位”是指由抗体结合的本发明的蛋白质。表位可以给予动物以产生该表位的抗体，然而本发明的抗体优选在完整蛋白质中特异性结合表位区域。
如果希望多克隆抗体，用免疫原性多肽免疫选择的哺乳动物(例如小鼠、兔、山羊、马等)。收集得自免疫动物的血清并根据已知程序处理。如果含有多克隆抗体的血清含有其它抗原的抗体，则通过免疫亲和性层析对该多克隆抗体进行纯化。产生和加工多克隆抗血清的技术为本领域已知。本发明多肽的单克隆抗体也可易于由本领域技术人员产生。本领域熟知通过杂交瘤产生单克隆抗体的一般方法。
对于本发明，除非特别指出，则术语“抗体”包括完整抗体的保留其结合靶抗原活性的片段。这种片段包括Fv、F(ab′)和F(ab′)2片段，以及单链抗体(scFv)。
实施例
实施例1-材料和方法
发育胚
在其种子中含有90％斑鸠菊酸的一种雌雄异体Euphorbia物种Bernardia pulchella的种子得自Belgium Botanical Gardens并用于在温室中建立植物。雄性和磁性植物上的花用钢刷授粉技术(brush pollination techniques)杂交。如下所述在不同生长阶段收获未成熟发育胚。
Bernardia pulchella cDNA文库的构建
用Trizol试剂(Invitrogen)根据供应商指导从大小为4-8mm的发育种子中分离总RNA。用Oligotex mRNA试剂盒(Qiagen)从总RNA中纯化信使RNA。用λZAP II-cDNA合成试剂盒(Stratagene-Catalogue No.200400)供应的寡-dT引物和逆转录酶SuperscriptIII(Invitrogen)从5μg mRNA合成第一链cDNA。双链cDNA连接于EcoRI/XhoI适体(adaptor)并从其出发用λZAPII-cDNA合成试剂盒根据供应商指导构建文库。初级文库的效价是4 x 106噬斑形成单位(pfu)/ml，扩增的文库的效价是3 x 109pfu/ml。文库中的cDNA***序列的平均***序列大小是1.4kb，文库中重组体的百分比是96％。
B.pulchella cDNA文库的大批切割(Bulk excision)和EST测序
含有3 x 104pfu的一部分未扩增的cDNA文库通过感染100μL OD600＝1.0的10mM MgSO4预处理的XL-1 Blue MRF’细胞(Stratagene)和10μLExAssist辅助噬菌体(1 x 108pfu，Stratagene)而从病毒载体中切割进入菌落中的质粒中。在37℃保温15分钟后，加入1.5mL 37℃预热的LB培养基，混合物在37℃保温2小时。混合物加热到65℃保持20分钟，在14000rpm离心5分钟后回收噬菌粒上清。噬菌粒用于感染OD600＝1.0的10mMMgSO4预处理的SOLR细胞(Stratagene)(每50μL噬菌粒感染100μL细胞)15分钟，然后加入300μL37℃预热的LB培养基后在37℃保温45分钟。然后离心收集细胞，铺板在LB/氨苄青霉素/IPTG/X-gal平板上，直至获得足够菌落用于EST测序。选择白色菌落进行质粒DNA提取并用标准反向引物(Beijing Genomic Institute，Beijing，China)测序。翻译所得序列以获得预测的氨基酸序列，用于在GenBank数据库中经BlastX检索同源序列。
B.pulchella cDNA文库筛选
XL1-Blue MRF’细胞在具有10mM MgSO4和0.2％麦芽糖的LB肉汤中于30℃生长过夜，离心1000xg收集，重悬于10mM MgSO4中至OD600为0.5。将一等份B.pulchella cDNA文库(5 x 105pfu)加入到所述XL1-BlueMRF’细胞，37℃15分钟，并与NZY顶层琼脂混合铺板。所得噬菌体噬斑然后转移到Hybond N+膜，所述膜然后用1.5M NaCl/0.5M NaOH变性，然后用1.5M NaCl/0.5M Tris-HCl(pH8.0)中和，最后用2 x SSC缓冲液漂洗。空气干燥后，对于高严格性，膜与放射活性标记的探针在60℃杂交过夜，用2xSSC/0.1％SDS在60℃洗30分钟，随后用0.2xSSC/0.1％SDS在60℃洗30分钟；对于中等严格性，在55℃杂交过夜并在60℃用2x SSC/0.1％SDS洗3次，每次10分钟。质粒从阳性噬斑中切割下来，确定***序列的核苷酸序列。
表达质粒的构建
用限制酶将在选择的cDNA克隆中的B.pulchella蛋白质编码区或者基因片段从载体中切下并与类似消化的pENTR11进入载体entry vector(Invitrogen)连接，并转化进E.coli DH5α。选择卡那霉素抗性/氨苄青霉素敏感性菌落，测序质粒中的***序列以证实它们的性质，然后用LR Clonase(Invitrogen)重组进用于酵母转化的酵母载体pYES-DEST52(Invitrogen)中或者重组进用于植物表达的pXZP391中处于Fp1种子特异性启动子(Stalberg et al.，1993)的控制下。所得酵母表达质粒转化进酵母株S288C或如下所述其他菌株中，其中一些是选择的基因的突变体以用于互补分析。所得植物表达质粒被转化进Agrobacterium tumefaciens菌株AGL1并用于经标准方法进行植物转化。
酵母培养及用前体脂肪酸饲养
经标准热休克方法将质粒导入酵母中，在含有2％葡萄糖或棉子糖作为唯一碳源的酵母合成drop out(SD)培养基平板上选择转化体。用作接种物的培养物在用2％葡萄糖或棉子糖作为唯一碳源的液体酵母基本培养基(YMM)中建立。从这些接种在1％NP-40的YMM培养基中的实验培养物，至初始OD600为大约0.3。培养物在30℃振荡培养直至OD600大约为1.0。离心收集细胞并用蒸馏水洗涤，然后重悬于相同体积的具有2％半乳糖而非葡萄糖的合成培养基(SG)中。在1％NP-40存在下加入选择的前体脂肪酸直至终浓度为0.5mM。培养物在30℃振荡保温48小时，置换离心收获。细胞沉淀用1％NP-40，0.5％NP-40和水洗涤以从细胞表面除去任何未掺入的脂肪酸。
植物转化
表达Crepis palaestinaΔ12-环氧化物酶基因Cpal2的拟南芥转基因品系Ven9和BU18用于转化实验中。Ven9是Cpal2纯合的T3植物，来自拟南芥C24生态型(Singh et al.，2001)中的AO*10品系并在种子油中产生大约7％(mol％)的斑鸠菊酸。与C24基因型的野生型植物相比，这些植物还显示种子油中降低的油酸去饱和水平。BU18是从Fp1启动子表达的外源Cpal2基因纯合的T3品系，并且对于失活编码Δ15去饱和酶的FAD3基因和编码脂肪酸延长酶的FAE1的fad3和fae1等位基因也是纯合的，并且还用C.palaestinaΔ12-去饱和酶基因Cpdes转化(Zhou et al.，2006)。BU18的种子油含有作为种子油中总脂肪酸的百分比的高达21％斑鸠菊酸，油酸去饱和水平与野生型相同。
Arabidopsis转化是通过用携带如上所述制备的各种表达构建体的根癌农杆菌(AGL1菌株)的悬液喷雾花芽而进行。在成熟时从处理的植物(T0代)收集种子。初级转化体(T1代)通过将种子铺在含有卡那霉素的培养基上鉴别，其中抗生素抗性的表达指示存在Kan选择标记基因并因此指示转化(Stoutjesdijk et al.，2002)。所有转基因Arabidopsis植物均在温室中在自然昼长、光照时间的控制温度24℃、夜间18℃下生长。收获来自T1植物的自交种子(T2代)，经气-液色谱(GC)用标准方法分析种子脂肪酸组成。为进行分离研究，种植各个T2种子，T2植物生长至成熟，收获T3种子并分析抗生素抗性及通过GC分析种子油的脂肪酸组成。
脂肪酶甲酯(FAME)制备
通过加入300μL于甲醇中的1％NaMeOH在室温放置20分钟，然后加入300μL 1M NaCl，脂肪酸甲酯(FAME)通过在作为培养物离心后的细胞沉淀获得的酵母细胞或Arabidopsis种子中总脂肪酸的酯交换形成。FAME用300uL己烷提取并经GC和GC-MS分析。
毛细管气-液色谱(GC)
FAME用配有6980系列自动化注射器和火焰-离子化检测器(FID)的Agilent 6890气相色谱分析。所用注射器和检测器温度分别为240℃和280℃。FAME样品在170℃注射到BPX70极性毛细管柱(SGE；60m x 0.25mmi.d.；0.25μm膜厚度)。2分钟后，炉温以5℃min-1升至200℃，以2.5℃min-1升至210℃，最后以10℃min-1升至240℃，在240℃保持4分钟。氦气是载气，柱头压(column head pressure)为45psi，注射后2分钟放气(purge)打开。峰的鉴别是基于将相对保留时间数据与标准FAME进行比较。为了定量，使用Chemstation(Agilent)积分(integrate)峰面积。
气相色谱-质谱(GC-MS)
在配有柱上注射的Finnigan Polaris Q and Trace GC2000 GC-MS离子阱上进行GC-MS。样品用AS3000 auto sampler注射到附着于BPX70极性毛细管柱(SGE；30m x 0.25mm i.d.；0.25μm膜厚度)的保留间隙(retention gap)上。保持初始温度60℃1分钟，随后温度程序是以30℃.min-1至120℃，然后以9℃.min-1至250℃，在250℃保持1分钟。用氦气作为载气。获得质谱并用XcaliburTM软件处理。
实施例2-B.pulchella二酰基甘油酰基转移酶2(BpDGAT2)的分离及表达
酰基CoA:二酰基甘油酰基转移酶(EC 2.3.1.20；DGAT)通过将脂肪酰基基团从酰基-CoA转移至二酰基甘油底物而催化TAG组装中的最后一步。在植物中已鉴别了三种不同的结构无关的DGAT酶。因为它们具有相同酶活性，它们是同工酶。鉴别的前2种酶是DGAT1和DGAT2，它们均定位于内质网(ER)并且含有预测的膜跨越结构域(membrane spanning domains)(Hobbs et al.，2000；Zou et al.1999；Lardizabal et al.，2001)。第三种酶是可溶性DGAT(DGAT3)，其最近在花生中被鉴别(Saha et al.，2006)，但是在其它物种中未被鉴定。
尽管2型二酰基甘油酰基转移酶基因(DGAT2)编码具有DGAT活性的蛋白质，但是如BLAST分析所确定的，它们在氨基酸序列上与由DGAT1基因家族编码的蛋白质无关。Arabidopsis中DGAT1的基因断裂不完全破坏DGAT活性。DGAT2蛋白比DGAT1小，并位于内质网的不同动态区域(Shockey et al.，2006)。预测DGAT2仅具有2个跨膜结构域，相比之下DGAT1中预测有10个跨膜结构域。
经EST测序和文库筛选克隆BpDGAT2
B.pulchella cDNA文库的总共12180个克隆(实施例1)从5′末端被测序。筛选从所述核苷酸序列预测的氨基酸序列以发现与Arabidopsis AtDGAT1(At2g19450)和AtDGAT2(At3g51520)、Ricinus communis DGAT2(AAY16324)及Vernicia fordii VfDGAT2(ABC94474)同源但是不同于BpDGAT1(见实施例3)的蛋白质序列。从12180个EST序列中鉴别了5个DGAT2样序列，即cDNA克隆Bp201685，Bp209844，Bp211489，Bp211518和Bp212233。在完成cDNA***序列的序列分析后，预测Bp209844含有全长cDNA(SEQ ID NO：43)，而Bp201685Bp211489，Bp211518和Bp212233是部分长度cDNA克隆。
编码DGAT2蛋白的开放读框以在核苷酸232-234的ATG起始密码子开始并以在核苷酸1210-1212的TGA终止密码子终止。Bp209844中基因的推导的氨基酸序列示于SEQ ID NO：1。所述326个氨基酸的序列显示与AtDGAT2(At3g51520)，RcDGAT(AAY16324)和VfDGAT2(ABC94474)分别为58％，68％和66％的相同性。针对Prosit数据库(http://expasy.org/tools/scanprosite)扫描BpDGAT2蛋白序列鉴别了至少一个潜在的糖基化位点(残基173-176；-NFTS-)，三个潜在的蛋白激酶C磷酸化位点(残基110-112，170-172和208-210)，一个酪蛋白激酶II磷酸化位点，及四个N-肉豆蔻酰化位点(残基81-86，165-170，190-195，200-205)。
BpDGAT2的表达
全长BpDGAT2 cDNA作为EcoRI-XhoI片段克隆进pENTR11以产生进入质粒pXZP080E。所述基因然后经LR Clonase重组进pYES-DEST52和pXZP391，分别产生质粒pXZP238和pXZP378。如实施例1所述分析在转化的酵母细胞中表达的基因的DGAT功能和底物特异性。
用pXZP378在Ven9和BU18中分别产生了21个和8个转基因FG和FC品系。来自这些品系的转基因种子的斑鸠菊酸水平及油去饱和比例(ODP)示于表2。ODP代表“油去饱和比例(oleic desaturation proportion)”，其是衍生自C18:1的去饱和脂肪酸的量与剩余的C18:1和衍生自C18:1的去饱和脂肪酸的量的总和的比率。
在Ven9背景中表达DGAT2的植物的种子油中的斑鸠菊酸水平从类似于Ven9至13.3％，而在BU18背景中在一些品系中观察到28％的水平，相比之下不具有DGAT2转基因的BU18大约为20％，提示DGAT2对斑鸠菊酸积累的增强作用。
Figure BPA00001279040000741
Figure BPA00001279040000751
实施例3-编码二酰基甘油酰基转移酶1(DGAT1)的基因的分离和表 达
拟南芥AtDGAT1的克隆
用校正聚合酶PfuUltraII(Stratagene)和引物：
AtDGAT1-F1 5’-TCGGGTACCGCTTTTCGAAATGGCGAT-3’(SEQ ID NO：86)及
AtDGAT1-R15’-TTGGATATCGACGTCATGACATCGATCCTTTTC-3’(SEQ ID NO：87)从茎cDNA扩增含有编码二酰基甘油酰基转移酶1基因(AtDGAT1；gene At2g19450)的全长拟南芥蛋白质编码区的DNA片段，并***到pBluescript SK(Stratagene)衍生物中，产生质粒pXZP163。在证实编码区的核苷酸序列后，切下基因并亚克隆进二元载体(binary vector)pWVec8-Fp1(Singh et al.，2001)中，产生质粒pXZP307，用于经实施例1所述方法在转基因植物中表达。
经筛选cDNA文库克隆编码DGAT1的Bernardia pulchella基因 (BpDGAT1)
作为KpnI-EcoRV片段从pXZP163切下的制备自AtDGAT1全长蛋白质编码区的放射活性探针用作探针筛选B.pulchella cDNA文库。杂交在55℃进行过夜，印迹在55℃用2x SSC/0.1％SDS洗2次，每次10分钟。选择12个阳性噬斑用于二次筛选，一个克隆被证实含有具有与探针强杂交的序列的***序列。在体内切除***序列后，确定所述***序列的核苷酸序列(SEQ ID NO：44)。编码蛋白质的开放读框以在核苷酸75-77的ATG起始密码子开始并以在核苷酸1725-1727的TGA终止密码子终止。这550个氨基酸的推导的氨基酸序列示于SEQ ID NO：2。所述基因被称为BpDGAT1，所编码的蛋白质与Arabidopsis AtDGAT1相比显示64％氨基酸相同性。
针对Prosit数据库(http://expasy.org/tools/scanprosite)扫描BpDGAT1蛋白序列鉴别了三个潜在的N-联糖基化位点(残基27-30，-NLSL-；73-76，-NLSM-；109-112，-NDSS-)，8个潜在的蛋白激酶C磷酸化位点(残基29-31，112-114，130-132，140-142，193-195，196-198，311-313，335-337)，9个潜在的酪蛋白激酶II磷酸化位点(残基2-5，38-41，49-52，66-69，86-89，140-143，196-199，282-285和431-434)，1个cAMP-和cGMP-依赖性蛋白激酶磷酸化位点(残基33-36，-RRWT-)，一个酪氨酸激酶磷酸化位点(残基416-423，-RFGDREFY-)，两个亮氨酸拉链基序(残基246-267，-LypvsviLscesavLsgvtlmL-；253-267，-LscesavLsgvtlmLfacivwL-)和两个N-肉豆蔻酰化位点(残基20-25，531-536)。
植物中AtDGAT1的表达
pXZP307中的AtDGAT1被导入Ven9品系的转基因植物并表达。18个转基因品系的种子油中环氧基脂肪酸即12，13-环氧基-油酸(epoxy-oleic)(18:1Ep；斑鸠菊酸)；12，13-环氧基亚油酸(epoxy linoleic)(18:2Ep)及两种环氧基脂肪酸之和(总Ep)作为总脂肪酸的百分比与亲代品系Ven9相比不显著改变，如表3所示。来自在相同时间和相同条件下生长的个体Ven9植物的种子油中斑鸠菊酸水平范围为5-9％。
BpDGAT1的表达
BpDGAT1 cDNA的全长蛋白质编码区作为BamHI-XhoI片段克隆进pENTR11以产生质粒pXZP079E。所述基因然后经LR Clonase重组进酵母表达载体pYES-DEST52和植物表达载体pXZP391中，分别产生pXZP237和pXZP377。如实施例1所述分析在转化的酵母细胞中表达的基因的DGAT功能和底物特异性。
用pXZP377转化Arabidopsis品系Ven9和BU18，分别产生了21个和23个转基因品系，分别命名为FG和FC。来自这些品系的转基因种子的斑鸠菊酸水平(Ver)及ODP示于表4。在Ven9中的表达BpDGAT1的几个品系具有增加水平的总环氧基脂肪酸，而在转基因BU18种子中未观察到明显的水平增加。这些品系后代中的环氧基脂肪酸水平正在被研究。
Figure BPA00001279040000781
Figure BPA00001279040000791
Figure BPA00001279040000801
实施例4-编码B.pulchella二酰基甘油酰基转移酶3(BpDGAT3)的 基因的分离和表达
DGAT3是鉴别自花生(Arachis hypogaea，Saha et al.，2006)的二酰基甘油酰基转移酶，其基因最近被克隆。与是ER膜相关蛋白质的DGAT1和DGAT2相反，发现DGAT3是可溶性酶，没有膜跨越结构域或者转运穿过膜的信号序列。另外，在Arabidopsis中，DGAT1mRNA在许多不同组织中高水平表达，包括萌发种子、幼苗、根和叶。但是花生中的可溶性DGAT3蛋白仅在未成熟的发育种子中检测到。
BpDGAT3的克隆
当用BlastX筛选得自EST集合的12180个核苷酸序列(实施例2)的氨基酸序列时，鉴别了12个部分长度cDNA克隆与被认为是DGAT3的花生(Arachis hypogaea)可溶性二酰基甘油酰基转移酶AhDGAT(登录号AY875644，Saha et al.，2006)享有序列同源性。这12个克隆在重叠区域中具有相同序列。来自一个克隆Bp200867的cDNA***序列被用作探针以在高严格性条件下筛选cDNA文库。鉴别了8个克隆，其中一个被测序并显示含有全长cDNA。编码DGAT3蛋白质的开放读框以在核苷酸73-75的ATG起始密码子开始并以在核苷酸1060-1062的TAG终止密码子终止(SEQ ID NO：45)。这个克隆的所得氨基酸序列示于SEQ ID NO：3。所述329个氨基酸的序列显示与花生可溶性DGAT3，AhDGAT的30％相同性和41％相似性，及与Arabidopsis DGAT样序列(AAD49767)的33％相同性和44％相似性。这个克隆因此含有称为BpDGAT3的基因的cDNA。
BpDGAT3具有富丝氨酸区域(-SESSTTSSSSSSES-)。针对Prosite数据库(http://expasy.org/tools/scanprosite)扫描BpDGAT3蛋白序列鉴别了5个潜在蛋白激酶C磷酸化位点(残基7-9，52-54，117-119，222-224，237-239)，3个酪蛋白激酶II磷酸化位点(残基85-88，138-141，140-143)，5个N-肉豆蔻酰化位点(残基41-46，46-51，230-235，302-307，323-328)和1个亮氨酸拉链模式(残基86-107，-LqdasraLmqqleeLkakekeL-)。
BpDGAT3的表达
在平末端化置换，全长BpDGAT3 cDNA作为BamHI-Bsp120IDNA片段克隆进pENTR11，产生质粒pXZP093E。所述基因然后经LR Clonase重组进pYES-DEST52和pXZP391，分别产生pXZP246和pXZP366。如实施例1所述分析在转化的酵母细胞中表达的基因的DGAT功能和底物特异性。
当用pXZP366转化Arabidopsis时，如实施例1所述，在植物Ven9和BU18中分别产生了称为GV和GW的转基因品系。
实施例5-编码B.pulchella磷脂酶A2(BpPLA2)的基因的分离和表达
脂质水解的初始步骤是由磷脂酶催化。这些酶分组成4个主要类别，磷脂酶A1和A2，磷脂酶C(PLC)及磷脂酶D(PLD)。磷脂酶A2(PLA2)蛋白质家族包括通过它们特异催化底物磷脂的中间(sn-2)酯键水解的能力而定义的酶(Schaloske et al.，2006)。这个反应的水解产物是游离脂肪酸和溶血磷脂。由PLA2释放的游离脂肪酸可以通过Kennedy途径组装成TAG。PLA2酶催化的另一个产物溶血磷脂在细胞信号传导、磷脂重塑和膜干扰(membrane perturbation)中起作用。更重要地，在磷脂PC的sn-2位合成的不寻常脂肪酸例如蓖麻油酸或斑鸠菊酸可以被PLA2释放，随后掺入种子油中的TAG中。PLA2酶目前被分类为15组和许多亚组，包括5种不同类型的酶，即分泌型PLA2(sPLA2)，细胞溶胶PLA2(cPLA2)，Ca2+不依赖性PLA2(iPLA2)，血小板激活因子乙酰水解酶(PAF-AH)和溶酶体PLA2。
BpPLA2的克隆
当用BlastX筛选得自EST集合的氨基酸序列时，鉴别了3个cDNA克隆(Bp205595，Bp210054和Bp210422)，它们编码与一种分泌型PLA2Arabidopsis磷脂酶A2(At2g06925，登录号NP_565337)的蛋白质序列同源的蛋白质。来自这3个克隆的序列在重叠区域中是相同的，并全部含有全长蛋白质编码序列。SEQ ID NO：46和4分别是来自最长cDNA克隆Bp205595的全长核苷酸序列和推导的氨基酸序列。编码BpPLA2蛋白的开放读框起自核苷酸71-73的ATG起始密码子，终止于核苷酸533-535的TAA终止密码子，编码154个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：4)。
BpPLA2的表达
BpPLA2cDNA克隆Bp205595的蛋白质编码区作为EcoRI-XhoI片段亚克隆进pENTR11，产生进入质粒pXZP082E。所述基因从这个质粒重组进酵母表达载体pYES-DEST52和植物表达载体pXZP391，分别产生pXZP239和pXZP380。如实施例1所述分析在转化的酵母细胞中表达的基因的PLA2功能和底物特异性。
pXZP380在植物Ven9和BU18中的转化分别产生22个FH和4个FD转基因品系。T2种子的种子油的脂肪酸组成的GC分析如表5所示。
Figure BPA00001279040000841
Figure BPA00001279040000851
实施例6-编码B.pulchella磷脂酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶 (BpPDAT)的基因的克隆和表达
PCR克隆拟南芥AtPDAT
编码二酰基甘油酰基转移酶的拟南芥基因AtPDAT(基因At5g13640)的蛋白质编码区用校正聚合酶PfuUltraII(Stratagene)和寡核苷酸引物
AtPDAT-F1 5’-TTAGGTACCAGTGACAGATATGCCCCTT-3’(SEQID NO：88)及
AtPDAT-R1 5’-ATGGAGCTCACAGCTTCAGGTCAATAC-3’(SEQID NO：89)，从拟南芥(生态型Columbia)叶cDNA扩增，并作为KpnI-SacI片段克隆进pBluescript SK derivative，产生质粒pXZP161。证实序列后，所述基因被克隆进植物表达载体pWVec8-Fp1(Singh et al.，2001)和pGNAP(Lee et al.，1998)中，产生质粒pXZP306和pXZP308，分别携带Hph和NptII选择标记基因。
经cDNA文库筛选基因克隆Euphorbia lagascae ElPDAT
以与实施例1中针对B.pulchella所述相似方式从得自E.lagascae发育胚的mRNA制备在载体λZAP II(Stratagene)中的cDNA文库。使用来自pXZP161的含有AtPDAT1的完整蛋白质编码序列的KpnI-SacI片段作为探针筛选所述文库，筛选是在60℃杂交，膜在55℃用1x SSC/0.1％SDS洗涤。鉴别了三个杂交噬斑，在体内切除***序列后进行测序。所有三个cDNA克隆的序列均是部分长度并显示与AtPDAT的同源性。最长的克隆命名为1510，与AtPDAT的氨基酸序列共享37％相同性和42％相似性。来自克隆1510的XbaI-HincII cDNA片段用作探针以在60℃再筛选E.lagascae cDNA文库。膜在60℃在2xSSC/0.1％SDS中洗2次，每次10分钟，在02.xSSC/0.1％SDS中洗10分钟。挑取26个噬斑用于使用相同杂交及洗涤条件进行二次筛选。用ElPDAT-特异性PCR分析来自二次筛选的9个阳性噬斑。其中5个经体内切除加工，获得具有最长***序列的克隆的cDNA序列，该序列示于SEQ ID NO：47。编码ElPDAT的开放读框起自核苷酸266-268的ATG起始密码子并终止于核苷酸1799-1801的TGA终止密码子。推导的氨基酸序列示于SEQ ID NO：5。编码的511个氨基酸的蛋白质比AtPDAT短150个氨基酸残基，并在重叠区域与AtPDAT具有50.3％氨基酸相同性和60.8％氨基酸相似性。
经cDNA文库筛选基因克隆B.pulchella BpPDAT
来自E.lagascae PDAT cDNA克隆1510的含有部分蛋白质编码序列的XbaI-HincII片段还用作探针在55℃杂交温度筛选B.pulchellacDNA文库。膜在60℃在2xSSC/0.1％SDS中洗3次，每次10分钟，然后在1xSSC/0.1％SDS中洗1次10分钟。挑取26个噬斑用于使用相同条件进行二次筛选。从二次筛选中选择10个阳性杂交噬斑。其中两个用体内切除处理，确定具有最长***序列的克隆Bp101529的cDNA序列。核苷酸序列示于SEQ ID NO：48。编码.The open reading frame encoding the BpPDAT蛋白的开放读框起自核苷酸208-210的ATG起始密码子并终止于核苷酸2254-2256的TGA终止密码子。682个氨基酸的推导氨基酸序列与AtPDAT享有76.3％氨基酸相同性和82.9％相似性，并示于SEQ ID NO：6。
AtPDAT的表达
质粒pXZP306用于转化Ven9植物。转化植物中AtPDAT基因的表达增加了ODP水平，但降低了斑鸠菊酸水平(表6)。用质粒pXZP308转化后的Ven9植物而非hph植物中AtPDAT的表达导致相似结果，所述质粒pXZP308使用nptII基因作为选择标记。可能AtPDAT相对于vernoyl-PC优选油酰-PC或亚油酰-PC作为一个底物以将酰基掺入TAG中，因此降低可利用的环氧化物酶底物(vernoloyl-PC)。还表面仅仅增加PDAT酶活性本身不增加种子油中不寻常脂肪酸的水平。事实上，数据提示降低油料种子植物中的PDAT内源活性可能有助于增加种子油的TAG中的MFA水平。
ElPDAT的表达
来自E.lagascae PDAT cDNA克隆1510的EcoRI-XhoI片段被***pENTR11，产生进入载体pXZP084E。该基因然后经Clonase LR重组酶反应***酵母表达载体pYES-DEST52和植物表达载体pXZP391中，分别产生质粒pXZP241和pXZP382。pXZP382用于转化Ven9植物和BU18植物，分别产生51个GM和20个GP转基因品系。T2种子的种子油的脂肪酸组成的GC分析见表7。
BpPDAT的表达
来自Bp101529的含有BpPDAT基因的XbaI-SphI片段被***pENTR11，得到进入载体pXZP081E。该基因然后经Clonase LR重组酶反应***酵母表达载体pYES-DEST52和植物表达载体pXZP391中，分别产生质粒pXZP240和pXZP379。pXZP379用于转化Ven9植物和BU18植物，分别产生35个GL和45个GO转基因品系。T2种子的种子油的脂肪酸组成的GC分析见表8。
Figure BPA00001279040000891
Figure BPA00001279040000901
Figure BPA00001279040000911
Figure BPA00001279040000921
Figure BPA00001279040000931
Figure BPA00001279040000941
实施例7-编码B.pulchella CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT)的 基因的分离和表达
经PCR基因克隆拟南芥AtCPT
在油料种子脂质合成中，ER的主要结构脂质二酰基-磷脂酰胆碱(PC)也是C18:1去饱和为C18:2和C18:3及修饰酶如羟化酶、环氧化物酶s、炔化酶和接合酶的酯化脂肪酸底物。酰基-PC在发育种子中作为TAG合成的中间体被快速周转。CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT)催化PC从DAG可逆合成，其是提供酰基基团用于经CoA不依赖性途径掺入TAG的一种途径。CPT基因已从拟南芥(At3g25585)、酿酒酵母(AAA63571)、大鼠(Rattus norvegicus)(NP_001007700)和人(Homo sapiens)(NP_001007795)等中分离。
编码CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶的拟南芥基因AtCPT(gene At3g25585)的全长蛋白质编码序列用校正聚合酶PfuUltraII(Stratagene)和寡核苷酸引物：
A3-25585-OF 5’-GATTCTAGAGAGACCCAATTTGGA-3’(SEQ ID NO：90)及
A3-25585-OR 5’-TTTCCCGGGTCAGGCTTCTTTCCGAGTAATCC-3’(SEQ ID NO：91)用叶cDNA作为模板进行扩增。PCR产物作为XbaI-SmaI片段克隆进pBluescript SK，产生质粒pXZP037。测序证实基因***序列正确后，将来自pXZP037的含有全长AtCPT编码序列的EcoRI-SmaI片段亚克隆进pENTR11的EcoRI-EcoRV位点，产生进入质粒pXZP115E。所述基因然后用LR Clonase反应克隆进酵母表达载体pYES-DEST52和植物表达载体pXZP391中。
经文库筛选基因克隆B.pulchella BpCPT
携带全长AtCPT蛋白质编码序列的pXZP115E的XbaI片段用作探针在65℃杂交温度筛选B.pulchella cDNA文库。膜在65℃在2xSSC/0.1％SDS、1xSSC/0.1％SDS、然后在0.2xSSC/0.1％SDS中洗涤，每次10分钟。分离10个噬斑并用于二次筛选。来自二次筛选的4个阳性杂交噬斑经体内切除(in vivo excision)处理并确定核苷酸序列。一个cDNABp500589的全长序列示于SEQ ID NO：49。编码BpCPT蛋白的开放读框起自核苷酸514-516的ATG起始密码子并终止于核苷酸1681-1683的TGA终止密码子。389个氨基酸的推导氨基酸序列(SEQ ID NO：7)与AtCPT享有78.7％相同性和87.2％相似性。
BpCPT的表达
含有BpCPT的cDNA克隆Bp500589的EcoRI-XhoI片段***到pENTR11中，产生进入质粒pXZP091E。所述基因然后***到酵母表达载体pYES-DEST52和植物表达载体pXZP391中，分别产生pXZP249和pXZP369。在转化的酵母细胞中表达的基因的CPT功能和底物特异性如实施例1所述分析。构建体pXZP369用于转化Arabidopsis品系，产生转基因品系。
实施例8-编码酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)的基因的 分离及表达
酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT；EC 2.3.1.23)催化溶血磷脂酰胆碱(LPC)的酰基-CoA依赖性酰基化以产生磷脂酰胆碱(PC)和CoA。LPCAT活性可影响脂肪酸在PC的sn-2位的掺入，在此处发生酰基链的去饱和和/或羟基化、epoxygenation、炔化(acetylenation)或大多数其它修饰。LPCAT属于膜结合o-酰基转移酶(MBOAT)蛋白质家族。LPCAT基因已从小鼠(BAE94687，BAF47695)、人(BAE94688)、大鼠(BAE94689)、酵母(Q06510)等中克隆。
拟南芥LPCAT样序列的基因克隆
当检查拟南芥基因组序列时，考虑两个基因(At1g12640和At1g63050)作为编码膜结合O-酰基转移酶(MBOAT)家族蛋白质的候选物，但是它们的具体功能未知。发明人考虑这些基因作为编码酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)的候选物。这些基因用校正聚合酶和引物从Arabidopsis(Columbia)叶cDNA扩增，引物A1-12640-OF 5’-TCCGAATTCAAAAAAACGGGTTTTCGACACC-3’(SEQID NO：92)和A1-12640-OR 5’-CGTCTCGAGAAGAAGATAACTGCTTATTC-3’(SEQ ID NO：93)用于第一个基因，引物A1-63050-OF 5’-TTGGAATTCACGCAAGATACAACCATG-3’(SEQ ID NO：94)和A1-63050-OR 5’-ATCCTCGAGACAACATTATTCTTCTTTTCTGG-3’(SEQ ID NO：95)用于第二个基因。
所得扩增的片段在用Taq聚合酶加A尾后克隆进pGEM-T Easy(Promega)中，分别产生质粒pXZP097TA和pXZP098TA。证实核苷酸序列正确后，这两个基因作为EcoRI-XhoI片段被***到pENTR11中，产生进入质粒pXZP097E和pXZP098E。然后两个基因经LR重组酶反应***到酵母表达载体pYES-DEST52和植物表达载体pXZP391中，产生质粒pXZP251，pXZP252，pXZP395和pXZP396。
B.pulchella BpLPCAT样序列的基因克隆
B.pulchella EST序列文库的BlastX检索鉴别了4个与两个AtLPCAT样序列同源的LPCAT样克隆。在它们之中，克隆Bp208211和Bp208643具有不同长度的5’-UTR序列，但是其它均相同并看起来含有全长蛋白质编码区。Bp215446是在重叠区域中与Bp208211相同的部分cDNA克隆。这些克隆中的序列因此是编码LPCAT酶的良好候选物并命名为BpLPCAT1。另一个克隆Bp211438也含有全长蛋白质编码区，与AtLPCAT样序列享有同源性但不同于BpLPCAT1，因此被命名为BpLPCAT2。Bp208211的完整cDNA序列示于SEQ ID NO：50。
编码BpLPCAT蛋白的开放读框起自核苷酸58-60的ATG起始密码子并终止于核苷酸1435-1437的TAG终止密码子。459个氨基酸的推导氨基酸序列(SEQ ID NO：8)与At1g12640编码的蛋白质享有74.4％相同性和85.2％相似性。Bp211438的完整cDNA序列示于SEQ ID NO：51。编码BpLPCAT样蛋白的开放读框起自核苷酸139-141的ATG起始密码子并终止于核苷酸1537-1539的TGA终止密码子。466个氨基酸的推导氨基酸序列(SEQ ID NO：9)与At1g63050.编码的蛋白质享有72.9％相同性和83.1％相似性。BpLPCAT和BpLPCAT样序列享有72.9％氨基酸相同性和83.1％相似性。
cDNA克隆Bp208211的EcoRI-XhoI片段和cDNA克隆Bp211438的BamHI-XhoI片段克隆进pENRT11中，分别产生进入质粒pXZP503E和pXZP504E。所述基因然后经LR重组酶反应克隆进酵母表达载体pYES-DEST52和植物表达载体pXZP391中，产生质粒pXZP253，pXZP254，pXZP397和pXZP398。
AtLPCAT在植物中的表达
如实施例1所述分析转化的酵母细胞中表达的基因的LPCAT功能及底物特异性。构建体pXZ395和pXZP396用于转化Arabidopsis品系Ven9和BU18，产生在种子中与Cpal2环氧化物酶共表达所述基因的转基因品系。经GC分析得自T1植物的T2种子的种子油的脂肪酸组成。
BpLPCAT在植物中的表达
如实施例1所述分析转化的酵母细胞中表达的基因的LPCAT功能及底物特异性。构建体pXZ397和pXZP386用于转化Arabidopsis品系Ven9和BU18，产生在种子中与Cpal2环氧化物酶共表达所述基因的转基因品系。
实施例9-编码B.pulchella磷脂酶C(BpPLC)的基因的分离及表达 BpPLC的基因克隆
筛选EST文库鉴别9个与Arabidopsis磷脂酶C(PLC)基因(At4g34920)同源的序列，它们组装成4个不同但密切相关的序列。一个克隆Bp200315看起来含有具有全长蛋白质编码区的cDNA(核苷酸序列SEQ ID NO：52，BpPLC-a)，所述蛋白质编码区编码318个氨基酸的蛋白质(氨基酸序列SEQ ID NO：10，BpPLC-a)，其与Arabidopsis PLC(At4g34920)的氨基酸序列享有79.9％相同性和87.1％相似性。编码BpPLC蛋白的开放读框起自核苷酸12-14的ATG起始密码子并终止于核苷酸966-968的TGA终止密码子。克隆Bp214073也是BpPLC-a基因的全长cDNA。克隆Bp202035，Bp203454和Bp208755含有BpPLC-a的部分长度序列。Bp200315的基因***序列作为EcoRI-XhoI片段克隆进pENTR11，产生进入质粒pXZP100E。该基因然后经LR重组酶反应克隆进酵母表达载体pYES-DEST52和植物表达载体pXZP391中，产生质粒pXZP250和pXZP390。
克隆Bp208641含有与拟南芥磷脂酶C(At5g67130，NP_569045)同源的全长cDNA序列(SEQ ID NO：53)。编码蛋白质的开放读框起自核苷酸34-36的ATG起始密码子并终止于核苷酸1297-1299的TGA终止密码子。其推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)与拟南芥磷脂酶C，登录号NP_569045享有65.7％相同性和76.9％相似性。该基因(BpPLC-b)与BpPLC-a仅享有35.2％核苷酸序列相同性，BpPLC-b蛋白与蛋白质BpPLC-a仅享有12.3％氨基酸序列相同性。
克隆Bp215053含有与磷酸肌醇特异性磷脂酶C(AAL17948)同源的基因(BpPLC-c，SEQ ID NO：54)的部分长度cDNA序列，但是与BpPLC-a仅具有46.5％的相同性。缺少N-末端大约170个氨基酸残基的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)与Mt PLC(AAL17948)共享57％相同性和69％相似性。
克隆Bp205027含有与Solanum tuberosum磷酸肌醇特异性磷脂酶C(CAA63954)具有同源性的部分长度序列(SEQ ID NO：55)。推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)与拟南芥磷酸肌醇特异性磷脂酶C2(At3g08510，NP_187464)在测序区域享有78.4％相同性和86.5％相似性。
BpPLC-a在植物中的表达
如实施例1所述分析在转化的酵母细胞中表达的基因的PLC功能及底物特异性。构建体pXZP390用于转化Arabidopsis品系Ven9和BU18，产生在种子中与Cpal2环氧化物酶共表达所述基因的转基因品系。收获一些品系的转化种子并分析脂肪酸组成。
实施例10-B.pulchella磷脂酶D(BpPLD)的分离及表达
磷脂酶D(PLD)家族形成磷脂酶的主要家族，它们首先在植物中发现并且编码它们的的基因从植物中克隆。PLD裂解磷脂，产生磷脂酸和游离首基(head group)如胆碱。所述酶经常由Ca2+、多磷酸肌醇、游离脂肪酸、G蛋白、N-酰基乙醇胺和膜脂的一或多种差异调节。植物PLD的生化性质、结构域结构及基因组组构比来自其它生物体的那些酶更趋异(Qin and Wang，2002)，但是它们仍可以与其它磷脂酶区分开。在Arabidopsis中，已鉴别了12个PLD基因，目前分为5类：PLDα(α1，At3g15730；α2，At1g52570；α3，At5g25370；α4，At1g55180)，PLDβ(β1，At2g42010；β2，At4g00240)，PLDγ(γ1，At4g11850；γ2，At4g11830；γ3，At4g11840)，PLDδ(At4g35790)和PLDξ(ξ1，At3g16790；ξ2，At3g05630)。
BpPLD的基因克隆
检查EST序列文库鉴别了48个含有与磷脂酶D或其它脂肪酶同源的序列的克隆。7个序列与属于亚家族PLDα1和PLDδ1的磷脂酶D基因同源。克隆Bp213916含有编码与PLDα1具有同源性的蛋白质的全长蛋白质编码区，其序列示于SEQ ID NO：56。编码蛋白质的开放读框起自核苷酸125-127的ATG起始密码子并终止于核苷酸2546-2548的TAA终止密码子。编码蛋白的807个氨基酸的推导的氨基酸序列示于SEQ ID NO：14并与Ricinus communis(蓖麻子)磷脂酶Dα1前体(胆碱磷酸酶1，磷脂酰胆碱水解性磷脂酶D 1，登录号Q41142)享有91.0％相同性和94.8％相似性。这个BpPLD蛋白序列的分析揭示存在N末端Ca2+/磷脂结合C2结构域，2个PLD家族的HKD基序(残基325-363，-TMFTHHQKIVVVDSAlpsgdperrriVSFVGGIDLCDGR-；和653-680，-FMIYVHTKMMIVDDEYIIIGSANINQRS-)。保守的“IYIENQYF”也在2个HKD基序之间发现，而第7个残基Phe(F)被Tyr(Y)取代。相对于PE底物，PLDα1优选PC底物。4个克隆Bp200708，Bp202515，Bp204745和Bp212073含有部分长度cDNA，与Bp213916在重叠区域相同，因此可能衍生自相同基因。2个其它克隆Bp203486和Bp213575含有显示与PLDδ1的同源性的部分长度cDNA序列。BpPLDα1蛋白编码区如上述针对其它基因所述***表达质粒。
实施例11-编码B.pulchella甘油-3-磷酸酰基转移酶(BpGPAT)的基因的 分离及表达
BpGPAT的基因克隆
通过检查EST文库，我们鉴别了部分长度cDNA克隆Bp203239，其编码与拟南芥甘油-3-磷酸酰基转移酶4蛋白(AtGPAT4)同源的蛋白质。来自这个克隆的EcoRI-XhoI片段用作探针以在65℃杂交温度筛选B.pulchella cDNA文库。膜在65℃分别于2xSSC/0.1％SDS，0.5xSSC/0.1％SDS和0.2xSSC/0.1％SDS中洗涤10分钟。分离24个噬斑，其中7个用于体内切除及测序。具有最长***序列的克隆Bp500619含有全长蛋白质编码区，其序列示于(SEQ ID NO：57)。编码蛋白质的开放读框起始于核苷酸29-31的ATG起始密码子并终止于核苷酸1532-1534的TGA终止密码子。推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)与AtGPAT4(基因At1g016100)享有79.1％相同性和87.9％相似性，与AtGPAT8(基因At4g00400，后来重新命名为AtLPAAT)享有80.5％相同性和88.6％相似性。用Bp500619基因***序列在低严格条件下筛选B.pulchella cDNA文库正在进行中，以分离GPAT基因家族的其它成员，因为在Arabidopsis中至少有7个编码GPAT的同种型的AtGPAT基因家族成员(Zheng et al.，2003)。
来自克隆Bp500619的cDNA***序列作为BamHI-XhoI片段被克隆进pENTR11，产生进入质粒pXZP505E。所述基因然后克隆进酵母表达载体pYES-DEST52和植物表达载体pXZP391，产生pXZP255和pXZP400。
BpGPAT的表达
如实施例1所述正在分析在转化的酵母细胞中表达的基因的GPAT功能及底物特异性。构建体pXZP400用于转化Arabidopsis品系Ven9和BU18，产生在种子中与Cpal2环氧化物酶共表达所述基因的转基因品系。从一些转基因品系中收获T2种子并分析脂肪酸组成。
实施例12-编码B.pulchella 1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(BpLPAAT) 的基因的分离及表达
BpLPAAT的基因克隆
当检查EST文库时，在克隆Bp205065上鉴别了一个部分序列，其编码与Arabidopsis 1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT，At4g30580)密切相关的蛋白质。在完成测序后(SEQ ID NO：58)，显示这个克隆编码酰基转移酶样蛋白质(SEQ ID NO：16)，其与Clitoria ternatea推定的花色素苷丙二酰转移酶(BAF49307)享有35.7％相同性和53.6％相似性，与拟南芥酰基转移酶样蛋白质(AAM65241)享有35.4％相同性和51.6％相似性。编码蛋白质的开放读框起始于核苷酸14-16的ATG起始密码子并终止于核苷酸1391-1393的TAA终止密码子。Bp205065中的***序列的EcoRI-XhoI片段用作探针在50℃杂交温度筛选B.pulchella cDNA文库。膜在50℃分别在2xSSC/0.1％SDS和1xSSC/0.1％SDS中各洗涤10分钟，产生120个阳性噬斑。在它们中，分离了58个噬斑，用于体内切除。在由这些基因***序列编码的11个全长蛋白质序列中，所有均显示与Bp205065至少90％的相同性，但是所有均是在不同氨基酸残基的变体。用Bp205065对B.pulchella EST序列进行TBlastX检索也鉴别了另外5个克隆，其与Bp205065享有＞90％序列相同性。
携带来自克隆Bp205065的全长蛋白质编码区的EcoRI-ApaI片段***到pENTR11中，产生进入质粒pXZP501E。所述基因然后克隆进酵母表达载体pYES-DEST52和植物表达载体pXZP391中，产生质粒pXZP290和pXZP601。
来自另外两个Arabidopsis LPAAT基因(At1g78690，At1g80950)的序列也用作探针筛选B.pulchella文库。其中第一个未鉴别出文库中的阳性克隆。来自At1g80950的探针在PCR反应中用叶和花cDNA作为模板核酸用正向引物5’-GGTTAGGTGAAAACAATAATG-3’(SEQ ID NO：96)和反向引物5’-GTCAGGCCAGTAAAATTTCAT-3’(SEQ ID NO：97)进行扩增。扩增产物克隆进pGEM-T Easy，测序证实预期核苷酸序列。含有At1g80950片段的NotI-NotI片段放射标记并用作探针通过在60℃在严格条件下杂交筛选Bernardia pulchella cDNA文库。膜在60℃用2x SSC/0.1％SDS洗2次，每次10分钟，随后在60℃用0.5xSSC/0.1％SDS洗2次，每次15分钟。鉴别了13个阳性噬斑，分离并用于二次筛选，随后体内切除在二次筛选中阳性的噬斑。
获得了两个几乎相同的序列，命名为Bp500989(SEQ ID NO：100)和Bp500997(SEQ ID NO：101)。由Bp500989编码的蛋白质序列(SEQ IDNO：98)与Ricinus communis酰基转移酶，登录号EEF5253779％相同及89％相似。Bp500997编码与Bp500989编码的非常相似的蛋白质(SEQ IDNO：99)，区别是其编码稍微更长的蛋白质，最后13个氨基酸残基与Bp500989的最后2个残基不同，以及具有不同的3’-UTR序列。
携带来自克隆Bp500989和Bp500997的全长蛋白质编码区的BamHI-XhoI和EcoRI-XhoI片段被***pENTR11中，产生进入质粒pXZP527E和pXZP529E。所述基因然后克隆进酵母表达载体pYES-DEST52和植物表达载体pXZP391中，产生质粒pXZP528，pXZP530和pXZP628，pXZP630。
BpLPAAT的表达
如实施例1所述分析在转化的酵母细胞中表达的基因的LPAAT功能及底物特异性。在构建体pXZP628和pXZP630中的这些基因也用于转化品系Ven9和BU18以分析对斑鸠菊酸积累的作用。
实施例13-编码其它B.pulchella脂肪酸代谢酶的基因的分离及表达
从EST序列文库中鉴别了4个克隆Bp202974，Bp209013，Bp209314和Bp213308，它们看起来是全长的并编码酰基转移酶样序列。确定全序列。
Bp202974的完整序列(SEQ ID NO：59)含有1646bp cDNA，编码显示与拟南芥推定的非常长链脂肪酸缩合酶(基因At1g19440)和酰基转移酶(基因At4g34510)的同源性的蛋白质。编码蛋白质的开放读框起自核苷酸99-101的ATG起始密码子并终止于核苷酸1605-1607的TAA终止密码子。推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)与拟南芥推定的非常长链脂肪酸缩合酶(NP_173376)享有84.7％相同性和90.7％相似性。携带来自克隆Bp202974的全长cDNA的BamHI-ApaI片段克隆进pENTR11，产生进入质粒pXZP092E。所述基因然后克隆进酵母表达载体pYES-DEST52和植物表达载体pXZP391中，产生质粒pXZP245和pXZP365。
Bp209013中的基因***序列的完整序列(SEQ ID NO：60)含有1569bpDNA，其编码与Gossypium hirsutum酰基转移酶样蛋白(AAL67994)同源的蛋白质。编码蛋白质的开放读框起自核苷酸71-73的ATG起始密码子并终止于核苷酸1391-1393的TAG终止密码子。推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：18)与Gossypium hirsutum酰基转移酶样蛋白(AAL67994)享有74.0％相同性和84.1％相似性，与拟南芥酰基转移酶(At5g23940)享有63.5％相同性和72.7％相似性。携带来自克隆Bp209013的全长cDNA的BamHI-ApaI片段克隆进pENTR11，产生进入质粒pXZP094E。所述基因然后克隆进酵母表达载体pYES-DEST52和植物表达载体pXZP391中，产生质粒pXZP247和pXZP367。
Bp209314的完整序列(SEQ ID NO：61)含有1553bp cDNA，其编码与拟南芥推定乙酰-CoA酰基转移酶(基因At2g33150)同源的蛋白质。编码蛋白质的开放读框起自核苷酸34-36的ATG起始密码子并终止于核苷酸1417-1419的TAA终止密码子。推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：19)与拟南芥推定的乙酰-CoA酰基转移酶(At2g33150)享有88.8％相同性和93.3％相似性，与Cucumis sativus乙酰-CoA酰基转移酶(CAA47926)享有86.6％相同性和93.3％相似性。另一个EST克隆Bp211052在重叠区域与Bp209314相同，并且可能代表来自相同基因的cDNA。携带来自克隆Bp209314的全长cDNA的EcoRI-XhoI片段克隆进pENTR11，产生进入质粒pXZP0872E。所述基因然后克隆进酵母表达载体pYES-DEST52和植物表达载体pXZP391中，产生质粒pXZP242和pXZP385。
Bp213308的完整序列(SEQ ID NO：62)含有1870bp cDNA，其编码与拟南芥推定的非常长链脂肪酸缩合酶基因At1g04220同源的蛋白质。编码蛋白质的开放读框起自核苷酸45-47的ATG起始密码子并终止于核苷酸1569-1571的TGA终止密码子。推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：20)与Gossypium hirsutum β-酮酰基-CoA合酶(ABV60087)享有81.2％相同性和86.8％相似性，与拟南芥推定的β-酮酰基-CoA合酶(NP_171918)享有74.1％相同性和84.1％相似性。携带来自克隆Bp213308的全长cDNA的EcoRI-XhoI片段克隆进pENTR11，产生进入质粒pXZP088E。所述基因然后克隆进酵母表达载体pYES-DEST52和植物表达载体pXZP391中，产生质粒pXZP243和pXZP386。
实施例14-编码B.pulchella环氧化物酶的基因的分离及表达
当检查EST文库时，两个部分长度克隆Bp202712(SEQ ID NO：63)和Bp210416编码的蛋白质与细胞色素P450型环氧化物酶CYP81D2同源并且与Euphoria lagascae环氧化物酶享有最高同源性，即在测序区域有33.7％相同性和48.3％相似性。这两个克隆除了一个克隆在5′末端长4个碱基以外是相同的，提示它们是来自相同基因的两个部分cDNA。部分克隆Bp202712的推导氨基酸序列示于SEQ ID NO：21。全长cDNA克隆通过筛选cDNA文库获得。
检查EST文库还鉴别了由克隆Bp203803编码的一个FAD2样序列。Bp203803的全长cDNA序列长度为1492bp(SEQ ID NO：64)。编码蛋白质的开放读框起自核苷酸117-119的ATG起始密码子并终止于核苷酸1266-1268的TGA终止密码子。推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：22)与拟南芥FAD2(At3g12120)享有78.1％相同性和87.0％相似性。
用来自Bp203803的EcoRI-EcoRI cDNA片段在50℃筛选cDNA文库，在50℃在2xSSC/0.1％SDS，0.5xSSC/0.1％SDS and 0.2xSSC/0.1％SDS中各洗涤15分钟后产生60个阳性噬斑。在纯化单个噬斑后，经体内切除处理13个噬斑，确定它们的序列。从这些克隆鉴别了两个具有FAD2样序列的克隆，它们与Bp203803高度同源但是不相同。克隆Bp500653是具有1122bpcDNA的cDNA克隆(SEQ ID NO：65)。其推导氨基酸序列(SEQ ID NO：23)与拟南芥FAD2(At3g12120)享有73.1％相同性和81.4％相似性，与由Bp203803编码的蛋白质(SEQ ID NO：38)享有63.5％相同性和70.1％相似性。从分离这个序列的全长克隆。
另一个克隆Bp500673含有大小为1433bp的全长cDNA(SEQ ID NO：66)，其编码FAD2样蛋白。编码蛋白质的开放读框起自核苷酸111-113的ATG起始密码子并终止于核苷酸1260-1262的TGA终止密码子。其推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：24)与拟南芥FAD2(At3g12120)享有78.4％相同性和87.2％相似性，与Bp203803(SEQ ID NO：22)享有98.2％相同性和98.7％相似性。
FAD-2样克隆Bp203803的EcoRI cDNA片段被***pENTR11中，产生pXZP089E。Crepis palaestinaΔ12-环氧化物酶Cpal2(Lee et al.，1998)的EcoRI cDNA片段也克隆进pENTR11，产生pXZP090E。这些质粒中的基因然后克隆进酵母表达载体pYES-DEST52中，分别产生质粒pXZP244和pXZP286。来自Bp203803的FAD2样基因的功能正在与酵母细胞中的Cpal2进行比较。将来自Bp203803的基因加入到酵母细胞中导致从油酸(C18:1)产生亚油酸(C18:2)，产生作为总脂肪酸含量百分比20.3％的亚油酸，证实该克隆编码Δ12去饱和酶(FAD2)。pXZP089E和pXZP090E中的基因还被克隆进植物表达载体pXZP391中，它们的功能在转基因植物中被证实。当在Arabidopsis MC49中表达时，pXZP089E不导致斑鸠菊酸生成，显示这个基因不编码环氧化物酶。来自克隆Bp500673的基因的表达质粒正在被构建。
实施例15-在亚麻子中产生环氧基脂肪酸
Δ12-环氧化物酶基因Capl2在亚麻中的表达
亚麻(Linum usitatissimum)sp.Ward用Crepis palaestinaΔ12-环氧化物酶基因Cpal2(单基因构建体pXZP371)或者同时含有Cpal2和CrepispalaestinaΔ12-去饱和酶基因Cpdes(双基因构建体pXZP373)的二元载体转化，二者均在亚麻核丝基因启动子(WO 01/16340)控制下表达。T1种子的GC分析显示来自36个pXZP371转基因T0品系的高达2.1％的环氧基脂肪酸及来自26个pXZP373转基因T0品系的2.3％的环氧基脂肪酸。
Δ12-环氧化物酶基因Cpal2在Linola亚麻中的表达
LinolaTM是一种亚麻突变体，其携带导致种子油中Δ12-环氧化物酶底物亚油酸C18:2Δ9，12的高积累(70％)及低亚麻酸(少于2％)C18:3Δ9，12，15的两个(both)内源Δ15-去饱和酶fad3基因中的突变。将表达Cpal2的转基因亚麻植物与Linola品种植物进行杂交以将Δ12-环氧化物酶基因转移进Linola背景。杂交产生来自67个杂交授粉的3000个3000F1种子。经过半种GC分析检查来自21个杂交的F1种子(杂合子)，每个杂交检查10个种子，鉴别了在种子油中含有更高斑鸠菊酸水平的6个杂交后代品系。从这些后代收获F2种子，种植并收获F3种子。来自这些F2植物的10个种子的库的GC分析产生高达11.2％总环氧基脂肪酸，其中28.8％是C18:3Δ9，12，15，提示这个F2植物(R17xEyre-43-34)不是fad3基因突变的纯合子。来自这个品系的10个F3种子的单种子GC分析鉴别了含有15.1％环氧基脂肪酸和2.8％C18:3Δ9，12，15的种子，提示这个种子是两个fad3基因突变纯合的。来自4个F2植物的F3种子基因相似分析被挑选并种植。从一个F3品系收获的F4种子的GC分析显示17.1％总环氧基脂肪酸(16.8％斑鸠菊酸和0.3％环氧基C18:2)，剩余3.7％C18:3。这个F3植物可能是两个fad3基因突变及Cpal2转基因的纯合子。这个品系的单种子分析正在进行。
实施例16-植物中多个基因组合的表达
个体B.pulchella TAG组装酶在产生斑鸠菊酸的Arabidopsis品系中的表达预期鉴别具有对斑鸠菊酸的特异性及因此在转基因种子中有效积累斑鸠菊酸中起作用的酶。有许多酶参与TAG组装，如图2所示。这些酶的功能可能导致在TAG不同sn位置的增加的斑鸠菊酸。为了在种子油中积累最大水平的斑鸠菊酸，所有3个sn位置应被斑鸠菊酸占据。因此，来自B.pulchella TAG组装途径的一个以上的关键酶-优选每种酶相对于非环氧化(epoxygenated)脂肪酸具有对斑鸠菊酸的特异性-的表达预期靶向所有3个位置并导致在种子油中斑鸠菊酸的最大积累。表达来自上述(实施例2-14)B.pulchella TAG组装基因的基因组合的植物表达载体正在被构建并在植物中表达以最大化斑鸠菊酸产生。
实施例17-B.pulchella其它酰基转移酶的克隆
B.pulchella EST测序产生了一些与不同酰基转移酶享有同源性的部分序列。克隆Bp202873(SEQ ID NO：67)和Bp208395(SEQ ID NO：68)编码与拟南芥酰基转移酶样蛋白(AAM62541)同源的氨基酸序列(分别为SEQ IDNO：25和26)。
克隆Bp203237(SEQ ID NO：69)编码与Bp209314同源的氨基酸序列(SEQ ID NO：27)。
克隆Bp215205(SEQ ID NO：70)，Bp212247和Bp204312代表了来自相同基因的cDNA，与拟南芥推定的3-酮酰基-CoA合酶4(KCS-4，非常长链脂肪酸缩合酶4，NP_173376)(VLCFA缩合酶4)同源，在测序的区域有79％的氨基酸序列相同性。由Bp215205编码的部分氨基酸序列示于SEQ IDNO：28。
克隆Bp207528(SEQ ID NO：71)编码与二酰基甘油酰基转移酶享有同源性但不同于BpDGAT1，BpDGAT2和BpDGAT3的部分长度序列(SEQ ID NO：29)。为了分离相应于Bp207528的全长cDNA克隆，克隆Bp207528的cDNA***序列用作探针在高严格性下筛选Bernardia pulchella cDNA文库。在24个阳性噬斑中，两个高度同源的但不相同的序列被分离，即Bp207528a(SEQ ID NO：104)和Bp207528b(SEQ ID NO：105)。Bp207528a和Bp207528b在蛋白质编码区仅11个碱基不同，导致编码蛋白质中1个氨基酸残基差异。Bp207528b还具有更长的5’-UTR，其相对是GA富集的。Bp207528编码具有325个氨基酸的蛋白质(Bp207528a提供为SEQ ID NO：102，而Bp207528b提供为SEQ ID NO：103)，其与Ricinus communis DGAT2蛋白质序列，登录号AAY16324有69％相同性。当与BpDGAT1，DGAT2，DGAT3比较时，Bp207528蛋白与BpDGAT2在蛋白质长度(DGAT2中327个氨基酸)及同源性(68％相同性vs与BpDGAT1或BpDGAT3少于12％相同性)上最相似。本发明人命名这个蛋白质为DGAT样蛋白，尽管其看起来是一蛋白质新类别中的第一个成员。
来自两个克隆的携带全长蛋白质编码区的EcoRI-XhoI片段被***pENTR11中，产生进入质粒pXZP521E和pXZP522E。所述基因然后克隆进酵母表达载体pYES-DEST52和植物表达载体pXZP391中，产生质粒pXZP299、pXZP300和pXZP621、pXZP622。蛋白质的功能在酵母和植物细胞中证实。
实施例18-编码来自B.pulchella的其它脂肪酶的克隆
总共56个EST克隆被鉴别为编码脂肪酶同系物。除了实施例5、9和10描述的磷脂酶A2、C和D之外，其它脂肪酶样克隆包括在此。
克隆Bp202796(全长cDNA)和Bp210074(部分长度cDNA)含有来自SEQ ID NO：72所示同一基因的序列并与Ricinus communis磷脂酶(登录号AAV66577)同源。具有SEQ ID NO：30所示氨基酸序列的编码的蛋白质与具有序列AAV66577的蛋白质有79.24％相同性和86.3％相似性。克隆Bp216215(SEQ ID NO：73)是除了在基因中有额外103bp***以外与Bp202796相同的部分序列，所述***是潜在的未加工的内含子。来自Bp202796的基因作为BamHI-XhoI片段被克隆进pENTR11，产生进入质粒pXZP095E。所述基因随后经LR重组酶反应克隆进酵母表达载体pYES-DEST52和植物表达载体pXZP391中，产生质粒pXZP248和pXZP368。构建体pXZP368用于转化Arabidopsis品系Ven9和BU18，产生在种子中与Cpal2环氧化物酶共表达所述基因的转基因品系。
克隆Bp201480，Bp215365，Bp212451含有来自不同于Bp202796(BpPL-a)但也同源于Ricinus communis磷脂酶AAV66577、在重叠区域与Bp202796具有71.4％相同性的基因的cDNA。来自全长cDNA克隆Bp201480的这个基因(命名为BpPL-b)的部分序列示于SEQ ID NO：74，其氨基酸序列示于SEQ ID NO：31。来自全长cDNA克隆Bp210076的部分序列除了与Bp201480相比时8个碱基变化外与BpPL-b相同。它可能是BpPL-b的同种型。
克隆Bp213710含有3′-末端部分序列(SEQ ID NO：75)，其编码与Ricinus communis磷脂酶AAV66577享有同源性的氨基酸序列(SEQ ID NO：32)，但是不同于BpPL-a或BpPL-b。它可能是BpPL-b的部分序列或者是另一基因家族成员即BpPL-c。
克隆Bp214230含有与拟南芥脂肪酶3类家族蛋白质(NP_190474，At3g49050)同源的部分长度序列(SEQ ID NO：76，BpL-d)。推导的氨基酸序列示于SEQ ID NO：33。
全长cDNA克隆Bp207119含有与另一种拟南芥脂肪酶3类家族蛋白(NP_197365，At5g18640)同源但是与Bp214230趋异的序列(BpL-e)。克隆Bp207119的部分序列示于SEQ ID NO：77，其推导的氨基酸序列示于SEQID NO：34。
克隆Bp201211，Bp203733，Bp207631和Bp214388均是全长cDNA，它们编码在重叠区域相同的序列，提示它们是衍生自同一基因(BpL-f)的EST克隆。Bp207631的部分序列示于SEQ ID NO：78，推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：35)同源于拟南芥家族II胞外脂肪酶3(EXL3，NP_177718，At1g75900)，具有59.2％相同性或72.4％相似性。
克隆Bp201783，Bp201784含有相同的与Arabidopsis脂肪酶(At1g73920)同源的部分长度序列(SEQ ID NO：79，BpL-g)。推导的氨基酸序列示于SEQ ID NO：36。
克隆Bp201910含有与Arabidopsis酯酶/脂肪酶/硫酯酶家族蛋白NP_175685(At1g52760)同源的部分长度序列(SEQ ID NO：80，BpL-h)。推导的氨基酸序列示于SEQ ID NO：37。Bp207135是部分cDNA，在重叠区域与Bp201910相同。
Bp200659含有编码与Arabidopsis推定的溶血磷脂酶(AAM60954)同源的氨基酸序列(SEQ ID NO：38)的序列(SEQ ID NO：81，BpL-i)。
克隆Bp202911含有编码与拟南芥酯酶/脂肪酶/硫酯酶家族蛋白(NP174694，At1g34340)同源的氨基酸序列(SEQ ID NO：39)的部分长度cDNA序列(SEQ ID NO：82)。
18个克隆含有与拟南芥GDSL-基序脂肪酶/水解酶家族蛋白同源的序列。这些克隆可能由一个基因家族的3个成员编码。克隆Bp217030是编码与拟南芥GDSL-基序脂肪酶/水解酶样蛋白(AAL48238，At5g45670)同源的序列的全长cDNA克隆。克隆Bp217030的部分核苷酸序列及推导的氨基酸序列示于SEQ ID NO：83和40。克隆Bp207002与Bp217030相同，但是具有较短的5′-UTR序列。
克隆Bp204437是具有与另一个拟南芥GDSL-基序脂肪酶/水解酶样蛋白(AAM62801，At5g45910)同源的序列的全长cDNA，但是与Bp217030不同。克隆Bp204437的部分核苷酸序列及其氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：84和41。
15个其它克隆被鉴别为具有与第三种拟南芥GDSL-基序脂肪酶/水解酶家族蛋白(NP_974029，At1g54790)同源的序列。克隆Bp207026，Bp208333，Bp212608，Bp215103和Bp215340含有全长cDNA，而Bp212602，Bp201566，Bp207138，Bp202663，Bp203295，Bp215057，Bp209506，Bp203770，Bp217088和Bp201728是部分长度cDNA克隆，从5′末端缺少了不同长度的序列。克隆Bp215340的部分核苷酸序列及其推导的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：85和42。
本领域技术人员应理解可以对特异实施方案所示发明做出各种变异和/或修饰而不偏离本发明精神或范围。因此目前实施方案被认为是举例的而非限制。
本申请要求2008年4月25日申请的US 61/125,438的优先权，其全部内容引入本文作参考。
本文讨论和/或引用的所有出版物均全文引入本文。
本申请包括的文件、条例、材料、装置、文章等的任何讨论仅是为本发明提供上下文。不应认为允许任何或所有这些内容构成在本申请的每项权利要求的优先权日之前的现有技术基础或作为与本领域相关的领域的常识。
参考文献
Abdullah et al.(1986)Biotechnology 4：1087.
Almeida and Allshire(2005)TRENDS Cell Biol.，15：251-258.
Banas et al.(2000).Biochem.Soc.Trans.28：703-705.
Baumlein et al.(1991)Mol.Gen.Genet.225：459-467.
Baumlein et al.(1992)Plant J.2：233-239.
Bourque(1995)Plant Sci.105：125-149.
Broun et al.(1998)Plant J.13：201-210.
Cahoon et al(2003).Plant J.34：671-683.
Cahoon et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.96：12935-40.
Capecchi(1980)Cell 22：479-488.
Cheng et al.(1996)Plant Cell Rep.15：653-657.
Clapp(1993)Clin.Perinatol.20：155-168.
Curiel et al.(1992)Hum.Gen.Ther.3：147-154.
Dahlqvist et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6487-6492.
Dauk et al(2007)Plant Sci.173：43-49.
Dyer(2002)Plant Physiol.130：2027-2038.
Dyer and Mullen(2008)Physiologia Plantarum 132：11-22.
Eglitis et al.(1988)Biotechniques 6：608-614.
Fujimura et al.(1985)Plant Tissue Culture Letters 2：74.
Graham et al.(1973)Virology 54：536-539.
Grant et al.(1995)Plant Cell Rep.15：254-258.
Harayama(1998).Trends Biotechnol.16：76-82.
Haseloff and Gerlach(1988)Nature 334：585-591.
Hatanaka et al(2004)Phytochemistry 65：2189-2196.
Hobbs et al.(2000)Biochem.Soc.Trans.28：687-689.
Iwabuchi et al(2003)J.Biol.Chem.278：4603-4610.
Knutzon et al.(1998)J.Biol.Chem.273：29360-6.
Koziel et al.(1996)Plant.Mol.Biol.32：393-405.
Lardizabal et al.(2001)J.Biol.Chem.276：38862-38869.
Lassner et al.(1995)Plant Physiol.109：1389-1394.
Lee et al.(1998)Science 280：915-918.
Lu et al.(1993)J.Exp.Med.178：2089-2096.
Lu et al.(2006)Plant J.45：847-856.
Millar and Waterhouse(2005)Funct.Integr.Genomics 5：129-135.
Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453.
Pasquinelli et al.(2005)Curr.Opin.Genet.Develop.，15：200-205.
Perriman et al.(1992)Gene 113：157-163.
Qin et al.(2002)Plant Physiol.128：1057-1068.
Qiu et al.(2001)J.Biol.Chem.276：31561-31566.
Saha et al.(2006)Plant Physiol.141：1533-1543.
Schaloske et al.(2000)Biochim Biophys Acta 1761：1246-1259
Senior(1998)Biotech.Genet.Engin.Revs.15：79-119.
Shippy et al.(1999)Mol.Biotech.12：117-129.
Shockey et al.(2006)Plant Cell 18：2294-2313.
Singh et al.(2001)Planta 212：872-879.
Smith et al.(2000)Nature 407：319-320.
Stalberg et al.(1993)Plant.Mol.Biol.23：671-683.
Stoutjesdijk et al.(2002)Plant Physiol.129：1723-1731.
Toriyama et al.(1986)Theor.Appl.Genet.205：34.
van de Loo et al.(1995)Proc Natl Acad Sci USA.92：6743-7.
Wagner et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6099-6103.
Waterhouse et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13959-13964.
Zheng et al.(2003)Plant Cell 15：1872-1887.
Zhou et al.(2006)Funct.Plant Biol.33：585-592.
Zou et al.(1999)Plant J.19：645-653.
Figure IPA00001279029500011
Figure IPA00001279029500021
Figure IPA00001279029500031
Figure IPA00001279029500041
Figure IPA00001279029500061
Figure IPA00001279029500071
Figure IPA00001279029500081
Figure IPA00001279029500091
Figure IPA00001279029500101
Figure IPA00001279029500111
Figure IPA00001279029500121
Figure IPA00001279029500131
Figure IPA00001279029500141
Figure IPA00001279029500151
Figure IPA00001279029500161
Figure IPA00001279029500191
Figure IPA00001279029500211
Figure IPA00001279029500221
Figure IPA00001279029500231
Figure IPA00001279029500241
Figure IPA00001279029500251
Figure IPA00001279029500261
Figure IPA00001279029500271
Figure IPA00001279029500281
Figure IPA00001279029500301
Figure IPA00001279029500311
Figure IPA00001279029500321
Figure IPA00001279029500341
Figure IPA00001279029500351
Figure IPA00001279029500361
Figure IPA00001279029500371
Figure IPA00001279029500381
Figure IPA00001279029500391
Figure IPA00001279029500401
Figure IPA00001279029500411
Figure IPA00001279029500421
Figure IPA00001279029500431
Figure IPA00001279029500451
Figure IPA00001279029500461
Figure IPA00001279029500471
Figure IPA00001279029500491
Figure IPA00001279029500501
Figure IPA00001279029500511
Figure IPA00001279029500521
Figure IPA00001279029500541
Figure IPA00001279029500551
Figure IPA00001279029500561
Figure IPA00001279029500581
Figure IPA00001279029500591
Figure IPA00001279029500601
Figure IPA00001279029500611
Figure IPA00001279029500621
Figure IPA00001279029500631
Figure IPA00001279029500641
Figure IPA00001279029500651
Figure IPA00001279029500661
Figure IPA00001279029500671
Figure IPA00001279029500681
Figure IPA00001279029500691
Figure IPA00001279029500701
Figure IPA00001279029500711
Figure IPA00001279029500721
Figure IPA00001279029500731
Figure IPA00001279029500741
Figure IPA00001279029500751
Figure IPA00001279029500761
Figure IPA00001279029500771
Figure IPA00001279029500781
Figure IPA00001279029500801
Figure IPA00001279029500811
Figure IPA00001279029500821
Figure IPA00001279029500831
Figure IPA00001279029500841
Figure IPA00001279029500851

Claims (61)

1.生产种子油的方法，包括如下步骤：
i)获得在其种子油中具有一或多种修饰的脂肪酸的转基因种子，以及
ii)加工该种子以提取种子油，
其中修饰的脂肪酸包含官能团羟基、环氧基、炔基(acetylenic group)或共轭双键，且其中种子油脂肪酸含量的至少23％(mol％)包含所述官能团，和/或在种子油中具有所述官能团的脂肪酸与缺乏所述官能团的脂肪酸的摩尔比是至少23∶77。
2.权利要求1的方法，其中种子油脂肪酸含量的至少27％(mol％)包含所述官能团。
3.权利要求1或2的方法，其中所述种子来自芸苔，Gossypium hirsutum，亚麻，向日葵，红花，大豆，玉蜀黍或者拟南芥。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述方法进一步包括收获种子，粉碎种子和/或纯化种子油。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中：
i)种子油总脂肪酸含量中低于4％(mol％)是亚麻酸，
ii)在种子油中总三酰基甘油的sn-3位置酯化的脂肪酸的至少4％或者至少10％(mol％)包含所述官能团，
iii)在种子油中总三酰基甘油的sn-2位置酯化的脂肪酸的至少4％或者至少10％(mol％)包含所述官能团，
iv)在种子油中总三酰基甘油的sn-1位置酯化的脂肪酸的至少4％或者至少10％(mol％)包含所述官能团，
v)至少10％的种子油是bi-vernoleate或者二-蓖麻油酸酯，和/或
vi)至少4％的种子油是tri-vernoleate或者三-蓖麻油酸酯。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中具有所述官能团的脂肪酸是：
i)C14，C16，C18，C20，C22或C24脂肪酸或者其任两或多种的组合，
ii)主要是C18脂肪酸，和/或
iii)是C18:1的12，13-环氧基衍生物，或者C18:1的12-羟基衍生物。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中：i)羟基基团与酰基链的碳-12键合，ii)环氧基基团或炔基基团在酰基链的碳12和13之间，或者iii)共轭双键在修饰的脂肪酸的酰基链的碳11和12之间。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中转基因种子包含编码脂肪酸羟化酶、脂肪酸环氧化物酶(epoxygenase)、脂肪酸炔化酶(acetylenase)或者脂肪酸接合酶(conjugase)的外源多核苷酸。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中转基因种子包含编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)、甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)、酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)、CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT)、磷脂酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)或者二酰基甘油:二酰基甘油酰基转移酶(DDAT)或者其两或多种的组合的外源多核苷酸。
10.权利要求1-9任一项的方法，其中转基因种子包含：
i)编码DGAT、GPAT、LPAAT、LPCAT、PLA2、CPT和PDAT的一或多种外源多核苷酸，
ii)编码DGAT、GPAT、LPAAT、LPCAT、PLA2和PDAT的一或多种外源多核苷酸，
iii)编码GPAT、LPAAT、DGAT2和/或PDAT的一或多种外源多核苷酸，
iv)编码GPAT和LPAAT的一或多种外源多核苷酸，
v)编码GPAT和DGAT2和/或DGAT3的一或多种外源多核苷酸，
vi)编码LPAAT和DGAT2和/或DGAT3的一或多种外源多核苷酸，
vii)编码GPAT、LPAAT和DGAT2和/或DGAT3的一或多种外源多核苷酸，或者
viii)编码LPCAT和/或PLA2的一或多种外源多核苷酸。
11.权利要求1-10任一项的方法，其中转基因种子进一步包含编码去饱和酶和/或延长酶的外源多核苷酸。
12.权利要求1-11任一项的方法，其中转基因种子进一步包含导入的突变或者外源多核苷酸，其下调种子的内源酶的产生和/或活性，所述内源酶选自DGAT、GPAT、LPAAT、LPCAT、PLA2、PLC、PLD、CPT、PDAT、DDAT、去饱和酶，或者延长酶或者其两种或多种的组合。
13.权利要求12的方法，其中外源多核苷酸选自：反义多核苷酸、有义多核苷酸、催化多核苷酸、microRNA、编码结合所述内源酶的多肽的多核苷酸及双链RNA。
14.权利要求12或13的方法，其中所述下调内源酶的产生和/或活性的外源多核苷酸不显著影响由种子中转基因编码的酶的产生和/或活性。
15.权利要求12-14任一项的方法，其中对于种子产生的每种转基因多肽，直向同源内源多肽的水平和/或活性当与等基因非转基因种子相比被下调。
16.转基因种子，其包含一或多种修饰的脂肪酸，所述修饰的脂肪酸包含官能团，所述官能团是羟基、环氧基、炔基或者共轭双键，其中所述种子的种子油脂肪酸含量的至少23％(mol％)包含所述官能团，和/或在种子油中具有所述官能团的脂肪酸与缺乏所述官能团的脂肪酸的摩尔比是至少23∶77。
17.转基因种子，其选自：
i)在其种子油中具有斑鸠菊酸和/或蓖麻油酸的红花种子，其中种子油总脂肪酸含量的至少17％(mol％)是斑鸠菊酸和/或蓖麻油酸，其中种子包含编码脂肪酸羟化酶或者脂肪酸环氧化物酶的外源多核苷酸，
ii)在其种子油中具有斑鸠菊酸和/或蓖麻油酸的Gossypium hirsutum种子，其中种子油总脂肪酸含量的至少17％(mol％)是斑鸠菊酸和/或蓖麻油酸，其中种子包含编码脂肪酸羟化酶或者脂肪酸环氧化物酶的外源多核苷酸，
iii)在其种子油中具有斑鸠菊酸和/或蓖麻油酸的芸苔种子，其中种子油总脂肪酸含量的至少15％(mol％)是斑鸠菊酸和/或蓖麻油酸，其中种子包含编码脂肪酸羟化酶或者脂肪酸环氧化物酶的外源多核苷酸，
iv)在其种子油中具有斑鸠菊酸和/或蓖麻油酸的亚麻种子，其中种子油总脂肪酸含量的至少15％(mol％)是斑鸠菊酸和/或蓖麻油酸，其中种子包含编码脂肪酸羟化酶或者脂肪酸环氧化物酶的外源多核苷酸。
18.权利要求16或17的的种子，其包含权利要求5-15定义的一或多种特征。
19.转基因植物，其产生权利要求16-18任一项的种子。
20.权利要求19的植物，其是芸苔、Gossypium hirsutum、亚麻、向日葵、红花、大豆、玉蜀黍或者拟南芥物种。
21.包含一或多种修饰的脂肪酸的种子油，所述修饰的脂肪酸包含官能团，所述官能团是羟基、环氧基、炔基或者共轭双键，其中种子油脂肪酸含量的至少23％(mol％)包含所述官能团，和/或在种子油中具有所述官能团的脂肪酸与缺乏所述官能团的脂肪酸的摩尔比是至少23∶77。
22.权利要求21的种子油，其包含和/或得自包含权利要求5-15定义的种子一或多种特征。
23.权利要求16-18任一项的产生种子的方法，其包括生长权利要求19或20的植物并收获种子。
24.增强植物组织或器官中一或多种修饰的脂肪酸的产生的方法，所述方法包括在植物组织或器官中表达：
i)编码脂肪酸羟化酶、脂肪酸环氧化物酶、脂肪酸炔化酶、脂肪酸接合酶或其两种或多种的组合的第一外源多核苷酸，以及
ii)编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)、甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)、酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)、CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT)、磷脂酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)或者二酰基甘油:二酰基甘油酰基转移酶(DDAT)、或其两种或多种的组合的第二外源多核苷酸，
其中所述修饰的脂肪酸包含官能团，所述官能团是羟基、环氧基、炔基或者共轭双键，其中产生的增强使得在用氯仿/甲醇从所述组织或器官提取总脂肪酸后，在所述组织或器官的油中所述包含官能团的修饰的脂肪酸的水平作为植物组织或器官的总脂肪酸含量的百分比增加至少6％，并且其中所述至少6％的增加是相对于具有所述第一外源多核苷酸但是缺乏第二外源多核苷酸的相应组织或器官中的总脂肪酸水平而言。
25.产生转基因细胞的方法，所述转基因细胞与等基因非转基因细胞相比具有增强的产生一或多种修饰的脂肪酸的能力，所述方法包括向细胞中导入：
i)编码脂肪酸羟化酶、脂肪酸环氧化物酶、脂肪酸炔化酶、脂肪酸接合酶或其两种或多种的组合的第一外源多核苷酸，
ii)编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)、甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)、酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)、CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT)、磷脂酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)或者二酰基甘油:二酰基甘油酰基转移酶(DDAT)、或其两种或多种的组合的第二外源多核苷酸多肽，以及
iii)分析细胞或其后代的与等基因非转基因细胞相比增强的产生修饰的脂肪酸的能力，
其中所述修饰的脂肪酸包含官能团，所述官能团是羟基、环氧基、炔基或者共轭双键，并且其中步骤i)和ii)可以同时进行或者以任何顺序相继进行。
26.权利要求25的方法，其中所述细胞是植物细胞，所述方法进一步包括产生转基因植物。
27.权利要求25或26的方法，其中所述方法进一步包括选择产生油的细胞，其中所述的油的脂肪酸含量的至少23％(mol％)包含所述官能团，和/或其中所述方法进一步包括选择产生油的细胞，其中在所述的油中具有所述官能团的脂肪酸与缺乏所述官能团的脂肪酸的摩尔比是至少23∶77。
28.使用权利要求25-27任一项的方法获得的细胞或者其后代。
29.产生转基因植物的方法，所述转基因植物与等基因非转基因植物相比产生一或多种修饰的脂肪酸的能力增强，所述方法包括：
i)向第一植物细胞中导入编码脂肪酸羟化酶、脂肪酸环氧化物酶、脂肪酸炔化酶、脂肪酸接合酶或其两种或多种的组合的第一外源多核苷酸，
ii)向第二植物细胞中导入编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)、甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)、酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)、CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT)、磷脂酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)、二酰基甘油:二酰基甘油酰基转移酶(DDAT)、或其两种或多种的组合的第二外源多核苷酸，
iii)从所述第一植物细胞产生包含所述第一外源多核苷酸的第一植物，
iv)从所述第二植物细胞产生包含所述第二外源多核苷酸的第二植物，以及
v)将所述第一植物或其后代与所述第二植物或其后代杂交以产生包含所述第一外源多核苷酸和第二外源多核苷酸的植物，
其中所述修饰的脂肪酸包含官能团，所述官能团是羟基、环氧基、炔基或者共轭双键，并且其中步骤i)和ii)可以同时进行或者以任何顺序相继进行，步骤iii)和iv)可以同时进行或者以任何顺序相继进行。
30.权利要求29的方法，其中所述方法进一步包括分析第一植物、第二植物、产生自步骤v)的植物和/或其后代的与等基因非转基因植物相比增强的产生修饰的脂肪酸的能力。
31.使用权利要求29或30的方法获得的植物或者后代植物。
32.生产包含一或多种修饰的脂肪酸的油的方法，所述方法包括在转基因细胞中表达：
i)编码脂肪酸羟化酶、脂肪酸环氧化物酶、脂肪酸炔化酶、脂肪酸接合酶或其两种或多种的组合的第一外源多核苷酸，及
ii)编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)、甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)、酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)、CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT)、磷脂酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)或者二酰基甘油:二酰基甘油酰基转移酶(DDAT)、或其两种或多种的组合的第二外源多核苷酸，
其中所述修饰的脂肪酸包含官能团，所述官能团是羟基、环氧基、炔基或者共轭双键。
33.权利要求32的方法，其中所述细胞是植物细胞或适合发酵的细胞。
34.权利要求32或33的方法，其中所述方法进一步包括在转基因细胞中表达第三外源多核苷酸，所述第三外源多核苷酸下调选自GPAT、LPAAT、DGAT、LPCAT、PLA2、PLC、PLD、CPT、PDAT、DDAT，去饱和酶或延长酶或其两种或多种的组合的种子内源酶的产生和/或活性。
35.第一外源多核苷酸和第二外源多核苷酸在产生转基因细胞中的用途，所述第一外源多核苷酸编码脂肪酸羟化酶、脂肪酸环氧化物酶、脂肪酸炔化酶、脂肪酸接合酶或其两种或多种的组合，所述第二外源多核苷酸编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)、甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)、酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)、CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT)、磷脂酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)或二酰基甘油:二酰基甘油酰基转移酶(DDAT)，或其两种或多种的组合，所述转基因细胞与等基因非转基因细胞相比具有增强的产生一或多种修饰的脂肪酸的能力，其中所述修饰的脂肪酸包含官能团，所述官能团是羟基、环氧基、炔基或者共轭双键。
36.真核细胞，其包含编码多肽的外源多核苷酸，所述多肽是：
i)具有SEQ ID NO：1-42、98、99、102或103任一氨基酸序列的多肽，
ii)具有与SEQ ID NO：1-42、98、99、102或103任一或多个序列至少30％相同的氨基酸序列的多肽，和/或
iii)是i)或ii)的生物学活性片段的多肽。
37.权利要求36的细胞，其中所述多肽是二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)、甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)、酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)、CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT)、磷脂酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)、二酰基甘油:二酰基甘油酰基转移酶(DDAT)、环氧化物酶、酰基转移酶和/或磷脂酶。
38.鉴别在脂肪酸-CoA产生或者脂肪酸修饰中参与三酰基甘油合成的核酸分子的方法，包括：
i)获得与启动子可操纵连接的核酸分子，所述核酸分子编码多肽，所述多肽包含具有与SEQ ID NO：1-5、7-16、21-24、98、99、102或103任一或多个序列至少30％相同的序列的氨基酸，
ii)将所述核酸分子导入所述启动子在其中有活性的细胞或者无细胞表达***，
iii)确定相对于导入所述核酸之前的细胞或无细胞表达***，三酰基甘油和/或脂肪酸-CoA的产生或者脂肪酸的修饰是否被修饰，及
iv)任选地，选择修饰三酰基甘油、脂肪酸-CoA或者脂肪酸的产生的核酸分子。
39.权利要求38的方法，其中三酰基甘油或者脂肪酸-CoA包含修饰的脂肪酸，所述修饰的脂肪酸包含官能团，所述官能团是羟基、环氧基、炔基或者共轭双键或其两种或多种的组合。
40.权利要求38或39的方法，其中所述核酸编码酶，所述酶具有甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)、二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)、磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)、CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT)、磷脂酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)、二酰基甘油:二酰基甘油酰基转移酶(DDAT)、酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)、磷脂酶A2(PLA2)、环氧化物酶或者Δ12去饱和酶的活性。
41.鉴别编码酰基转移酶或者磷脂酶的核酸分子的方法，包括：
i)获得与启动子可操纵连接的核酸分子，所述核酸分子编码多肽，所述多肽包含具有与SEQ ID NO：1-20、25-42、98、99、102或者103任一个或多个序列至少30％相同的序列的氨基酸，
ii)将所述核酸分子导入所述启动子在其中有活性的细胞或者无细胞表达***，
iii)确定相对于导入所述核酸之前的细胞或无细胞表达***，脂肪酸组成成分如脂肪酸-CoA:脂肪酸-PC:三酰基甘油的比率是否改变，及
iv)任选地，选择改变脂肪酸组成成分的核酸分子。
42.基本纯化的和/或重组多肽，其包含具有SEQ ID NO：1-42、98、99、102或103任一序列的氨基酸，其生物学活性片段，或者与SEQ ID NO：1-42、98、99、102或103任一个或多个序列具有至少30％相同性的氨基酸序列。
43.权利要求42的多肽，其中所述多肽是二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)、甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)、酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)、CDP-胆碱二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT)、磷脂酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)、二酰基甘油:二酰基甘油酰基转移酶(DDAT)、脂肪酸环氧化物酶、酰基转移酶和/或磷脂酶。
44.权利要求42或43的多肽，所述多肽在第一酯化脂肪酸底物上具有增强的酶活性，所述底物包含一条、二条或三条酰基链，每条链可以相同或不同，其中一条、二条或三条底物酰基链包含官能团，所述官能团是羟基、环氧基、炔基或者共轭双键或其两种或多种的组合，其中增强的活性是相对于缺乏所述官能团的另一个相应的酯化脂肪酸底物而言。
45.权利要求42-44任一项的多肽，其中第一脂肪酸底物是包含所述官能团的酰基-CoA底物或者在sn-2位置酯化的酰基链上包含所述官能团的二酰基甘油底物或磷脂酰胆碱二酰基甘油底物。
46.权利要求42-45任一项的多肽，其是进一步包含至少一个其它多肽序列的融合蛋白。
47.分离的和/或外源多核苷酸，其包含：
i)选自SEQ ID NO：43-85、100、101、104或105中的任一个的核苷酸序列，
ii)编码权利要求42-46任一项的多肽的核苷酸序列，
iii)与SEQ ID NO：43-85、100、101、104或105的一或多个序列的蛋白质编码区至少30％相同的核苷酸序列，和/或
iv)在严格条件下与i)-iii)的任一个序列杂交的序列。
48.包含权利要求47的多核苷酸的嵌合载体，其中所述多核苷酸与启动子可操纵地连接。
49.包含权利要求42-46任一项的重组多肽、权利要求47的外源多核苷酸和/或权利要求48的载体的细胞。
50.产生权利要求42-46任一项多肽的方法，所述方法包括在细胞或无细胞表达***中表达权利要求48的载体。
51.包含权利要求28、36、37和49任一项的细胞的转基因非人生物体。
52.权利要求51的生物体，其是转基因植物或者适于发酵的生物体如酵母或真菌。
53.包含权利要求28、36、37和49任一项的细胞的种子。
54.产生种子的方法，所述方法包括：
a)生长权利要求19、20和31任一项的的植物，及
b)收获种子。
55.生产含有修饰的脂肪酸的油的方法，所述方法包括从权利要求16-18和53任一项的种子、权利要求19、20和31任一项的植物、权利要求28、36、37和49任一项的细胞和/或权利要求51或52的的转基因非人生物体中提取油。
56.权利要求55的方法，其中所述细胞是适于发酵的生物体的细胞，所述方法进一步包括使所述细胞暴露于至少一种脂肪酸前体。
57.发酵方法，其包括如下步骤：
i)提供含有液体组合物的容器，所述液体组合物包含权利要求28、36、37和49任一项的细胞或者适合发酵的包含所述细胞的生物体及发酵和脂肪酸生物合成所需的组分，及
ii)提供适于所述容器中含有的液体组合物的发酵的条件。
58.生产修饰的脂肪酸或者脂肪酸-CoA的方法，或者进行环氧化物酶反应、去饱和酶反应、酰基转移酶反应或者磷脂酶反应的方法，所述方法包括将可与磷脂酰胆碱、甘油或CoA酯化的脂肪酸与权利要求42-46任一项的多肽接触。
59.油或脂肪酸，其产自或者得自权利要求16-18和53任一项的种子、权利要求19、20和31任一项的植物、权利要求28、36、37和49任一项的细胞和/或权利要求51或52的转基因非人生物体。
60.权利要求16-18和53任一项的种子、权利要求19、20和31任一项的植物、权利要求21或22的种子油、权利要求28、36、37和49任一项的细胞、权利要求42-46任一项的多肽、权利要求47的多核苷酸、权利要求48的载体、权利要求51或52的转基因非人生物体和/或权利要求59的油或脂肪酸在生产工业产品中的应用。
61.组合物，其包含权利要求16-18和53任一项的种子、权利要求19、20和31任一项的植物、权利要求21或22的种子油、权利要求28、36、37和49任一项的细胞、权利要求42-46任一项的多肽、权利要求47的多核苷酸、权利要求48的载体、权利要求51或52的转基因非人生物体和/或权利要求59的油或脂肪酸以及合适的载体。
CN2009801234808A 2008-04-25 2009-04-24 用于产生包含修饰的脂肪酸的三酰基甘油的多肽及方法 Pending CN102170774A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12543808P 2008-04-25 2008-04-25
US61/125,438 2008-04-25
PCT/AU2009/000517 WO2009129582A1 (en) 2008-04-25 2009-04-24 Polypeptides and methods for producing triacylglycerols comprising modified fatty acids

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102170774A true CN102170774A (zh) 2011-08-31

Family

ID=41216348

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009801234808A Pending CN102170774A (zh) 2008-04-25 2009-04-24 用于产生包含修饰的脂肪酸的三酰基甘油的多肽及方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20110218348A1 (zh)
CN (1) CN102170774A (zh)
AU (1) AU2009240794A1 (zh)
BR (1) BRPI0911606A2 (zh)
CA (1) CA2722275A1 (zh)
WO (1) WO2009129582A1 (zh)
ZA (1) ZA201008170B (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104271743A (zh) * 2011-12-27 2015-01-07 联邦科学技术研究组织 产生脂质的方法
CN105039394A (zh) * 2015-09-08 2015-11-11 内蒙古民族大学 一种获得蓖麻油酸含量提高的蓖麻新材料的方法
CN107674876A (zh) * 2016-08-01 2018-02-09 西北农林科技大学 MoKCS基因、该基因编码的酶及其应用
CN109477060A (zh) * 2016-06-28 2019-03-15 费尔曼塔格公司 增加tag产量的修饰藻类
CN109679931A (zh) * 2019-01-30 2019-04-26 天津大学 一种苦皮藤酰基转移酶35019及其基因序列
CN113502295A (zh) * 2021-06-09 2021-10-15 西北农林科技大学 TmLPCAT基因用于提高三酰甘油sn-2位超长链脂肪酸含量的应用
CN114615881A (zh) * 2019-08-07 2022-06-10 罗特哈姆斯泰德研究有限公司 产生甘油三酯的非人类生物体

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7807849B2 (en) 2004-04-22 2010-10-05 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
CA3023314C (en) 2004-04-22 2019-12-10 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
WO2008006171A1 (en) 2006-07-14 2008-01-17 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Altering the fatty acid composition of rice
EP2059588A4 (en) 2006-08-29 2010-07-28 Commw Scient Ind Res Org FATTY ACID SYNTHESIS
US8168858B2 (en) 2008-06-20 2012-05-01 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-9 fatty acid elongase genes and their use in making polyunsaturated fatty acids
AU2009273755A1 (en) 2008-07-21 2010-01-28 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Improved vegetable oils and uses therefor
EP2315519B1 (en) 2008-07-21 2016-08-17 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Improved cottonseed oil and uses
DK2358882T3 (da) 2008-11-18 2017-11-06 Commw Scient Ind Res Org Enzymer og fremgangsmåder til fremstilling af omega-3 fedtsyrer
US8431772B1 (en) * 2008-11-19 2013-04-30 University Of Kentucky Research Foundation Diacylglycerol acyltransferase sequences and related methods
BR112012015641A2 (pt) * 2009-12-24 2015-11-24 Du Pont "polinucleotídeo isolado, construtor de dna recombinante, célula hospedeira, método para produzir uma planta transformada, para aumentar o teor de pelo menos um um ácido graxo, para aumentar pelo menos uma eficiencia de conversão, semente transgênica, plantas, óleos, alimento humano ou de animal e plantas de progênie"
ES2640100T3 (es) * 2010-06-28 2017-10-31 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Métodos para producir lípidos
US8809026B2 (en) 2011-12-27 2014-08-19 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Processes for producing lipids
US11639507B2 (en) 2011-12-27 2023-05-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Processes for producing lipids
SG11201406843WA (en) 2012-04-25 2014-11-27 Commw Scient Ind Res Org High oleic acid oils
AU2013255080A1 (en) * 2012-04-30 2014-12-18 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Fatty acid modification and tag assembly genes
KR102197208B1 (ko) 2012-06-15 2021-01-04 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션 식물 세포에서 장쇄 다중불포화 지방산의 생성
EP2861727B1 (en) 2012-06-19 2018-03-21 E. I. du Pont de Nemours and Company Mutant acyl-coa:lysophosphatidylcholine acyltransferases
BR112016006839A8 (pt) 2013-10-04 2017-10-03 Solazyme Inc Óleos customizados
PE20170253A1 (es) 2013-12-18 2017-04-14 Nuseed Pty Ltd Lipido que comprende acidos grasos poliinsaturados de cadena larga
WO2015184303A1 (en) 2014-05-29 2015-12-03 Novogy, Inc. Increasing lipid production in oleaginous yeast
CA2953008C (en) 2014-06-27 2024-03-19 Nuseed Pty Ltd Lipid comprising docosapentaenoic acid
EP4303288A3 (en) 2014-07-07 2024-03-06 Nuseed Global Innovation Ltd Processes for producing industrial products from plant lipids
CN107960101A (zh) 2015-04-06 2018-04-24 柯碧恩生物技术公司 具有lpaat消融的产油微藻
EP3507370A4 (en) 2016-09-02 2020-06-24 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation PLANTS WITH MODIFIED TRAITS
US20180142218A1 (en) 2016-10-05 2018-05-24 Terravia Holdings, Inc. Novel acyltransferases, variant thioesterases, and uses thereof
US11913006B2 (en) 2018-03-16 2024-02-27 Nuseed Global Innovation Ltd. Plants producing modified levels of medium chain fatty acids

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030115632A1 (en) * 1998-07-02 2003-06-19 Lardizabal Kathryn Dennis Diacylglycerol acyl transferase proteins
US6620986B1 (en) * 1999-11-23 2003-09-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Transformation of Ricinus communis, the castor plant
WO2006127655A2 (en) * 2005-05-20 2006-11-30 Washington State University Enhancement of hydroxy fatty acid accumulation in oilseed plants

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5504200A (en) * 1983-04-15 1996-04-02 Mycogen Plant Science, Inc. Plant gene expression
US4945050A (en) * 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5420034A (en) * 1986-07-31 1995-05-30 Calgene, Inc. Seed-specific transcriptional regulation
US5188958A (en) * 1986-05-29 1993-02-23 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in brassica species
US5177010A (en) * 1986-06-30 1993-01-05 University Of Toledo Process for transforming corn and the products thereof
SE455438B (sv) * 1986-11-24 1988-07-11 Aga Ab Sett att senka en brennares flamtemperatur samt brennare med munstycken for oxygen resp brensle
US5004863B2 (en) * 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
US5416011A (en) * 1988-07-22 1995-05-16 Monsanto Company Method for soybean transformation and regeneration
US5932479A (en) * 1988-09-26 1999-08-03 Auburn University Genetic engineering of plant chloroplasts
US5141131A (en) * 1989-06-30 1992-08-25 Dowelanco Method and apparatus for the acceleration of a propellable matter
US5877402A (en) * 1990-05-01 1999-03-02 Rutgers, The State University Of New Jersey DNA constructs and methods for stably transforming plastids of multicellular plants and expressing recombinant proteins therein
US5451513A (en) * 1990-05-01 1995-09-19 The State University of New Jersey Rutgers Method for stably transforming plastids of multicellular plants
US5384253A (en) * 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
US5518908A (en) * 1991-09-23 1996-05-21 Monsanto Company Method of controlling insects
US5593874A (en) * 1992-03-19 1997-01-14 Monsanto Company Enhanced expression in plants
US5362865A (en) * 1993-09-02 1994-11-08 Monsanto Company Enhanced expression in plants using non-translated leader sequences
US5545818A (en) * 1994-03-11 1996-08-13 Calgene Inc. Expression of Bacillus thuringiensis cry proteins in plant plastids
US6310194B1 (en) * 1994-09-26 2001-10-30 Carnegie Institution Of Washington Plant fatty acid hydroxylases
US5850026A (en) * 1996-07-03 1998-12-15 Cargill, Incorporated Canola oil having increased oleic acid and decreased linolenic acid content
US6432684B1 (en) * 1997-04-11 2002-08-13 Abbott Laboratories Human desaturase gene and uses thereof
NZ500542A (en) * 1997-04-15 2000-11-24 Commw Scient Ind Res Org Plant fatty acid epoxygenase genes and uses therefor
US7589253B2 (en) * 1997-04-15 2009-09-15 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Fatty acid epoxygenase genes from plants and uses therefor in modifying fatty acid metabolism
DE19950589A1 (de) * 1999-10-20 2001-05-23 Gvs Ges Fuer Erwerb Und Verwer Elongasepromotoren für gewebespezifische Expression von Transgenen in Pflanzen
CA3023314C (en) * 2004-04-22 2019-12-10 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
US7807849B2 (en) * 2004-04-22 2010-10-05 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
US8685679B2 (en) * 2004-11-04 2014-04-01 E I Du Pont De Nemours And Company Acyltransferase regulation to increase the percent of polyunsaturated fatty acids in total lipids and oils of oleaginous organisms
WO2008006171A1 (en) * 2006-07-14 2008-01-17 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Altering the fatty acid composition of rice
EP2059588A4 (en) * 2006-08-29 2010-07-28 Commw Scient Ind Res Org FATTY ACID SYNTHESIS
US8525917B2 (en) * 2007-08-06 2013-09-03 Canon Kabushiki Kaisha Image sensing apparatus with plural focus detection pixel groups
CA2722276A1 (en) * 2008-04-25 2009-10-29 Commonwealth Scientific Industrial Research Organisation Recombinant cells and methods for hydroxylating fatty acids
AU2009273755A1 (en) * 2008-07-21 2010-01-28 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Improved vegetable oils and uses therefor
EP2315519B1 (en) * 2008-07-21 2016-08-17 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Improved cottonseed oil and uses
DK2358882T3 (da) * 2008-11-18 2017-11-06 Commw Scient Ind Res Org Enzymer og fremgangsmåder til fremstilling af omega-3 fedtsyrer
ES2640100T3 (es) * 2010-06-28 2017-10-31 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Métodos para producir lípidos
AR089442A1 (es) * 2011-12-27 2014-08-20 Commw Scient Ind Res Org Procesos para producir lipidos
US8809026B2 (en) * 2011-12-27 2014-08-19 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Processes for producing lipids
SG11201406843WA (en) * 2012-04-25 2014-11-27 Commw Scient Ind Res Org High oleic acid oils

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030115632A1 (en) * 1998-07-02 2003-06-19 Lardizabal Kathryn Dennis Diacylglycerol acyl transferase proteins
US6620986B1 (en) * 1999-11-23 2003-09-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Transformation of Ricinus communis, the castor plant
WO2006127655A2 (en) * 2005-05-20 2006-11-30 Washington State University Enhancement of hydroxy fatty acid accumulation in oilseed plants

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEF,M ET AL.: "Identification of non-heme diiron proteins that catalyze triple bond and epoxy group formation.", 《SCIENCE》 *
NCBI NUCLEOTIDE DATABASE: "GenBank DQ923084", 《NCBI》 *
SHOCKEY,JM ET AL.: "tung tree DGAT1 and DGAT2 have nonredundant functions in triacylglycerol biosynthesis and are localized to different subdomains of the endoplasmic reticulum.", 《PLANT CELL》 *
SUJATHA,M ET AL.,: "stable genetic transformation of castor(Ricinus communis L.)via agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer using embryo axes from mature seeds.", 《PLANT CELL REP.》 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104271743A (zh) * 2011-12-27 2015-01-07 联邦科学技术研究组织 产生脂质的方法
CN110951769A (zh) * 2011-12-27 2020-04-03 联邦科学技术研究组织 产生脂质的方法
CN105039394A (zh) * 2015-09-08 2015-11-11 内蒙古民族大学 一种获得蓖麻油酸含量提高的蓖麻新材料的方法
CN109477060A (zh) * 2016-06-28 2019-03-15 费尔曼塔格公司 增加tag产量的修饰藻类
CN109477060B (zh) * 2016-06-28 2022-06-17 费尔曼塔格公司 增加tag产量的修饰藻类
CN107674876A (zh) * 2016-08-01 2018-02-09 西北农林科技大学 MoKCS基因、该基因编码的酶及其应用
CN107674876B (zh) * 2016-08-01 2022-06-07 西北农林科技大学 MoKCS基因、该基因编码的酶及其应用
CN109679931A (zh) * 2019-01-30 2019-04-26 天津大学 一种苦皮藤酰基转移酶35019及其基因序列
CN114615881A (zh) * 2019-08-07 2022-06-10 罗特哈姆斯泰德研究有限公司 产生甘油三酯的非人类生物体
CN114615881B (zh) * 2019-08-07 2024-06-04 罗特哈姆斯泰德研究有限公司 产生甘油三酯的非人类生物体
CN113502295A (zh) * 2021-06-09 2021-10-15 西北农林科技大学 TmLPCAT基因用于提高三酰甘油sn-2位超长链脂肪酸含量的应用
CN113502295B (zh) * 2021-06-09 2022-06-07 西北农林科技大学 TmLPCAT基因用于提高三酰甘油sn-2位超长链脂肪酸含量的应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20110218348A1 (en) 2011-09-08
AU2009240794A1 (en) 2009-10-29
CA2722275A1 (en) 2009-10-29
WO2009129582A1 (en) 2009-10-29
BRPI0911606A2 (pt) 2015-07-28
ZA201008170B (en) 2012-02-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102170774A (zh) 用于产生包含修饰的脂肪酸的三酰基甘油的多肽及方法
US11814600B2 (en) Process for producing industrial products from plant lipids
US10513717B2 (en) Synthesis of fatty acids
US10925293B2 (en) Methods of producing lipids
AU2009240795B2 (en) Recombinant cells and methods for hydroxylating fatty acids
AU2013204308A1 (en) Methods of producing lipids
WO2012003545A1 (en) Acetylenation of fatty acids

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20110831