CN102169121B

CN102169121B - 人类激酶sbk1的新应用

Info

Publication number: CN102169121B
Application number: CN2010101146318A
Authority: CN
Inventors: 王平章; 石太平; 郭帅; 马大龙
Original assignee: Sinogenomax Co Ltd
Current assignee: Sinogenomax Co Ltd
Priority date: 2010-02-25
Filing date: 2010-02-25
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2030-02-25
Also published as: CN102169121A

Abstract

本发明涉及人类激酶SBK1的新应用，具体地说，本发明涉及SBK1在诊断癌症特别是卵巢癌中的应用、SBK1的拮抗剂在制备诊断和/或治疗癌症特别是卵巢癌的药物中的应用、诊断和/或治疗癌症特别是卵巢癌的药物组合物以及检测SBK1表达的试剂在制备用于检测癌症特别是卵巢癌的组合物中的应用。

Description

人类激酶SBK1的新应用

技术领域

本发明涉及人类激酶SBK1的新应用，具体地说，本发明涉及SBK1在诊断癌症特别是卵巢癌中的应用、SBK1的拮抗剂在制备诊断和/或治疗癌症的药物中的应用、诊断和/或治疗癌症的药物组合物以及检测SBK1表达的试剂的应用。

背景技术

癌症是恶性肿瘤的总称，是严重威胁人类健康的一大类疾病，在人类疾病中是仅次于心血管***疾病的第二大死亡原因。据估计，发达国家中约有三分之一的人会在他们生命历程的不同阶段患上癌症，其中近四分之一的患者最终死于癌症。一直以来，人们都在不断寻找有效的治疗方法去征服癌症。

随着人们对基因及其功能认识的逐渐深入，对癌症的发生、发展、迁移以及转归等，在分子生物学水平的发病机制研究的越来越清楚，为癌症的早期诊断和治疗奠定了基础。尤其是人类基因组计划的完成，人类全部基因的鉴定和注释，给人们呈现了一幅全新的蓝图，也为癌症治疗药物新靶标的发现和新型治疗药物的研究与开发提供了巨大的动力。药物靶标(drug target)即细胞内与药物相互作用并赋予药物效应的特定分子。98％以上药物靶标在生化性质上都属于蛋白质。靶标抗癌药物就是针对这些靶标，具有针对性强，效果显著，毒副作用小等特点。根据最新人类转录组数据库(H-InvitationalDatabase，H-InvDB)的统计，有注释的人类编码基因34057个(Yamasaki C etal，Nucleic Acids Res，2008，36：D793-799)，而目前所有批准上市的药物中针对人类蛋白质发挥作用涉及的编码基因不到300个(Golden JB.Curr Opin DrugDiscov Devel.2003，6(3)：310-316；Imming P，et al.Nat Rev Drug Discov.2006，5(10)：821-834；Overington JP，et al.Nat Rev Drug Discov.2006，5(12)：993-996；Chen X，et al.Nucleic Acids Res.2002，30(1)：412-415)，其他少数靶标分别来源于细菌、病毒、真菌或者是其他病原体，而人类基因组上预计的药物靶标有2000～3000个，所以大量的药物靶标有待于研究、开发。这些药物靶标从功能分类上涉及到酶类、转录因子、离子通道、细胞膜受体及核受体等等。在所有上市、临床试验以及尚在实验室研究阶段的药物靶标中，具有催化活性的酶类蛋白质占到将近80％(Gao Z，et al.BMCBioinformatics.2008，19(9)：104)。

蛋白激酶属于酶类，为磷酸基团转移酶，将ATP的γ磷酸基转移到底物特定的氨基酸残基上，使蛋白质磷酸化。研究表明，在人类基因组上共存在518个(Manning G，et al.Science，2002，298：1912-1933)或511个(Park J，et al.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(23)：8114-8119)蛋白激酶基因。这些激酶通过对蛋白质进行磷酸化修饰，使该蛋白质活性发生改变，常起着分子“开/关”的作用，控制着近30％的细胞蛋白质的活性，参与了几乎所有的细胞功能，例如细胞的增殖、分化，肌细胞的收缩，细胞的内吞以及诸多新陈代谢过程等等。蛋白激酶过度活跃是导致一些癌症的病因。由于蛋白激酶在控制细胞行为的核心作用而被视为治疗多种疾病的靶标得到学术界和生物医药公司的广泛研究。例如，由拜耳公司和Onyx制药公司共同研发的抗癌药物Sorafenib(Nexavar，BAY 43-9006)片剂已于2006年1月获得FDA批准用于治疗晚期肾细胞癌(RCC)或肾癌。该品是多激酶抑制剂，可作用于RAF/MEK/ERK阻止细胞增殖以及作用于VEGFR-2/PDGFR-β阻止肿瘤血管生成。此外如BCR-Abl抑制剂药物Gleevec(诺华公司)用于治疗慢性粒细胞白血病(chronicmyeloid leukemia，CML)和胃肠基质瘤；表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂药物Iressa(gefitinib)和Tarceva(erlotinib)(阿斯利康公司)用于治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)。毫无疑问，未来将会产生更多的阻断激酶的抑制剂用做治疗用药。

SBK1(SH3-binding domain kinase 1)基因是近年来首次克隆到的人的新的激酶基因(王平章等，人SBK1 cDNA的克隆及其相互作用蛋白的筛选，中国生物化学与分子生物学报，2006年4月，22(4)：313-321)。而之前，关于该激酶是否存在并不确定，尽管Manning等在激酶物组数据库中收录了该基因的预测序列(Manning G，et al.Science，2002，298：1912-1933.http//:www.kinase.com)，而Park等在后来的报道中却忽略掉了该基因(ParkJ，et al.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(23)：8114-8119)。分析表明，人的SBK1基因含有四个外显子，编码区(ORF)长1275bp，编码424个氨基酸，在不同的物种之间具有较高的保守性，如编码区与鼠的核苷酸序列同源性达87.7％，而氨基酸序列同源性达95.7％，在羧基端均有一个PV富集区，推测其能与含有SH3结构域的蛋白质结合。

发明内容

本发明的一个目的在于提供SBK1的拮抗剂在制备诊断和/或治疗癌症特别是卵巢癌的药物中的应用。

本发明的另一个目的是提供一种多克隆抗体。

本发明的另一个目的是提供一种诊断和/或治疗癌症特别是卵巢癌的药物组合物。

本发明的另一个目的是提供一种检测SBK1表达的试剂在制备用于检测癌症特别是卵巢癌的组合物中的应用。

在本发明中，SBK1包括SBK1基因或SBK1蛋白等。所述SBK1蛋白为如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，其具有424个氨基酸。所述SBK1基因为编码本发明的SEQ ID NO：2的多核苷酸序列，其可以为SEQ ID NO：2所示氨基酸的编码序列，或者除了上述氨基酸序列的编码序列之外，还可以包括非编码序列，例如内含子、编码序列5′或3′端的非编码序列等。所述多核苷酸序列可以是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因组DNA以及合成的DNA。其中优选的基因为SEQ ID NO：1所示的多核苷酸，其序列全长1610个核苷酸，编码序列为第336～1610位核苷酸。或者，更优选一种分离的核苷酸序列，其只包含编码SBK1蛋白序列，例如SEQ ID NO：1所示的编码序列：核苷酸336～1610。本领域普通技术人员已知，本发明的SBK1的核苷酸序列可以完全相同于如SEQ ID NO：1所示的编码序列，也可以由于遗传密码的简并性，不完全等同于上述核苷酸的编码序列。

本发明的SBK1核苷酸序列可以依据标准的PCR扩增技术将cDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板，并选取合适的寡核苷酸引物扩增得到。这样得到的多核苷酸可以克隆进合适的载体中，并用DNA分析技术进行序列描述。也可以通过标准DNA合成技术得到，例如，使用可以按本领域熟知的固相亚磷酸酰胺三酯法在DNA合成仪上合成。本发明的SBK1蛋白可以通过常规方法获得，例如通过转化宿主细胞并在被转化的宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用适当的方法(如温度变动或化学特质诱导)诱导启动子，然后继续培养。培养完成后，可用离心法收集细胞，并用任何已知的方法，如冻融法、超声处理法、溶菌酶溶解法或机械破碎法破碎细胞。可以用各种已知的方法从宿主细胞培养物中回收和纯化本发明的SBK1蛋白，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸萃取法、超滤法、离子交换层析法、磷酸纤维层析法、疏水相互作用层析法、凝胶过滤法、亲和层析法及高压液柱层析法。

在本发明的一个实施方式中，本发明通过免疫组织化学检测，在膀胱、肺、肝脏、睾丸、子宫、结肠、口腔舌腺、胃***、卵巢、皮肤、***、乳腺、肾脏、食道、胃体、胰腺的癌症组织中均检测到SBK1的表达；同时统计学数据证明本发明的SBK1在浆液性卵巢癌组织中与正常组织相对比明显高表达。因此，本发明的SBK1可作为癌症特别是卵巢癌诊断的一个新的指标。同时，本发明SBK1有可能作为癌症特别是卵巢癌治疗的一个新靶点，例如抑制本发明SBK1的基因或蛋白，可以用于治疗癌症。

根据本发明的一个方面，本发明提供SBK1的拮抗剂在制备诊断和/或治疗癌症特别是卵巢癌的药物中的应用。由于拮抗剂(例如蛋白、核酸、碳水化合物)可以与本发明的SBK1结合并抑制或封闭本发明的SBK1的生物活性，所以本发明的拮抗剂可以用于诊断和/或治疗癌症。

在本发明的一个实施方式中，所述的拮抗剂可以为抗SBK1或其抗原性片段的特异性单克隆或多克隆抗体。这里所述的“特异性”是指抗体能结合于本发明的SBK1基因产物或片段。优选那些能与本发明的SBK1的基因产物结合但不识别且不与其它非相关抗原分子结合的抗体。本领域普通技术人员已知，本发明的单克隆抗体或多克隆抗体可以通过本发明的SBK1的全长或其抗原性的片段作为抗原进行免疫获得，所述抗原性片段例如位于SEQ IDNO：2的第5～24位氨基酸。所述抗原性片段序列短、易于合成，而且经生物信息学分析以及实验证明其抗原性比较好。

在本发明的一个实施方式中，所述的拮抗剂可以为针对本发明的SBK1的反义RNA。反义RNA能与本发明的SBK1的mRNA分子特异性地互补结合，从而抑制SBK1的表达和功能。通常反义RNA由15～20个核苷酸组成，可由人工合成及以表达载体两种方式得到。后者是利用基因重组技术，在适当的启动子和转录终止子间反向***一段靶基因，从而得到反义表达的RNA。

在本发明的另一个实施方式中，所述的拮抗剂可以为小干扰RNA(siRNA)。所谓siRNA，就是包含19个碱基的小片段RNA，在导入细胞或组织后，可以特异地诱发与其同源的靶基因mRNA发生降解，导致靶基因的表达受到抑制，从而控制与靶基因有关的功能。所述siRNA可以通过诸如化学合成、体外转录或用RNase III消化长片段双链RNA等体外制备方法或siRNA表达载体、siRNA表达框架等体内表达方法来制备，并利用各种方法提高本发明RNA的稳定性。

本发明的SBK1可作为癌症特别是卵巢癌诊断的一个新的指标，利用前述针对SBK1或其片段的多克隆抗体或单克隆抗体可检测样品中SBK1的表达或表达水平，从而为诊断肿瘤提供新的诊断依据。

可以利用本领域已知的任何方法检测本发明的SBK1在核酸水平的表达，例如经与用放射性同位素标记的反义RNA或DNA探针与扩增后的DNA序列杂交，这样可根据放射性的有无及强度来定性或定量检测SBK1的表达水平。也可以采用非放射性标记物。也可使用衍生于PCR方法检测，例如逆转录PCR(RT-PCR)。逆转录PCR不仅可以检测DNA，也能对RNA进行分析和研究。作为选择，可以原位直接从活组织检查或切除术得到的患者组织的组织切片(固定和/或冰冻)上来检测本发明SBK1多核苷酸的表达，此时不需要纯化核酸。这些分析技术包括DNA或RNA印迹分析、单链构象多态性分析、原位杂交分析以及聚合酶链反应。这些分析既可揭示SBK1表达的定量方面的情况，也可揭示SBK1表达和/或组合物的定性方面的情况。例如可以采用Southern杂交分析来检测本发明的多核苷酸在核酸水平的表达水平。

也可以在蛋白质水平检测本发明SBK1的表达水平。检测方法也是本领域已知的，例如利用本发明SBK1蛋白特异性的单克隆抗体或多克隆抗体，利用直接或间接酶联免疫吸附试验、免疫荧光法、Western blot、免疫组织化学等进行检测。在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horserad-ishPeroxidase，HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatease，AP)。也可以使用葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。本领域普通技术人员已知，针对不同的酶，可使用不同的底物，HRP作用的底物包括，但不限于邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS等。免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。免疫印迹(Western blot)是借助SDS存在下高分辨率的PAGE电泳将抗原根据其分子量大小不同而有效分成许多蛋白区带，将分离后的蛋白带经不同途径转移至一种固相支持体如硝酸纤维膜或PVDF膜上，然后以抗体为探针，与附着于固相支持体的靶蛋白抗原表位发生特异性反应，结合于固相支持体的抗体可用酶标的二抗如碱性磷酸酶或辣根过养化物酶偶联的第二抗体等检测。免疫印迹可鉴定出混合物中未知蛋白及其分子质量。免疫组织化学是在组织切片中进行的抗原抗体反应，可以检测抗原在组织中的含量和定位。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种多克隆抗体，其与SEQ IDNO：2的第5～24位氨基酸特异性结合。经本发明的实验检验，SEQ ID NO：2的第5～24位氨基酸可以有效产生抗体。上述抗体不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。本发明的抗体可以通过本领域普通技术人员已知的各种方法来制备。例如，纯化的本发明SBK1蛋白或其具有抗原性的片段，可被施用于动物(例如小鼠、豚鼠、鸡、兔、山羊、绵羊、马等动物等)以诱导含有多克隆抗体的抗血清的产生，必要时在免疫时可加入佐剂，以增强免疫效果。为了使实验结果真实可靠，需要对抗血清进行纯化。抗血清纯化可使用几种不同的方法，常用的是蛋白A/G结合法和抗原亲和纯化法。制备本发明的SBK1或其片段的单克隆抗体的方法是本领域已知的方法，例如以蛋白或其片段作为抗原免疫动物(例如小鼠、豚鼠、鸡、兔、山羊、绵羊、马等动物)，取免疫动物的脾细胞作为能够产生抗体的浆细胞(免疫细胞)，与同系动物的骨髓瘤细胞进行融合。筛选能够产生目的抗体的杂交瘤细胞，并进行单克隆化。

根据本发明的另一方面，本发明还提供一种诊断和/或治疗癌症特别是卵巢癌的药物组合物。该药物组合物包含针对SBK1或其片段的抗体、反义RNA、siRNA等拮抗剂，还可以包含一种或多种药学可接受的载体或赋形剂。所述载体或赋形剂可以包括生理盐水、等渗葡萄糖溶液、缓冲盐水、甘油、乙醇及上述溶液的组合。所述药物组合物还可以进一步包含渗透促进剂、抗氧化剂和/或蛋白酶抑制剂等。

为治疗目的，所述药物组合物可以采用适当的制剂形式并通过适当的给药途径来施用。

至于本发明的药物组合物在诊断方面的应用，可以利用所述药物对来自受试者的样品进行检测，所述样品来自脱离受试者的组织切片；检测的具体方法例如通过直接或间接酶联免疫吸附试验、免疫荧光法、Western blot、免疫组织化学等测定SBK1蛋白在靶组织中的表达水平；或者，例如经与用放射性或非放射性同位素标记的反义RNA或DNA探针与扩增后的DNA序列杂交，进行检测，也可使用衍生于PCR方法检测，例如逆转录PCR(RT-PCR)。作为选择，可以原位直接从活组织检查或切除术得到的患者组织的组织切片(固定和/或冰冻)上来检测本发明SBK1多核苷酸的表达，此时不需要纯化核酸。这些分析技术包括DNA或RNA印迹分析、单链构象多态性分析、原位杂交分析以及聚合酶链反应分析。

本发明还提供检测SBK1的基因或蛋白的表达的试剂在制备用于检测肿瘤的组合物中的应用。所述的组合物可以为药物组合物、检测制剂或试剂盒。所述试剂可以为蛋白、核酸、碳水化合物等，优选为抗体、反义RNA或小干扰RNA(siRNA)。例如，所述的检测SBK1的基因(编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多核苷酸序列)的表达的试剂可以包括SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示的引物。所述的检测SBK1的蛋白(SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列)的表达的试剂可以包括针对SEQID NO：2所示的氨基酸序列的单克隆抗体或多克隆抗体；优选所述多克隆抗体为纯化的多克隆抗体；优选所述的多克隆抗体针对SEQ ID NO：2所示序列的第5～24位氨基酸。

本发明的SBK1的基因或蛋白可以作为诊断指标。因此，可以利用限制性片段长度多态性分析(RFLP)、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、荧光原位杂交法(FISH)等方法或它们的组合，检测体内因本发明的SBK1表达不足或过量所致的病理状态。同样，也可以使用本发明SBK1蛋白的抗体，通过放射性免疫分析、竞争性结合法、Western印迹分析法或酶联免疫吸附法(ELISA)达到相同的目的。

附图说明

图1显示人SBK1的cDNA序列以及所编码的蛋白质氨基酸序列。

图2显示SBK1在人的不同组织中RT-PCR结果。

图3显示SBK1在不同细胞系中RT-PCR结果。

图4显示SBK1在不同的细胞系中Western blot检测结果。

图5显示免疫组化染色结果，其中，左边图片为正常卵巢组织，右边图片为浆液性卵巢癌组织。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(2002年第三版[美]萨姆布鲁克等著，科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中未标明来源的试剂和材料均可商购获得。

实施例1、人SBK1的编码区核苷酸序列以及氨基酸序列

按照现有技术(例如王平章等，人SBK1 cDNA的克隆及其相互作用蛋白的筛选，中国生物化学与分子生物学报，2006年4月，22(4)：313-321)的记载，PCR扩增获得SBK1 cDNA序列，该cDNA序列片段长1610bp(参见SEQ ID NO：1及图1所示)，包含一个1275bp的完整ORF，编码424个氨基酸(参见SEQ IDNO：2所示)。在起始密码子ATG之前存在同一读框内终止密码子(In-framestop code)TGA，参见图1中方框标注。蛋白序列包含完整的激酶结构域(SEQID NO：2所示第52～316位氨基酸)，含有保守的ATP结合位点(SEQ ID NO：2所示第82位赖氨酸，参见图1中方框标注的第82位赖氨酸K)以及保守的催化区活性位点(SEQ ID NO：2所示174位天冬氨酸，参见图1中方框标注的第174位天冬氨酸D)。蛋白序列羧端含有一个富含PV的区域(参见图1中下划线标注的氨基酸序列)，推测该区域与含有SH3结构域的蛋白结合，其中方框标注的氨基酸序列为推测的与SH3结构域作用的核心区域，斜体标注的核苷酸序列为PCR的引物序列。

实施例2、人SBK1基因的表达谱分析

为保证扩增的特异性和敏感性，本实施例中的表达谱分析采用巢式PCR方法，即设计外侧和内侧2套PCR引物，先使用外侧PCR引物(上游引物为5’-CCCAAGATCCGGTCATTACAACTCCACA-3’(SEQ ID NO：3)，下游引物5’-TCAGACGCAGATCTCGATGGCCGTGGC-3’(SEQ ID NO：4))进行扩增，模板采用1μl组织或细胞系cDNA；然后取PCR产物2μl，以内侧引物(上游引物为5’-AGCATCACCAACAGCCTCTCCTCC-3’(SEQ ID NO：5)，下游引物为5’-CCGGTGAGCACGCAGAAGATGAG-3’(SEQ ID NO：6))进行扩增，20μl扩增体系。巢式PCR条件采用Touchdown-PCR方法为：94℃变性30秒，从65℃依次降低到60℃退火30秒，每个循环退火温度降低0.5℃，共10个循环，然后以60℃退火共20个循环，均72℃延伸30秒。各组织cDNA模板均商购获得，例如购自北京诺赛基因组研究中心有限公司研发课题组，也可按照现有技术的方法自行制备获得。各细胞系RNA提取、逆转录分别采用TRIzol及RT-PCR试剂盒(Invitrogen)根据配套的说明书进行操作处理，采用GAPDH作为内参。

RT-PCR表达谱分析结果参见图2。图2各泳道分别为：1乙状结肠，2左心窦，3胆囊，4结肠癌，5胃癌，6子宫，7十二指肠，8皮肤癌，9肺，10***，11肌肉，12盲肠，13肺癌，14阑尾，15膀胱，16睾丸，17胎盘，18食道，19***，20***，M表示Marker，自上而下片断大小分别为2000、1000、750、500、250、100bp。图2上部分图片为SBK1的扩增结果，扩增产物为452bp，下部分为内参GAPDH的扩增结果。取部分PCR产物经测序验证为SBK1的表达序列。图3为各细胞系cDNA为模板的PCR电泳结果，各泳道分别为：1MRC5，2HeLa，3H520，4H1299，5Du145，6U251，7HepG2，8A549，9HT29，10293T，11MCF7，12有引物无模板对照。

从图2和图3可以看出，SBK1在RNA水平上在各细胞系中均有表达，但是只在少数组织内有明显的PCR条带。

实施例3、内源性SBK1的检测

(1)多肽合成及抗体制备、纯化。采用DNAstar软件对SBK1蛋白质序列进行抗原性分析，并选取特异性的亲水区域CPEPEPPRSLTCCGPGTAPG(SEQ ID NO：2所示第5～24位氨基酸)作为设计抗原的肽段，由上海华大天源生物科技有限公司进行肽段的合成。使用匙孔血蓝蛋白(KLH)作为载体蛋白与抗原肽进行偶联，纯化的偶联肽与弗氏完全佐剂(FCA)进行乳化，免疫兔子以制备兔抗血清。按常规免疫程序进行免疫。使用ELISA方法检测血清效价。制备成功的兔抗血清，使用溴化氰活化琼脂糖凝胶4B偶联抗原肽制备亲和层析柱对抗体进行纯化。纯化后的抗体即可用于Western blot检测。

(2)Western blot检测内源性SBK1。各细胞系根据各自培养要求分别使用含10％血清的DMEM或1640培养基(HyClone)进行培养。各取约100万个培养细胞使用100μl细胞裂解液(1×PBS，1％NP40，0.5％sodiumdeoxycholate，0.1％SDS)裂解细胞，离心取上清用于Western blot检测。按标准的Western blot程序进行电泳、转膜、封闭等操作。一抗使用上述纯化的兔抗人SBK1抗体，二抗使用HRP标记的羊抗兔抗体(Santa Cruz)。使用Pierce公司的发光检测试剂盒进行检测。

结果参见图4所示，图4中各泳道分别为：1SBK1过表达产物对照，2HT29，3Du145，4H520，5HeLa，6HepG2，7MG63，8U251，9A549。SBK1分子量大小为50KD，Beta-ACTIN分子量43KD。上部分图片为SBK1的检测，下部分图片为内参Beta-ACTIN的检测。

由图4可以看到，尽管表达强弱不一，SBK1在各细胞系中均有所表达，以肺癌细胞H520表达最为明显。这进一步证明了内源性的SBK1蛋白的存在。

实施例4、免疫组化染色检测

肿瘤及边缘组织组合芯片(型号为CC00-11-016)购买自陕西超英生物科技有限公司。该芯片各组织取材于60例病例，点阵总数为96个。每种组织包含3个独立病例来源的癌组织和3个正常或癌旁组织的点阵。

免疫组化染色过程：先使用微波加热法进行抗原修复，以10％正常山羊血清(PBS)封闭，室温15分钟，将切片倾斜，将血清吸去后直接滴加用PBS稀释的一抗(实施例3制备得到的纯化的兔抗人SBK1抗体)工作液，37℃孵育1小时或4℃过夜。PBS洗5分钟×3次，滴加生物素标记的二抗(HRP标记的羊抗兔抗体(Santa Cruz))工作液37℃，30～40分钟。PBS洗5分钟×3次，滴加辣根过氧化物酶标记的抗生物素工作液，37℃，30～40分钟孵育，PBS洗后，DAB显色(阳性显色可见棕黄色)。使用自来水充分冲洗终止显色，苏木精复染(染核，呈蓝色)，酒精脱水，二甲苯透明处理，最后使用中性树胶封片。

组织芯片免疫组化染色结果表明，在全部的膀胱、肺、肝脏、睾丸、子宫、结肠、口腔舌腺、胃***、卵巢、皮肤、***、乳腺、肾脏、食道、胃体、胰腺的癌症组织及其癌旁组织(或正常组织)中，全部的浆液性卵巢腺癌(病理诊断均为III期)组织中，与正常卵巢组织相对，SBK1明显高表达(参见图5)。

序列表

<110>北京诺赛基因组研究中心有限公司

<120>人类激酶SBK1的新应用

<130>GAI10CN0262C

<160>6

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1610

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(336)..(1610)

<400>1

cccaagatcc ggtcattaca actccacacc tcaagacaag aagacccagc tcagaacgcc 60

cctagatcag gggatcccaa ttccccccaa ctccggtaca tagaaatccc aaatctaggc 120

agccggggac agcaagagac actctcacca gcaagaagcc tcggggatcc cccccctaaa 180

gctccaggac ttgggcgact gagcccctgg cggcaccgct tgcaccccgg tccatggtcg 240

tggcgccctg agcccccggg gccgggcaga cgaagaccgc gacggcgccc aggccccctg 300

ccgcggcgtc cccgcggccc cagcccaggg agaag atg agc gtg ggc tgc cca 353

Met Ser Val Gly Cys Pro

1 5

gag cct gag ccg ccc cgc tcc ctg acc tgc tgt ggg ccg ggg act gcc 401

Glu Pro Glu Pro Pro Arg Ser Leu Thr Cys Cys Gly Pro Gly Thr Ala

10 15 20

cct ggg cct ggt gcc ggt gtg ccc ctt ctc act gaa gac atg cag gcc 449

Pro Gly Pro Gly Ala Gly Val Pro Leu Leu Thr Glu Asp Met Gln Ala

25 30 35

ctg act ctc cgc aca ctg gcc gcc agc gac gtc acc aag cac tac gaa 497

Leu Thr Leu Arg Thr Leu Ala Ala Ser Asp Val Thr Lys His Tyr Glu

40 45 50

cta gtc cgg gag ctg ggc aaa ggc acc tat ggg aag gtt gac ctg gtg 545

Leu Val Arg Glu Leu Gly Lys Gly Thr Tyr Gly Lys Val Asp Leu Val

55 60 65 70

gtc tac aag ggc aca ggc aca aaa atg gca ctg aag ttt gtg aac aag 593

Val Tyr Lys Gly Thr Gly Thr Lys Met Ala Leu Lys Phe Val Asn Lys

75 80 85

agc aaa acc aag ctg aag aac ttc cta cgg gag gtg agc atc acc aac 641

Ser Lys Thr Lys Leu Lys Asn Phe Leu Arg Glu Val Ser Ile Thr Asn

90 95 100

agc ctc tcc tcc agc ccc ttc atc atc aag gtc ttt gac gtg gtc ttt 689

Ser Leu Ser Ser Ser Pro Phe Ile Ile Lys Val Phe Asp Val Val Phe

105 110 115

gag aca gag gac tgc tac gtc ttt gcc cag gag tac gca cct gct ggg 737

Glu Thr Glu Asp Cys Tyr Val Phe Ala Gln Glu Tyr Ala Pro Ala Gly

120 125 130

gac ctg ttt gac atc atc cct ccc cag gtg ggg ctc cct gag gac acg 785

Asp Leu Phe Asp Ile Ile Pro Pro Gln Val Gly Leu Pro Glu Asp Thr

135 140 145 150

gtg aag cgc tgt gtg cag cag ctg ggc ctg gcg ctg gac ttc atg cac 833

Val Lys Arg Cys Val Gln Gln Leu Gly Leu Ala Leu Asp Phe Met His

155 160 165

ggg cgg cag ctg gtg cac cgc gac atc aag ccc gag aac gtg ctg ctg 881

Gly Arg Gln Leu Val His Arg Asp Ile Lys Pro Glu Asn Val Leu Leu

170 175 180

ttc gac cgc gag tgc cgc cgc gta aag ctg gcc gac ttc ggc atg acg 929

Phe Asp Arg Glu Cys Arg Arg Val Lys Leu Ala Asp Phe Gly Met Thr

185 190 195

cgc cgc gtg ggc tgc cgc gtc aag cgc gtg agc ggc acc atc cct tac 977

Arg Arg Val Gly Cys Arg Val Lys Arg Val Ser Gly Thr Ile Pro Tyr

200 205 210

acg gcg cct gag gtg tgc cag gcg ggc cgc gcc gac ggg ctg gcg gtg 1025

Thr Ala Pro Glu Val Cys Gln Ala Gly Arg Ala Asp Gly Leu Ala Val

215 220 225 230

gac acg ggc gtg gac gtg tgg gcc ttc ggc gtg ctc atc ttc tgc gtg 1073

Asp Thr Gly Val Asp Val Trp Ala Phe Gly Val Leu Ile Phe Cys Val

235 240 245

ctc acc ggc aac ttc ccg tgg gag gcg gcg tcg ggc gcc gac gcc ttc 1121

Leu Thr Gly Asn Phe Pro Trp Glu Ala Ala Ser Gly Ala Asp Ala Phe

250 255 260

ttc gag gag ttc gtg cgc tgg cag cgg ggc cgc ctg ccg ggg ctg cct 1169

Phe Glu Glu Phe Val Arg Trp Gln Arg Gly Arg Leu Pro Gly Leu Pro

265 270 275

tcg cag tgg cgc cgc ttc acc gag ccc gcg ctg cgc atg ttc cag cgc 1217

Ser Gln Trp Arg Arg Phe Thr Glu Pro Ala Leu Arg Met Phe Gln Arg

280 285 290

tta ctg gcc ctg gag ccc gag cgc cgc ggc cca gcc aag gag gtg ttc 1265

Leu Leu Ala Leu Glu Pro Glu Arg Arg Gly Pro Ala Lys Glu Val Phe

295 300 305 310

cgc ttc ctc aag cac gag ctc acg tcc gag ctg cgc cgc cgg ccc tcg 1313

Arg Phe Leu Lys His Glu Leu Thr Ser Glu Leu Arg Arg Arg Pro Ser

315 320 325

cac cgc gcg cgc aag ccc ccc ggg gac cgc ccg ccc gcc gcc ggg cca 136l

His Arg Ala Arg Lys Pro Pro Gly Asp Arg Pro Pro Ala Ala Gly Pro

330 335 340

ctg cgc ctc gag gcg cct ggg ccg ctc aag cgg acg gtg ctg acc gag 1409

Leu Arg Leu Glu Ala Pro Gly Pro Leu Lys Arg Thr Val Leu Thr Glu

345 350 355

agc ggc agc ggc tcc cgg ccc gcg ccc ccc gcc gtc ggg tcg gtg ccc 1457

Ser Gly Ser Gly Ser Arg Pro Ala Pro Pro Ala Val Gly Ser Val Pro

360 365 370

ttg ccc gtg ccg gtg ccg gtg cca gtg ccc gtg ccg gtg cct gtg ccc 1505

Leu Pro Val Pro Val Pro Val Pro Val Pro Val Pro Val Pro Val Pro

375 380 385 390

gag ccc ggc cta gct ccc cag ggg ccc ccc ggc cgg acc gac ggc cgc 1553

Glu Pro Gly Leu Ala Pro Gln Gly Pro Pro Gly Arg Thr Asp Gly Arg

395 400 405

gcg gac aag agc aaa ggg cag gtg gtg ctg gcc acg gcc atc gag atc 1601

Ala Asp Lys Ser Lys Gly Gln Val Val Leu Ala Thr Ala Ile Glu Ile

410 415 420

tgc gtc tga 1610

Cys Val

<210>2

<211>424

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Met Ser Val Gly Cys Pro Glu Pro Glu Pro Pro Arg Ser Leu Thr Cys

1 5 10 15

Cys Gly Pro Gly Thr Ala Pro Gly Pro Gly Ala Gly Val Pro Leu Leu

20 25 30

Thr Glu Asp Met Gln Ala Leu Thr Leu Arg Thr Leu Ala Ala Ser Asp

35 40 45

Val Thr Lys His Tyr Glu Leu Val Arg Glu Leu Gly Lys Gly Thr Tyr

50 55 60

Gly Lys Val Asp Leu Val Val Tyr Lys Gly Thr Gly Thr Lys Met Ala

65 70 75 80

Leu Lys Phe Val Asn Lys Ser Lys Thr Lys Leu Lys Asn Phe Leu Arg

85 90 95

Glu Val Ser Ile Thr Asn Ser Leu Ser Ser Ser Pro Phe Ile Ile Lys

100 105 110

Val Phe Asp Val Val Phe Glu Thr Glu Asp Cys Tyr Val Phe Ala Gln

115 120 125

Glu Tyr Ala Pro Ala Gly Asp Leu Phe Asp Ile Ile Pro Pro Gln Val

130 135 140

Gly Leu Pro Glu Asp Thr Val Lys Arg Cys Val Gln Gln Leu Gly Leu

145 150 155 160

Ala Leu Asp Phe Met His Gly Arg Gln Leu Val His Arg Asp Ile Lys

165 170 175

Pro Glu Asn Val Leu Leu Phe Asp Arg Glu Cys Arg Arg Val Lys Leu

180 185 190

Ala Asp Phe Gly Met Thr Arg Arg Val Gly Cys Arg Val Lys Arg Val

195 200 205

Ser Gly Thr Ile Pro Tyr Thr Ala Pro Glu Val Cys Gln Ala Gly Arg

210 215 220

Ala Asp Gly Leu Ala Val Asp Thr Gly Val Asp Val Trp Ala Phe Gly

225 230 235 240

Val Leu Ile Phe Cys Val Leu Thr Gly Asn Phe Pro Trp Glu Ala Ala

245 250 255

Ser Gly Ala Asp Ala Phe Phe Glu Glu Phe Val Arg Trp Gln Arg Gly

260 265 270

Arg Leu Pro Gly Leu Pro Ser Gln Trp Arg Arg Phe Thr Glu Pro Ala

275 280 285

Leu Arg Met Phe Gln Arg Leu Leu Ala Leu Glu Pro Glu Arg Arg Gly

290 295 300

Pro Ala Lys Glu Val Phe Arg Phe Leu Lys His Glu Leu Thr Ser Glu

305 310 315 320

Leu Arg Arg Arg Pro Ser His Arg Ala Arg Lys Pro Pro Gly Asp Arg

325 330 335

Pro Pro Ala Ala Gly Pro Leu Arg Leu Glu Ala Pro Gly Pro Leu Lys

340 345 350

Arg Thr Val Leu Thr Glu Ser Gly Ser Gly Ser Arg Pro Ala Pro Pro

355 360 365

Ala Val Gly Ser Val Pro Leu Pro Val Pro Val Pro Val Pro Val Pro

370 375 380

Val Pro Val Pro Val Pro Glu Pro Gly Leu Ala Pro G1n Gly Pro Pro

385 390 395 400

Gly Arg Thr Asp Gly Arg Ala Asp Lys Ser Lys Gly Gln Val Val Leu

405 410 415

Ala Thr Ala Ile Glu Ile Cys Val

420

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

cccaagatcc ggtcattaca actccaca 28

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

tcagacgcag atctcgatgg ccgtggc 27

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

agcatcacca acagcctctc ctcc 24

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

ccggtgagca cgcagaagat gag 23

Claims

1.检测SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或编码该氨基酸序列的核苷酸序列的表达的试剂在制备用于检测癌症的组合物中的应用，其中所述的癌症为卵巢癌。

2.如权利要求1所述的应用，其中所述的组合物为检测制剂或试剂盒。

3.如权利要求1所述的应用，其中所述的检测编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列的表达的试剂包括SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的引物。

4.如权利要求1所述的应用，其中所述的检测SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的表达的试剂包括针对SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的单克隆抗体或多克隆抗体。

5.如权利要求4所述的应用，其中所述多克隆抗体为纯化的多克隆抗体。

6.如权利要求4所述的应用，其中所述的多克隆抗体针对SEQ ID NO：2所示序列的第5～24位氨基酸。